标题：

Artesunate与Navitoclax联合在高级别浆液性卵巢癌模型中的抗肿瘤药物协同作用

引用： McCorkle, J.R.; Ahn, R.; Cao, C.D.; Hill, K.S.; Dietrich, C.S.; Kolesar, J.M. Artesunate与Navitoclax联合在高级别浆液性卵巢癌模型中的抗肿瘤药物协同作用. 《癌症》 2024, 16, 1321. DOI: https://doi.org/10.3390/cancers16071321.

学术编辑： Alexandre Escargueil

接收日期：2024年3月4日 修订日期：2024年3月22日 接受日期：2024年3月25日 发布日期：2024年3月28日

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摘要：

Artesunate属于从青蒿（Artemisia annua）植物提取的药物类别，称为青蒿素类。Artesunate传统上用于治疗严重的疟疾，但也表现出对多种恶性肿瘤（包括卵巢癌）的抗肿瘤活性。数据表明，Artesunate通过加剧细胞氧化应激，触发凋亡。在本研究中，我们研究了Navitoclax（一种Bcl-2家族抗凋亡蛋白的抑制剂）是否能增强Artesunate在卵巢癌细胞中的疗效。Artesunate和Navitoclax作为单一药物都在二维和三维卵巢癌细胞模型中表现出抗增殖作用。在将Navitoclax与Artesunate结合后，我们在每个测试的二维细胞系和卵巢肿瘤类器官模型中观察到抗肿瘤药物的协同作用。进一步使用腹腔CAOV3异种移植模型在BALB/scid小鼠中研究这种药物组合，显示Artesunate/Navitoclax组合优于单一的Artesunate和安慰剂对照组，但未优于单一的Navitoclax。通过优化，这种药物组合可能为卵巢癌提供新的治疗选择，值得进一步的临床前研究。

关键词：

Artesunate；Navitoclax；药物协同作用；卵巢癌

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1. 引言

卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤，2023年美国估计有13,270例死亡病例。虽然卵巢癌仅占所有新发癌症病例的1%，但其年死亡率估计为2.2%。由于死亡率高于发病率且五年生存率仅为50%左右，因此寻找改善卵巢癌治疗效果的策略至关重要。

卵巢癌的一线治疗包括细胞减灭术和以紫杉烷和铂类药物为基础的辅助化疗，这一方案在过去30年中几乎没有变化。最近，某些患者接受了贝伐珠单抗和/或PARP抑制剂的维持治疗，后者对BRCA突变型卵巢癌（约占所有病例的15%）特别有益。然而，超过70%的患者在诊断时处于晚期，且多达80%的患者会复发并最终死于其疾病，这突显了新治疗方法的迫切需要。

Artesunate是一种青蒿素的半合成衍生物，青蒿素是从青蒿（Artemisia annua）植物中提取的，该植物在中国草药中已作为退烧剂使用了2000多年。Artesunate目前用于治疗疟疾，但也显示出在广泛的癌细胞系中具有抗肿瘤活性，包括卵巢癌。Artesunate的主要抗癌机制被认为是生成活性氧（ROS），导致DNA和蛋白质的氧化损伤，从而引发凋亡。四十年的疟疾治疗和癌症临床试验已经表明，Artesunate的耐受性良好。

Navitoclax是一种小分子Bcl-2家族（即BCL2、BCL2L1、BCL2L2）抗凋亡蛋白的抑制剂，已在卵巢癌的临床前模型中表现出活性，包括一种25例高级别浆液性卵巢癌的体外模型。基于有前景的临床前数据，Navitoclax作为单一药物在一项包括45名重度治疗的高级别浆液性、铂类耐药或复发性卵巢癌患者的二期试验中进行了评估。在此试验中，Navitoclax显示出有限的活性，只有一名患者达到部分缓解，虽然不良反应可接受，但血小板减少症是主要的毒性。在其他癌症中，Navitoclax与化疗联合使用已显示出有效性，但受到毒性的限制。

由于Artesunate能诱导凋亡，评估利用Bcl-2蛋白抑制剂的潜在药物协同作用是一条可行的研究路径，这也可能改善Navitoclax单一药物的活性。此外，两种药物的可接受毒性特征使它们成为临床研究的有吸引力的候选药物。虽然青蒿素类已在白血病和非小细胞肺癌细胞中与Bcl-2抑制剂联合进行了临床前评估，但尚未在卵巢癌中研究Artesunate与Navitoclax的联合应用。我们使用2D和3D人类卵巢肿瘤模型，体外和体内评估了该方案的抗肿瘤疗效。

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2. 材料与方法

2.1 二维细胞培养

四种高级别浆液性卵巢癌细胞系（OVCAR3、UWB1.289、CAOV3和OV-90）购自ATCC。细胞在37°C和5% CO2的恒定条件下培养，每周传代2到3次。OVCAR3细胞在RPMI-1640基础培养基中生长，含20%胎牛血清和0.01 mg/mL牛胰岛素；UWB1.289细胞在RPMI-1640与乳腺上皮细胞生长培养基（MEGM）按1:1比例混合的培养基中生长，补充有3%胎牛血清；CAOV3细胞在含10%胎牛血清的DMEM中生长；OV-90细胞在MCDB 105与199培养基按1:1混合的培养基中生长，补充有15%胎牛血清。

2.2 二维细胞活力检测

将3 × 10^3细胞接种到96孔白色壁微孔板中，在100 µL生长培养基中培养并在37°C、5% CO2条件下孵育24小时。随后去除生长培养基，替换为含药物的培养基或作为阴性对照的空白培养基。每个细胞系在逐级稀释的Navitoclax或Artesunate中培养72小时。Artesunate的药物浓度范围为0.05 µM到100 µM（12个浓度；4倍稀释）；Navitoclax浓度范围为0.01 µM到25 µM（12个浓度；2倍稀释）。处理后，使用CellTiter-Glo 2.0细胞活力测定（Promega，东京中央）测量细胞活力，并用未经处理的对照细胞进行标准化（药物处理的发光值/未经处理的平均发光值×100）。使用R统计软件包drc中的四参数对数对数非线性模型确定每种药物在每个细胞系中的IC50值。

2.3 二维药物组合/协同分析

使用上述方法，经过72小时的处理后，测定细胞活力。Artesunate和Navitoclax单独和组合进行测试，采用6 × 6完全因子协同研究设计，每个细胞系至少进行了3次独立实验。测试的Artesunate浓度范围为0 µM到200 µM，Navitoclax浓度范围为0 µM到40 µM。使用R统计软件中的synergyfinder包分析药物协同作用，协同评分使用Loewe加成模型实现。

2.4 三维肿瘤类器官培养

肿瘤类器官细胞系UK1254建立于Markey癌症中心49岁患者的晚期上皮性卵巢癌。类器官在37°C和5% CO2的恒定条件下培养，每周传代一次，每周更换培养基两次。细胞在Corning® Matrigel®生长因子减少的基质胶中生长。基础培养基为Advanced DMEM/F12，添加了从HEK293 RSPO-1表达细胞中获得的R-Spondin-1(RSPO-1)条件培养基（20%体积/体积）、Wnt-3A（50 ng/mL）、FGF10（100 ng/mL）、Noggin（100 ng/mL）、EGF（10 ng/mL）、A83-01（500 nM）、Y-27632（9 µM）、B27补充剂（2%体积/体积）、N2补充剂（1%体积/体积）、烟酰胺（1 mM）、Glutamax（2 mM）、HEPES（10 mM）和primocin（50 µg/mL）。

2.5 类器官活力测定

UK1254类器官在逐级稀释的Navitoclax或Artesunate中生长72小时。使用CellTiter-Glo 3D细胞活力测定（Promega）测量细胞活力。使用高通量成像评估细胞活力，并与未经处理的对照细胞进行比较，以确定每种药物浓度下的反应。使用四参数对数对数非线性回归模型确定每种药物的IC50。测试了6个浓度，Artesunate的范围为0 µM到16 µM（10倍稀释），Navitoclax的范围为0 µM到12.5 µM（2倍稀释）。

2.6 类器官药物组合/协同分析

使用上述细胞增殖测定方法生成剂量反应数据。药物组合对每种药物的五种逐级稀释浓度进行了测试，使用第六种浓度作为对照。使用R统计软件中的Bioconductor synergyfinder包评估药物组合对药物-药物相互作用的影响。协同评分使用Loewe加成模型、Bliss独立模型、最高单一药物模型（HSA）和零相互作用效能模型（ZIP）实现。协同评分=0表示加成；评分>0表示协同作用；评分<0表示拮抗作用。Artesunate的浓度范围为0 µM到50 µM（4倍稀释），Navitoclax的浓度范围为0 µM到12.5 µM（2倍稀释）。

2.7 凋亡检测

将CAOV3和OVCAR3卵巢癌细胞（4 × 10^5）接种到60 mm培养皿中，并在37°C、5% CO2条件下孵育24小时。然后用10 µM Navitoclax、25 µM Artesunate（OVCAR3）或50 µM Artesunate（CAOV3）处理细胞48小时。为了评估药物组合，细胞还被处理10 µM Artesunate和/或10 µM Navitoclax 48小时。去除培养基后，用D-PBS洗涤细胞，并使用Accutase细胞分离溶液（BD Biosciences）分离细胞。收集细胞，离心5分钟（300×g），用冰冷的D-PBS洗涤两次，然后重悬于1X Annexin V结合缓冲液（BD Biosciences）中。将细胞通过70 µm的筛网过滤，然后使用FITC Annexin V凋亡检测试剂盒I（BD Biosciences）用FITC-Annexin V和碘化丙啶标记15分钟。随后通过流式细胞仪分析细胞。

2.8 体内异种移植小鼠模型

动物研究经肯塔基大学机构动物护理和使用委员会批准。BALB/c scid（CBySmn.Cg-Prkdcscid/J）小鼠购自Jackson实验室，并在无病原体的条件下饲养在屏障笼中。

通过使用pLL-CMV-rFLuc-GFP-mPGK-Puro Lenti-Labeler慢病毒载体对CAOV3细胞进行慢病毒转染，生成表达荧光素酶和GFP的CAOV3细胞（CAOV3-luc）。通过在含有1 µg/mL嘌呤霉素的CAOV3培养基中培养2周，选择转染细胞。通过FACS进一步富集GFP阳性细胞，收集最高GFP表达的25%细胞。筛选后的细胞在含1 µg/mL嘌呤霉素的培养基中维持。

将六周龄的雌性BALB/c scid小鼠腹腔注射1.25 × 10^7 CAOV3-luc细胞。为了监测细胞移植，小鼠通过腹腔注射IVIS-brite D-荧光素钾盐（150 mg/kg，PerkinElmer）。小鼠通过3%异氟烷吸入麻醉，并使用Lago光学成像系统（Spectral Instruments）每周成像一次，以评估注射后5-15分钟的全身生物发光。使用Aura图像分析软件（版本4.0.7，Spectral Instruments）定量生物发光。

使用8只肿瘤负担相当的小鼠组进行治疗效果评估，随机分配为安慰剂对照组、单一Artesunate治疗组、单一Navitoclax治疗组或Artesunate与Navitoclax联合治疗组。各组的肿瘤负担在开始治疗时通过生物发光测量相等。Artesunate和Navitoclax购自MedChemExpress，并在10% DMSO、40% PEG-300、5% Tween-80和45%生理盐水中制备。治疗每天一次，持续5天（周一至周五），共8周。Navitoclax的剂量为50 mg/kg。Artesunate的剂量为50 mg/kg，持续4周，然后增加到100 mg/kg，持续接下来的4周。治疗期间，每周按上述方法进行生物发光成像。

2.9 统计分析

统计分析使用R（版本4.0.1）或GraphPad Prism进行。统计显著性设定为*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。

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3. 结果

3.1 单一药物敏感性分析

我们在一组人类高级别浆液性卵巢癌细胞系中评估了对Artesunate的相对新生敏感性，包括CAOV3、OVCAR3、OV-90和BRCA1缺失的UWB1.289细胞。由于Artesunate对卵巢癌细胞增殖的时间依赖性作用，我们选择在治疗72小时后评估细胞活力，这与之前的研究一致。进行了细胞活力测定，并计算了IC50值。不同细胞系之间的Artesunate敏感性相差约10倍。OV-90细胞中的Artesunate IC50值显著高于CAOV3、UWB1.289和OVCAR3细胞。

我们之前的研究表明，Artesunate暴露会诱导癌细胞凋亡；因此，我们旨在确定通过抑制Bcl-2家族的抗凋亡蛋白是否能增强Artesunate在卵巢癌细胞中的疗效。Navitoclax属于BH3模拟物小分子抑制剂家族，能抑制Bcl-2、Bcl-xL和Bcl-w。在卵巢癌细胞系中评估了对Navitoclax的敏感性，CAOV3、UWB1.289、OV-90和OVCAR3细胞的平均IC50值分别为3.33 µM、3.53 µM、7.93 µM和13.33 µM。Navitoclax在OVCAR3细胞中的IC50值显著高于其他细胞系。

新型上皮性卵巢癌类器官UK1254也被评估了对Artesunate和Navitoclax的敏感性。UK1254类器官的Artesunate IC50均值为4.15 µM，Navitoclax IC50均值为3.80 µM，与在二维细胞系中观察到的值相当。

3.2 Artesunate与Navitoclax联合

为了确认在我们的模型系统中观察到的Artesunate介导的细胞活力损失确实是由凋亡引起的，我们对Artesunate敏感的CAOV3和OVCAR3细胞分别用50 µM和25 µM Artesunate处理48小时。使用FITC-Annexin V和碘化丙啶染色并通过流式细胞仪分析凋亡。在与未经处理的对照相比，Artesunate导致CAOV3细胞中的凋亡增加了9.3%，而OVCAR3细胞中的凋亡增加了23.5%。在CAOV3和OVCAR3细胞中，凋亡率显著高于未处理细胞中观察到的基础凋亡率。接下来，使用中度细胞毒性单一药物浓度的Artesunate和Navitoclax以1:1摩尔比进行联合治疗，并在CAOV3和OVCAR3细胞中处理10 µM的Artesunate和Navitoclax单独或联合48小时。结果显示，10 µM的Navitoclax在CAOV3细胞中诱导了43.1%的凋亡，在OVCAR3细胞中诱导了16.1%的凋亡。单独使用Artesunate分别在CAOV3和OVCAR3细胞中触发了6.7%和17.4%的凋亡。组合使用时，CAOV3细胞的凋亡率增加到68.3%，而OVCAR3细胞的凋亡率增加到54.4%。

随后，对整个卵巢癌细胞系进行了药物协同作用的正式分析。经过72小时的处理后，在所有测试的卵巢癌细胞系中观察到临床相关浓度下的细胞毒性药物协同作用，包括对Artesunate耐药的OV-90细胞。使用Loewe加成模型评估协同作用，我们发现组合治疗在CAOV3、OVCAR3、UWB1.289和OV-90细胞中显著优于非相互作用的零模型。此外，在UK1254类器官系中也观察到了显著的药物协同作用。为了确保Artesunate和Navitoclax的表观协同作用不依赖于模型，我们还使用了Bliss独立模型、零相互作用效能模型（ZIP）和最高单一药物模型（HSA）分析了我们的数据。对于所有测试的细胞系，Artesunate和Navitoclax在每种模型下都被认为具有协同作用，除了UWB1.289细胞，在其中组合被分类为加成。

3.3 卵巢癌异种移植模型中的Artesunate与Navitoclax

体外观察到的药物协同作用促使我们进一步使用正交小鼠异种移植模型研究Artesunate和Navitoclax的组合治疗。生成CAOV3-luc细胞以使用全身生物发光成像监测小鼠中的腹腔肿瘤生长。简要地说，CAOV3细胞使用绿色荧光蛋白（GFP）和荧光素酶（rFLuc）共表达的慢病毒载体进行标记，并通过FACS和嘌呤霉素筛选具有稳定基因整合的细胞（CAOV3-luc）。在6周龄雌性BALB/c scid小鼠中建立了腹腔肿瘤异种移植，并通过每周的生物发光成像监测移植情况。

植入后五周，移植建立，32只CAOV3-luc肿瘤负担相等的小鼠被随机分配到四个治疗组：安慰剂对照组、单一Artesunate治疗组、单一Navitoclax治疗组和联合治疗组。制定了基于之前研究的剂量方案，以在小鼠异种移植模型中展示效力并将毒性最小化。治疗通过灌胃给药，每周5天，持续8周，Navitoclax剂量为50 mg/kg。Artesunate在前4周的剂量为50 mg/kg，随后由于较低剂量未显示出明显效力，增加到100 mg/kg，持续接下来的4周。治疗耐受性良好，观察到的药物相关毒性最小。在Navitoclax单一组的两只小鼠中有三次鼻出血事件，但无需干预即得到缓解。

图4A显示了治疗开始和结束时每个治疗组的肿瘤异种移植生物发光的代表性图像。图4B总结了相对于治疗前水平的总发射变化的定量（平均值±标准误）。在治疗的第4至第8周期间，安慰剂和单一Artesunate治疗组相比于Navitoclax单一治疗组和联合治疗组显示出更高的肿瘤进展率。在治疗期间，安慰剂对照组的一只小鼠因第10天明显的异氟烷过量暴露而死亡，并从研究中剔除。另一只安慰剂治疗的小鼠在治疗第6周死于疾病。其余30只小鼠在整个研究期间存活。治疗结束后的一周，测量了生物发光，并发现联合治疗组的小鼠中位总发射量显著低于安慰剂和单一Artesunate治疗组。单一Navitoclax治疗组与其他治疗组之间或安慰剂与单一Artesunate治疗组之间未观察到显著差异。

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4. 讨论

卵巢癌仍然是最致命的妇科恶性肿瘤，但新治疗方式的发展有限。尽管结果略有改善，但当前的前线治疗，包括铂类/紫杉烷双药组合，在近三十年内几乎没有显著变化。显然，寻找更好的卵巢癌治疗策略至关重要。

Artesunate是一种水溶性、口服可用的青蒿素半合成衍生物，已显示出对多种癌细胞的细胞毒性活性。我们目前的研究和先前的研究表明，Artesunate可以抑制人卵巢癌细胞系和肿瘤类器官的细胞增殖并诱导凋亡。青蒿素类还显示出增强卵巢癌细胞中铂类药物的细胞毒性作用。尽管抗癌活性的证据大多来自临床前研究，Artesunate在早期临床试验中也表现出临床活性。此外，青蒿素类，包括Artesunate，具有良好的耐受性，已被广泛用于全球范围内的疟疾一线治疗，未有严重不良事件的报告。这些数据支持进一步临床研究Artesunate作为癌症治疗的潜力。

Navitoclax属于一种称为BH3模拟物的药物类别，可增强凋亡的诱导。通过结合Bcl-2蛋白的BH3结构域，Navitoclax破坏了促凋亡蛋白BIM的隔离，导致其释放并最终引发凋亡。单一Navitoclax的临床评价一直未能取得理想效果，活性未达到预期，且显著的剂量限制性但可控的血小板减少症。在一项对小细胞肺癌患者的II期研究中，Rudin等人报告了2.6%的患者部分缓解，23.1%的患者病情稳定，41%的患者病情进展。此外，41%的研究对象发生了III–IV级血小板减少症。MONAVI-GINECO研究评估了Navitoclax单一疗法在复发性上皮性卵巢癌中的疗效。与小细胞肺癌的结果类似，2.2%的患者出现了部分缓解，32.6%的患者病情稳定，65.2%的患者病情进展。26%的患者发生了III–IV级血小板减少症，导致25%的受影响个体停药。Navitoclax单一治疗始终未能产生可接受的结果，这促使研究重点转向组合治疗策略，以增强疗效并避免剂量限制性毒性。

包括利妥昔单抗、达沙替尼、维莫非尼、伏立诺他、他莫昔芬等靶向药物在内的化疗药物与Navitoclax联合使用在实体瘤和血液癌症中显示出增强的疗效。Navitoclax增强了在2D和3D卵巢癌细胞培养中的卡铂和紫杉醇的体外活性，并在HRD卵巢癌细胞中与鲁卡帕利呈现协同作用。我们自己的工作表明，Navitoclax与Artesunate的组合在2D人卵巢癌细胞系以及一种新型高级别浆液性卵巢癌类器官模型中表现出显著的药物协同作用。

青蒿素类与Navitoclax的联合使用已在几种癌症模型中显示出优于单一治疗的效果，包括白血病和非小细胞肺癌。我们旨在证明Artesunate与Navitoclax是一种有前途的转移性卵巢癌治疗策略。如图3所示，各种卵巢癌细胞模型中，体外药物协同作用显著且一致。这包括Artesunate耐药细胞系OV-90、BRCA1突变细胞系UWB1.289以及患者衍生肿瘤类器官系UK1254。不幸的是，这些体外结果未能转化为动物模型。尽管体内研究显示联合治疗优于安慰剂和单一Artesunate治疗，但未优于单一Navitoclax。这表明Navitoclax在组合治疗中发挥了主要作用。

联合治疗未能优于单一Navitoclax是意料之外的，但可能有几个解释。首先，药物给药途径可能不适合最大化Artesunate的生物利用度。因此，Artesunate浓度可能低于在肿瘤部位实现药物协同作用所需的阈值。在健康个体中，口服Artesunate的绝对生物利用度估计仅为21.6%。可能使用静脉注射Artesunate的Navitoclax组合治疗更有效。其次，Artesunate的给药频率可能不足。报道的Artesunate在人类中的半衰期估计相对较短。文献回顾发现，几乎所有研究都估计口服治疗后的Artesunate半衰期小于1小时。短的消除半衰期进一步得到了报告的小分布容积的支持。我们的体内研究可能需要增加口服Artesunate的给药频率，以达到肿瘤内部所需的Navitoclax药物协同作用浓度。最后，可能允许肿瘤进展到对Artesunate不再敏感的程度。正如小分布容积所示，Artesunate在不易灌注的组织中分布可能有限。腹膜和网膜血管丰富，提供了充足的机会将Artesunate从血浆灌注到腹腔。尽管我们使用了能够充分药物暴露的转移性卵巢癌正交腹腔模型，CAOV3-luc细胞在治疗前已允许移植超过4周。这可能允许大转移灶的建立，阻碍Artesunate进入较大的肿瘤结节。另一种策略是提前启动组合治疗，针对微小转移灶和循环肿瘤细胞，这可能产生预期的协同作用。因此，这可能表明Artesunate与Navitoclax的组合在临床上更适合用于尚未发生远处转移的患者的辅助治疗。

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5. 结论

如前所述，Navitoclax与Artesunate在体外以临床可达到的浓度协同杀死卵巢癌细胞。这种药物组合可能有助于满足卵巢癌治疗的紧迫需求，但还需要进行临床前优化。由于缺乏有效剂量和给药方式的共识，Artesunate的临床应用受到限制。然而，Artesunate作为疟疾治疗的几十年使用经验表明其具有良好的安全性，这可能在与合适药物（如Navitoclax）联合使用时转化为有利的治疗指数。继续对这种治疗组合进行临床前研究对于实现其在卵巢癌中的治疗潜力至关重要。

附录材料：以下支持信息可以从https://www.mdpi.com/article/10.3390/cancers16071321/s1下载，表S1: 使用各种协同模型评估Artesunate和Navitoclax的协同评分。

作者贡献： 概念化，J.R.M.、R.A. 和 J.M.K.；方法学，J.R.M.、R.A. 和 K.S.H.；形式分析，J.R.M.、R.A. 和 K.S.H.；调查，J.R.M.、R.A.、C.D.C. 和 K.S.H.；原稿撰写，J.R.M. 和 R.A.；审阅和编辑，J.R.M.、R.A.、C.D.C.、K.S.H.、C.S.D. 和 J.M.K.；监督，C.S.D. 和 J.M.K.；资金获取，J.M.K.。所有作者已阅读并同意已发布版本的手稿。

资金支持： 此研究得到了美国国立卫生研究院国家癌症研究所肯塔基大学Markey癌症中心的资助，资助编号为P30CA177558。

伦理声明： 动物研究的方案已获得肯塔基大学机构动物护理和使用委员会的批准。

数据可用性声明： 本文中所述的数据可应要求从通讯作者处获得。

致谢： 此研究得到了肯塔基大学Markey癌症中心（P30CA177558）生物样本采购与转化病理学以及流式细胞仪与免疫监测共享资源的支持。肯塔基大学实验室动物资源部提供了额外支持。

利益冲突： Jill M. Kolesar已获得来自Loxo@Lilly和Artemilife的研究支持，并且是VesiCure Technologies和Helix Diagnostics的创始人和股东。资助者未参与研究设计、数据收集、分析或解释，手稿的撰写或发表结果的决策。

 

 

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