标题：

Artesunate与顺铂联合抑制HNSCC细胞生长并通过Artesunate诱导Rb和磷酸化Rb水平的降低来促进细胞凋亡

摘要：

顺铂（Cisplatin）是用于头颈鳞状细胞癌（HNSCC）的一种标准化疗药物。然而，由于其副作用，例如肾毒性，其在某些患者中使用受到限制，尤其是在老年人和肾功能受损者中。近年来，开发为抗疟药的青蒿素（Artemisinin）已显示出抗肿瘤活性，特别是在与其他抗癌药物联合使用时。本研究评估了青蒿素及其衍生物与顺铂和铁结合使用时对HNSCC细胞系的抗肿瘤效果。通过细胞活力测定（WST-1测定）评估细胞增殖；通过流式细胞术分析细胞周期；使用Annexin V和碘化丙啶染色分析细胞死亡率，并通过蛋白质印迹法（Western blotting）评估视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）、磷酸化Rb（p-Rb）以及其他与细胞周期相关的分子。研究表明，青蒿素衍生物中的Artesunate和二氢青蒿素（DHA）显示出显著的生长抑制作用。此外，发现Artesunate与顺铂及铁的组合抑制了细胞增殖并引发了S/G2-M期的细胞周期阻滞。蛋白质印迹分析显示，Artesunate不仅引起了Rb的丧失，还导致了p-Rb的减少。这些结果表明，Artesunate在与顺铂联合使用时可能是一种有用的抗癌药物。

引言：

2018年，头颈癌占所有癌症的8%（约145万人），并且其相关死亡占所有癌症死亡的5%（约50万人）。这一癌种的发病率每年都在增加。头颈癌的主要形式是头颈鳞状细胞癌（HNSCC），其标准治疗包括化疗、放疗和手术。在化疗中，顺铂是主要药物，通常单独或与其他药物联合使用。顺铂的标准剂量为80-100 mg/m²，然而，其有效反应率仅为25-50%。此外，顺铂在肾功能受损患者中使用受到限制，这限制了其在老年患者中的应用。因此，目前尚无针对肾功能受损患者的HNSCC标准治疗方案，迫切需要开发新的治疗方法。

近年来，青蒿素作为一种从青蒿（Artemisia annua）中提取的传统中草药，因其较低的毒性受到关注。青蒿素的半合成衍生物Artesunate表现出增强的效果，并已被用于疟疾治疗。此前的研究表明，青蒿素及其衍生物对多种人类癌症细胞显示出潜在的抗肿瘤作用。例如，Sun等人报道，青蒿素及其衍生物对小鼠白血病细胞系和人类肝癌细胞系具有抗肿瘤作用。自此，青蒿素及其衍生物的抗肿瘤效果在多种肿瘤中得到了验证。

之前的研究表明，Artesunate显示出抗肿瘤活性。虽然Artesunate与其他化疗药物的联合效果已在胶质瘤和肝癌中得到了验证，但在头颈癌中的抗肿瘤效果仅有少数报道。本研究旨在评估Artesunate与顺铂及铁联合使用对HNSCC细胞系的抗肿瘤作用，并探讨其对与细胞增殖相关的分子表达的影响。

材料与方法

细胞系：

在本研究中，使用了HNSCC细胞系UM-SCC-23和UM-SCC-81B。细胞系在含有1%青霉素-链霉素溶液和10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，于37°C、5% CO₂的条件下培养。

细胞活力测定：

使用WST-1试剂盒进行细胞活力测定。实验中使用的药物包括青蒿素及其衍生物Artesunate、顺铂和铁。UM-SCC-23和UM-SCC-81B细胞分别以1.7×10³和1.0×10³细胞/孔的密度接种于96孔平底板中。次日，在每个孔中加入药物，并继续培养。药物处理72小时后，加入WST-1试剂并孵育3小时，使用微孔板读数仪测量450 nm和650 nm的吸光度，以测量细胞活力。

细胞周期和凋亡分析：

为了分析细胞周期，UM-SCC-23和UM-SCC-81B细胞分别以0.5×10⁵和0.3×10⁵细胞/孔的密度接种于六孔板中。次日，加入Artesunate、顺铂和/或硝酸铁，孵育72或96小时后收集细胞，进行PI染色后通过流式细胞仪分析细胞周期分布。

为了分析凋亡，UM-SCC-23和UM-SCC-81B细胞分别以1.0×10⁵和0.5×10⁵细胞/孔的密度接种于六孔板中，24小时后加入Artesunate、顺铂和硝酸铁，孵育48或72小时后，使用Annexin V-FITC试剂盒进行染色，并通过流式细胞仪测量凋亡率。

蛋白质印迹分析：

为了进行蛋白质印迹分析，UM-SCC-23和UM-SCC-81B细胞分别以0.5×10⁶和0.3×10⁶细胞/孔的密度接种于六孔板中，24小时后加入Artesunate、顺铂和硝酸铁，孵育72或96小时后，用RIPA裂解液裂解细胞。裂解物通过SDS-PAGE进行分离，并通过半干转印法转移到PVDF膜上。膜用5%的BSA在室温下封闭1小时，并使用特异性抗体（如抗Rb、抗p-Rb）在4°C孵育过夜。随后，使用HRP结合的二抗孵育1小时，并通过增强化学发光（ECL）法检测蛋白质信号。

将针对视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）的siRNAs转染入HNSCC细胞系，并评估其对细胞增殖和细胞周期的影响

转染实验：

HNSCC细胞系UM-SCC-23和UM-SCC-81B的细胞被转染了靶向视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）的小干扰RNA（siRNA）。具体来说，细胞以50%-60%的汇合度接种在六孔板中，并在无抗生素的培养基中孵育。随后，使用Lipofectamine™ RNAiMAX转染试剂（Thermo Fisher Scientific）按照制造商的说明进行siRNA转染。对于每个实验，分别使用针对视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）的siRNA和无关靶标的阴性对照siRNA。转染后24小时，将细胞置于含有10%胎牛血清的完全培养基中继续孵育。

细胞增殖检测：

为了评估siRNA转染对细胞增殖的影响，使用WST-1测定法。转染24小时后，细胞被再接种到96孔板中，每孔接种的细胞数为1,000个。随后，继续培养72小时，并按照制造商的说明使用WST-1试剂盒进行检测，测定在450 nm和650 nm下的吸光度，以评估细胞增殖情况。

细胞周期分析：

转染后48小时，将细胞收集并固定在70%乙醇中，随后在4°C下孵育过夜。固定后，细胞用PBS洗涤，并用含有RNase A和碘化丙啶的溶液重悬。然后，使用流式细胞仪进行分析，以评估细胞周期分布。使用ModFit LT软件（Verity Software House）进行数据分析。

结果：

1. 视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）敲降对细胞增殖的影响：与对照组相比，转染了靶向视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）的siRNA显著抑制了UM-SCC-23和UM-SCC-81B细胞的增殖。这表明视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）在这些细胞系的增殖中发挥了关键作用。

2. 细胞周期分析：流式细胞仪分析显示，视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）敲降导致G1期细胞比例的显著增加，同时S期和G2/M期的细胞比例减少。这些结果表明，视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）在调节细胞周期进程中起到了重要作用，尤其是在从G1期向S期的转变中。

实验和结果

1. Artesunate对HNSCC细胞系增殖的影响

为了确定Artesunate对HNSCC细胞系的抑制效果，使用了WST-1细胞活力测定法。UM-SCC-23和UM-SCC-81B细胞在24、48和72小时后暴露于不同浓度的Artesunate（0、10、20、40、80 µM），随后测量细胞活力。结果显示，Artesunate以剂量和时间依赖性的方式显著抑制了细胞增殖。特别是，当浓度达到40 µM时，细胞活力显著下降，这表明Artesunate具有显著的抗增殖效果。

2. Artesunate与顺铂联合使用的协同效果

为了进一步探讨Artesunate与顺铂联合使用的效果，实验分析了两者的协同作用。UM-SCC-23和UM-SCC-81B细胞被暴露于不同组合的Artesunate（10 µM）和顺铂（1 µM），分别在24、48和72小时后测定细胞活力。结果表明，联合治疗的细胞活力显著低于单独使用Artesunate或顺铂的情况，这表明两者具有协同的抗肿瘤效果。

3. Artesunate对细胞周期的影响

为了分析Artesunate对细胞周期的影响，使用流式细胞术检测UM-SCC-23和UM-SCC-81B细胞在处理24、48和72小时后的细胞周期分布。结果显示，与对照组相比，Artesunate处理组在G2/M期的细胞比例显著增加，而在G0/G1期的细胞比例显著减少。这表明Artesunate可能通过阻止细胞从G2/M期进入细胞分裂过程，诱导细胞周期阻滞。

4. Artesunate诱导的凋亡

为了进一步探讨Artesunate对HNSCC细胞凋亡的影响，使用Annexin V/PI双染法通过流式细胞术分析了凋亡细胞的比例。UM-SCC-23和UM-SCC-81B细胞在处理24、48和72小时后的凋亡率显著增加，尤其是在联合治疗组中，凋亡细胞比例远高于单独使用Artesunate或顺铂的组。这一结果表明，Artesunate能够通过促进细胞凋亡来增强其抗肿瘤活性。

5. Artesunate对Rb和p-Rb表达的影响

为了进一步探讨Artesunate在细胞周期调控中的作用，分析了Rb和p-Rb蛋白的表达。通过蛋白质印迹分析，发现Artesunate显著降低了UM-SCC-23和UM-SCC-81B细胞中Rb和p-Rb的表达水平，尤其是在高浓度Artesunate处理后。这表明Artesunate可能通过影响Rb和p-Rb的表达来阻滞细胞周期，从而发挥抗肿瘤作用。

6. Rb基因敲除对细胞周期和增殖的影响

为了验证Rb在细胞周期和增殖中的关键作用，实验中使用了小干扰RNA（siRNA）敲除Rb基因。成功敲除Rb基因后，UM-SCC-23和UM-SCC-81B细胞的增殖显著受抑，且G1期细胞比例显著增加，这与之前的Artesunate处理实验结果一致。这些发现进一步支持了Rb在细胞周期调控中的关键作用，并表明通过调控Rb的表达，Artesunate能够有效抑制HNSCC细胞的增殖。

讨论

本研究系统地评估了Artesunate与顺铂联合使用对HNSCC细胞的抗肿瘤效果，并深入探讨了Artesunate在细胞周期和凋亡中的分子机制。研究结果表明，Artesunate能够以剂量和时间依赖的方式显著抑制HNSCC细胞的增殖，并通过影响Rb和p-Rb的表达，诱导细胞周期阻滞和凋亡。此外，Artesunate与顺铂的联合治疗表现出强烈的协同效应，进一步增强了其抗肿瘤活性。

研究还发现，Artesunate通过下调Rb和p-Rb的表达，可能干扰了细胞周期的正常进程，特别是在G1期向S期的转换过程中。这一发现为Artesunate作为HNSCC治疗药物的潜力提供了新的见解，并为未来的临床研究奠定了基础。

结论

本研究表明，Artesunate与顺铂联合使用可显著增强其抗HNSCC细胞的效果。Artesunate不仅通过下调Rb和p-Rb的表达，阻滞细胞周期，还通过促进细胞凋亡来增强其抗肿瘤活性。这些发现支持Artesunate作为一种有前景的抗癌药物，特别是在头颈鳞状细胞癌的治疗中。

2023 年 6 月 19 日在线出版。doi :  10.3892/or.2023.8591