本文短链接： https://gettr.ink/FNyAe4

Sourse: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4172338/

青蒿素触发人类Ishikawa子宫内膜癌细胞的G1细胞周期停滞并通过破坏NF-kB转录信号通路抑制细胞周期依赖性激酶4（CDK4）的启动子活性和表达

作者：Kalvin Q. Tran, Antony S. Tin, and Gary L. Firestone
加州大学伯克利分校分子与细胞生物学系和癌症研究实验室，伯克利，加利福尼亚州，94720-3200

摘要

目前关于青蒿素（一种源自青蒿的天然抗疟药物）在人体子宫内膜癌细胞中的抗增殖作用知之甚少。青蒿素在培养的人类Ishikawa子宫内膜癌细胞中引发了G1细胞周期停滞，并下调了CDK2和CDK4的转录和蛋白水平。CDK4启动子-荧光素酶报告基因的分析表明，青蒿素对CDK4基因表达的抑制与CDK4启动子活性的丧失有关。染色质免疫沉淀显示青蒿素抑制了NF-κB亚基p65和p50与Ishikawa细胞内源性CDK4启动子的相互作用。共免疫沉淀实验表明，青蒿素通过增加与IκB-α（一种NF-κB抑制剂）的蛋白-蛋白相互作用，破坏了p65和p50的核转运，并破坏了其与CDK4启动子的相互作用，导致CDK4基因表达的丧失。青蒿素处理刺激了IκB-α蛋白水平的增加，而未改变IκB-α的转录水平。最后，外源性p65的表达导致该NF-κB亚基在青蒿素处理的细胞和未经处理的细胞中在细胞核中积累，逆转了青蒿素对CDK4蛋白表达和启动子活性的下调，并阻止了青蒿素引起的G1细胞周期停滞。综上所述，我们的结果表明，青蒿素在子宫内膜癌细胞中的抗增殖作用的关键事件是通过破坏NF-κB与CDK4启动子的相互作用来转录下调CDK4表达。

关键词

子宫内膜癌细胞；青蒿素抗增殖信号；NF-κB；CDK4基因表达

引言

子宫内膜癌是女性生殖系统最常见的癌症，特别是在西方国家。尽管手术、放疗和化疗等传统治疗方法在早期诊断和治疗中有效，但对于晚期或复发性子宫内膜癌的治疗选择仍然有限。因此，开发新的治疗策略来抑制子宫内膜癌的进展变得尤为重要。

青蒿素是一种从中药青蒿（Artemisia annua L.）中提取的天然产物，最初被发现具有抗疟疾活性。近来的研究表明，青蒿素及其衍生物在多种癌症细胞中具有抗增殖作用，包括乳腺癌、结肠癌、白血病和黑色素瘤。然而，青蒿素在子宫内膜癌中的作用及其潜在机制尚未被充分研究。

在这项研究中，我们调查了青蒿素对人类Ishikawa子宫内膜癌细胞的作用，重点研究其对细胞周期的影响及其可能的分子机制。我们的研究结果表明，青蒿素通过引发G1细胞周期停滞并下调CDK4和CDK2的表达来抑制Ishikawa细胞的增殖。这种作用是通过破坏NF-κB转录信号通路并抑制CDK4启动子的活性实现的。

材料和方法

细胞培养和药物处理

Ishikawa细胞（人类子宫内膜癌细胞系）在含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养，补充有青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 μg/mL）。细胞在37°C、5% CO2的环境中培养。青蒿素用DMSO溶解，终浓度不超过0.1%。

细胞增殖测定

使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8，Dojindo Molecular Technologies, Inc.）进行细胞增殖测定。将Ishikawa细胞接种到96孔板中，在37°C孵育24小时。然后用不同浓度的青蒿素处理细胞，孵育时间为0、24、48和72小时。通过测量450 nm处的吸光度来评估细胞活性。

细胞周期分析

将Ishikawa细胞在6孔板中接种，培养至约80%的汇合度后，用青蒿素处理24小时。然后，使用流式细胞术分析细胞周期分布。用70%的冷乙醇固定细胞，随后用PBS洗涤，并用含有50 μg/mL RNA酶A和50 μg/mL碘化丙啶的溶液染色30分钟。通过流式细胞仪测量荧光强度，并使用ModFit LT软件进行数据分析。

Western Blot分析

将Ishikawa细胞用不同浓度的青蒿素处理24小时后，用冰冷的PBS洗涤细胞，并用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液裂解细胞。通过SDS-PAGE分离蛋白质，并将其转移到PVDF膜上。使用5%脱脂奶粉在PBS中封闭膜，随后用抗体（针对CDK4、CDK2、p21、p27、IκB-α、NF-κB p65、NF-κB p50和β-actin）孵育。使用HRP标记的二抗，并通过化学发光法检测蛋白质。

实时定量PCR

用青蒿素处理Ishikawa细胞24小时后，用Trizol试剂提取总RNA。使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。使用SYBR Green PCR试剂进行实时定量PCR，检测CDK4、CDK2和IκB-α的mRNA表达水平。将每个基因的表达标准化为内参基因β-actin。

荧光素酶报告基因测定

将Ishikawa细胞在24孔板中接种，并用含有CDK4启动子区域的荧光素酶报告基因质粒转染细胞。用青蒿素处理转染后的细胞24小时。通过荧光素酶报告基因分析系统测量荧光素酶活性。

染色质免疫沉淀（ChIP）分析

将Ishikawa细胞用青蒿素处理24小时后，用甲醛固定细胞。裂解细胞，并用超声破碎染色质。将破碎的染色质与抗NF-κB p65或抗NF-κB p50抗体孵育，并与蛋白A/G琼脂糖珠共沉淀。洗涤珠子，逆转交联并提取DNA。使用CDK4启动子区域的特异性引物进行PCR扩增。

共免疫沉淀

将Ishikawa细胞用青蒿素处理24小时后，用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液裂解细胞。用抗NF-κB p65抗体孵育裂解物，并与蛋白A/G琼脂糖珠共沉淀。通过Western Blot分析共沉淀的蛋白质，检测NF-κB p65与IκB-α的相互作用。

统计分析

所有实验重复三次，并表示为均值±标准误差。使用t检验或方差分析（ANOVA）评估数据的统计显著性，p值<0.05被认为具有统计显著性。

结果

青蒿素在Ishikawa子宫内膜癌细胞中引发G1细胞周期停滞

为了研究青蒿素对人类Ishikawa子宫内膜癌细胞的影响，我们首先分析了细胞增殖。用不同浓度的青蒿素处理细胞24小时后，观察到显著的细胞增殖抑制作用。进一步的流式细胞术分析显示，青蒿素引发了Ishikawa细胞的G1期细胞周期停滞（图1A和B）。这些结果表明，青蒿素通过阻滞G1期细胞周期来抑制Ishikawa细胞的增殖。

青蒿素下调CDK4和CDK2的表达

为了进一步理解青蒿素引发的G1期细胞周期停滞的机制，我们检测了细胞周期调控蛋白CDK4和CDK2的表达水平。Western Blot分析显示，青蒿素处理显著下调了CDK4和CDK2的蛋白表达（图2A）。此外，实时定量PCR结果显示，青蒿素处理也下调了CDK4和CDK2的mRNA水平（图2B）。这些数据表明，青蒿素通过下调CDK4和CDK2的表达来引发G1期细胞周期停滞。

青蒿素抑制CDK4启动子活性

为了进一步探讨青蒿素对CDK4表达的调控机制，我们进行了荧光素酶报告基因测定。将Ishikawa细胞转染含有CDK4启动子区域的荧光素酶报告基因质粒，并用青蒿素处理24小时。结果显示，青蒿素显著抑制了CDK4启动子的活性（图3）。这些结果表明，青蒿素通过抑制CDK4启动子活性来下调CDK4基因的表达。

青蒿素通过破坏NF-κB转录信号通路抑制CDK4表达

为了研究青蒿素对CDK4启动子活性抑制的分子机制，我们进行了染色质免疫沉淀（ChIP）分析，检测NF-κB与CDK4启动子的相互作用。结果显示，青蒿素处理显著减少了NF-κB亚基p65和p50与CDK4启动子的结合（图4A）。进一步的共免疫沉淀实验表明，青蒿素增加了NF-κB p65与IκB-α的相互作用，导致p65从细胞核转运至细胞质，从而破坏了其转录活性（图4B）。此外，Western Blot分析显示，青蒿素处理增加了IκB-α蛋白水平，但未改变其mRNA水平（图4C）。这些结果表明，青蒿素通过增加IκB-α蛋白的稳定性并抑制NF-κB的核转运来下调CDK4表达。

外源性p65表达逆转青蒿素引发的G1期停滞和CDK4下调

为了验证NF-κB在青蒿素引发的G1期细胞周期停滞和CDK4下调中的作用，我们在Ishikawa细胞中外源性表达了NF-κB p65。结果显示，p65的过表达逆转了青蒿素对CDK4蛋白表达的抑制，并恢复了CDK4启动子的活性（图5A和B）。此外，p65的过表达也阻止了青蒿素引发的G1期细胞周期停滞（图5C）。这些结果进一步支持了NF-κB在青蒿素调控CDK4表达和细胞周期停滞中的关键作用。

讨论

我们的研究首次表明，青蒿素通过破坏NF-κB信号通路来下调CDK4基因表达，并引发人类Ishikawa子宫内膜癌细胞的G1期细胞周期停滞。青蒿素处理显著减少了NF-κB亚基p65和p50与CDK4启动子的相互作用，并通过增加IκB-α蛋白的稳定性来抑制NF-κB的核转运。外源性p65的表达逆转了青蒿素引发的G1期停滞和CDK4下调，进一步证明了NF-κB在这一过程中发挥的关键作用。

这些发现揭示了青蒿素在调控细胞周期中的潜在作用机制，并为青蒿素作为抗子宫内膜癌药物的潜力提供了新的见解。然而，进一步的研究仍然需要深入探讨青蒿素在其他癌症类型中的作用，以及其在临床应用中的潜力。

nihms-541555.pdf 青蒿素触发人类Ishikawa子宫内膜癌细胞的G1细胞周期停滞并通过破坏NF-kB转录信号通路抑制细胞周期依赖性激酶4（CDK4）的启动子活性和表达.docx 青蒿素触发人类Ishikawa子宫内膜癌细胞的G1细胞周期停滞并通过破坏NF-kB转录信号通路抑制细胞周期依赖性激酶4（CDK4）的启动子活性和表达.pdf