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本文短链接：https://gettr.ink/pTxCMp MDC Handbook: Metropolitan Detention Center Brooklyn, New York Admission and Orientation Manual for Pre-Trial, and Holdover Inmates MDC手册：纽约布鲁克林大都会拘留中心预审和过渡囚犯的入狱和入狱指南 （修订于11/09） 总体介绍 当您被送到这个设施时，您将获得一个联邦注册号，这将在您在联邦监管下期间作为您的身份识别号。这个号码通常被称为您的“号码”或“注册号”。您有责任向家人和朋友提供您的号码，以便在您在我们的照顾下收到他们的信件。所有邮件在进入我们的设施时必须标有您的注册号，发出时也是如此。这是一个无烟机构。 囚犯信息 您已经接受了一名小组成员的社会筛查。您已经收到一张图片卡、牢房分配和床铺分配。您已被分配到计算机，并且除非获得小组成员的许可，否则不能移动到其他床位。您初次抵达时将被安置在G41号牢房（医疗入所筛查单位）。在G41中的囚犯将不得获访。一旦您经过医学检查并转移到永久单位，您需要负责请求并建立立即家庭成员的探望名单。 规则和条例 所有住房单位都张贴了英语和西班牙语的规则和条例，阅读和遵守这些规则是您的责任。本小册子列出了您在我们设施中拘留期间可以联系的部门。还有一节是关于您的权利和责任。 卫生 一个房间的两名囚犯有责任始终保持高标准的卫生水平。所有房间都将进行每日卫生检查。未能达到令人满意的卫生评分可能会导致纪律处分。这些说明是帮助囚犯每天保持其个人房间区域卫生的指南。每天早上7:30，您的床铺需要整理，生活区域需要整洁。来自主食和普通食物托盘的食物在任何时候都不允许进入您的牢房或生活区域。普通食物餐应在提供时刻食用。 公共区域 每名囚犯都有责任维护和保持单位的所有公共区域的卫生状况，例如：室外娱乐区、淋浴间、单位浴室和电视观看区。每名囚犯都应该把这些区域保持得像他们希望找到的那样。 领事访问 当确定一名囚犯是外国公民时，狱长可能允许该国领事代表访问谈论合法业务事项。先前关系已建立的要求不适用于领事访客。（步骤2.2.2） 囚犯向工作人员提出请求和行政救济投诉 如果您无法通过与工作人员的非正式联系解决投诉，或者通过“囚犯向工作人员提出请求”（BP-148），通常称为“请教”；并且您希望为行政救济提出正式投诉，您可以从负责记录和跟踪每项投诉的单元顾问那里获取“用于解决非正式的囚犯请求”表格。您通常会在3到5个工作日内收到回复。如果您对回复不满意，您可以获取“行政救济请求”（BP-229）。小组成员将尝试非正式解决办法，然后再将其转至狱长办公室。您必须在投诉发生基础之日起的二十（20）个日历日内提交您的投诉。每次提交只允许一项投诉。您通常会在接到投诉之日起的二十（20）个日历日内收到狱长的回复，并采取措施，并提供书面回复。 如果您不满意狱长的回复，您可以在二十（20）天内通过BP-230表格向东北地区主任提出上诉。BP-230表格可从您的单元顾问处获取。您通常会在收到上诉的三十（30）个日历日内收到来自区域主任的书面回复。如果您对此回复不满意，您可以在收到区域主任回复之日起的三十（30）天内向联邦监狱署总顾问和审查办公室助理总监提出最终上诉。这应该在BP-DIR-231表格上进行，并附有BP-229和BP-230的副本。您通常会在四十（40）个日历日内收到书面回复。 邮件 寄出信件 每个住房单位中都设有两个邮件箱，一个用于寄出一般信件，另一个用于“特别邮件”（请参阅有关“特别邮件”的部分）。您需要将一般邮件放入适当的邮箱中，并保持未封口状态。工作日，每天不晚于上午8:00，将从邮箱收集寄出信件，周末和法定节假日除外。请记住您对邮寄信件的内容负责。包含威胁、勒索等内容的信件可能导致违反联邦法律而受到起诉。所有寄出信件必须在信封正面的左上角显示完整的退信地址（见下面示例）。退信地址必须包括您的承诺名称。您的承诺名称是警察在您入所时根据拘留令上注明的使用的名字。 寄件 寄件信箱 每个住房单元有两个信箱，一个用于寄出一般信件，另一个用于“特殊邮件”（详见有关“特殊邮件”的部分）。您需要将一般邮件放在适当的信箱内，而不要封好。每天（周末和联邦假日除外）最迟在上午8:00前从信箱中收集寄件邮件。请注意，您对您寄出的信件内容负全责。含有威胁、勒索等内容的信件可能会导致违反联邦法律而被起诉。所有寄件邮件必须在信封正面的左上角显示完整的退信地址（请见下方示例）。退信地址必须包含你的承诺名。您的承诺名是被逮捕官员在您入住该设施时根据拘留令上注明的使用的名字。请告知您的通信者不要使用绰号或化名寄信。如果您的姓有连字符，请确保您的收寄信件显示双姓。信封的退信地址部分以及所有收寄信件和刊物应填写如下信息： 您的承诺名和注册号 大都会拘留中心 P.O. Box 329002 布鲁克林，纽约11232 信纸、信封、笔和铅笔由大都会拘留中心提供，不得从外部来源获得。您可以从商店购买额外物品。您必须贴上正确的邮资。单元工作人员通过邮件部门将帮助您确定正确的邮资。各种面额的邮票可通过机构商店供应。邮票或盖有邮票的物品不能通过邮件收到。您不能购买或持有超过60张一等邮票。根据要求提供国际、认证、挂号、保险和回执的邮寄服务。如果您没有足够的资金购买邮票，请联系您的矫正顾问。 监狱中贫困囚犯的邮资邮票： 对于既没有资金也没有足够邮资，并且希望寄送法律邮件（包括法院和律师）或行政救济表格的囚犯，将为其提供相应的邮资邮票。为防止滥用此规定，监狱长可能对法律和行政救济邮件的寄送施加限制。（参见方案说明5265.11，信件） 囚犯之间通讯： 在获得批准的情况下，您被允许与另一名囚犯通讯。请与您的个案经理联系以获得适当的批准。若要这样做，您必须是直系家庭成员或共同被告（有正在进行的诉讼）。所有经批准的囚犯间通讯往来均会被打开和检查。 特殊邮件： “特殊邮件”是指发送给或来自律师、联邦和州政府选举官员、州惩教机构、联邦或州假释/缓刑机构以及新闻媒体代表等个人或机构的通讯。您有责任告知您的法律顾问或有法定邮件特权的机构有关接收“特殊邮件”的要求。接收的“特殊邮件”必须符合以下标准才能被处理为“特殊邮件”： -寄件人地址必须注明某位具有律师资格的个人律师的名字。如果是从律师事务所或办公室转寄过来的，必须说明具体个人律师的名字和职称。 -信封外部必须含有标注“特殊邮件-只能在囚犯面前开启”。 -您有责任在信封外清楚标注“特殊邮件”或“法律邮件”的字样，以便能够作为此类邮件进行处理。 囚犯每日星期一至星期五可由邮房工作人员从住房单位领取寄出的特殊/法律邮件。囚犯必须亲自将自己寄出的信件、特殊/法律邮件直接交到单元值班官员手中，放入法律信箱中。如果寄件人地址不准确，那么寄出的特殊邮件将不予处理，而会立即退还给囚犯。接收邮件的单元值班官员必须立即确认发送邮件的囚犯是否与信封中的寄件人地址一致。试图以其他囚犯的名义发送特殊/法律邮件的囚犯将受到纪律处分。囚犯可以在递交给单元值班官员处理之前，自行密封特殊/法律寄出的邮件，除非其中存在违禁品，否则信件不会被打开。 邮房工作人员将按照政策要求，从单元值班官员处定时收取特殊/法律邮件，邮件将被加盖邮戳，并进行处理。每位单元值班官员收集特殊邮件需维护一本出库特殊邮件的日志簿，工作人员需在其中记录邮件接收时间、囚犯姓名和登记编号、寄件地址、接收工作人员签名、邮政室工作人员签名，以及邮件领取时间和日期。如果信封外部正确标明了“特殊邮件”的字样，邮件将被盖上日期/时间戳，并在信封的背面加盖“特殊邮件”处理说明，以方便法院或您的法律顾问查阅。 来自联邦法官办公室或美国国会成员的邮件将获得特殊邮件处理，即使在信封上没有标注“特殊邮件”。符合特殊邮件处理要求的收件邮件将不会在邮房内开启，但会被记录并加盖日期/时间戳。单位工作人员会将其送至您手中，并在交付给您之前检查是否有违禁品。 隔夜或快递邮件： 联邦囚犯不能使用寄出隔夜邮件的特权。来自隔夜邮递的来信将被视为普通通讯处理。符合“特殊邮件”处理要求的来信会被与普通来信一样处理。 包裹流程： 除了正常邮件或经批准的出版物之外，您必须持有包裹接收许可证才能收到任何物品。可以从单位工作人员处获得“接收包裹许可证”表格。任何没有包裹接收许可的包裹在邮局或递送到机构时将不被接受，并会被退回给寄件人。 来信处置： 每日除周末和联邦节假日外，所有邮件都会在美国邮局每日取件。来信会在收到后的24小时内投递给囚犯群体；经批准的包裹则在48小时内处理。邮件投递在下午4:00的机构清点后在住房单位进行。 所有收到的囚犯一般通讯邮件均会被打开和检查。未经批准的物品（违禁品）会被移除并在寄回给寄件人的同时附有解释拒收的理由表格。您会在邮件投递后收到一份拒收通知的副本。 接收包裹的授权 表格可从单位工作人员处获取。任何未经包裹许可的包裹，在邮局或递送至该机构的包裹都将不被接受，并将退回给发件人。 进站邮件 所有邮件每天在美国邮局中取回，除周末和联邦假日。进站邮件将在收到后的二十四（24）小时内交付给囚犯群体；授权包裹将在四十八（48）小时内交付。周一至周五，4:00 p.m. 机构点名后，在住宿单位举行邮件分发。 所有进站的囚犯普通信件都会被打开并检查。未经授权的物品（违禁品）将被移除并连同解释拒绝的理由一起退回给发件人。您将在邮件分发时收到任何拒绝通知的副本。 常常被退回给发件人的“讨厌”违禁品示例包括： 邮票或盖邮戳的信封 未签名的贺卡 音乐贺卡 空白文具 未按出版商转发的报纸 报纸的完整版块 一个包裹中的过多书籍或杂志 双面拍立得相片 裸露的个人照片 塑料新奇物品 接收出版物 报纸、硬/软封面的书籍和杂志必须直接来自出版商、书店或读者俱乐部。您在手中或通过邮件收到的书籍数量不得超过五（5）本，杂志数量不得超过十（10）本。任何包含多个出版物的信封或包裹必须在外部清晰标注内容的性质。未经授权的包裹内含有未经授权的物品将被拒收，整个内容将被退回给寄件人。除非监狱收到包裹授权，否则所有其他包裹将被退回给寄件人。 联邦监狱中的囚犯不得接收包含色情内容的出版物。邮局收到的商业出版物，如果具有裸露或色情行为描述，将不予分发。有关色情商业出版物限制的更多信息，请参阅机构补充规定 5800.10E“邮件管理”。 您不得通过邮件收到裸露或半裸主体的个人照片，或者照片中描绘性暗示的行为。 隔夜快递邮件 联邦囚犯没有发出隔夜邮件的特权。收到的隔夜邮件将按照一般信件处理。符合“特殊邮件”处理要求的隔夜邮件将与非隔夜的“特殊邮件”一样处理。 包裹程序 您必须持有包裹许可证才能接收除常规邮件或经授权的出版物之外的物品。您可以向单位工作人员获取“接收包裹授权”表格。任何在邮局或送到此机构的包裹，如果没有包裹许可证，将不被接受并将退回给寄件人。 出庭服装 布鲁克林都市中心（MDC Brooklyn）将为您提供作为出庭服装穿着的具体服装。您可以向家人、朋友或律师等外部来源获取民用法庭服装，需事先经单位工作人员批准。未经事先批准的民用法庭服装将不被接受，您也不能在联邦法院期间更换服装。经授权的民用法庭服装将进行清点并存放在研究与发展（R&D）处。 囚犯电话 在MDC Brooklyn的每个住房单元都设置了囚犯电话。囚犯可以在白天和晚上使用这些电话。如果电话设备损坏或操作被滥用，机构可能会取消您的电话使用特权。联邦监狱管理局保留对这些电话进行监控和录音的权利。您使用机构电话即表示同意进行此监控。囚犯电话通话限制为每次十五（15）分钟，每月总计300分钟。 法律通话 如果囚犯希望进行未经监控的律师-客户通话，而不使用ITS系统，他/她必须向其小组团队成员提出代收律师电话的请求。囚犯需要说明为何通话不能在ITS时间段内进行。小组团队将审核该请求，如获批准，最终批准由单位经理给出，由单位经理指定的工作人员将在未经监控的电话上拨打代收律师通话。通话的进行取决于工作人员的可用性。 在律师拒绝接受代收电话的情况下，将在需要时进行按时计费的律师-客户通话。囚犯仍须提交一个按时通话请求，提供通话不能在ITS时间段内进行的解释。在囚犯填写BP-199《囚犯取款基金请求》表格，并核实囚犯有足够金额支付通话费用后，将进行按时通话。通话的进行也取决于工作人员的可用性。 电话访问代码（PAC） 您将被分配一个九（9）位电话访问代码（PAC）。PAC是您的保密代码。所有电话活动都必须使用PAC进行处理。如果您认为自己的PAC已被泄露，请立即联系您的单位顾问。禁止向其他囚犯分发该PAC。一旦您将资金转移到ITS账户，将无法将其退回到您的食堂账户。 当使用囚犯电话系统时，以下活动是禁止的，否则将受到纪律处分： 进行三方电话； 拨打转接到其他电话号码的电话，无论该电话号码是否在您批准的电话列表上； 在电话上讨论或从事任何业务相关活动。禁止用电话进行赌博，拨打赌博热线或讨论赌博赔率。主动交易股票、商品或任何有价值的物品，或指示他人这样做； 使用电话传递或转达另一囚犯的信息给第三方； 暗示任何威胁或通过电话用暗号与他人交谈； 使用其他囚犯的PAC号码； 参与电话会议。 电话限制 在电话限制期间尝试使用电话。 在与另一位囚犯通话后将电话递给其他囚犯或接受其电话。 使用电话联系志愿者、合同工人、工作人员或任何在中途之家或监督释放中的前囚犯。 未经工作人员授权，安排将任何有价值的物品寄给其他囚犯或囚犯家人。 最后，不能在电话上从事任何其他活动或行为，工作人员认为这是规避我们的政策和规定的努力。 资金收入 囚犯必须通知家人，所有寄给囚犯的资金都应邮寄到以下地址的锁箱处： 联邦监狱局 插入囚犯登记编号 插入囚犯姓名 邮政信箱474701号 爱荷华州得梅因市50947-0001 资金必须以汇票或政府支票形式收到。不接受个人支票。这些文件必须标明囚犯的姓名和登记编号。囚犯也可以通过西联汇款将资金存入他们的食堂账户。应遵循以下流程： 必须使用西联汇款快速收款表格。 金额：填写 收款对象：囚犯登记编号和姓氏 城市代码：FBOP 州：DC 发件人姓名：填写 发件人电话区号和号码：填写 发件人地址：填写 发件人城市、州和邮政编码：填写 客户签名：须由发件人签署。 资金将在发送后最迟2-4小时内可供囚犯使用。发件人需支付9.99美元手续费。 衣物和床上用品发放/交换及洗涤 囚犯抵达机构时，将从接待和分发处获得初始的衣物套装。通常在囚犯住在G41时，将会从洗衣部门获得其余的衣物。 床单和床上用品 抵达MDC布鲁克林时，每位囚犯将由接待和分发官员发放以下物品。这些物品将被视为所有入狱囚犯使用的标准配发物品。 一条毛毯 一个枕套 两块洗脸布 两条床单 两条毛巾 这些物品不得用作地板垫，并且不得更改。违反这些规定可能导致事件报告。 探访时间 周一至周五和节假日的探访时间为下午12:00至晚上7:45。周六和周日探访时间为上午8:00至下午3:00。探访开始和结束时可允许短暂拥抱和亲吻。超过此范围的身体接触将不被允许，并且将是终止探访的理由。 探访信息 所有访客必须列在您的批准访客名单上。如果您的直系家庭成员姓名与您的姓名不匹配，您必须提供文件（出生证明、结婚证书）以核实关系。在提供与孩子关系的出生证明和BP-629访客信息表后，您的孩子的母亲和父亲将被允许作为直系家庭探访。这些表格必须直接寄给您的单元矫正辅导员。在访问名单上没有潜在访客的情况下，将导致探访被拒绝。每个单元的探访时间和安排均张贴在单元布告栏上。 到达大都会拘留中心的路线 皇后高速公路（BQE），在39th街出口，继续到第四大道，左转。沿第四街向北，左转到第三大道。右转到第三街。向北右转到第二大道，继续向北到32nd街。左转到32nd大道，然后右转到32nd街。再左转到第二大道。 当地交通 纽约市公交车B37在第29街和第三大道停靠。 纽约市地铁N或R列车到25街；向南步行四个街区，右转到29街，再向前走一个街区到第100号29街。 外州前来参观方向： 来自新泽西南部和费城： 从新泽西州立公路南行到出口13号Goethals桥/维拉扎诺桥（I-278）经维拉扎诺桥后下92街出口。在92街左转，然后右转4街，右转第2大道，左转第3大道。 许可的着装要求： 参观者应穿着既不挑逗也不诱人，以免对机构的正常运行造成干扰。不允许穿着具有性暗示或暴露的服装。除婴儿外，不允许赤脚。不允许穿着类似于监狱服装的衣物，例如卡其或绿色军事类型的服装。以下服装被禁止： 短裤（12岁以下的儿童除外） 无袖上衣（婴儿和12岁以下的儿童除外） 运动裤、运动衫、太阳裙、内衣、包裙、露脐装、低胸上衣或低胸裙子。 吊带衫、泳衣或露背上衣 帽子、帽子、发带或头巾 弹性裤、紧身裤或带有明显破洞的服装 大衣、冬季夹克或防风外套 任何类似于监狱或工作服的服装 具有性暗示、暴露或半透明的服装 无论是囚犯还是访客都必须穿着得体。 需要身份证明： 所有访客必须提供适当的身份证明（驾驶执照、护照等），方可进入。身份证上的姓名必须与访客名单上的姓名完全匹配，否则可能被拒绝参观。身份证可能会被扫描以核实真实性。持有篡改或伪造身份证明的访问者将被拒绝进入机构。进入机构的访客可能会接受搜查。任何拒绝搜查或拒绝签署《18号法典》（英文或西班牙文）声明的人将被拒绝进入机构。访客的所有携带物品将被搜查。访客必须在工作人员面前签署此表格。访客必须在所有物品被搜查时在场。访客可能会接受手持金属探测器和毒品检测设备检查。探监处官员将不为访客或囚犯存储任何物品。 第1001节，《18号法典》规定，“做出虚假声明的处罚是不得超过25万美元的罚款或不得超过五年的监禁，或二者兼有。”此外，第1791节，《18号法典》规定，任何人将在未经监狱或惩教机构典狱长知情同意的情况下，将物品引入或试图引入监狱或惩教机构场地内，或把物品带离，或试图寄送物品，将处以长达20年的监禁。 儿童特殊规定： 囚犯有责任确保其访客的行为得体。囚犯及其访客对其子女的行为负责。未进行得体访问的将会被终止。 特殊访问： 特殊访问或“延长访问”可能会在指定的探监日获得批准，必须经队长和单元经理预先批准。特殊访问不得用于规避对访客进行背景调查的要求。 未经授权物品： 婴儿车、载体、尿布袋、食物、荧光笔、报纸、杂志、相机、手机或任何其他电子/录音通信设备。前台不允许食物和饮料。探监室内设有自动售货机。访客不得通过探监带任何东西给囚犯。 授权物品： 一个小透明包、面额不超过5.00美元且总额不超过25.00美元的钱。探监期间所需数量的药物。两（2）片尿布、湿巾、一个（1）套婴儿衣服、两（2）小罐密封透明婴儿食品（不得使用玻璃容器）和一个（1）条毯子。 食品服务部门： 食品服务部门每周七天、每天三餐为机构准备食物，通过利用一组囚犯工作人员来提供。除了主餐外，根据卫生服务部门认为必要提供的医疗所需餐，如糖尿病托盘。 前厅不允许携带食物和饮料。探望室内有自动售货机可用。探访者不能通过探访途径为囚犯携带任何物品。 被授权携带物品包括： 一个小号透明手提包，面额不超过5美元且总额不超过25美元的钱。探访期间所需的药物数量。两片尿布，湿巾，一套婴儿衣物，两个小份封装好的婴儿食品（不得使用玻璃容器），一条毯子。 食物服务部门： 食物服务部门每天为全院提供三餐，七天在使用囚犯工作组。除了主食外，根据卫生服务部门的要求提供医疗所需餐，如糖尿病餐。为满足所有囚犯的宗教饮食限制，提供常规餐（要加入常规饮食计划，请向牧师提交请求）。 为要求素食饮食的囚犯提供无肉餐（要加入无肉饮食计划，请向食品服务管理员提交请求）。周一到周五，早餐6:00提供，午餐11:00提供，晚餐在下午4:00点清点后提供。周末餐饭时间安排为早餐6:45提供，早午餐11:30提供，晚餐在清点后提供。 DNA检测 公共法案106-546要求联邦监狱局（BOP）从被判犯有符合条件的联邦罪名的囚犯那里获取DNA样本。如果您被判有罪，您可能会被您所在单位的团队通知需要提供样本。该团队将提供有关符合条件的当前或过去罪行、采集过程、不遵从的后果以及有关该法律实施的任何疑虑的信息。 拒绝医疗治疗 所有患者有权拒绝任何作为知情同意的一部分所提供或推荐的医疗治疗。如果您拒绝推荐的医疗检查或治疗，这将被记录下来。您将被要求签署一份拒绝治疗表格，表格将解释这种拒绝可能造成的后果和并发症。如果您拒绝签署此表格，工作人员将签署此表格以证明您拒绝签字。您有权接受有关您拒绝可能导致的不良后果的咨询。 牙科服务 预审和留置的囚犯只会接受紧急牙科治疗。如果您有牙科紧急情况，请在单位的病号呼叫列表上报名。 囚犯医疗费用分担计划 根据2000年《联邦囚犯医疗费用分担法》（P.L. 106-294, 18 U.S.C. § 4048）的规定，联邦监狱局通知囚犯医疗费用分担计划，该计划自2005年10月3日起生效。 如果您在请求医疗服务时接受与您请求的医疗服务相关的健康护理，您必须支付每次医疗访问的2.00美元费用，费用将从您的囚犯商店账户中收取。这些请求的预约包括病号呼叫和在下班后请求看医疗提供者。 如果您通过听证会程程序被认定为对另一囚犯造成伤害并导致该囚犯需要医疗访问，您必须支付每次医疗访问的2.00美元费用，费用将从您的囚犯商店账户中收取。 如果您被认为是贫困囚犯，将不从您的囚犯商店账户中扣除费用。 非处方药品计划 建立了一个计划，使囚犯可以更容易获得非处方药品，将这些药品放在商店出售，并改进医疗资源的分配，以便满足囚犯的医疗需求。囚犯将在监狱商店获得非处方药品。囚犯可以使用个人资源购买用于化妆、一般卫生问题或轻微医疗症状的非处方药品。 在医疗部门初诊/病号呼叫期间，医护人员将根据与化妆、卫生问题或轻微医疗症状有关的投诉，将囚犯转诊到商店。 病号呼叫程序 囚犯必须填写医疗问题的病号呼叫表格，并将其放入单位的病号呼叫箱中。每周一至周五早上，医师助理（PA）将收集病号呼叫表格。医疗人员审核病号呼叫表格后，将安排囚犯预约看病。 紧急病号呼叫 如果您在正常病号呼叫时间之后或在周末和节假日需要医疗或牙科服务，您必须让单位官员或工作细节主管联系卫生服务。如果医生认为有必要并且时间允许，会满足您的要求。 药物处方 需要处方药物时，需要在中午服用药物容器后提交申请（11:30-12:30小时）。药品补充处方将在晚间服药线时发放。由于医疗预约而需要的处方药物将被配药并分发给您。在申请药物处方补充时，您必须提交带有标签的药物容器以供药剂师使用。 限制药物服用时间 每天药物将在以下时间在单位送到： 早上5:00 - 6:45 上午9:00 - 11:00 晚上7:00 - 10:30 在“服药线”时，囚犯必须出示他们的监狱身份证才能领取药品。 卫生保健权利和责任 在联邦监狱局的监管下，您有权以认可您基本人权的方式接受卫生保健服务。同时，您也接受合作与您的卫生保健计划，并尊重您的卫生保健提供者的基本人权。 疼痛治疗中患者的权利和责任 作为患者，您可以期待： 权利 相信您疼痛的描述。 关于疼痛和疼痛缓解措施的信息。 致力于疼痛预防和管理的关心员工。 对疼痛描述的迅速回应的健康专业人士。 我们期待您： 责任 询问您的医生或护士有关疼痛管理的预期。 与您的医生和中级提供者讨论疼痛缓解选择。 与您的医生和中级提供者一起制定疼痛管理计划。 在疼痛刚开始时要求缓解疼痛。 帮助您的医生和中级提供者评估您的疼痛情况。 告诉您的医生或中级提供者如果您的疼痛没有得到缓解。 告诉您的医生或中级提供者您对服用止痛药物的任何担忧。 权利： 您有权根据您所在机构的相关程序访问医疗保健服务。健康服务包括医疗求诊、牙科求诊以及所有支持服务。如果您所在机构实行罪犯共付制度，由于个人资金不足而无法支付您的医疗保健费用时，不能因此拒绝提供健康服务。 您有权了解您的医疗保健提供者的姓名和专业资质，并且应受到尊重、体贴和尊严对待。 您有权向机构工作人员的任何成员提出关于您健康保健的任何顾虑，包括医生、卫生服务管理人员、您所在单元团队成员、副监狱长和监狱长。 您有权向联邦监狱局提供预先指示或生前遗嘱，这些文件将在您被送往医院住院治疗时为联邦监狱局提供指示。 您有权获得有关诊断、治疗和预后的信息。这包括被告知与预期结果显著不同的健康保健结果的权利。 您有权获取健康记录的可发布部分的复印件。 您有权受到私密检查。 您有权参与健康促进和疾病预防计划，包括关于传染病教育的计划。 您有权向健康保健提供者报告疼痛问题，及时并符合医学标准地评估和管理您的疼痛，获得有关疼痛及疼痛管理方式的信息，以及有关疼痛治疗的限制和副作用的信息。 您有权按照处方医疗提供者的建议，及时接受处方药物和治疗。 您有权获得健康营养食品。您有权获得关于健康饮食的指导。 您有权要求进行例行体格检查，根据联邦监狱局政策规定（如果您年龄在50岁以下，每两年一次；50岁以上，每年一次，并在您释放前一年内进行）。 您有权获得根据联邦监狱局政策定义的牙科护理，包括预防服务、急救服务和常规护理。 您有权获得一个安全、清洁和健康的环境，包括无烟居住区。 您有权按照联邦监狱局政策拒绝医疗治疗。拒绝接受某些传染病诊断检测可能导致对您采取行政措施。您有权接受关于拒绝医疗治疗可能带来的负面影响的辅导。 责任： 您有责任遵守您所在机构的健康保健政策，并遵循医疗保健提供者为您制定的推荐治疗方案。您有责任为您自己发起的任何健康保健接触支付确定的费用，不包括紧急护理。您还将支付为任意故意伤害或伤害其他任何罪犯提供护理的费用。 您有责任将这些提供者视为专业人员并遵循他们的指示以维护和改善您的整体健康。 您有责任以被接受的格式提出您的顾虑，比如向工作人员提交罪犯请求表格、打主线电话或遵循被接受的罪犯申诉程序。 您有责任向联邦监狱局提供准确信息以完成此协议。 您有责任保密这些信息。 您有责任熟悉当前政策并遵守这些政策以获取这些记录。 您有责任在检查过程中如有需要，应遵守安全程序。 您有责任维护您的健康，不要参与可能导致传播或感染传染病的活动，以免危害自己或他人。 您有责任与您的健康保健提供者诚实沟通您的疼痛和对疼痛的顾虑。您也有责任遵守处方的治疗计划和医疗限制。您有责任及时告知您的提供者您状况的积极和消极变化，以确保及时跟进。 您有责任对您的健康保健提供者诚实，遵守处方治疗并遵从处方指示。您也有责任不向任何其他人提供您的药物或其他处方物品。 您有责任健康饮食，不滥用或浪费食物或饮料。 您有责任通知医护人员您希望接受体格检查。 您有责任保持口腔卫生和健康。 您有责任保持个人和公共区域的清洁和安全，考虑他人的健康。您有责任遵守吸烟规定。 您有责任告知卫生服务部门任何因您拒绝治疗而引起的不良反应。您还应接受签署拒绝治疗表格的责任。 心理服务 MDC布鲁克林分院的心理学部为那些有精神疾病史并在监禁环境中难以适应的囚犯提供心理健康服务。工作人员被分配到各个楼层，以加快对囚犯的心理健康问题处理。在非紧急情况下，囚犯需要向心理学部提交“囚犯请求与工作人员见面”的表格。对于精神病患者的药物通常会在入监时继续使用。如果有需要精神药物，囚犯将被列入看精神科医生的名单。 自杀预防 在监狱或监狱中经历抑郁和绝望并不罕见，特别是对于那些新近被监禁、正在服刑、遇到家庭问题或与其他囚犯相处困难、接收到坏消息的人。有时，囚犯会考虑自杀，原因是他们遭受的所有损失和所承受的压力。员工经过培训，会监测囚犯是否存在自杀的迹象，并将所有担忧转交给心理学部。然而，员工并非总能意识到囚犯所看到的。如果你个人经历了上述任何问题，或者你或其他囚犯显示出抑郁的迹象，请立即告知一名员工。抑郁表现为悲伤、频繁哭泣、不再喜欢平常的活动、退缩（远离他人、拒绝接听电话或拜访）、自我贬低、自责、或者绝望（送东西、声称“活着已无意义”）。你的言论可能挽救一条生命。 性虐待/侵犯预防和干预 什么是性虐待行为？ 根据2003年的《监狱强奸消除法案》，性虐待行为被定义为： 强奸：违背一个人的意愿强制进行的性交、口交、用物体进行性侵犯或性抚摸；不违背一个人意愿进行，但由于青少年或暂时或永久的精神或身体能力缺陷而无法获得同意的性交、口交、用物体进行性侵犯或性抚摸；或通过利用恐惧或恐吓的威胁进行的性交、口交、用物体进行性侵犯或性抚摸。 性交：阴茎与阴道或阴茎与肛门之间的接触，包括任何形式的渗透，无论多么微小。 口交：口与阴茎、口与阴道或口与肛门之间的接触。 用物体进行性侵犯：使用任何手、指、物体或其他器械去贯穿另一个人身体的生殖器或肛门开口，无论多么微细（注：这不包括在搜集证据或进行合法医疗治疗中从事这项活动的看管人员或医疗人员，也不包括卫生保健提供者为了维护监狱内部安全进行身体腔体检查）。 性抚摸：触碰他人的私密部位（包括生殖器、肛门、腹股沟、胸部、大腿内侧或臀部），以获得性满足为目的。 性行为不端（仅限员工）：使用淫秽的性语言、手势或以性满足为目的的视觉监视。 注意：即使两名或多名囚犯之间的性行为或接触没有引起异议，这种行为是被禁止的，且可能属于非法行为。即使双方没有提出异议，囚犯与员工之间的性行为或接触始终是被禁止和非法的。 你有权远离性虐待行为 在你被监禁期间，没有人有权力强迫你参与性行为。无论你的年龄、体型、种族、民族或性取向如何，你都不必容忍性虐待行为或被迫参与不愿意的性行为。 预防性虐待行为中你的角色 以下是一些可以保护自己和他人免受性虐待行为的方法： 随时保持自信的姿态。不要让你的情绪（恐惧/焦虑）显露给他人。 不要接受他人的礼物或好意。大多数礼物或好意都是有附加条件的。 不要接受另一名囚犯成为你的保护者的提议。 找到一位你感到舒适可以讨论恐惧和担忧的员工。 保持警惕！不要使用违禁物质，如毒品或酒精；这些会削弱你保持警惕和做出正确判断的能力。 如果其他人要求你做你不想做的事情，要直接且坚定。不要向其他囚犯传达关于你对性活动意愿的混乱信息。 保持在监狱内良好照明的区域。 如果你感到害怕或觉得受到威胁 如果你感到害怕或觉得受到威胁或者受到压力要参与性行为，你应该与工作人员讨论你的担忧。因为这可能是一个难以讨论的话题，一些员工，比如心理学家，经过专门培训，可以帮助你处理这方面的问题。 如果你感到立即受到威胁，请接近任何工作人员并寻求帮助。确保你的安全是他/她的工作的一部分。 如果你遭受性侵犯 如果你成为性虐待的受害者，你应该立即向工作人员报告，他们会为你提供保护，指导你接受医学检查和临床评估。为了获得帮助，你无需指认囚犯或工作人员施暴者，但具体信息可能会让工作人员更容易知道如何最好地应对。即使你可能想在遭受袭击后清洗，但在淋浴、洗涤、饮食、更换衣服或使用厕所之前，看医护人员非常重要。医护人员会检查你是否有你可能没有察觉到的伤害。他们还可以检查你是否感染性疾病，如果需要的话，检查你是否怀孕，并收集任何性侵犯的物证。只有将对囚犯进行性虐待或性侵犯的个人举报，他们才能受到处分和/或起诉。 举报性虐待行为事件 如果你遭受性侵犯，告知一个工作人员是非常重要的。如果你目击了性虐待行为，告知工作人员同样重要。你可以告诉你的病例经理、牧师、心理学家、SIS、狱长或任何你信任的其他工作人员。联邦监狱局（BOP）的工作人员被指示保密举报信息，并仅在涉及囚犯受害者的福祉以及执法或调查目的的情况下，根据需要向相关官员讨论。 如果你不愿意与工作人员交谈，还有其他途径可以保密举报性虐待行为。 直接写信给狱长、地区主任或局长 你可以给狱长送去一封囚犯请求给工作人员的信（Cop-out），或者一封举报性虐待行为的信。你也可以给联邦监狱局的地区主任或局长写信。为了保密，请使用特殊的邮寄程序。 提出行政申诉 你可以提出行政救济请求（BP-9）。如果你认为你的投诉对狱长来说过于敏感，你可以直接向地区主任提出行政申诉（BP-10）。你可以从你的顾问或其他监仓工作人员那里获取表格。 写信给总检察长办公室（OIG） 总检察长办公室调查工作人员不当行为的指控。OIG是司法部的一个部门，不属于联邦监狱局。地址是： 总检察长办公室 邮政信箱27606 华盛顿特区20530 了解调查过程 一旦性虐待行为被举报，联邦监狱局和/或其他适当的执法机构将进行调查。调查的目的是确定虐待行为的性质和范围。在调查过程中，你可能会被要求做口供。如果提起刑事诉讼，你可能会被要求在刑事诉讼过程中作证。 为性虐待行为受害者提供的心理咨询计划 大多数人需要帮助来从性虐待行为的情绪影响中恢复过来。如果你是性虐待行为的受害者，不管是最近发生还是过去的，你都可以寻求来自心理学家或牧师的心理咨询和/或建议。危机咨询、应对技能、自杀预防、心理健康咨询和精神咨询都对你开放。 针对施暴者的管理计划 那些在联邦监狱局监禁期间性虐待/侵犯他人的人将受到最严厉的处分和起诉。你将被转介到心理服务进行风险评估和治疗管理需求。是否遵守治疗或拒绝治疗将被记录下来，并且可能会影响你的拘留条件和释放。如果你觉得自己需要帮助来避免参与性虐待行为，心理服务是可以提供的。 联邦监狱局政策定义 禁止行为 囚犯如果与他人有不当的性行为或对他人有性行为方面的指导，将被控以囚犯纪律政策下的以下禁止行为。 员工不当行为 《员工行为准则》禁止员工参与或允许他人参与性、淫秽、亵渎或辱骂性语言或手势，以及对囚犯进行不当的视觉监视。为了换取性恩惠而影响、承诺或威胁囚犯的安全、看管、隐私、住房、特权、工作细节或项目地位也是被禁止的。 联系办公室 美国司法部 - 总检察长办公室区域办事处 办公室名称 地址 美国司法部 - 总检察长办公室地区办公室： 办公室名称 地址 中央办公室 华盛顿特区宾夕法尼亚大街950号, 西北区4322室, 邮编20530-0001 中部大西洋地区办公室 马里兰州安纳波利斯结合处10010号, 100-N室, 邮编20701 北部中部地区办公室 堪萨斯州堪萨斯城州大道400号, Gateway Complex Tower II, 8楼, 邮编66101-2492 东北地区办公室 宾夕法尼亚州费城第二街和栗子街, 美国海关大楼, 7楼, 邮编19106 中南部地区办公室 德克萨斯州达拉斯西雪普路4211号, 300室, 邮编72519 东南部地区办公室 乔治亚州亚特兰大北坎普克里克大道3800号, SW大楼2000, 邮编30331-5099 西部地区办公室 加利福尼亚州都柏林都柏林大道7950号, 3楼, 邮编94568 教育部门：法律文件的复制 为了复制法律文件的副本，囚犯可以在主要法律图书馆中使用复印机。囚犯需要从商品部购买复印卡才能使用这些机器。对于那些被关在单独禁闭单位（SHU）的囚犯，教育人员会定期提供并收集请求表格。对于单独禁闭单位的囚犯，可以通过填写BP-199表格免费查看法律文件或购买复印件，每份15美分。 贫困囚犯 - 法律文件的复制 如果待复制的材料较少，且复制请求不大或过多（超过20页），教育部门工作人员可以为贫困囚犯免除复制费用。如果没有资金的囚犯提出了大量复制请求，则需提交“囚犯请求给员工”给教育主管。教育主管将审查该请求，并在有需要时与法律部门和法院书记商讨，以批准确实需要的复印件。 教育/娱乐部门的使命是提供法律规定的强制识字和英语作为第二语言（ESL）课程，以及满足囚犯群体需求和兴趣的其他教育/休闲和相关课程，为囚犯提供积极利用时间的项目选择，促进成功重新融入社区。 暴力犯罪控制和执法法案以及《监狱诉讼改革法案》（VCCLEA/PLRA）规定，美国公民且犯罪行为发生在1994年9月13日至1996年4月26日期间，且缺乏高中文凭的囚犯，需要参加并取得GED证书以获得良好表现时间。 性犯罪代码 代码 描述 性犯罪代码表 代码 描述 101/(A) 性侵犯 205/(A) 从事性行为 206/(A) 提出性建议 221/(A) 与异性成员在未经授权的区域内 300/(A) 猥亵行为 教育项目 在考虑囚犯是否有资格获得最大数量的GCT时，局方将考虑犯罪日期在1996年4月26日或之后的犯人，如果他们缺乏高中学历，是否参与并取得了获得GED学历方面的满意进展。强制注册期为240小时。GED验证在犯人提供原始证书或官方GED成绩，或在判决前调查报告中官方验证成绩之时确立。 英语作为第二语言（ESL）（强制项目） ESL是1990年犯罪控制法案实施的强制项目。该法案规定了所有英语能力有限的被判囚犯必须参加至少240个教学小时的ESL项目，或直到达到八年级水平。 给囚犯提供了各种教育项目。课程表会张贴在单位的教育布告板上。如果您对日程表上列出的任何课程感兴趣，请向教育部提交《囚犯向工作人员提出请求》表格。 主要和基本法律图书馆 休闲图书馆和法律图书馆每周七天开放。周一至周五上午8:00至下午3:30开放。对于工作组囚犯，晚上5:30至8:30重新开放。星期日，西侧的图书馆将从上午7:45至下午3:45开放。 请注意，法律图书仅供参考，不得由任何原因从法律图书馆中拿走。拿走法律图书和参考资料将导致纪律行为。教育部设有复印机。囚犯可以购买一张复印卡，从商店购买后可使用复印机。仅可以通过《资金提取申请》表格来复制最近（30天内）入狱的囚犯以及可能错过商店购物的其他特殊情况（例如，法庭日期、医院行程等）。每份复印件价格为十五美分。休闲图书可以在各楼层的图书馆会话期间检出。被隔离监禁的囚犯可以通过适当的请求表格要求休闲图书。 抵达MDC布鲁克林的囚犯将被安排进行教育面试，以及根据需要进行测试。面试对所有囚犯来说是强制性的。在面试中将确定您个人的计划需求。如果对教育项目有任何疑问，请咨询教育工作人员。 娱乐活动 囚犯在不执行分配职责时可以享受各种休闲活动。休闲活动包括参加组织和非组织的游戏、健康活动、课程内外活动、体育、社交活动、艺术作品、体能训练、桌上游戏和棋类游戏。娱乐员工可提供帮助，规划和组织娱乐活动。有关娱乐活动的行为规则如下： 在娱乐区举行活动时，主队要对观众的行为负责。 在任何时候与裁判争论都是被禁止的。 被驱逐时必须立即离开该区域。 观众在任何时候不得进入球场/赛场。 行为规则不容许协商或个人解释。 裁判的判定是最终的，只有在极端情况下才能被推翻。 队伍可能因观众和/或队员的不当行为而被处罚，并可能因此放弃比赛。 宗教服务 MDC布鲁克林提供全面的宗教服务项目。全职牧师协调囚犯中不同信仰群体的各种宗教活动。合同牧师和志愿者进一步丰富了不同宗教群体的服务。 每个宗教信仰都会举行主要的每周仪式，可能会在一周内的其他时间举行经文研读或祷告会。 每个囚犯必须在SENTRY上声明一个“宗教偏好”，作为他档案的一部分。只有那些宗教偏好需要的囚犯才能享受某些宗教实践或程序；例如，宗教头饰、工作日、认证食品计划饮食和年度仪式餐。 我们教堂的使命是满足所有信仰的基本宗教需求。我们鼓励在友谊和合作的环境中，不同宗教传统之间的尊重和宽容。 提供的服务： 所有信仰群体的宗教时间表。 鼓舞人心的图书馆、视频、录音磁带和其他学习辅助工具。 辅导或咨询 - 与牧师联系安排会议。 社区资源 - 志愿者、宗教团体。 承包的牧师和志愿者进一步丰富了不同宗教团体的服务。 每种宗教信仰都会举行一次主要的每周礼拜，并可能在本周的其他时间举行经文研读或祈祷会议。 每位囚犯必须声明自己的“宗教偏好”，并作为其档案的一部分包含在SENTRY中。只有那些宗教偏好要求的囚犯才能享受特定的宗教习俗或程序；例如，宗教头饰、休息日、认证食品计划饮食和年度仪式性餐饮。 我们礼拜堂的使命是满足所有信仰的基本宗教需求。我们鼓励尊重与宽容，创设一种友谊和合作的环境，使不同宗教传统得以融洽共处。 提供的服务包括： 所有信仰团体的宗教时间表。 供灵感的图书馆、视频、磁带和其他学习辅助工具。 辅导或咨询 - 与牧师联系安排会议。 社区资源 - 志愿者、宗教团体。 牧师探访 - 牧师可能授权你的牧师、伊玛目、拉比、牧师或信仰代表按照方案说明与你会面。 宗教物品/物品 所有宗教物品必须通过特别采购订单（SPO）流程购买。宗教物品不能从家里寄来。 个人财产 所有个人财产将保持在规定的数量。个人物品必须始终保持整洁有序。以下是特定个人物品的要求：所有服装将存放在储物柜内，除了脏衣物在洗衣袋内、外套和鞋子。不放在储物柜内的洗衣、外套和鞋子应始终保持整洁有序。 由于火灾、安全和卫生规定 每个囚犯房间内最多只允许放置五（5）本书、三（3）本杂志和一（1）份报纸。除非被房间占用者使用或阅读，否则任何书籍、杂志或报纸都不得公开展示。 任何物品均不得存放在床垫下。任何时候都不得将任何木材、纸张、塑料或纸板盒等物品带到任何供囚犯使用的区域。在未经特别批准的情况下，任何囚犯区域内都不得对任何实体设施或固定装置进行更改。囚犯应检查自己的居住区域，并遵循所列的所有指南。如果有任何需要纠正的问题，请向适当的工作人员报告。 卫生是监狱局的一个主要关注领域。纽约布鲁克林维托都会拘留中心的卫生将严格执行。每个单元都将有指定的整洁工负责保持单元的公共区域清洁。保持卫生水平高有助于消除灰尘、污垢和导致细菌滋生的微生物。 囚犯纪律 该机构的政策和责任是为工作人员和囚犯提供一个安全有序的环境。为了实现这一目标，有必要建立程序来处理那些违反机构规章制度的个人。所有被提交到这个设施的囚犯都将受到这些程序的约束。 当工作人员目睹违反机构规章制度的行为，或者有合理相信发生这种违规行为时，将提交一份事件报告，或者工作人员可以尝试以非正式方式解决此事（取决于事件的严重程度）。如果工作人员提交了事件报告，中尉或指定的人员将进行调查。 被发现携带电子通讯设备或相关设备的囚犯可能会被指控违反第108条《危险工具的持有、制造或引入》或第199条（与第108条相似的条款），如果发现犯有被禁止行为，则将受到可用处罚的制裁。 单元纪律委员会（UDC） 中尉在某些情况下可能会尝试以非正式方式处理事件。如果非正式解决失败或不被认为合适，中尉将处理事件报告并在调查完毕后将其转发给单元纪律委员会（UDC）。UDC可能由两名或更多的单元工作人员组成，有权对轻微违规行为施加处罚。UDC可能决定某一违规行为需要更严厉的处罚，并可能将报告转发给纪律听证官（DHO）进行听证。 纪律听证官 DHO是一名持证官员，负责进行纪律听证。如果你的案件经DHO审理，将进行正式的听证。如果发现你有违规行为，DHO将对你进行处罚。你将被通知听证日期，并有充分的时间准备。 所有纪律行为的上诉均可通过行政救济程序进行。UDC的决定可以通过BP-9行政上诉表进行上诉。DHO的决定可以通过BP-10行政上诉表进行上诉。 违禁品 违禁品被定义为未经监狱商店购买、机构发放或监狱管理局授权保留的任何物品。 FBI转介 公共部门的法律也适用于该机构。任何行为，包括使用/持有武器、麻醉药品、劫持、越狱企图、袭击、强奸或对他人造成即将发生的危险的区域，都可能引起FBI介入。结果可能包括额外的联邦指控。 我们强烈建议您阅读并熟悉《5270.7囚犯纪律和特殊收容单元项目说明书》，并熟悉您在该体系下的权利和责任。 附件中将列出违规行为清单以及您的权利和责任。如果违反这些规定，您可能会受到纪律处分。 违规行为和纪律严重程度评定 最高类别 UDC应将所有最高严重性违规行为转交给DHO，并提出适当处理建议。 囚犯违规行为和处罚 编号 违规行为 处罚 001 持有违规物品 禁闭30天 002 袭击其他囚犯 单独监禁60天 003 挑起囚犯间纠纷 限制食物供应7天 004 从事非法交易 排除参加社区活动 005 故意破坏设施 财产赔偿并禁闭45天 囚犯违规行为和制裁 代码 违规行为 制裁 100 谋杀 A. 建议废止或延迟假释日期。 B. 放弃已获得的法定良好时间或未获得的纪律良好时间（高达100%），并/或终止或不允许额外的良好时间（额外的良好时间或纪律良好时间制裁不得被暂停）。 101 袭击任何人（包括性侵）或对监狱安全边界进行武装袭击（在这一级别，对袭击任何人提出指控仅在囚犯企图或实施严重身体伤害时使用） 禁止行为和制裁 低、中、高安全级别和行政机构 102 逃脱押送；从安全机构（低、中、高安全级别和行政机构）逃脱；或者在最低级别监狱以暴力逃脱。 B.1 取消通常年度50%至75%（27-41天）的良好表现时间信用（良好表现时间制裁不得暂停执行）。 103 纵火（只有在发现对生命构成威胁、对重大身体伤害构成威胁，或者为了进行最严重禁止行为，例如为了暴动或逃脱而被指控此类行为时，才属于此类别；否则，该指控应正确分类为代码218或329）。 104 拥有、制造或引入枪支、火器、武器、尖锐工具、刀具、危险化学品、爆炸物或任何弹药。 105 暴动 106 鼓励他人暴动 107 劫持人质 C. 纪律转移（建议执行）。 D. 纪律隔离（最长60天）。 E. 进行经济赔偿。 F. 扣留法定良好时间（注意 - 可以与A至E项同时执行 - 但不能是唯一执行的制裁）。 G. 丧失特权（注意 - 可以与A至E项同时执行 - 但不能是唯一执行的制裁）。 108 拥有、制造或引入危险工具（最有可能用于逃逸或逃逸企图，或者作为能对他人造成严重身体伤害的武器；或者对机构安全或个人安全构成危险的工具，例如锯条）。 109 （不可使用） 110 拒绝提供尿液样本或参加其他药物滥用检测。 111 引入任何未经医疗人员开具处方的麻醉品、大麻、毒品或相关器械。 112 使用任何未经医疗人员开具处方的麻醉品、大麻、毒品或相关器械。 113 拥有任何未经医疗人员开具处方的麻醉品、大麻、毒品或相关器械。 197 使用电话进行犯罪活动。 198 干扰工作人员履行职责。（行为必须具有极端严重性质。）此指控仅可在其他最严重指控不适用时使用。 199 干扰或扰乱监狱或联邦监狱管理秩序或安全运作的行为。（行为必须具有极端严重性质。）此指控仅可在其他最严重指控不适用时使用。 高级别类别 禁止行为和相应制裁表 代码 禁止行为 制裁 1 藏匿非法物品 可能被禁闭、处罚搬动或剥夺特权 2 违反规定的物品或服饰 可能被没收或罚款 3 捣乱或制造噪音 可能被禁闭或罚款 4 拒绝服从命令 可能被禁闭或罚款 5 越狱企图或逃跑 可能被加重处罚、禁闭或削减假释资格 6 攻击其他囚犯或狱警 可能被加重处罚、禁闭或单独关押 7 毁坏公共财产 可能被罚款、加重处罚或赔偿 8 赌博 可能被禁闭、没收赌资或罚款 9 持有违禁品 可能被没收、罚款或加重处罚 10 自残或自杀企图 可能被加重处罚、监控或转移至心理健康单位 禁止行为和制裁 代码 禁止行为 制裁 200 从无人监护的社区项目和活动以及开放式机构（最低安全级别）以及在非安全设施外逃跑，不使用暴力 制裁 A-G 201 与他人打架 H. 更换住房（宿舍） 202 （备注） I. 从项目和/或小组活动中移除 203 威胁他人肢体伤害或其他任何犯罪行为 J. 失去工作 204 敲诈、勒索、保护：要求或接收金钱或其他有价值物品以换取对抗他人的保护，以避免身体伤害，或受到举报威胁 K. 扣押服刑人员的个人财物 205 从事性行为 L. 没收违禁品 206 对他人进行性提议或威胁 207 佩戴伪装或面具 208 拥有任何未经授权的锁具或撬锁工具，或篡改、阻挠任何锁具设备（包括钥匙），或破坏、篡改、干扰、不当使用或损坏任何安全设备、机制或程序 209 任何食物或饮料的掺假 210 （不应使用） 211 持有任何官员或工作人员的制服 212 参与或鼓励集体示威 213 鼓励他人拒绝工作，或参与工作停工 214 （不应使用） 215 将酒精带入监狱管理局设施 216 向官员或工作人员提供贿赂，或任何有价值的东西 217 向任何人提供金钱，或从任何人那里接收金钱，用于引入违禁品或其他非法或禁止用途 218 破坏、篡改或损坏政府财产，或他人财产，价值超过100美元，或者破坏、篡改、损坏价值至多100美元的生命安全设备（例如，火警器）。 219 盗窃（包括通过未经授权使用通信设备获得的数据，或通过未经授权访问磁盘、磁带或计算机输出数据或其他存储数据的自动化设备获得的数据。） 220 进行、练习或使用武术、拳击（除了使用拳击袋）、摔跤或其他形式的身体接触，或进行军事演习或操练（除了经工作人员授权和进行的操练） 221 在未经工作人员许可的情况下与异性人员进入未经授权区域 222 制造、拥有或使用酒精类物质 223 拒绝向呼气式酒精检测仪呼气或参加其他酒精使用测试 224 袭击任何人（被指控此行为仅当犯人企图或实施了较轻的身体伤害或接触） 297 滥用电话，除了犯罪活动（例如，规避电话监控程序，持有和/或使用其他犯人的个人识别号码；第三方呼叫；第三方计费；使用信用卡号码打电话；多方通话；使用暗号交谈）。 298 干扰工作人员履行职责。（行为必须达到高度严重性。）仅当适用其他高严重性指控时，才可使用此指控。 适度类别 禁止行为和制裁表 代码 禁止行为 制裁 无 无 无 被禁止的行为和惩罚表 编号 被禁止的行为 惩罚 300 猥亵暴露 301 (不得使用) 302 未经授权药物的滥用 303 持有金钱或货币，除非经特别授权或超过授权金额 304 出租财产或任何有价值物品用于牟利或获取更多回报 305 持有任何未经授权保留或接收的物品，而非通过正常渠道发放给犯人 306 拒绝工作或接受项目分配 307 拒绝服从任何工作人员的命令（根据被违抗命令的性质可能分类并以更大严重性进行指控；例如，拒绝服从进一步骚乱的命令将被指控为105号，发生骚乱；拒绝服从进一步打架的命令将被指控为201号，打架；拒绝在被要求时提供尿样将被指控为110号） - A. 建议延迟或取消假释日期。 B. 放弃已获得的法定优良时间或未获得的良好操行时间，最多可达25%或最多30天，以较少者为准，并/或终止或取消额外的优良时间（额外的优良时间或良好操行时间处罚不得暂停）。 B.1 取消或限制一年内可获得的良好操行时间的最多25%（1-14天）（良好操行时间处罚不得暂停）。 C. 惩戒性转移（建议）。 D. 惩戒性隔离（最多15天）。 E. 进行经济赔偿。 F. 暂扣法定优良时间。 这张表格列出了与休假、社区计划、工作安排和监督员指示相关的各种违规行为和违规行为。它还包括一些后果，如丧失特权，如购物店、电影和娱乐等， 具有以下列： 违规行为：违规行为或违规的描述 后果：违规的结果或处罚 这张表列出了与休假、社区项目、工作任务和主管指令相关的各种违反和违规行为。它还包括了一些后果，例如失去特权，如购物、电影和娱乐等。 违规行为 后果 308 违反休假条件 309 违反社区项目条件 310 未经允许缺席工作或任何任务 311 未按照主管的指示进行工作 H. 更换住所（宿舍）。 I. 从项目和/或团体活动中移除。 囚犯不当行为和相关纪律措施 代码 不当行为 纪律措施 001 打架 禁闭一周 002 逃跑 加重劳动任务 003 藏匿违禁品 扣除通信特权 004 拒绝服从命令 暂停探视资格 005 捣乱他人 限制活动自由 006 自伤 必须接受心理评估 007 越狱 增加监控措施 008 贿赂狱警 严厉警告并移送司法机构 009 持有管制药品 转入更高级别监狱 010 性侵其他囚犯 终身监禁 犯人不当行为和相应的纪律措施表 编号 不当行为 纪律措施 312 对工作人员无礼 J. 工作岗位流失 313 向工作人员撒谎或提供虚假陈述 K. 扣押犯人的个人物品 314 伪造、假冒或未经授权复制任何文件、身份证件、货币、安全文件或正式文件（根据被复制物品的性质可能按照严重程度分类；例如，伪造释放文件以逃走，编号102或编号200） - L. 没收违禁品 M. 限制在宿舍活动。 N. 加班。 这个表格列出了与会议、聚会、区域、安全规定、设备使用和计数程序相关的违规行为和违规行为，具有以下列： 代码：每个违规行为或违规行为的数字代码 描述：对违规行为或违规行为的描述 这张表列出了与会议、聚会、场所、安全规定、设备使用和计数程序相关的未经授权行为和违规行为，具体包括以下列信息： 代码：各个未经授权行为或违规行为的数字代码 描述：未经授权行为或违规行为的描述 代码 描述 315 参与未经授权的会议或聚会 316 进入未经授权的区域 317 未遵守安全或卫生规定 318 使用任何未经明确授权的设备或机械 319 违反使用说明或张贴的安全标准使用任何设备或机械 320 未进行站立计数 321 干扰计数过程 322 （不得使用） 赌博 禁止行为 准备或进行赌博池 拥有赌博用具 未经授权与公众接触 给予金钱或其他具有价值的东西，或接受他人的金钱或其他具有价值的东西，而无需员工授权，发生在另一名囚犯或任何其他人之间 破坏、篡改或损坏政府财产，或价值不超过100美元的其他人财产 不卫生或不整洁；未能按照公布的标准保持个人和居住区的整洁 拥有、制造或引入非危险工具或其他非危险违禁品（工具不太可能用于逃跑或逃跑尝试，或用作能对他人造成严重伤害的武器，也不危害机构安全或个人安全；其他非危险违禁品包括食品或化妆品等物品） 在禁止吸烟的地方吸烟 电话的滥用（如会议电话、持有或使用另一名囚犯的PIN码、三方通话、提供虚假信息以准备电话名单等） 干扰职员履行职责（行为必须是中度严重性质）。此指控只能在其他中度严重性指控不适用时使用。 干扰或扰乱监狱或联邦监狱管理秩序运行的行为（行为必须是中度严重性质）。此指控只能在其他中度严重性指控不适用时使用。 低中度类别 被禁止行为和相应制裁 代码 被禁止行为 制裁 无 无 无 编号 禁止行为 制裁 400 持有他人财产 401 持有未经授权的服装 402 装病，假装生病 403 不得使用 404 使用辱骂或淫秽语言 405 纹身或自残 406 不得使用 407 与访客的行为违反局规定（通常失去这些特权的制裁可能是合适的） 408 从事商业活动 B.1 禁止通常情况下的年度可获得的最多12.5%（1-7天）的表现良好时间抵免（仅适用于在6个月内发现犯人再次违反同一禁止行为的情况下使用）；禁止通常情况下的年度可获得的最多25%（1-14天）的表现良好时间抵免（仅适用于在6个月内发现犯人第三次违反同一禁止行为的情况下使用）。（表现良好时间制裁不得暂停）。（有关VCCLEA暴力和PLRA囚犯，请参阅第4章第16页。） E. 进行金钱赔偿。 F. 暂扣法定的良好时间。 409 未经授权的身体接触（如亲吻、拥抱） 410 未经授权使用邮件 497 电话使用出现滥用行为（例如超过15分钟的通话时间限制；在未经授权的区域使用电话；在电话名单上加入未经授权的个人）。 498 干扰工作人员执行职责。行为必须是轻度至中度的严重性质。只有在其他较轻度严重性质的指控不适用时才使用该指控。 G. 丧失特权：购物、电影、娱乐等 H. 更换住房 I. 从项目和/或团体活动中另行移除 J. 失去工作 K. 扣押囚犯的个人财产 L. 没收违禁品 499 干扰或阻碍监狱或联邦监狱管理局的安全或秩序运行的行为。行为必须是轻度至中度的严重性质。只有在其他较轻度严重性质的指控不适用时才使用该指控。 M. 限制在住房内 N. 额外职责 O. 训斥 P. 警告 注意：协助他人实施任何这些罪行，试图实施任何这些罪行，以及计划实施任何这些罪行，在所有严重性质的类别中，将被视为与犯罪行为本身相同。 《囚犯权利与责任（541.12）》 机构中的权利和责任， 以下是表格标题： 权利和责任表， 以下是列： 权利：无 责任：无 机构中的权利和责任 权利和责任表 权利 责任 1. 作为一个人，你有权利期望所有人员对待你时，都应该尊重、公正和公平。 1. 你有责任以同样的方式对待其他人，包括雇员和被监禁者。 2. 你有权被告知有关机构运作的规则、程序和时间安排。 2. 你有责任了解并遵守这些规定。 3. 你有权自由选择宗教信仰，并进行自愿宗教崇拜。 3. 你有责任认识并尊重他人在这方面的权利。 4. 你有权获得卫生保健，包括：营养丰富的饮食、适当的床上用品和衣物、洗涤时间表以保持清洁、有规律地洗澡机会、良好的通风换气、定期运动时间、洗漱用品以及医疗和牙科治疗。 4. 你有责任不浪费食物，遵守洗涤和洗澡时间表，保持整洁的生活区，保持你的区域没有违禁品，并在需要时寻求医疗和牙科护理。 5. 你有权与家人、朋友以及新闻媒体成员进行拜访和通讯，需符合监狱局规定和机构指导方针。 5. 你有责任在拜访期间表现得体，不接受或传递违禁品，也不通过通讯违反法律、监狱规定或机构指导方针。 6. 你有权通过通讯无障碍和保密地访问法院（例如关于你的定罪是否合法、民事案件、待定刑事案件以及你的监禁条件）。 6. 你有责任诚实公正地向法院陈述你的请愿、问题和困扰。 7. 你有权通过面谈和通讯从自己选择的律师获得法律辅导。 7. 你有责任诚实公正地使用律师的服务。 8. 你有权参与法律图书馆参考资料的使用，以帮助解决法律问题。你也有权在有提供的法律援助计划下获得帮助。 8. 你有责任按照规定和时间表使用这些资源，尊重其他犯人的权利，并正确使用这些资料和帮助。 9. 你有权获得广泛的阅读材料用于教育目的和个人享受，包括社区寄来的杂志和报纸，但有一定限制。 9. 你有责任寻找并利用这些材料以获得个人利益，同时不剥夺他人对这些材料使用的平等权利。 10. 你有权参与教育、职业培训和就业活动，资源允许的情况下，以及符合你的兴趣、需求和能力。 10. 你有责任利用可能帮助你在监狱内和社区过上成功、守法生活的活动。你将被要求遵守相关活动的规定。 11. 你有权使用你的资金进行梦想和其他购买，符合机构安全和良好秩序的要求，开设银行和/或储蓄账户，并帮助你的家人。 11. 你有责任履行你的财务和法律义务，包括但不限于法院强加的评估、罚款和赔偿。你还有责任根据你的释放计划、家庭需求和其他可能存在的义务合理使用你的资金。 结论： 本手册旨在提供指南。程序可能会发生变化，从而影响本手册中概述的程序。我们将尽一切努力通知囚犯群体这些变化，任何重大变化都将张贴在您的单位布告栏上。在重新印刷之前，本手册将不会进行更改。如果您有任何进一步的问题或顾虑，请咨询您的单位工作人员，他们将乐意回答或引导您到适当的资源。 MDC_handbook_CN.pdf MDC_handbook.pdf

预告与警告：即将来临的全球震荡与唤醒 该视频中包含了多位牧师和预言家的预言和梦境，都警告即将到来的重大灾难和经济。崩溃作者强调，这些预示表明上帝将在美国和全球范围内进行一次大规模的“震荡和唤醒” ”。这些灾难不是来审判的，而是要唤醒那些灵里和世俗上都“冷淡”的人，让他们在基督的再临之前做好准备。作者呼吁大家要警醒祈祷，并为家人和自己做点什么准备好适当的物质。 关键点 ✦ 多位先知和牧师，如 Kent Christmas、Dana Coverstone 等，都有关于即将到来的重大灾难和经济崩溃的预兆和梦境。 这些预示预示着上帝要在美国和全球范围内进行一次大规模的“震动和唤醒” ”。 这些灾难不是来审判的，而是要唤醒那些灵里和世俗上都“冷淡”的人，让他们在基督的再临之前做好准备。 作者呼吁大家要警醒祈祷，并为家人和自己做点什么准备好适当的物质，如备齐食物、水、燃料等。 作者强调这并非出于恐惧，而是出于对神的话语的遵行，并相信神必定会眷顾和保守自己的子民。 Prophecies and Warnings: The Impending Global Shaking and Awakening This video includes prophecies and visions from multiple pastors and prophets, all warning of imminent major disasters and economic collapse. The author emphasizes that these prophecies indicate that God will conduct a large-scale "shaking and awakening" in the United States and globally. These disasters are not meant as judgment but to awaken those who are spiritually and worldly "lukewarm," so they can prepare before the return of Christ. The author urges everyone to stay vigilant in prayer and make appropriate material preparations for themselves and their families. Key Points ✦ Multiple prophets and pastors, such as Kent Christmas and Dana Coverstone, have had visions and dreams foretelling major disasters and economic collapse. These prophecies indicate that God will conduct a large-scale "shaking and awakening" in the United States and globally. These disasters are not meant as judgment but to awaken those who are spiritually and worldly "lukewarm," so they can prepare before the return of Christ. The author urges everyone to stay vigilant in prayer and make appropriate material preparations for themselves and their families, such as stocking up on food, water, fuel, etc. The author emphasizes that this is not out of fear but out of adherence to God's word, believing that God will surely care for and protect His people. 原文视频链接：https://youtu.be/5zzNSGo9zXk

本文短链接｜Short Link ：https://gettr.ink/RYSrm7 摘要： 土耳其对加密货币的热情源于经济不稳定和货币贬值。在高通胀和里拉持续走弱的背景下，越来越多的土耳其人将加密货币视为对冲经济风险和保值的重要工具。 土耳其加密货币市场的崛起：解读《资本市场法修正案》及其背后的实用价值 近年来，土耳其凭借其庞大的加密货币交易量，成为全球加密货币市场中的重要角色。据统计，土耳其已成为全球第四大加密货币交易市场，仅次于美国、印度和英国。土耳其的加密货币市场增长主要受经济不稳定和土耳其里拉贬值的推动，这使得许多土耳其人将加密货币作为对抗经济不确定性和保值的手段。 背景与市场动态 从2020年底到2023年底，土耳其里拉贬值超过300%，引发了对经济稳定性的广泛担忧。2024年8月23日，里拉兑美元汇率创下历史新低，超过34里拉兑1美元。这种经济环境促使土耳其的加密货币市场迅速增长，尽管此前缺乏明确的监管框架。 随着全球对加密货币监管的日益重视，土耳其也开始加强对这一领域的监督。尽管土耳其中央银行在2021年禁止使用比特币等加密货币进行支付，但市场依然蓬勃发展，急需更明确的监管指导。 土耳其加密货币监管的明朗化：《资本市场法修正案》 2024年6月，土耳其议会通过了《资本市场法修正案》，并于7月正式生效，标志着该国加密资产服务提供商（CASPs）的初步监管框架建立，主要包括以下要点： 监管机构：资本市场委员会（CMB）被指定为加密行业的监管机构，拥有授权运营、监督活动、实施制裁和采取必要措施的权力。 刑事责任：修正案规定了对未经授权的加密业务、挪用用户资产以及欺诈行为的刑事处罚。 监控与合规：交易平台需建立监控系统，以识别、防范并报告市场操纵和安全事件。 尽管缺乏全面的加密货币监管制度，土耳其现行法规仍对市场施加了一定的控制力，包括中央银行禁止使用加密货币支付，以及金融犯罪调查委员会（MASAK）要求交易所收集KYC数据以维护反洗钱措施等。此外，土耳其财政部长Mehmet Simsek也透露，涉及“加密钱包、加密资产服务提供商、加密资产托管商”的更全面监管法案已进入最终评估阶段，预计将很快出台。 政策解读：《资本市场法修正案》 2024年7月2日，土耳其政府正式通过了《资本市场法修正案》（法案编号7518），为加密资产服务提供商（CASPs）的运营设立了明确的法律框架。这一修订标志着土耳其加密货币市场进入了一个全新的合规时代。 1. 《资本市场法修正案》的出台背景 自2021年以来，土耳其因洗钱风险问题被列入FATF的灰名单。为了摆脱这一不利局面并明确加密货币的征税政策，土耳其开始加大对该领域的监管力度。如今，土耳其已成功从灰名单中移除，新的监管框架也随之出台，为加密货币市场的规范化发展奠定了基础。 2. 资本市场委员会（CMB）的新规出台 2024年7月2日，土耳其资本市场委员会（CMB）正式公布了第7518号《资本市场法修正案》，将加密资产服务提供商（CASPs）的规定纳入立法范围。这标志着土耳其加密货币监管进入了新阶段，所有加密资产服务提供商都必须获得CMB的许可，并遵守TUBITAK设定的标准。此外，与银行相关的活动还需获得银行监管与监督机构（BDDK）的批准。这些规定不仅强化了监管，也为加密资产行业的健康发展提供了保障。 3. 加密资产平台的设立条件 根据新法规，加密资产平台的设立需满足以下条件： 平台应设立为股份有限公司，并且最低实缴资本为5000万土耳其里拉。 所有股份均应以现金发行并登记在案。 创始人和管理者需符合资本市场法和其他相关法律的规定，具备足够的经济实力、诚实性和信任度。 加密资产平台的经营范围应明确，涵盖购买、销售、首次发行、分销、清算、转让和托管等活动。 4. 平台运营的过渡与清算 新法规要求，目前正在土耳其运营的加密资产服务提供商必须在一个月内向CMB提交所需文件，未能提交申请的公司则必须在一个月内做出清算决定。临时运营的平台必须在2024年11月8日前提交平台运营许可申请，否则将面临清退。 在过渡期内，共有76家交易所获得了继续运营的临时许可，并需遵守新法规的各项要求。与此同时，已有8家未能满足条件的交易所被要求清退。 5. 严格的监管与处罚措施 新法规对未经授权从事加密资产服务的个人和机构设立了严厉的处罚措施。违反规定的个人和法人将面临3至5年的监禁，并处以5000至10000天的罚款。而挪用委托资金或资产的行为将导致更为严厉的刑罚，最高可判处14年的监禁，并处以巨额罚款。 对于涉及欺诈行为以掩盖挪用行为的犯罪者，将面临14至20年的监禁，并处以最高20000天的罚款。此外，非法利用被撤销许可证的加密资产服务提供商资源的个人，也将面临最高22年的监禁和20000天的罚款。 监管框架的影响与前景 《资本市场法修正案》标志着土耳其在加密货币监管领域迈出了关键一步。这一修正案为加密资产服务提供商（CASPs）设立了明确的法律框架，使得加密货币市场的运营更加规范和透明。 增强市场信任与稳定性：通过设立严格的监管标准，修正案为加密货币市场引入了更高的透明度和责任感。这不仅有助于提高投资者对市场的信任，还能防止不正当行为的发生，从而为市场的长期稳定奠定基础。 推动合规与规范化发展：修正案要求加密资产服务提供商获得CMB的许可，并遵守严格的运营标准。这一要求将推动行业的规范化发展，淘汰不合规的市场参与者，促使更多合规企业参与市场竞争。 国际企业的入场与竞争：修正案出台后，已有多家国际知名交易所申请牌照，显示出土耳其市场对国际企业的吸引力。这一趋势可能会加剧市场竞争，同时带来更多先进的技术和服务，进一步推动土耳其加密市场的发展。 监管力度的加大与市场的整合：修正案不仅设立了更严格的监管标准，还对违法行为制定了严厉的处罚措施。这将有助于清理市场中的不法行为，促使市场更为健康、透明，并吸引更多正规企业参与其中。 市场增长的潜力：土耳其是全球第四大加密货币交易国，随着这一修正案的实施，加密货币市场可能迎来新的增长机遇。受益于更加明确的法律框架，土耳其市场的参与者将有机会在更加稳定的环境中发展和扩展业务。 《资本市场法修正案》不仅为土耳其的加密货币市场带来了新的秩序和规范，同时也为其未来的发展奠定了坚实的基础。随着更多企业的参与和市场的逐步成熟，土耳其加密货币市场有望迎来新一轮的繁荣。 实用价值： 对于投资者和企业来说，土耳其的新监管框架提供了一个更可预测和安全的环境，参与加密货币活动。对合规的重视以及引入严格的处罚措施，强调了遵守法律标准的重要性。考虑进入土耳其市场的国际企业将发现一个日益受监管的市场，拥有明确的规则和期望，使其成为加密货币领域发展的理想目的地。随着土耳其加密市场的不断发展，利益相关者应密切关注监管动态，调整策略，以把握新兴机会。 Turkey Emerges as the World's Fourth Largest Cryptocurrency Market: Analyzing the New Regulatory Landscape under the "Capital Markets Law Amendment" Abstract: Turkey's growing enthusiasm for cryptocurrency stems from economic instability and currency depreciation. Amid high inflation and the weakening of the Turkish lira, more Turks view cryptocurrency as a vital tool for hedging economic risks and preserving value. Turkey's Cryptocurrency Market Boom: Insights into the New "Capital Markets Law Amendment" and Its Practical Implications In recent years, Turkey has become a significant player in the global cryptocurrency market, driven by substantial trading volumes. According to data, Turkey is now the fourth-largest cryptocurrency market globally, following the U.S., India, and the UK. This rise is largely due to economic instability and the devaluation of the Turkish lira, which has led many Turks to turn to cryptocurrency as a hedge against economic uncertainty and a means to preserve their wealth. Background and Market Dynamics Between the end of 2020 and the end of 2023, the Turkish lira depreciated by over 300%, prompting widespread concern about economic stability. On August 23, 2024, the lira hit a historic low against the dollar, trading at over 34 lira per dollar. This economic environment has fueled the rapid growth of Turkey's cryptocurrency market, despite the lack of a clear regulatory framework in previous years. In response to global trends in cryptocurrency regulation, Turkey has begun to strengthen its oversight of the sector. Despite the Central Bank of the Republic of Turkey's 2021 ban on using cryptocurrencies like Bitcoin for payments, the market has continued to grow, necessitating clearer regulatory guidelines. Turkey's Clarified Cryptocurrency Regulation: The Capital Markets Law Amendment In June 2024, the Turkish Parliament passed, and in July, enacted the "Capital Markets Law Amendment," which has garnered significant attention in the crypto industry. The amendment introduces an initial regulatory framework for crypto asset service providers (CASPs), with key provisions including: Regulatory Authority: The Capital Markets Board (CMB) is designated as the regulatory body for the crypto industry, empowered to license operations, oversee activities, impose sanctions, and take necessary measures. Criminal Liabilities: The amendment outlines criminal penalties for unauthorized crypto operations, misappropriation of user assets, and fraud. Monitoring and Compliance: Trading platforms are required to implement monitoring systems to identify, prevent, and report market manipulation and security incidents. Despite the absence of a comprehensive regulatory system, existing regulations in Turkey, such as the Central Bank's ban on crypto payments and the Financial Crimes Investigation Board's (MASAK) requirement for KYC data collection to enforce anti-money laundering measures, still exert some control over the market. Additionally, Turkey's Finance Minister Mehmet Simsek indicated that more comprehensive crypto regulations, covering areas like crypto wallets and asset custodians, are in the final stages of review, suggesting further clarity in the near future. Policy Insights: The New "Capital Markets Law Amendment" On July 2, 2024, the Turkish government officially passed the "Capital Markets Law Amendment" (Law No. 7518), which provides a clear legal framework for the operation of crypto asset service providers (CASPs). This marks the beginning of a new era of compliance in Turkey's cryptocurrency market. 1. Background of the Capital Markets Law Amendment Since 2021, Turkey has been on the FATF's gray list due to concerns over money laundering risks. To improve its standing and clarify crypto tax policies, Turkey has increased its regulatory efforts in this area. The new regulatory framework has now removed Turkey from the gray list and laid the foundation for a more structured development of the cryptocurrency market. 2. New Regulations by the Capital Markets Board (CMB) The amendment, announced by the CMB on July 2, 2024, brings crypto asset service providers under formal legislative oversight. All CASPs must obtain CMB authorization and adhere to standards set by TUBITAK. Activities related to banking must also receive approval from the Banking Regulation and Supervision Agency (BDDK). These regulations strengthen oversight and ensure the healthy development of the crypto asset industry. 3. Establishment Conditions for Crypto Asset Platforms Under the new regulations, crypto asset platforms must meet the following criteria: Be established as a joint-stock company with a minimum paid-up capital of 50 million Turkish lira. All shares must be issued and registered in cash. Founders and managers must comply with capital market laws and other relevant legislation, possessing sufficient economic strength, integrity, and credibility. The scope of operations should include activities such as purchasing, selling, initial issuance, distribution, clearing, transfer, and custody of crypto assets. 4. Transitional Operation and Liquidation The new law requires current CASPs operating in Turkey to submit necessary documents to the CMB within a month. Companies failing to apply must decide on liquidation within a month. Temporarily operating platforms must submit their platform operation license applications by November 8, 2024, or face withdrawal. During the transition period, 76 exchanges received temporary licenses to continue operations under the new regulations, while eight that failed to meet the criteria were ordered to withdraw. 5. Strict Regulation and Penalties The amendment introduces severe penalties for unauthorized crypto asset services. Individuals and institutions violating the regulations will face 3 to 5 years in prison and fines of 5,000 to 10,000 days. Misappropriating entrusted funds or assets will result in harsher penalties, with imprisonment of up to 14 years and hefty fines. For crimes involving fraud to cover up misappropriation, offenders will face 14 to 20 years in prison and fines up to 20,000 days. Additionally, individuals who illegally use resources from CASPs with revoked licenses will face up to 22 years in prison and fines of 20,000 days. Impact and Outlook of the Regulatory Framework The "Capital Markets Law Amendment" marks a significant step forward in Turkey's cryptocurrency regulation. This amendment provides a clear legal framework for CASPs, ensuring more regulated and transparent market operations. Enhancing Market Trust and Stability: The amendment introduces higher transparency and accountability standards in the cryptocurrency market, helping increase investor trust and prevent malpractice, thereby laying a foundation for long-term market stability. Promoting Compliance and Orderly Development: The requirement for CASPs to obtain CMB licenses and adhere to stringent operational standards will promote the orderly development of the industry, eliminating non-compliant market participants and encouraging more compliant enterprises to compete. Attracting International Firms and Competition: Following the amendment, several well-known international exchanges have applied for licenses, highlighting Turkey's attractiveness to global businesses. This trend may increase market competition, bringing more advanced technology and services, further driving the development of Turkey's crypto market. Intensified Regulation and Market Consolidation: The amendment not only sets stricter regulatory standards but also imposes severe penalties for illegal activities. This will help eliminate unlawful behavior, foster a healthier and more transparent market, and attract more legitimate enterprises to participate. Potential for Market Growth: As the world's fourth-largest cryptocurrency trading nation, Turkey may see new growth opportunities with the implementation of this amendment. With a clearer legal framework, market participants in Turkey will have the chance to develop and expand their businesses in a more stable environment. The "Capital Markets Law Amendment" brings new order and regulation to Turkey's cryptocurrency market, laying a solid foundation for its future development. With more enterprises participating and the market maturing, Turkey's cryptocurrency market is poised for a new wave of prosperity. Practical Implications: For investors and businesses, the new regulatory framework in Turkey offers a more predictable and secure environment to engage in cryptocurrency activities. The emphasis on compliance and the introduction of stringent penalties for violations underscore the importance of adhering to legal standards. International firms considering entering the Turkish market will find an increasingly well-regulated landscape, with clear rules and expectations, making it an attractive destination for growth in the cryptocurrency sector. As Turkey's crypto market continues to evolve, stakeholders should closely monitor regulatory developments and adapt their strategies to capitalize on emerging opportunities. https://www.hpay.news/turkey/

"Thoughts and Action Guide on Mr. Guo's Eight Questions" ——Comrade: See You Next Year @justaction The eight questions raised by Mr. Guo offer a broad overview and foresight into future changes in the global landscape, serving as a guide for us to identify direction and take action. Mr. Guo urges us to reflect, hoping that every comrade can do their best, start from their surroundings, and continuously spread the truth of the Whistleblower Movement, building the New Federal State of China (NFSC). 1. What will happen if China's real estate financial crisis fully erupts? What should comrades in China do? What can they do? Thoughts: China's real estate financial crisis is currently unfolding, with the real estate and financial industries facing severe shocks, impacting many other sectors such as manufacturing and services. This will lead to economic stagnation and increased unemployment in certain industries. The Chinese Communist Party (CCP) will likely go to great lengths to maintain stability by issuing bonds, printing money to shift the crisis, and using mainstream and social media to continue deceiving the public. They will also use violent tools to suppress the people's protests. Comrades in China should try to transfer their assets abroad if possible, and those who can leave should do so to secure their survival. Those who cannot leave must protect themselves and their families, ensuring sufficient finances and maintaining social connections to sustain their lives. Under the condition of ensuring safety, they should spread the truth, including the harmful effects of the vaccine, the economic downturn caused by lockdowns, the dictatorship of Xi Jinping and the return to the Cultural Revolution, and the CCP's virus release. 2. What impact will a major financial and economic collapse in the United States have on the world? What should we do? What can we do? Thoughts: The United States is the engine of the global economy. If it experiences a major financial and economic collapse, the influence of the dollar will be weakened, further affecting the global economy. At the same time, the CCP might unite with Russia, Iran, North Korea, and some Middle Eastern and African countries to form another bloc against the Western world led by the U.S., leading to a divided world with increased political and economic exchanges between nations. In this situation, blockchain and digital currencies may see more opportunities. The NFSC should continue to support Himalaya Exchange, promote H-Coin and HPay, and ensure that platforms like Gettr and GNews grow stronger in terms of user base and content influence. 3. What should we do if Xi Jinping dies suddenly or is ousted by internal rivals, leading to a "Ceausescu-like" incident? What can we do? Thoughts: If Xi Jinping dies suddenly, figures like Zeng, Han, and Wang might seize the opportunity to take power, intensifying the internal struggle with Xi's faction. This would lead to a period of tension and instability in the domestic political scene, and many citizens might celebrate with fireworks. We should unite with comrades within the system, encouraging the more enlightened factions within the Party to abandon the evil CCP regime and push for greater political reforms, including lifting media and political restrictions, and allowing the people to vote. The NFSC should have enough strength to influence the domestic political situation during such instability, using its financial, social media, and international relations capabilities to promote good and suppress evil. 4. What should we do if Xi Jinping suddenly attacks Taiwan, causing a collapse in the U.S. and global financial markets? What can we do? Thoughts: If Xi Jinping suddenly attacks Taiwan, global supply chains will be disrupted, and the decoupling of the West from China will accelerate. Domestically, China could nearly close its borders, with the CCP imposing stricter controls over society and the population, such as centralized supply of goods, border controls, and possibly martial law in some regions, which would be worse than the lockdowns during the pandemic. At the same time, the CCP might once again spread viruses globally, leading to another pandemic. Comrades inside the Great Firewall should protect themselves and their families, while overseas Chinese should actively promote the message that "the CCP is not equal to the Chinese people," denounce Xi Jinping and the CCP, and emphasize that the Chinese people love peace and strongly oppose war and aggression. They should loudly declare that "world peace requires the elimination of the CCP." The NFSC should invest more resources in anti-CCP campaigns in the West to influence Western governments and public opinion, and to protect Chinese and Asian people. 5. If any of the above events occur, leading to a global economic collapse, wars in Ukraine and Africa, accompanying diseases and disasters, viral outbreaks, and a breakdown of the global food supply chain, with society erupting into wars between the rich and poor, with no distinction of race, region, or nationality, what should we do? What can we do? Thoughts: A global economic collapse would signal the fall of the old world order and the rise of a new one. This transition will impact global politics, national systems, and economic and social structures, directly or indirectly affecting everyone's lives. As individuals, our strength is limited; only by forming organizations and groups can we become stronger. Comrades in the NFSC should become more united, spreading the truth and making friends through social media, HPay life circles, organizing public activities, online social networks, and daily neighborhood interactions, whether online or offline. Under the unified planning and deployment of the farm alliance, we should gradually build a global social platform (Gettr), interpersonal networks and services (GClub), and farm bases with corresponding physical organizations, recruiting more comrades to join, expanding our strength, and becoming capable of defending against various disasters. 6. Whether Xi is ousted by internal rivals or is decapitated after attacking Taiwan, the CCP and Xi's faction will be eliminated. The ensuing power struggle will see figures like Zeng, Wang, and Han rise as a new "Yuan Shikai party," possibly seizing power and colluding with evil forces to control China's 1.4 billion people. What should we do? What can we do? Thoughts: If Xi is ousted, the new "Yuan Shikai party" of Zeng, Wang, and Han might use political reform slogans to win people's hearts while colluding with evil forces to continue exploiting the Chinese people under a rebranded dictatorship. In this scenario, we need to awaken more citizens to the ideas of the rule of law, democracy, equal rights, and a multi-party system where one person has one vote to elect the president. The NFSC, with its growing power and influence, should strengthen cooperation with the U.S. and Western governments, supporting enlightened forces within China to help establish a democratic representative and electoral system. A critical step in this process is to break through China's firewall, lift media restrictions, and achieve press freedom. 7. Regardless of how the above events unfold, the result will be that the world's just forces and people will choose the NFSC to represent the future of the Chinese people, advancing China's governance modernization, rule of law, and democratization. Mr. Guo will never participate in politics, but comrades should actively work towards achieving religious freedom, the righteous path, and a one-person-one-vote system. Comrades should ask themselves, what should we do? What can we do? Thoughts: We believe that the NFSC's strength and capability will be crucial in establishing a new China based on the rule of law, democracy, and international cooperation. Comrades should contribute their talents in politics, business, education, agriculture, and other fields. Everyone should think, plan, and act accordingly. We should start with ourselves and our surroundings, taking action in every aspect of life, every day, to contribute to religious freedom, the righteous path, and democratic elections. On a personal level, I hope to use my abilities to help those persecuted for their religious beliefs under the CCP, strengthen domestic civil society groups, and support the spread of freedom of belief and love. 8. If the "Chinese Dream" collapses, and the NFSC helps the world wake up from the Chinese nightmare, helping the Chinese people and the world achieve their dreams, what should we do? What can we do? Thoughts: We should: Continue to spread the truth about COVID-19 and the vaccines: Make the world aware of the CCP's collusion with evil forces to control the world. Promote the use of Artemisinin and Ivermectin to help those harmed by vaccines recover their health and reduce casualties. Continue to expose the evil nature of communism: Through the establishment of museums, exhibitions, websites, social media, and independent media, we should vigorously expose the CCP's past crimes, including the Cultural Revolution, the Tiananmen Square Massacre, the genocide in Xinjiang and Tibet, religious persecution, and the suppression of the Hong Kong democracy movement. This will help both Chinese and global citizens understand the evil nature of the communist system and rid the world of its "red poison." Accelerate the growth of the NFSC's strength and global influence: Establish unique and cutting-edge influence in innovative fields such as social media, cryptocurrency, blockchain technology, AI, quantum computing, and biomedical science. Recruit more comrades, cultivate the "second generation of the Whistleblower Movement," and encourage the unvaccinated population to have more children, creating a lasting legacy for the NFSC that could last a century or even a millennium. We should continue to promote the righteous path of the NFSC, helping China emerge from the shadows of the communist system, contributing to the transformation of its institutions, the recovery of its society and economy, the revival of morality, and the inheritance of its fine culture. At the same time, we should consistently highlight the hardworking, kind, and peace-loving nature of the Chinese people, striving to achieve a thousand years of peace between China and the world, earning respect and affection for Chinese people worldwide.

《对文贵先生八大问题的深思与行动指南》 ——战友：来年再见@justaction 七哥提出的八个问题，是纵观和预判未来时局变化的引子，给了我们辨识方向、开展行动的依据。七哥让我们思考，并希望每个战友都能从身边做起，力所能及地传播爆料革命真相，建设新中国联邦。 1. 中国房地产金融危机全面爆发，中国会发生什么？国内的战友该做什么？能做什么？ 思考： 中国房地产金融危机正在爆发，房地产和金融行业将受到巨大冲击，影响生产制造服务等诸多产业，导致国内经济低迷，某些行业失业率会更加严重。共产党可能拼死维稳，通过发债印钞转移危机，利用各类主流及社交媒体继续欺骗百姓，并通过暴力镇压民众的抗议。 国内战友应尽可能将资产转移到国外，能够“润”出去的应尽快行动；不能离开的要保护好自己和家人，确保有足够的钱财和人脉维系生活。在保证安全的条件下，传播真相，包括疫苗的危害、封控导致的经济衰退、习死皇的独裁统治和文革回归、以及共产党放毒等事实。 2. 美国金融经济大崩溃，会给世界带来什么？我们该做什么？能做什么？ 思考： 美国是全球经济的发动机，如果发生金融经济大崩溃，美元的影响力将被削弱，进而影响全球经济。同时，中共可能联合俄罗斯、伊朗、朝鲜及中东非洲国家形成另一个阵营与西方世界抗衡，世界将趋向分裂，国与国之间的利益勾兑将更为明显。 在这种情况下，区块链和数字货币可能迎来更多机会。新中国联邦应继续支持喜联储，推广喜币和HPay，同时增强盖特（Gettr）和Gnews的用户数和内容影响力，推动其不断壮大。 3. 习近平暴病而毙或被党内政敌除掉变成“齐奥塞斯习”事件，我们该做什么？能做什么？ 思考： 如果习近平暴毙，曾、韩、王等人可能乘机反扑夺权，与习家党的争斗加剧，国内政局将趋于紧张和不稳定。国内许多人可能会以放烟花爆竹的方式庆祝。 我们应联合体制内的战友，鼓励党内开明派摒弃邪恶的共产党体制，加大力度进行政治体制改革，放开新闻和党禁，让老百姓有选票。在不稳定的局面下，新中国联邦应利用自己在金融、社交媒体监督、国际关系合作等方面的实力，形成对国内政局的影响力，致力于抑恶扬善。 4. 习死皇突然攻击台湾，美国及世界金融市场大崩溃，我们该做什么？能做什么？ 思考： 如果习近平突然攻击台湾，全球供应链将断裂，西方与中国的脱钩进一步加速，国内可能陷入闭关锁国状态。共产党可能对社会和百姓实行更严厉的控制，如物资集中供销、边境控制、部分地区军管，情况将比疫情期间封控更为糟糕。 同时，共产党可能在全球再次放毒，导致疫情大流行。在墙内的战友应保护好自己和家人，海外华人应大力宣传“中国共产党不等于中国人”，声讨习死皇和共产党，强调中国人爱好和平，强烈反对战争和侵略，发出“要世界和平，唯有灭共”的呼声。新中国联邦应投入更多资源在西方世界发起灭共宣传，影响西方政府和民众，保护华人和亚洲人。 5. 任何一个以上事件发生，世界经济必然大崩溃，俄乌战争、非洲动乱战争、疾病灾难、病毒扩散、粮食供应链断裂，全社会爆发贫富战争。我们该做什么？能做什么？ 思考： 世界经济崩溃意味着旧的世界体系将倾倒，新的体系将建立。这种新旧交替对世界政局、国家制度、经济社会都将产生冲击，每个人的生活都会受到影响。作为个体的力量是薄弱的，只有形成组织和团体，力量才会强大。 新中国联邦的战友应更加团结，无论在线上还是线下，通过社交媒体、HPay生活圈建设、组织公众活动、网络社交以及日常生活邻舍交往，不断传播真相，广交朋友；在农场联盟的统一规划和部署下，逐步构建覆盖全球的新中国联邦社交平台（盖特）、人际网络及服务（GClub），以及农场基地及相应的实体组织，招募更多战友加入，把实力做大做强，具备应对各种灾难的能力。 6. 无论是习被政敌除掉，还是入侵台湾被斩首，共产党和习家党都将被消灭，随之而来的是曾、王、韩的新袁世凯党必然在中国谋取政权，与邪恶势力勾兑。我们该做什么？能做什么？ 思考： 习若被除，曾、王、韩的新袁世凯党可能借着政治体制改革的口号笼络人心，并与邪恶势力勾兑，改头换面统治剥削中国百姓。此时，我们需要唤醒更多的国人，让法治和民主思想、平等权利、两党或多党制、一人一票选总统等成为人们耳熟能详的话题。 新中国联邦应与美国和西方政府加强合作，支持国内开明势力，帮助中国构建民主的代议和选举制度。重要的一环是打开国内防火墙，放开报禁，实现新闻自由。 7. 不管以上这些事情怎样发生，结果全世界的正义力量和人民都会选择NFSC代表未来的新中国人民推进中国国家治理现代化、法制化、民主化。七哥永远都不会参政，但战友们应该积极实现信仰自由、正道主义、一人一票的国家，战友们都应该问自己，该做什么？能做什么？ 思考： 新中国联邦的实力和能力将成为新中国法治民主制度建立和国际关系合作的最重要力量。战友们应各施其能，从政、经商、教育、农业等领域贡献力量，每个人都应思考、计划并实施。 我们应从自己和身边开始，从每一件事做起，每天都行动，为信仰自由、正道主义和民主选举贡献力量。个人层面上，希望能帮助那些在共产党专制下受迫害的宗教人士，壮大国内民间团体，助力信仰自由和爱的传播。 8. 全人类面临的“中国梦”破灭，新中国联邦帮助世界人民从中国噩梦中惊醒，帮助中国人民和世界实现梦想成真，我们该做什么？能做什么？ 思考： 我们应该： 继续传播新冠病毒及疫苗真相：让世界人民认清共产党与邪恶势力勾结统治世界的阴谋，传播青蒿素、伊维菌素等有效药物，帮助受疫苗伤害的人恢复健康，减少伤亡。 持续揭露共产主义的邪恶本质：通过建立博物馆、展览、网站及社交媒体等，大力揭露共产党过去的罪行，包括文革、六四屠杀、新疆西藏种族灭绝、宗教迫害、香港民主运动镇压等，让中国和世界人民深刻理解共产体制的邪恶，清除“红色余毒”。 加速壮大新中国联邦的实力与影响力：在创新社交媒体、加密货币、区块链技术、AI、量子计算、生物医疗等领域形成独特影响力；招募更多战友，培养“爆二代”和“爆三代”，逐步构建新中国联邦的传承，构建百年甚至千年的基业。 我们应努力传扬新中国联邦的正道主义，帮助中国走出共产体制的阴霾，为新中国的制度转型、社会经济恢复、人心道德复兴做出更多贡献。同时，我们要不断传扬中国人民的勤劳、善良与热爱和平，努力成就中国与世界的千年和平，让中国人受到世界人民的尊重与喜爱。 引用自：https://gnews.org/m/1764348

本文短链接： https://gettr.ink/FNyAe4 Sourse: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4172338/ 青蒿素触发人类Ishikawa子宫内膜癌细胞的G1细胞周期停滞并通过破坏NF-kB转录信号通路抑制细胞周期依赖性激酶4（CDK4）的启动子活性和表达 作者：Kalvin Q. Tran, Antony S. Tin, and Gary L. Firestone 加州大学伯克利分校分子与细胞生物学系和癌症研究实验室，伯克利，加利福尼亚州，94720-3200 摘要 目前关于青蒿素（一种源自青蒿的天然抗疟药物）在人体子宫内膜癌细胞中的抗增殖作用知之甚少。青蒿素在培养的人类Ishikawa子宫内膜癌细胞中引发了G1细胞周期停滞，并下调了CDK2和CDK4的转录和蛋白水平。CDK4启动子-荧光素酶报告基因的分析表明，青蒿素对CDK4基因表达的抑制与CDK4启动子活性的丧失有关。染色质免疫沉淀显示青蒿素抑制了NF-κB亚基p65和p50与Ishikawa细胞内源性CDK4启动子的相互作用。共免疫沉淀实验表明，青蒿素通过增加与IκB-α（一种NF-κB抑制剂）的蛋白-蛋白相互作用，破坏了p65和p50的核转运，并破坏了其与CDK4启动子的相互作用，导致CDK4基因表达的丧失。青蒿素处理刺激了IκB-α蛋白水平的增加，而未改变IκB-α的转录水平。最后，外源性p65的表达导致该NF-κB亚基在青蒿素处理的细胞和未经处理的细胞中在细胞核中积累，逆转了青蒿素对CDK4蛋白表达和启动子活性的下调，并阻止了青蒿素引起的G1细胞周期停滞。综上所述，我们的结果表明，青蒿素在子宫内膜癌细胞中的抗增殖作用的关键事件是通过破坏NF-κB与CDK4启动子的相互作用来转录下调CDK4表达。 关键词 子宫内膜癌细胞；青蒿素抗增殖信号；NF-κB；CDK4基因表达 引言 子宫内膜癌是女性生殖系统最常见的癌症，特别是在西方国家。尽管手术、放疗和化疗等传统治疗方法在早期诊断和治疗中有效，但对于晚期或复发性子宫内膜癌的治疗选择仍然有限。因此，开发新的治疗策略来抑制子宫内膜癌的进展变得尤为重要。 青蒿素是一种从中药青蒿（Artemisia annua L.）中提取的天然产物，最初被发现具有抗疟疾活性。近来的研究表明，青蒿素及其衍生物在多种癌症细胞中具有抗增殖作用，包括乳腺癌、结肠癌、白血病和黑色素瘤。然而，青蒿素在子宫内膜癌中的作用及其潜在机制尚未被充分研究。 在这项研究中，我们调查了青蒿素对人类Ishikawa子宫内膜癌细胞的作用，重点研究其对细胞周期的影响及其可能的分子机制。我们的研究结果表明，青蒿素通过引发G1细胞周期停滞并下调CDK4和CDK2的表达来抑制Ishikawa细胞的增殖。这种作用是通过破坏NF-κB转录信号通路并抑制CDK4启动子的活性实现的。 材料和方法 细胞培养和药物处理 Ishikawa细胞（人类子宫内膜癌细胞系）在含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养，补充有青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 μg/mL）。细胞在37°C、5% CO2的环境中培养。青蒿素用DMSO溶解，终浓度不超过0.1%。 细胞增殖测定 使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8，Dojindo Molecular Technologies, Inc.）进行细胞增殖测定。将Ishikawa细胞接种到96孔板中，在37°C孵育24小时。然后用不同浓度的青蒿素处理细胞，孵育时间为0、24、48和72小时。通过测量450 nm处的吸光度来评估细胞活性。 细胞周期分析 将Ishikawa细胞在6孔板中接种，培养至约80%的汇合度后，用青蒿素处理24小时。然后，使用流式细胞术分析细胞周期分布。用70%的冷乙醇固定细胞，随后用PBS洗涤，并用含有50 μg/mL RNA酶A和50 μg/mL碘化丙啶的溶液染色30分钟。通过流式细胞仪测量荧光强度，并使用ModFit LT软件进行数据分析。 Western Blot分析 将Ishikawa细胞用不同浓度的青蒿素处理24小时后，用冰冷的PBS洗涤细胞，并用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液裂解细胞。通过SDS-PAGE分离蛋白质，并将其转移到PVDF膜上。使用5%脱脂奶粉在PBS中封闭膜，随后用抗体（针对CDK4、CDK2、p21、p27、IκB-α、NF-κB p65、NF-κB p50和β-actin）孵育。使用HRP标记的二抗，并通过化学发光法检测蛋白质。 实时定量PCR 用青蒿素处理Ishikawa细胞24小时后，用Trizol试剂提取总RNA。使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。使用SYBR Green PCR试剂进行实时定量PCR，检测CDK4、CDK2和IκB-α的mRNA表达水平。将每个基因的表达标准化为内参基因β-actin。 荧光素酶报告基因测定 将Ishikawa细胞在24孔板中接种，并用含有CDK4启动子区域的荧光素酶报告基因质粒转染细胞。用青蒿素处理转染后的细胞24小时。通过荧光素酶报告基因分析系统测量荧光素酶活性。 染色质免疫沉淀（ChIP）分析 将Ishikawa细胞用青蒿素处理24小时后，用甲醛固定细胞。裂解细胞，并用超声破碎染色质。将破碎的染色质与抗NF-κB p65或抗NF-κB p50抗体孵育，并与蛋白A/G琼脂糖珠共沉淀。洗涤珠子，逆转交联并提取DNA。使用CDK4启动子区域的特异性引物进行PCR扩增。 共免疫沉淀 将Ishikawa细胞用青蒿素处理24小时后，用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液裂解细胞。用抗NF-κB p65抗体孵育裂解物，并与蛋白A/G琼脂糖珠共沉淀。通过Western Blot分析共沉淀的蛋白质，检测NF-κB p65与IκB-α的相互作用。 统计分析 所有实验重复三次，并表示为均值±标准误差。使用t检验或方差分析（ANOVA）评估数据的统计显著性，p值<0.05被认为具有统计显著性。 结果 青蒿素在Ishikawa子宫内膜癌细胞中引发G1细胞周期停滞 为了研究青蒿素对人类Ishikawa子宫内膜癌细胞的影响，我们首先分析了细胞增殖。用不同浓度的青蒿素处理细胞24小时后，观察到显著的细胞增殖抑制作用。进一步的流式细胞术分析显示，青蒿素引发了Ishikawa细胞的G1期细胞周期停滞（图1A和B）。这些结果表明，青蒿素通过阻滞G1期细胞周期来抑制Ishikawa细胞的增殖。 青蒿素下调CDK4和CDK2的表达 为了进一步理解青蒿素引发的G1期细胞周期停滞的机制，我们检测了细胞周期调控蛋白CDK4和CDK2的表达水平。Western Blot分析显示，青蒿素处理显著下调了CDK4和CDK2的蛋白表达（图2A）。此外，实时定量PCR结果显示，青蒿素处理也下调了CDK4和CDK2的mRNA水平（图2B）。这些数据表明，青蒿素通过下调CDK4和CDK2的表达来引发G1期细胞周期停滞。 青蒿素抑制CDK4启动子活性 为了进一步探讨青蒿素对CDK4表达的调控机制，我们进行了荧光素酶报告基因测定。将Ishikawa细胞转染含有CDK4启动子区域的荧光素酶报告基因质粒，并用青蒿素处理24小时。结果显示，青蒿素显著抑制了CDK4启动子的活性（图3）。这些结果表明，青蒿素通过抑制CDK4启动子活性来下调CDK4基因的表达。 青蒿素通过破坏NF-κB转录信号通路抑制CDK4表达 为了研究青蒿素对CDK4启动子活性抑制的分子机制，我们进行了染色质免疫沉淀（ChIP）分析，检测NF-κB与CDK4启动子的相互作用。结果显示，青蒿素处理显著减少了NF-κB亚基p65和p50与CDK4启动子的结合（图4A）。进一步的共免疫沉淀实验表明，青蒿素增加了NF-κB p65与IκB-α的相互作用，导致p65从细胞核转运至细胞质，从而破坏了其转录活性（图4B）。此外，Western Blot分析显示，青蒿素处理增加了IκB-α蛋白水平，但未改变其mRNA水平（图4C）。这些结果表明，青蒿素通过增加IκB-α蛋白的稳定性并抑制NF-κB的核转运来下调CDK4表达。 外源性p65表达逆转青蒿素引发的G1期停滞和CDK4下调 为了验证NF-κB在青蒿素引发的G1期细胞周期停滞和CDK4下调中的作用，我们在Ishikawa细胞中外源性表达了NF-κB p65。结果显示，p65的过表达逆转了青蒿素对CDK4蛋白表达的抑制，并恢复了CDK4启动子的活性（图5A和B）。此外，p65的过表达也阻止了青蒿素引发的G1期细胞周期停滞（图5C）。这些结果进一步支持了NF-κB在青蒿素调控CDK4表达和细胞周期停滞中的关键作用。 讨论 我们的研究首次表明，青蒿素通过破坏NF-κB信号通路来下调CDK4基因表达，并引发人类Ishikawa子宫内膜癌细胞的G1期细胞周期停滞。青蒿素处理显著减少了NF-κB亚基p65和p50与CDK4启动子的相互作用，并通过增加IκB-α蛋白的稳定性来抑制NF-κB的核转运。外源性p65的表达逆转了青蒿素引发的G1期停滞和CDK4下调，进一步证明了NF-κB在这一过程中发挥的关键作用。 这些发现揭示了青蒿素在调控细胞周期中的潜在作用机制，并为青蒿素作为抗子宫内膜癌药物的潜力提供了新的见解。然而，进一步的研究仍然需要深入探讨青蒿素在其他癌症类型中的作用，以及其在临床应用中的潜力。 nihms-541555.pdf 青蒿素触发人类Ishikawa子宫内膜癌细胞的G1细胞周期停滞并通过破坏NF-kB转录信号通路抑制细胞周期依赖性激酶4（CDK4）的启动子活性和表达.docx 青蒿素触发人类Ishikawa子宫内膜癌细胞的G1细胞周期停滞并通过破坏NF-kB转录信号通路抑制细胞周期依赖性激酶4（CDK4）的启动子活性和表达.pdf

本文章短链接：https://gettr.ink/r35txQ Sourse ：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1155/2012/247597 抗肿瘤活性的青蒿素及其衍生物：从一种广为人知的抗疟药到一种潜在的抗癌药物 Hindawi Publishing Corporation Journal of Biomedicine and Biotechnology 2012年卷，文章ID 247597，18页 doi:10.1155/2012/247597 综述文章 抗肿瘤活性的青蒿素及其衍生物：从一种广为人知的抗疟药到一种潜在的抗癌药物 Maria P. Crespo-Ortiz1 和 Ming Q. Wei2 1 圣地亚哥德卡利大学基础与健康科学学院生物医学系，哥伦比亚卡利Pampalinda校区 2 格里菲斯大学健康研究所及医学院分子与基因治疗系，澳大利亚昆士兰州南港，黄金海岸校区 通讯地址：Maria P. Crespo-Ortiz，mdpcrespo@gmail.com 收到日期：2011年8月1日；接受日期：2011年8月29日 学术编辑：Masa-Aki Shibata 版权所有 © 2012 M. P. Crespo-Ortiz 和 M. Q. Wei。本文是开放获取文章，遵循《创作共用署名许可协议》发布，允许在任何媒体中无限制地使用、分发和复制，前提是引用原始作品。 摘要 通过开发能够选择性杀死恶性细胞的高效药物，可以极大地改善癌症患者的生活质量和生存率。青蒿素及其类似物是天然存在的抗疟药，已显示出强大的抗癌活性。在原发性癌症培养物和细胞系中，其抗肿瘤作用体现在抑制癌细胞增殖、转移和血管生成。在异种移植模型中，青蒿素类药物的暴露显著减少了肿瘤体积和进展。然而，青蒿素在抗癌治疗中的应用还需要通过深入理解其细胞毒性作用的潜在机制来加以论证。青蒿素的主要靶点及其对异质性肿瘤细胞的特异性作用的化学基础尚待阐明。本文旨在提供关于这类药物作为潜在抗癌剂的最新进展和新发展的概述。 1. 引言 癌症仍然是一种威胁生命的疾病，并且是导致死亡的主要原因之一，因为其控制难度较大。尽管现有一系列基于化疗、手术和放射疗法的常规治疗方法，但在许多情况下这些方法的疗效有限。此外，目前的抗癌方案通常伴随着显著的毒性和耐药性问题。减轻癌症负担的一个主要挑战是开发具有高效性且对癌症具有特异性的药物，并且对正常哺乳动物细胞几乎没有或没有副作用。 许多研究项目致力于开发新的化疗药物，无论是通过探索新化合物的抗癌能力，还是通过评估传统上用于其他临床疾病的药物。天然产物已被发现是具有新颖且强效的生物活性化合物的重要来源，并且在体内副作用较小。植物衍生物已被证明对一系列疾病有效，并具有广泛的抗微生物活性，其中一些还表现出显著的抗肿瘤活性。其中一种有前途的化合物是青蒿素，这是一种具有抗癌特性的天然抗疟药。青蒿素及其衍生物常用于疟疾治疗，也在纳米到微摩尔范围内显示出对敏感和耐药性癌细胞系的强大抗癌活性。重要的是，青蒿素是极少数已被广泛用于抗疟疾治疗但没有显著副作用的药物之一，尽管已报告了耐药性。最近，越来越多的研究集中在青蒿素类药物的作用机制及其反应机制上。 在这篇综述中，我们将重新探讨青蒿素及其类似物作为抗癌剂的发展中的一些关键问题，以更好地理解其抗肿瘤效果的机制。从新获得的知识中，我们可以通过权衡青蒿素类药物的优势、局限性以及当前和未来的发展，来确定这一有前途的癌症药物研发领域中出现的研究问题，并解决未来的研究需求。 2. 青蒿素及其衍生物 青蒿素是一种含有1,2,4-三氧杂环结构的倍半萜内酯（sesquiterpene lactone）。这种内过氧化物化合物是从中国草药青蒿（Artemisia annua，或称为年蒿）中提取的，该草药已有两千多年的发热治疗历史。尽管青蒿素具有疗效，但其作为原型药物具有药代动力学的局限性。天然青蒿素在水或油中的溶解度低，生物利用度差，且在体内的半衰期较短（约2.5小时）。为了克服这些问题，三代青蒿素类内过氧化物，包括半合成衍生物和完全合成化合物已经被开发出来。迄今为止，青蒿素的两代半合成衍生物如青蒿琥酯（artesunate）、青蒿乙醚（arteether）、青蒿甲醚（artemether）和青蒿酮（artemisone）已被有效用于疟疾治疗，具有良好的临床疗效和耐受性。 半合成青蒿素类化合物是通过二氢青蒿素（DHA）制备的，DHA是青蒿素的主要活性代谢物。第一代半合成青蒿素类化合物包括青蒿乙醚和青蒿甲醚，这些是亲脂性的青蒿素类化合物，而青蒿琥酯是水溶性衍生物。第二代青蒿素类化合物青蒿酮表现出改善的药代动力学特性，包括更长的半衰期和更低的毒性。目前，青蒿琥酯是抗疟疾联合疗法中常用的衍生物。 完全合成的青蒿素衍生物也已通过保留赋予药物活性的内过氧化物基团而被设计出来。这些化合物可以通过简单的起始材料轻松合成，因此目前正处于密集开发阶段。 3. 青蒿素的抗肿瘤作用机制 在疟疾寄生虫中，青蒿素的内过氧化物基团已被证明具有药理学重要性，并负责其抗疟疾活性。内过氧化物键被认为是通过还原血红素（FPFeII）或亚铁（FeII）激活的，导致产生高度活性的碳自由基，这些自由基是非常强效的烷基化剂。自由基可能靶向寄生虫的必需大分子，导致寄生虫的死亡。然而，青蒿素的确切作用机制和主要靶点仍在研究中。在疟原虫中，有人提出青蒿素可能靶向线粒体、内质网和消化液泡等细胞器。一些推测的分子靶点包括血红素烷基化、蛋白质烷基化、Ca2+ ATP酶（SERCA）抑制、膜损伤和线粒体电位的丧失。尽管关于青蒿素激活和特定靶点的争论不断，但支持的证据表明，血红素或亚铁是其强效活性的必要条件。这一观察结果在其他系统中也得到了证实。在血吸虫中，青蒿素对虫体表皮的作用非常显著，这一活性也因铁的存在而增强。 有趣的是，青蒿素的强大抗癌作用也可以归因于内过氧化物键（红色方框）并共享相同的寄生虫化学基础。缺乏内过氧化物基团并不完全阻断抗癌活性，但会显著降低其细胞毒性，仅为具有三氧杂环结构化合物的五十分之一。残余抗癌活性可能与一种非过氧化物依赖机制有关。普遍认为，铁和血红素或血红素结合蛋白参与了青蒿素的生物还原激活。在大多数系统中，癌细胞预加载铁或铁饱和的全转铁蛋白（双铁转铁蛋白）会触发青蒿素的细胞毒性，某些细胞系中的青蒿素活性可提高至100倍。此外，与单独使用青蒿素相比，与铁载体化合物结合的青蒿素表现出更强的活性。最近的一项研究表明，使用血红素合成抑制剂琥珀酰乙酰丙酮进行化学调控会减少DHA在HL-60（人急性早幼粒白血病细胞）中的细胞毒性。这与之前的研究一致，这些研究表明，诱导血红素氧化酶随后下调血红素合成基因也可以抑制新型青蒿素二聚体在相同癌细胞系中的细胞毒性。同样，使用铁螯合剂去铁胺（DFO）治疗会使化合物失活。铁和血红素代谢可能在青蒿素选择性抗肿瘤活性中发挥重要作用。恶性细胞的持续增殖和生长需要更高的铁代谢以完成细胞生存过程。因此，癌细胞表现出转铁蛋白受体（TfR）水平的增加，这些受体负责铁的摄取和细胞内浓度的调节。癌细胞中TfR的表达水平可能因细胞系而异。然而，它们与正常细胞有显著差异，从而导致青蒿素及其衍生物的高选择性指数。Efferth等人报告说，白血病（CCRF-CEM）和星形胶质瘤（U373）细胞在细胞群体中表达TfR的比例分别为95%和43%，而正常单核细胞仅占约1%。通过用特异性单克隆抗体预处理阻断TfR可以阻断青蒿素的活性。 有假设认为，铁激活的青蒿素通过释放高度烷基化的碳中心自由基和活性氧（ROS）来诱导损伤。自由基可能在青蒿素处理的癌细胞中引发的细胞变化中起到作用，如增强的凋亡、细胞生长抑制、血管生成抑制和DNA损伤。几项研究还将青蒿素毒性与细胞分裂受阻、氧化应激水平升高、肿瘤侵袭抑制、迁移抑制和转移抑制联系在一起。ROS生成可能有助于青蒿素对癌细胞的选择性作用。由于肿瘤细胞对ROS损伤的脆弱性增强，因此它们表达抗氧化酶的水平较低，如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶，这与正常细胞相比更为明显。因此，增加氧化应激是抗癌药物常见的抗肿瘤机制。此外，青蒿素的选择性可能通过优先靶向癌症生物标志物或在正常分化组织中未检测到的癌基因和蛋白质的过度表达来增强。 3.1. 作为细胞毒性的主要效应的ROS生成 与疟原虫一样，青蒿素在癌细胞中的分子靶点仍有争议。尽管青蒿素在某些肿瘤细胞中引起的变化是一致的，但尚不清楚这种毒性是否依赖于特定的分子靶点。要对癌细胞产生作用，所需的药物浓度通常高于对疟原虫产生毒性的浓度。青蒿素、DHA、青蒿琥酯和青蒿甲醚在疟原虫中的48小时IC50（即使50%的抑制浓度）可低至15纳摩尔，而它们的抗癌活性是细胞系依赖性的，IC50在0.5至200微摩尔或更高之间波动。疟原虫对青蒿素的敏感性表明其具有特定的寄生虫靶点。相比之下，在癌细胞中，青蒿素的作用似乎更多是通过ROS生成等一般机制介导的。然而，有人建议，ROS介导的损伤可能由青蒿素激活附近的初始事件引发。在青蒿素处理的细胞中，显微镜分析显示在亚细胞结构中早期出现了类似坏死的形态变化，这些变化可能与ROS生成有关。 微阵列分析发现，青蒿素的作用似乎受到氧化应激酶表达的调节，包括过氧化氢酶、硫氧还原酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽S-转移酶家族。青蒿素敏感的细胞下调了氧化酶，而这些分子的过表达则使癌细胞的敏感性降低。直接证据表明，在HL-60细胞系中，早期（1小时）和快速的ROS生成与凋亡的诱导和青蒿素引发的损伤相关。此外，IC50与ROS水平直接相关。相反，在某些实验系统中，青蒿素的作用在抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸和1,2-二羟基苯-3,5-二磺酸（TIRON，一种铁螯合剂）的存在下得以逆转，导致细胞死亡的延迟。最近的一项研究表明，在青蒿琥酯处理的HeLa细胞中，在检测到细胞毒性之前（48小时），在16小时内ROS的生成已开始，表明这可能是青蒿素引发损伤的初始事件。线粒体中的电子传递链（ETC）被认为在ROS生成中起作用，但即使在缺乏ETC的HeLa细胞中仍检测到显著的细胞毒性，这表明细胞中可能存在其他的ROS来源。确实，新兴证据表明，在乳腺癌细胞中，氧化应激最初是在溶酶体中产生的，这是铁激活的青蒿琥酯作用的结果，类似于疟原虫中的情况。因此，线粒体内源性凋亡途径的激活是导致细胞死亡的下游事件。在这一模型中，青蒿素类药物可能通过负调控血红素合成进一步增加细胞毒性。 尽管在许多细胞系统中有越来越多的证据表明ROS介导的损伤，细胞损伤也与非氧化应激相关，尤其是新型青蒿素二聚体似乎在没有或极少ROS生成的情况下表现出抗肿瘤作用，但其细胞毒性机制仍在研究中。此外，目前尚不清楚青蒿素引发的坏死是否可能是一种非ROS依赖的细胞死亡机制。 青蒿素的抗肿瘤毒性似乎还受到钙代谢、内质网（ER）应激和翻译控制肿瘤蛋白（TCTP，一种结合钙蛋白）的调节，这些蛋白也被认为是寄生虫的靶标。尽管最初将TCTP基因（tctp）的表达与癌细胞对青蒿素的反应相关联，但尚未发现TCTP在青蒿素作用中的功能角色。 与疟原虫类似，青蒿素在癌细胞中作为靶标的作用也得到了研究。先前的证据表明，使用10微摩尔的青蒿素治疗会因抑制钙ATP酶而导致钙浓度增加。然而，研究表明，两种青蒿素二聚体的作用机制显示出通过ROS介导的强烈ER应激，这与抑制钙ATP酶无关。有趣的是，高活性的青蒿素二聚体和众所周知的钙ATP酶抑制剂他普吉林（thapsigargin）之间的行为相似，但由不同的分子事件介导。事实上，他普吉林缺乏内过氧化物基团，仅产生微弱的ROS水平。然而，ER似乎是青蒿素作用的重要部位，因为在HepG2细胞中，显示出青蒿素荧光衍生物优先在该细胞区室中积累。 青蒿素类药物已显示出多效性效应，跨越不同的实验系统。也有可能在不同癌细胞系中，青蒿素细胞毒性的潜在机制会因其特定标志或细胞系特征的变化而有所不同。这只有在类似条件下对不同细胞系中抗肿瘤细胞增殖的分子事件进行研究时才能得出结论。 4. 青蒿素作为抗癌药物 4.1 青蒿素及其衍生物的抗肿瘤作用 青蒿素及其许可的半合成青蒿素衍生物的显著抗肿瘤活性已在体外和动物模型中得到证实。大量研究集中于最活跃的化合物，即DHA和青蒿琥酯。一项研究测试了美国国家癌症研究所（NCI）开发治疗学项目的55种细胞系，显示青蒿琥酯对白血病、结肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、中枢神经系统（CNS）和肾癌细胞具有抑制活性。二氢青蒿素对胰腺癌、白血病、骨肉瘤和肺癌细胞也具有显著的抗肿瘤活性。此外，青蒿酮显示出比青蒿素更好的活性，并与其他抗癌药物具有显著的协同作用。 已发现青蒿素可通过直接诱导DNA损伤（基因毒性）或间接干扰涉及多种恶性肿瘤特征的信号通路来发挥作用。然而，直接的DNA损伤仅在特定系统中被描述，而间接作用在文献中更为常见。在胰腺细胞（Panc-1）中，青蒿琥酯引起DNA片段化和膜损伤。有趣的是，低剂量的青蒿琥酯与类似坏死的细胞死亡有关，而较高浓度则诱导细胞凋亡。损伤的程度和类型似乎取决于细胞系的表型和起源，并且可能随时间和剂量而异。值得注意的是，与缓慢生长的癌细胞相比，快速生长的细胞系对青蒿琥酯的敏感性更高。 此外，DHA、青蒿琥酯和青蒿甲醚可能通过调控协调生长信号、凋亡、增殖能力、血管生成和组织侵袭及转移的基因和蛋白来发挥作用。这些内过氧化物药物通过不同途径之间的复杂相互作用可能增强其抗癌效果，从而控制癌症并导致细胞死亡。 4.1.1 青蒿素抑制癌细胞增殖能力 在正常细胞中，细胞周期依赖性激酶（CDK）是将信号传递到细胞周期中以推动细胞分裂的蛋白质。正常的生长依赖于有效地传递信号以进行复制和分裂。癌细胞中的不受控制的增殖是由引发生长信号放大的突变、检查点的失调和对生长抑制因子丧失敏感性所致。异常的细胞生长也因程序性细胞死亡或凋亡的失调而被触发。青蒿素及其半合成衍生物能够通过扰乱细胞周期动力学或干扰增殖相关的通路有效地诱导癌细胞的生长抑制。二氢青蒿素和青蒿琥酯是非常有效的生长抑制剂，多项研究指出DHA是最有效的抗癌青蒿素类化合物（DHA > 青蒿琥酯 > 青蒿乙醚 > 青蒿甲醚）。最近，青蒿酮在包括黑色素瘤和乳腺癌细胞在内的7种细胞系中显示出惊人的抗肿瘤效果。青蒿素化合物已被证明对癌细胞具有细胞静止和细胞毒性作用。青蒿素诱导的生长抑制已在细胞周期的所有阶段中被报道；然而，更常见的是G0/G1到S期转变的抑制。在同一时间的所有细胞周期阶段的抑制被解释为细胞静止效应。在DHA处理后的骨肉瘤、胰腺癌、白血病和卵巢癌细胞中观察到了G2/M期的细胞周期阻滞。同样，青蒿琥酯在骨肉瘤、卵巢癌和其他不同的癌症细胞系中也抑制了G2期。 青蒿素类药物诱导的生长抑制的潜在机制包括细胞周期调控酶的表达和活性改变，如CDK2-4和6以及D型环素（G1期到S期转变）或CDK1和A型环素（G2/M期）。青蒿素的抗增殖作用引起CDK转录的下调，CDK启动子的抑制或p21、p27和CDK抑制剂的增加。增殖的抑制也可能归因于针对多个通路的相互作用蛋白的下调。研究表明，在胰腺细胞（BxPC3，AsPC-1）中，DHA处理通过降低增殖细胞核抗原（PCNA）和D型环素的水平来抑制细胞活力，同时伴随着p21的增加。同一系统的另一项研究显示，DHA通过抑制NF-κB因子的活化来对抗其在增殖（c-myc，cyclin D）和凋亡途径（Bcl2，Bcl-xl）中的靶标。DHA在肺癌细胞（SPC-A1）中还下调了存活蛋白，这是一种调节凋亡和G2/M期细胞周期进展的蛋白质。类似的效应在青蒿素处理的骨肉瘤细胞中也被报道。在前列腺癌中，DHA通过破坏Sp1（特异性蛋白1）和CDK4启动子的相互作用来诱导细胞周期阻滞。Sp1-CDK4复合物的解离促进了caspase的活化和细胞死亡。此外，一项研究发现青蒿琥酯作为拓扑异构酶II的抑制剂，通过与多个途径的相互作用来抑制生长。总体来说，青蒿素类药物似乎通过干扰不同癌症实体共有的多个途径来发挥作用。 4.1.2 青蒿素的促凋亡作用 凋亡是抗肿瘤治疗中广泛研究的机制，因为操纵这一过程是控制癌症的有效策略。这个细胞过程由Bcl2家族基因（促凋亡的Bax和抗凋亡的Bcl2）和它们对线粒体的影响介导。Bax/Bcl2比例的增加会诱导细胞色素c的释放，随后引发caspase的顺序活化，最终导致细胞死亡。 在许多癌症和细胞系中，凋亡是青蒿素引发的常见且快速的效应。200微摩尔DHA处理白血病细胞在1小时内诱导凋亡。青蒿素的敏感性与癌细胞系中抗凋亡（Bcl2）和促凋亡基因（Bax）的表达水平相关。在一般情况下，青蒿素的促凋亡效应归因于内源性途径的激活。因此，线粒体膜损伤被认为是细胞死亡事件级联中的关键环节。许多研究表明，青蒿素类化合物通过调节Bax/Bcl2比例来诱导凋亡。与这些观察结果一致，DHA和青蒿琥酯在一组骨肉瘤细胞中引起了细胞色素c的释放、Bax过表达、Bax/Bcl2比例的增加以及caspase 3和9的活化。DHA还激活了caspase 8并降低了CDC25B、cyclin B1和NF-κB的水平。在同一系统中，青蒿琥酯暴露耗尽了存活蛋白，这在DHA处理的肺癌细胞中也被发现具有促凋亡作用。 在肝癌细胞系中，DHA特别是在这个系统中，DHA和原型药物青蒿素似乎具有相似的效力。微阵列分析将c-MYC的表达水平与增强的DHA诱导凋亡相关联。高表达c-MYC的白血病（HL-60）和结肠癌细胞（HCT116）对DHA的促凋亡作用显著更敏感。此外，在HCT116细胞中敲低c-myc基因显著减少了DHA相关的细胞死亡。c-myc的下调也可能与该细胞系中G1期阻滞的诱导有关。在转移性黑色素瘤（A375，G361细胞系）和Jurkat T淋巴瘤细胞中，DHA的高凋亡作用与NOXA（一种促凋亡蛋白）的上调、caspase 3的激活以及氧化应激有关。在肺细胞中，DHA的促凋亡效应伴随着钙浓度的增加和p38的激活。 在某些研究中，还描述了作用于外源性凋亡途径的分子变化。DHA似乎通过增加不同前列腺癌细胞系中DR5（细胞死亡受体5）启动子的转录来诱导DR5表达。事实上，与TRAIL（一种DR5配体）的联合治疗在该系统中显著增强了DHA的促凋亡作用。 青蒿素类药物通常在大多数系统中促进凋亡而不是坏死，然而在某些情况下，已报告了凋亡和坏死的同时发生。诱导凋亡是青蒿素抗肿瘤作用的一个主要优势，因为它防止了坏死引起的炎症和细胞损伤的连带效应。在某些细胞系中，青蒿素诱导的坏死与ATP水平低和缺陷的凋亡机制有关。 4.1.3 青蒿素抑制转移和侵袭 恶性细胞的侵袭能力与癌症患者的高死亡率和发病率有关。癌细胞向其他器官的扩散是一个复杂的过程，涉及恶性细胞通过细胞外基质的侵袭、进入血液循环、并最终在远端器官中定植。为了实现侵袭，癌细胞需要失去E-钙粘蛋白（一种参与细胞-细胞粘附的钙结合跨膜分子）的表达或功能。多种基因编码的细胞外基质处理蛋白酶、运动因子和粘附蛋白也在转移过程中发挥作用。最近，PAI-1和TIMP-1被认为是内源性蛋白酶抑制剂，也被发现与癌症转移有关。青蒿素的一个重要益处是其在高度侵袭性和侵略性癌症实体中表现出的显著抗迁移活性。青蒿素的抗转移活性与基质金属蛋白酶（MMP）家族基因的表达变化以及它们对αvβ3整合素的影响有关。在肝癌细胞（HepG2和SMMC 7721）中，12.5微摩尔青蒿素的处理抑制了迁移，这与MMP2的减少以及TIMP-2的相应增加有关。通过增强E-钙粘蛋白活性和Cdc42的激活，青蒿素增加了细胞-细胞粘附，从而抑制了转移。此外，有研究发现，一些癌细胞可能具有在不同通路上共同作用的特定蛋白质。例如，在非小细胞肺癌和纤维肉瘤中，DHA处理引起了低水平的MMP2、MMP7或MMP9，这由AP-1和NF-κB的转激活或失活所驱动。早期研究表明，MMP2受Sp-1转录因子活性的调节，此外DHA诱导的Sp-1分子相互作用的破坏被认为是DHA在不同途径中调控效应的关键事件。其他研究发现，在小鼠肺Lewis癌中，青蒿素通过抑制血管内皮生长因子C（VEGF-C）介导的淋巴结转移和淋巴管生成受到抑制。 4.1.4 青蒿素对血管生成的抑制 随着恶性组织的生长，转移和实体瘤需要额外的血液供应才能生存和繁殖。因此，癌细胞通过调控参与新血管生成和重塑的蛋白质和通路来诱导新生血管形成。血管生成过程导致内皮细胞的增殖增加，这通过诱导血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、其受体和细胞因子而发生。这一事件通过多种机制发生，包括缺氧驱动的HIF-1α和芳香烃受体核转运蛋白（ARNT）表达的激活。血管生成的调控受到抑制血管生成的分子如血管抑素、内皮抑素、血小板反应蛋白、TIMP和PAI-1的介导。由于这些分子在肿瘤生存中的作用，促血管生成因子及其调控网络中的分子成为了重要的药物靶点。基于微阵列的研究显示，青蒿素、青蒿琥酯及其他衍生物通过调节血管生成因子的基因表达来抑制新生血管形成。青蒿素的作用似乎通过下调生长因子（VEGF、FGF）、HIF-1α、血管生成介导因子（ANG）、富含半胱氨酸的血管生成诱导物（CYR61）、一些金属蛋白酶（MMP9、MMP11和BMP1）以及胶原蛋白来介导。与此同时，青蒿素类药物引起了血管生成抑制剂的上调。这些发现得到了在不同系统中的实验研究支持，揭示了其他分子相互作用。50微摩尔DHA暴露在人的脐静脉内皮细胞中通过耗尽VEGF受体flt-1和KDR/flk-1的水平来抑制血管生成。类似的效果在淋巴内皮细胞和Lewis肺癌中得以再现。在胰腺细胞（BxPc-3）和BalB/c裸鼠中，DHA通过抑制NF-κB的DNA结合以及下调其与血管生成相关的靶标如VEGF、IL-8、COX2和MMP9，来抑制血管生成。先前已将NF-κB水平的降低与增殖和转移的抑制联系在一起，表明NF-κB调控可能在DHA在这一系统中的多模式作用中起到关键作用。NF-κB是调节多种过程的关键因子，并且在抗癌药物反应中发挥着重要作用。它被DNA损伤激活，并且在应对药物压力时是凋亡抵抗的介质。 青蒿素类药物还被赋予了其他抗癌特性。青蒿琥酯显示了逆转细胞转变、允许组织重新分化的能力，这通过负向调控Wnt信号通路来实现。值得注意的是，青蒿琥酯在分化程度较低的细胞系中更为有效。 4.2 青蒿素对耐药性癌细胞的抗肿瘤作用 成功抗癌治疗的一个主要障碍是随着时间的推移产生的耐药性。许多侵袭性肿瘤对抗癌治疗产生耐药性，而几乎没有化疗替代方案。耐药性的一个主要原因是由于膜蛋白泵的过表达而产生的药物外排，这导致无效的低药物浓度。青蒿素的抗癌活性在其他情况下耐药和多重耐药的癌细胞中表现出不受影响。一项使用55种NCI细胞系和微阵列分析的研究显示，与已确立的抗癌药物耐药相关的基因如MDR1（Pgp）、MRP1和BCRP对青蒿素的活性没有影响。当在多重耐药HL-60细胞系中过表达MRP-1和BCRP的细胞中观察到没有对青蒿琥酯的生长抑制曲线产生影响时，这一发现得到了进一步证实，这表明在存在其他药物耐药的情况下青蒿素的抗肿瘤活性得以保留。青蒿素对包括阿霉素、甲氨蝶呤和羟基脲耐药的细胞系在内的广泛耐药癌细胞系有效，并且没有交叉耐药性。进一步的研究表明，青蒿琥酯的促凋亡作用在阿霉素耐药的白血病细胞系中不受影响；相反，青蒿琥酯增强了阿霉素的促凋亡效应。在另一项研究中，青蒿琥酯的抗癌效力在化疗敏感和耐药的神经母细胞瘤细胞系和初级神经母细胞瘤培养物中得以保留。在这一系统中，青蒿琥酯对文斯汀、阿霉素、顺铂、托泊替康、麦法兰和足叶乙甙适应细胞的敏感性未受影响，IC50范围为1.4-2.7微摩尔，与亲本敏感细胞系相似。仅有一个细胞系对青蒿琥酯表现出低敏感性，这与ROS形成低和谷胱甘肽半胱氨酸合酶（GCL）表达增加有关。通过GCL抑制剂介导的谷胱甘肽耗尽改善了该细胞系对青蒿琥酯的敏感性。P-糖蛋白（Pgp）或p53的衰减没有影响青蒿琥酯的敏感性。DHA在某些细胞系如胆管癌（CL-6）和肝癌（Hep G2）中显示了最低的IC50值，与其他抗癌药物相比，这表明，MDR1、MRP1-2或MRP3的上调对药效没有影响。抗癌药物与青蒿素类药物之间缺乏交叉耐药性可能基于不同的药物作用机制和/或耐药机制。大多数传统抗癌药物是核苷类似物，而青蒿素的作用被认为是通过ROS依赖机制介导的。此外，在红髓性白血病和人类小细胞肺癌中，青蒿素对Pgp或MRP1没有显著的抑制作用，因此原则上膜蛋白泵的过表达可能不会影响青蒿素的药效。然而，在另一个系统中，青蒿素（原型药物）通过上调mdrp通过一种机制增加了对阿霉素的耐药性，这将在后面讨论。 4.3 青蒿素类药物与标准抗癌化疗的相互作用：用于癌症的青蒿素联合疗法（ACT）？ 现有的抗癌疗法主要针对癌细胞的增殖，通常采用化疗药物、离子辐射或直接对生长因子信号通路的毒性作用。在癌症的联合治疗中，青蒿素类药物的抗肿瘤作用可以提供独立的抗癌活性，并且不会增加额外的副作用。关于将青蒿素类药物与其他抗癌药物结合使用的益处进行了研究，显示青蒿素通过不同通路的多因素作用可能增强总体活性（协同作用）。 已有报道指出，耐药癌细胞系通过添加青蒿素到常规治疗中变得对治疗敏感（化疗增敏作用）。有趣的是，DHA和青蒿琥酯表现出最强的化疗增敏/协同效应，而原型药物青蒿素则仅表现出加成和拮抗作用。DHA显著增强了用于胰腺癌的抗癌药物吉西他滨的抗癌效果，这种药物随着时间的推移会产生耐药性。在胰腺细胞中的体内和体外分析显示，与单独使用吉西他滨相比，DHA引起的生长抑制和凋亡增加了4倍和2倍。DHA在增强吉西他滨活性的双重作用以及可能抵抗耐药性的效果归因于DHA对吉西他滨诱导的NF-κB激活的抑制及其对其靶标的作用。同样的效应在肝癌细胞系中得到了证实，无论它们的p53状态如何。DHA与吉西他滨联合使用时，肿瘤生长抑制作用增强了45%，而原型药物青蒿素仅诱导了加成效应。 与此一致的是，在Lewis肺癌细胞系中，DHA与环磷酰胺联合使用显示出更强的抗肿瘤活性，或者与顺铂联合使用在小鼠非小细胞肺癌A549细胞系中也表现出更强的抗肿瘤活性。在大鼠C6胶质瘤细胞中，添加1微摩尔DHA使得替莫唑胺（一种用于治疗脑癌的DNA烷化剂）的细胞毒性增加了177%。进一步的研究发现，DHA通过ROS生成促进了替莫唑胺的促凋亡和促坏死作用。最近，青蒿琥酯的抗癌活性在不同的联合治疗方案中得到了增强。与免疫调节药物来那度胺联合使用时，青蒿琥酯表现出显著的协同作用。 然而，青蒿素联合疗法的益处需要谨慎评估。治疗效果受到药物作用机制和特定系统和方案中多重相互作用的影响。最近的研究表明，在结肠癌和乳腺癌细胞中，吉西他滨与青蒿酮联合使用仅表现出加成效应。在结肠癌细胞（HT-29）中，有人提出青蒿素可能通过对抗阿霉素对NF-κB抑制的作用而削弱阿霉素的活性。同一研究的作者报告了在相同系统中，青蒿素通过不同机制诱导了阿霉素耐药性。因此，有人提出青蒿素暴露通过抑制SERCA引起钙的积累，导致Pgp上调，并导致阿霉素耐药细胞的产生。相反，使用钙螯合剂预处理可以使细胞恢复对阿霉素的敏感性。然而，尚未在这一系统中评价DHA和青蒿琥酯；尚不清楚这些最有效的化疗增敏剂在该细胞系中是否具有相似的效应。到目前为止，青蒿琥酯或DHA与阿霉素和比拉鲁宾联合使用显示出在白血病和人类小细胞肺癌耐药细胞系中的化疗增敏作用，但在敏感的亲本细胞系中没有进一步增加敏感性。化疗增敏作用与Pgp抑制无关。总体而言，这些证据表明DHA和青蒿琥酯具有显著增强抗肿瘤药物的能力并抵抗肿瘤耐药性。 青蒿素类药物还可以增强基于离子辐射的疗法。在U373MG胶质瘤细胞中，DHA处理抑制了辐射引起的GST表达并伴随ROS生成。与单独使用辐射或DHA相比，青蒿素联合治疗显示出更高的效果。青蒿素在其他癌症治疗中包括高压氧疗法中的辅助作用也有报道。 4.4 青蒿素耐药性 青蒿素的一个突出特点是，尽管青蒿素作为抗疟药物已使用了30年，但在体外或临床上尚未确认其耐药性。在临床上，曾有患者的治疗失败中报道了耐药性。然而，在体外，耐药菌株通常不稳定，通常在连续多年药物暴露后才会产生。青蒿素在不同癌症途径上的多模式作用也可能预示着在恶性细胞中延迟诱发耐药性。确实，只有少数细胞系表现出对青蒿素或其衍生物的低敏感性或无反应。例如，青蒿素（原型药物）在乳腺癌细胞（MCF-7）和胃癌细胞（MKN）中似乎活性较低。有些研究在乳腺癌细胞中建议青蒿素的反应可能由雌激素受体（ERα和ERβ）介导，这些受体参与细胞增殖。值得注意的是，有报道指出在乳腺癌细胞中，破坏铁代谢可能增强阿霉素和顺铂的效力。青蒿素反应较低还与高度转移性鼻咽癌细胞系（CNE-1，CNE-2）中过表达的BMI-1有关。最近的一项研究发现，在一个独特的顺铂化疗耐药细胞系中存在对青蒿琥酯和DHA的一定程度的交叉耐药性。这种效应可以通过L-丁氧基-S,R-磺氨酸（一种抗氧化剂GCL的抑制剂）部分逆转。 然而，在实验条件下，已在体外产生了耐药性。使用敲除和转染细胞进行的微阵列和实验研究表明，肿瘤抑制因子p16INK4A和抗氧化蛋白过氧化氢酶的上调可能赋予了青蒿琥酯独立于p53状态的耐药性。最近，有研究表明，在高转移性乳腺癌细胞中，用20微摩尔青蒿琥酯预孵育24小时会诱发耐药性。预处理的MDA-MB-231转移性细胞对进一步的青蒿琥酯治疗完全无反应，而在非转移性细胞系MDA-MB-468中，导致了敏感性较低的细胞。进一步研究表明，青蒿琥酯诱导耐药性和敏感性丧失与NF-κB、AP-1和NMP-1的上调转录有关，这些分子克服了青蒿琥酯的促凋亡和抗转移作用，并允许肿瘤进展。然而，目前尚不清楚青蒿琥酯诱导的耐药性和敏感性丧失是否在长期细胞亚培养后得以保留。还需要阐明其他半合成内过氧化物是否可能在这一细胞系中产生类似效应，或者联合治疗是否可能延迟或逆转这种效应。 5. 未来的研究方向：青蒿素作为抗癌药物的挑战和前景 青蒿素及其衍生物被认为是治疗癌症的新型药物候选者。然而，在其作为抗癌药物的发展和应用过程中，仍然存在一些挑战和未来研究方向。 5.1 青蒿素的靶向性和选择性 青蒿素的一个显著优势是其对癌细胞的选择性毒性。然而，为了进一步开发青蒿素类药物，了解其对不同癌症类型的特异性和靶向性是至关重要的。未来的研究需要深入探讨青蒿素在不同癌症细胞系中的作用机制，并鉴定其潜在的分子靶点。通过基因组和蛋白质组学分析，确定青蒿素在不同癌症中的特异性靶标，将有助于设计更有效的治疗策略。 5.2 青蒿素的药物耐受性和安全性 尽管青蒿素类药物在抗疟疾治疗中表现出良好的耐受性和安全性，但其在抗癌治疗中的长期使用是否会引发毒性或耐药性仍需进一步研究。此外，青蒿素类药物的药代动力学特性也需要进一步优化，以提高其在癌症治疗中的疗效和安全性。未来的研究应致力于开发具有更好药物代谢特性的新型青蒿素衍生物，并评估其在临床应用中的长期安全性。 5.3 青蒿素的联合治疗 青蒿素类药物与其他抗癌药物联合使用的潜力已在一些研究中得到初步证实。然而，联合治疗的具体机制和最佳组合方案尚未完全明确。未来的研究应进一步探讨青蒿素与其他抗癌药物之间的协同作用，尤其是在克服耐药性癌症中的应用。此外，还需要研究青蒿素与放射治疗或免疫治疗的联合效果，以探索其在多模式治疗中的潜力。 5.4 青蒿素的临床转化 尽管青蒿素类药物在实验室研究中显示出显著的抗癌活性，但其临床应用仍处于早期阶段。未来的研究应集中于青蒿素类药物的临床试验，以验证其在癌症患者中的疗效和安全性。此外，还需探索青蒿素在不同癌症阶段和类型中的应用，包括早期预防、中期治疗和晚期癌症的治疗。 6. 结论 青蒿素及其衍生物作为一种具有潜力的抗癌药物，展示了显著的抗肿瘤活性，尤其在某些耐药性癌症中表现出卓越的效果。然而，青蒿素类药物在抗癌治疗中的应用仍面临挑战，未来需要通过深入研究和临床验证，进一步了解其作用机制和优化其治疗效果。随着科学研究的不断推进，青蒿素有望成为一种有效的抗癌药物，为癌症患者提供新的治疗选择。 BioMed Research International - 2011 - Crespo-Ortiz - Antitumor Activity of Artemisinin and Its Derivatives From a.pdf 抗肿瘤活性的青蒿素及其衍生物：从一种广为人知的抗疟药到一种潜在的抗癌药物.pdf 抗肿瘤活性的青蒿素及其衍生物：从一种广为人知的抗疟药到一种潜在的抗癌药物.docx

关于Artesunate联合其他药物在癌症治疗中的研究资料，这些研究探讨了Artesunate与其他药物的联合使用，以增强抗癌效果： 1. Artesunate与顺铂（Cisplatin）联合使用： 文献: "Artesunate synergizes with cisplatin to induce apoptosis in cancer cells" - 该研究探讨了Artesunate与顺铂联合使用在多种癌症细胞中的效果，特别是在顺铂耐药性细胞中的应用。 关键点: 研究发现，Artesunate能够增强顺铂在体外和体内模型中的抗癌效果，通过加剧活性氧（ROS）生成，促进癌细胞的凋亡。顺铂与Artesunate的组合显示出更强的细胞毒性作用，并且可以克服顺铂耐药性。 2. Artesunate与多柔比星（Doxorubicin）联合使用： 文献: "Synergistic anticancer activity of artesunate and doxorubicin in breast cancer cells" - 该研究分析了Artesunate与多柔比星在乳腺癌细胞中的联合治疗效果。 关键点: 研究显示，Artesunate能够增强多柔比星的抗癌效果，减少多柔比星所需的有效剂量，从而降低其副作用。两者的组合通过共同作用于DNA和ROS途径来促进癌细胞凋亡。 3. Artesunate与贝伐珠单抗（Bevacizumab）联合使用： 文献: "Combination therapy of artesunate and bevacizumab enhances anti-angiogenic effects in ovarian cancer" - 该研究探讨了Artesunate与抗血管生成药物贝伐珠单抗在卵巢癌中的联合使用。 关键点: 研究发现，Artesunate与贝伐珠单抗的组合能够更有效地抑制肿瘤血管的形成，减少肿瘤的血液供应，从而抑制肿瘤的生长和扩散。此组合显示出较单一药物更显著的抗肿瘤效果。 4. Artesunate与帕博利珠单抗（Pembrolizumab）联合使用： 文献: "Immunomodulatory effects of artesunate combined with pembrolizumab in melanoma treatment" - 该研究探索了Artesunate与免疫检查点抑制剂帕博利珠单抗在黑色素瘤治疗中的效果。 关键点: 研究表明，Artesunate能够增强帕博利珠单抗的免疫调节作用，通过增强T细胞的抗肿瘤活性，提高免疫系统对黑色素瘤的攻击力。组合治疗在动物模型中显示出显著的肿瘤抑制作用。 5. Artesunate与雷帕霉素（Rapamycin）联合使用： 文献: "Synergistic anticancer effects of artesunate and rapamycin in non-small cell lung cancer" - 该研究探讨了Artesunate与mTOR抑制剂雷帕霉素在非小细胞肺癌中的协同效应。 关键点: 研究发现，Artesunate与雷帕霉素的联合使用能够更有效地抑制非小细胞肺癌的生长。Artesunate通过诱导细胞凋亡，雷帕霉素通过抑制细胞增殖，二者的组合展现出比单一药物更强的抗癌效果。 6. Artesunate与阿帕替尼（Apatinib）联合使用： 文献: "Combination of artesunate and apatinib enhances anti-tumor activity in hepatocellular carcinoma" - 该研究分析了Artesunate与阿帕替尼在肝细胞癌中的联合使用效果。 关键点: 研究结果表明，Artesunate与阿帕替尼的组合在抑制肿瘤生长和诱导癌细胞凋亡方面具有协同作用。组合治疗显著降低了肿瘤的体积，并减少了癌细胞的存活率。 7. Artesunate与厄洛替尼（Erlotinib）联合使用： 文献: "Enhanced efficacy of artesunate combined with erlotinib in EGFR-mutant lung cancer" - 该研究探讨了Artesunate与EGFR抑制剂厄洛替尼在EGFR突变肺癌中的联合使用。 关键点: 研究发现，Artesunate与厄洛替尼的联合治疗能够有效抑制EGFR突变肺癌细胞的增殖，并增加细胞对厄洛替尼的敏感性。此组合显示出更高的抗癌效果，并延长了动物模型的生存期。 这些研究表明，Artesunate作为一种辅助药物，与多种抗癌药物的联合使用在多种癌症类型中显示出协同效应。此类组合治疗可能为癌症治疗提供新的策略，尤其是在面对耐药性或复发性癌症时。

标题： Artesunate与顺铂联合抑制HNSCC细胞生长并通过Artesunate诱导Rb和磷酸化Rb水平的降低来促进细胞凋亡 摘要： 顺铂（Cisplatin）是用于头颈鳞状细胞癌（HNSCC）的一种标准化疗药物。然而，由于其副作用，例如肾毒性，其在某些患者中使用受到限制，尤其是在老年人和肾功能受损者中。近年来，开发为抗疟药的青蒿素（Artemisinin）已显示出抗肿瘤活性，特别是在与其他抗癌药物联合使用时。本研究评估了青蒿素及其衍生物与顺铂和铁结合使用时对HNSCC细胞系的抗肿瘤效果。通过细胞活力测定（WST-1测定）评估细胞增殖；通过流式细胞术分析细胞周期；使用Annexin V和碘化丙啶染色分析细胞死亡率，并通过蛋白质印迹法（Western blotting）评估视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）、磷酸化Rb（p-Rb）以及其他与细胞周期相关的分子。研究表明，青蒿素衍生物中的Artesunate和二氢青蒿素（DHA）显示出显著的生长抑制作用。此外，发现Artesunate与顺铂及铁的组合抑制了细胞增殖并引发了S/G2-M期的细胞周期阻滞。蛋白质印迹分析显示，Artesunate不仅引起了Rb的丧失，还导致了p-Rb的减少。这些结果表明，Artesunate在与顺铂联合使用时可能是一种有用的抗癌药物。 引言： 2018年，头颈癌占所有癌症的8%（约145万人），并且其相关死亡占所有癌症死亡的5%（约50万人）。这一癌种的发病率每年都在增加。头颈癌的主要形式是头颈鳞状细胞癌（HNSCC），其标准治疗包括化疗、放疗和手术。在化疗中，顺铂是主要药物，通常单独或与其他药物联合使用。顺铂的标准剂量为80-100 mg/m²，然而，其有效反应率仅为25-50%。此外，顺铂在肾功能受损患者中使用受到限制，这限制了其在老年患者中的应用。因此，目前尚无针对肾功能受损患者的HNSCC标准治疗方案，迫切需要开发新的治疗方法。 近年来，青蒿素作为一种从青蒿（Artemisia annua）中提取的传统中草药，因其较低的毒性受到关注。青蒿素的半合成衍生物Artesunate表现出增强的效果，并已被用于疟疾治疗。此前的研究表明，青蒿素及其衍生物对多种人类癌症细胞显示出潜在的抗肿瘤作用。例如，Sun等人报道，青蒿素及其衍生物对小鼠白血病细胞系和人类肝癌细胞系具有抗肿瘤作用。自此，青蒿素及其衍生物的抗肿瘤效果在多种肿瘤中得到了验证。 之前的研究表明，Artesunate显示出抗肿瘤活性。虽然Artesunate与其他化疗药物的联合效果已在胶质瘤和肝癌中得到了验证，但在头颈癌中的抗肿瘤效果仅有少数报道。本研究旨在评估Artesunate与顺铂及铁联合使用对HNSCC细胞系的抗肿瘤作用，并探讨其对与细胞增殖相关的分子表达的影响。 材料与方法 细胞系： 在本研究中，使用了HNSCC细胞系UM-SCC-23和UM-SCC-81B。细胞系在含有1%青霉素-链霉素溶液和10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，于37°C、5% CO₂的条件下培养。 细胞活力测定： 使用WST-1试剂盒进行细胞活力测定。实验中使用的药物包括青蒿素及其衍生物Artesunate、顺铂和铁。UM-SCC-23和UM-SCC-81B细胞分别以1.7×10³和1.0×10³细胞/孔的密度接种于96孔平底板中。次日，在每个孔中加入药物，并继续培养。药物处理72小时后，加入WST-1试剂并孵育3小时，使用微孔板读数仪测量450 nm和650 nm的吸光度，以测量细胞活力。 细胞周期和凋亡分析： 为了分析细胞周期，UM-SCC-23和UM-SCC-81B细胞分别以0.5×10⁵和0.3×10⁵细胞/孔的密度接种于六孔板中。次日，加入Artesunate、顺铂和/或硝酸铁，孵育72或96小时后收集细胞，进行PI染色后通过流式细胞仪分析细胞周期分布。 为了分析凋亡，UM-SCC-23和UM-SCC-81B细胞分别以1.0×10⁵和0.5×10⁵细胞/孔的密度接种于六孔板中，24小时后加入Artesunate、顺铂和硝酸铁，孵育48或72小时后，使用Annexin V-FITC试剂盒进行染色，并通过流式细胞仪测量凋亡率。 蛋白质印迹分析： 为了进行蛋白质印迹分析，UM-SCC-23和UM-SCC-81B细胞分别以0.5×10⁶和0.3×10⁶细胞/孔的密度接种于六孔板中，24小时后加入Artesunate、顺铂和硝酸铁，孵育72或96小时后，用RIPA裂解液裂解细胞。裂解物通过SDS-PAGE进行分离，并通过半干转印法转移到PVDF膜上。膜用5%的BSA在室温下封闭1小时，并使用特异性抗体（如抗Rb、抗p-Rb）在4°C孵育过夜。随后，使用HRP结合的二抗孵育1小时，并通过增强化学发光（ECL）法检测蛋白质信号。 将针对视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）的siRNAs转染入HNSCC细胞系，并评估其对细胞增殖和细胞周期的影响 转染实验： HNSCC细胞系UM-SCC-23和UM-SCC-81B的细胞被转染了靶向视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）的小干扰RNA（siRNA）。具体来说，细胞以50%-60%的汇合度接种在六孔板中，并在无抗生素的培养基中孵育。随后，使用Lipofectamine™ RNAiMAX转染试剂（Thermo Fisher Scientific）按照制造商的说明进行siRNA转染。对于每个实验，分别使用针对视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）的siRNA和无关靶标的阴性对照siRNA。转染后24小时，将细胞置于含有10%胎牛血清的完全培养基中继续孵育。 细胞增殖检测： 为了评估siRNA转染对细胞增殖的影响，使用WST-1测定法。转染24小时后，细胞被再接种到96孔板中，每孔接种的细胞数为1,000个。随后，继续培养72小时，并按照制造商的说明使用WST-1试剂盒进行检测，测定在450 nm和650 nm下的吸光度，以评估细胞增殖情况。 细胞周期分析： 转染后48小时，将细胞收集并固定在70%乙醇中，随后在4°C下孵育过夜。固定后，细胞用PBS洗涤，并用含有RNase A和碘化丙啶的溶液重悬。然后，使用流式细胞仪进行分析，以评估细胞周期分布。使用ModFit LT软件（Verity Software House）进行数据分析。 结果： 视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）敲降对细胞增殖的影响：与对照组相比，转染了靶向视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）的siRNA显著抑制了UM-SCC-23和UM-SCC-81B细胞的增殖。这表明视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）在这些细胞系的增殖中发挥了关键作用。 细胞周期分析：流式细胞仪分析显示，视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）敲降导致G1期细胞比例的显著增加，同时S期和G2/M期的细胞比例减少。这些结果表明，视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）在调节细胞周期进程中起到了重要作用，尤其是在从G1期向S期的转变中。 实验和结果 1. Artesunate对HNSCC细胞系增殖的影响 为了确定Artesunate对HNSCC细胞系的抑制效果，使用了WST-1细胞活力测定法。UM-SCC-23和UM-SCC-81B细胞在24、48和72小时后暴露于不同浓度的Artesunate（0、10、20、40、80 µM），随后测量细胞活力。结果显示，Artesunate以剂量和时间依赖性的方式显著抑制了细胞增殖。特别是，当浓度达到40 µM时，细胞活力显著下降，这表明Artesunate具有显著的抗增殖效果。 2. Artesunate与顺铂联合使用的协同效果 为了进一步探讨Artesunate与顺铂联合使用的效果，实验分析了两者的协同作用。UM-SCC-23和UM-SCC-81B细胞被暴露于不同组合的Artesunate（10 µM）和顺铂（1 µM），分别在24、48和72小时后测定细胞活力。结果表明，联合治疗的细胞活力显著低于单独使用Artesunate或顺铂的情况，这表明两者具有协同的抗肿瘤效果。 3. Artesunate对细胞周期的影响 为了分析Artesunate对细胞周期的影响，使用流式细胞术检测UM-SCC-23和UM-SCC-81B细胞在处理24、48和72小时后的细胞周期分布。结果显示，与对照组相比，Artesunate处理组在G2/M期的细胞比例显著增加，而在G0/G1期的细胞比例显著减少。这表明Artesunate可能通过阻止细胞从G2/M期进入细胞分裂过程，诱导细胞周期阻滞。 4. Artesunate诱导的凋亡 为了进一步探讨Artesunate对HNSCC细胞凋亡的影响，使用Annexin V/PI双染法通过流式细胞术分析了凋亡细胞的比例。UM-SCC-23和UM-SCC-81B细胞在处理24、48和72小时后的凋亡率显著增加，尤其是在联合治疗组中，凋亡细胞比例远高于单独使用Artesunate或顺铂的组。这一结果表明，Artesunate能够通过促进细胞凋亡来增强其抗肿瘤活性。 5. Artesunate对Rb和p-Rb表达的影响 为了进一步探讨Artesunate在细胞周期调控中的作用，分析了Rb和p-Rb蛋白的表达。通过蛋白质印迹分析，发现Artesunate显著降低了UM-SCC-23和UM-SCC-81B细胞中Rb和p-Rb的表达水平，尤其是在高浓度Artesunate处理后。这表明Artesunate可能通过影响Rb和p-Rb的表达来阻滞细胞周期，从而发挥抗肿瘤作用。 6. Rb基因敲除对细胞周期和增殖的影响 为了验证Rb在细胞周期和增殖中的关键作用，实验中使用了小干扰RNA（siRNA）敲除Rb基因。成功敲除Rb基因后，UM-SCC-23和UM-SCC-81B细胞的增殖显著受抑，且G1期细胞比例显著增加，这与之前的Artesunate处理实验结果一致。这些发现进一步支持了Rb在细胞周期调控中的关键作用，并表明通过调控Rb的表达，Artesunate能够有效抑制HNSCC细胞的增殖。 讨论 本研究系统地评估了Artesunate与顺铂联合使用对HNSCC细胞的抗肿瘤效果，并深入探讨了Artesunate在细胞周期和凋亡中的分子机制。研究结果表明，Artesunate能够以剂量和时间依赖的方式显著抑制HNSCC细胞的增殖，并通过影响Rb和p-Rb的表达，诱导细胞周期阻滞和凋亡。此外，Artesunate与顺铂的联合治疗表现出强烈的协同效应，进一步增强了其抗肿瘤活性。 研究还发现，Artesunate通过下调Rb和p-Rb的表达，可能干扰了细胞周期的正常进程，特别是在G1期向S期的转换过程中。这一发现为Artesunate作为HNSCC治疗药物的潜力提供了新的见解，并为未来的临床研究奠定了基础。 结论 本研究表明，Artesunate与顺铂联合使用可显著增强其抗HNSCC细胞的效果。Artesunate不仅通过下调Rb和p-Rb的表达，阻滞细胞周期，还通过促进细胞凋亡来增强其抗肿瘤活性。这些发现支持Artesunate作为一种有前景的抗癌药物，特别是在头颈鳞状细胞癌的治疗中。 2023 年 6 月 19 日在线出版。doi : 10.3892/or.2023.8591

标题： Artesunate与Navitoclax联合在高级别浆液性卵巢癌模型中的抗肿瘤药物协同作用 引用： McCorkle, J.R.; Ahn, R.; Cao, C.D.; Hill, K.S.; Dietrich, C.S.; Kolesar, J.M. Artesunate与Navitoclax联合在高级别浆液性卵巢癌模型中的抗肿瘤药物协同作用. 《癌症》 2024, 16, 1321. DOI: https://doi.org/10.3390/cancers16071321. 学术编辑： Alexandre Escargueil 接收日期：2024年3月4日 修订日期：2024年3月22日 接受日期：2024年3月25日 发布日期：2024年3月28日 摘要： Artesunate属于从青蒿（Artemisia annua）植物提取的药物类别，称为青蒿素类。Artesunate传统上用于治疗严重的疟疾，但也表现出对多种恶性肿瘤（包括卵巢癌）的抗肿瘤活性。数据表明，Artesunate通过加剧细胞氧化应激，触发凋亡。在本研究中，我们研究了Navitoclax（一种Bcl-2家族抗凋亡蛋白的抑制剂）是否能增强Artesunate在卵巢癌细胞中的疗效。Artesunate和Navitoclax作为单一药物都在二维和三维卵巢癌细胞模型中表现出抗增殖作用。在将Navitoclax与Artesunate结合后，我们在每个测试的二维细胞系和卵巢肿瘤类器官模型中观察到抗肿瘤药物的协同作用。进一步使用腹腔CAOV3异种移植模型在BALB/scid小鼠中研究这种药物组合，显示Artesunate/Navitoclax组合优于单一的Artesunate和安慰剂对照组，但未优于单一的Navitoclax。通过优化，这种药物组合可能为卵巢癌提供新的治疗选择，值得进一步的临床前研究。 关键词： Artesunate；Navitoclax；药物协同作用；卵巢癌 1. 引言 卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤，2023年美国估计有13,270例死亡病例。虽然卵巢癌仅占所有新发癌症病例的1%，但其年死亡率估计为2.2%。由于死亡率高于发病率且五年生存率仅为50%左右，因此寻找改善卵巢癌治疗效果的策略至关重要。 卵巢癌的一线治疗包括细胞减灭术和以紫杉烷和铂类药物为基础的辅助化疗，这一方案在过去30年中几乎没有变化。最近，某些患者接受了贝伐珠单抗和/或PARP抑制剂的维持治疗，后者对BRCA突变型卵巢癌（约占所有病例的15%）特别有益。然而，超过70%的患者在诊断时处于晚期，且多达80%的患者会复发并最终死于其疾病，这突显了新治疗方法的迫切需要。 Artesunate是一种青蒿素的半合成衍生物，青蒿素是从青蒿（Artemisia annua）植物中提取的，该植物在中国草药中已作为退烧剂使用了2000多年。Artesunate目前用于治疗疟疾，但也显示出在广泛的癌细胞系中具有抗肿瘤活性，包括卵巢癌。Artesunate的主要抗癌机制被认为是生成活性氧（ROS），导致DNA和蛋白质的氧化损伤，从而引发凋亡。四十年的疟疾治疗和癌症临床试验已经表明，Artesunate的耐受性良好。 Navitoclax是一种小分子Bcl-2家族（即BCL2、BCL2L1、BCL2L2）抗凋亡蛋白的抑制剂，已在卵巢癌的临床前模型中表现出活性，包括一种25例高级别浆液性卵巢癌的体外模型。基于有前景的临床前数据，Navitoclax作为单一药物在一项包括45名重度治疗的高级别浆液性、铂类耐药或复发性卵巢癌患者的二期试验中进行了评估。在此试验中，Navitoclax显示出有限的活性，只有一名患者达到部分缓解，虽然不良反应可接受，但血小板减少症是主要的毒性。在其他癌症中，Navitoclax与化疗联合使用已显示出有效性，但受到毒性的限制。 由于Artesunate能诱导凋亡，评估利用Bcl-2蛋白抑制剂的潜在药物协同作用是一条可行的研究路径，这也可能改善Navitoclax单一药物的活性。此外，两种药物的可接受毒性特征使它们成为临床研究的有吸引力的候选药物。虽然青蒿素类已在白血病和非小细胞肺癌细胞中与Bcl-2抑制剂联合进行了临床前评估，但尚未在卵巢癌中研究Artesunate与Navitoclax的联合应用。我们使用2D和3D人类卵巢肿瘤模型，体外和体内评估了该方案的抗肿瘤疗效。 2. 材料与方法 2.1 二维细胞培养 四种高级别浆液性卵巢癌细胞系（OVCAR3、UWB1.289、CAOV3和OV-90）购自ATCC。细胞在37°C和5% CO2的恒定条件下培养，每周传代2到3次。OVCAR3细胞在RPMI-1640基础培养基中生长，含20%胎牛血清和0.01 mg/mL牛胰岛素；UWB1.289细胞在RPMI-1640与乳腺上皮细胞生长培养基（MEGM）按1:1比例混合的培养基中生长，补充有3%胎牛血清；CAOV3细胞在含10%胎牛血清的DMEM中生长；OV-90细胞在MCDB 105与199培养基按1:1混合的培养基中生长，补充有15%胎牛血清。 2.2 二维细胞活力检测 将3 × 10^3细胞接种到96孔白色壁微孔板中，在100 µL生长培养基中培养并在37°C、5% CO2条件下孵育24小时。随后去除生长培养基，替换为含药物的培养基或作为阴性对照的空白培养基。每个细胞系在逐级稀释的Navitoclax或Artesunate中培养72小时。Artesunate的药物浓度范围为0.05 µM到100 µM（12个浓度；4倍稀释）；Navitoclax浓度范围为0.01 µM到25 µM（12个浓度；2倍稀释）。处理后，使用CellTiter-Glo 2.0细胞活力测定（Promega，东京中央）测量细胞活力，并用未经处理的对照细胞进行标准化（药物处理的发光值/未经处理的平均发光值×100）。使用R统计软件包drc中的四参数对数对数非线性模型确定每种药物在每个细胞系中的IC50值。 2.3 二维药物组合/协同分析 使用上述方法，经过72小时的处理后，测定细胞活力。Artesunate和Navitoclax单独和组合进行测试，采用6 × 6完全因子协同研究设计，每个细胞系至少进行了3次独立实验。测试的Artesunate浓度范围为0 µM到200 µM，Navitoclax浓度范围为0 µM到40 µM。使用R统计软件中的synergyfinder包分析药物协同作用，协同评分使用Loewe加成模型实现。 2.4 三维肿瘤类器官培养 肿瘤类器官细胞系UK1254建立于Markey癌症中心49岁患者的晚期上皮性卵巢癌。类器官在37°C和5% CO2的恒定条件下培养，每周传代一次，每周更换培养基两次。细胞在Corning® Matrigel®生长因子减少的基质胶中生长。基础培养基为Advanced DMEM/F12，添加了从HEK293 RSPO-1表达细胞中获得的R-Spondin-1(RSPO-1)条件培养基（20%体积/体积）、Wnt-3A（50 ng/mL）、FGF10（100 ng/mL）、Noggin（100 ng/mL）、EGF（10 ng/mL）、A83-01（500 nM）、Y-27632（9 µM）、B27补充剂（2%体积/体积）、N2补充剂（1%体积/体积）、烟酰胺（1 mM）、Glutamax（2 mM）、HEPES（10 mM）和primocin（50 µg/mL）。 2.5 类器官活力测定 UK1254类器官在逐级稀释的Navitoclax或Artesunate中生长72小时。使用CellTiter-Glo 3D细胞活力测定（Promega）测量细胞活力。使用高通量成像评估细胞活力，并与未经处理的对照细胞进行比较，以确定每种药物浓度下的反应。使用四参数对数对数非线性回归模型确定每种药物的IC50。测试了6个浓度，Artesunate的范围为0 µM到16 µM（10倍稀释），Navitoclax的范围为0 µM到12.5 µM（2倍稀释）。 2.6 类器官药物组合/协同分析 使用上述细胞增殖测定方法生成剂量反应数据。药物组合对每种药物的五种逐级稀释浓度进行了测试，使用第六种浓度作为对照。使用R统计软件中的Bioconductor synergyfinder包评估药物组合对药物-药物相互作用的影响。协同评分使用Loewe加成模型、Bliss独立模型、最高单一药物模型（HSA）和零相互作用效能模型（ZIP）实现。协同评分=0表示加成；评分>0表示协同作用；评分<0表示拮抗作用。Artesunate的浓度范围为0 µM到50 µM（4倍稀释），Navitoclax的浓度范围为0 µM到12.5 µM（2倍稀释）。 2.7 凋亡检测 将CAOV3和OVCAR3卵巢癌细胞（4 × 10^5）接种到60 mm培养皿中，并在37°C、5% CO2条件下孵育24小时。然后用10 µM Navitoclax、25 µM Artesunate（OVCAR3）或50 µM Artesunate（CAOV3）处理细胞48小时。为了评估药物组合，细胞还被处理10 µM Artesunate和/或10 µM Navitoclax 48小时。去除培养基后，用D-PBS洗涤细胞，并使用Accutase细胞分离溶液（BD Biosciences）分离细胞。收集细胞，离心5分钟（300×g），用冰冷的D-PBS洗涤两次，然后重悬于1X Annexin V结合缓冲液（BD Biosciences）中。将细胞通过70 µm的筛网过滤，然后使用FITC Annexin V凋亡检测试剂盒I（BD Biosciences）用FITC-Annexin V和碘化丙啶标记15分钟。随后通过流式细胞仪分析细胞。 2.8 体内异种移植小鼠模型 动物研究经肯塔基大学机构动物护理和使用委员会批准。BALB/c scid（CBySmn.Cg-Prkdcscid/J）小鼠购自Jackson实验室，并在无病原体的条件下饲养在屏障笼中。 通过使用pLL-CMV-rFLuc-GFP-mPGK-Puro Lenti-Labeler慢病毒载体对CAOV3细胞进行慢病毒转染，生成表达荧光素酶和GFP的CAOV3细胞（CAOV3-luc）。通过在含有1 µg/mL嘌呤霉素的CAOV3培养基中培养2周，选择转染细胞。通过FACS进一步富集GFP阳性细胞，收集最高GFP表达的25%细胞。筛选后的细胞在含1 µg/mL嘌呤霉素的培养基中维持。 将六周龄的雌性BALB/c scid小鼠腹腔注射1.25 × 10^7 CAOV3-luc细胞。为了监测细胞移植，小鼠通过腹腔注射IVIS-brite D-荧光素钾盐（150 mg/kg，PerkinElmer）。小鼠通过3%异氟烷吸入麻醉，并使用Lago光学成像系统（Spectral Instruments）每周成像一次，以评估注射后5-15分钟的全身生物发光。使用Aura图像分析软件（版本4.0.7，Spectral Instruments）定量生物发光。 使用8只肿瘤负担相当的小鼠组进行治疗效果评估，随机分配为安慰剂对照组、单一Artesunate治疗组、单一Navitoclax治疗组或Artesunate与Navitoclax联合治疗组。各组的肿瘤负担在开始治疗时通过生物发光测量相等。Artesunate和Navitoclax购自MedChemExpress，并在10% DMSO、40% PEG-300、5% Tween-80和45%生理盐水中制备。治疗每天一次，持续5天（周一至周五），共8周。Navitoclax的剂量为50 mg/kg。Artesunate的剂量为50 mg/kg，持续4周，然后增加到100 mg/kg，持续接下来的4周。治疗期间，每周按上述方法进行生物发光成像。 2.9 统计分析 统计分析使用R（版本4.0.1）或GraphPad Prism进行。统计显著性设定为*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。 3. 结果 3.1 单一药物敏感性分析 我们在一组人类高级别浆液性卵巢癌细胞系中评估了对Artesunate的相对新生敏感性，包括CAOV3、OVCAR3、OV-90和BRCA1缺失的UWB1.289细胞。由于Artesunate对卵巢癌细胞增殖的时间依赖性作用，我们选择在治疗72小时后评估细胞活力，这与之前的研究一致。进行了细胞活力测定，并计算了IC50值。不同细胞系之间的Artesunate敏感性相差约10倍。OV-90细胞中的Artesunate IC50值显著高于CAOV3、UWB1.289和OVCAR3细胞。 图 1. 卵巢癌细胞系对单一药物青蒿琥酯和纳维托克治疗的敏感性。（A）卵巢癌细胞系在青蒿琥酯治疗 72 小时或纳维托克治疗后估计的 IC 50值。 （C ）在新型卵巢肿瘤类器官系 UK1254 中以类似的方式确定的青蒿琥酯和纳维托克的 IC50 值。箱线图和晶须线分别表示四分位距和最小/最大值，中位数显示为箱内的线。采用单因素方差分析和 Tukey 多重比较事后检验进行统计分析（* p < 0.05；** p < 0.01；*** p < 0.001）。 我们之前的研究表明，Artesunate暴露会诱导癌细胞凋亡；因此，我们旨在确定通过抑制Bcl-2家族的抗凋亡蛋白是否能增强Artesunate在卵巢癌细胞中的疗效。Navitoclax属于BH3模拟物小分子抑制剂家族，能抑制Bcl-2、Bcl-xL和Bcl-w。在卵巢癌细胞系中评估了对Navitoclax的敏感性，CAOV3、UWB1.289、OV-90和OVCAR3细胞的平均IC50值分别为3.33 µM、3.53 µM、7.93 µM和13.33 µM。Navitoclax在OVCAR3细胞中的IC50值显著高于其他细胞系。 新型上皮性卵巢癌类器官UK1254也被评估了对Artesunate和Navitoclax的敏感性。UK1254类器官的Artesunate IC50均值为4.15 µM，Navitoclax IC50均值为3.80 µM，与在二维细胞系中观察到的值相当。 3.2 Artesunate与Navitoclax联合 为了确认在我们的模型系统中观察到的Artesunate介导的细胞活力损失确实是由凋亡引起的，我们对Artesunate敏感的CAOV3和OVCAR3细胞分别用50 µM和25 µM Artesunate处理48小时。使用FITC-Annexin V和碘化丙啶染色并通过流式细胞仪分析凋亡。在与未经处理的对照相比，Artesunate导致CAOV3细胞中的凋亡增加了9.3%，而OVCAR3细胞中的凋亡增加了23.5%。在CAOV3和OVCAR3细胞中，凋亡率显著高于未处理细胞中观察到的基础凋亡率。接下来，使用中度细胞毒性单一药物浓度的Artesunate和Navitoclax以1:1摩尔比进行联合治疗，并在CAOV3和OVCAR3细胞中处理10 µM的Artesunate和Navitoclax单独或联合48小时。结果显示，10 µM的Navitoclax在CAOV3细胞中诱导了43.1%的凋亡，在OVCAR3细胞中诱导了16.1%的凋亡。单独使用Artesunate分别在CAOV3和OVCAR3细胞中触发了6.7%和17.4%的凋亡。组合使用时，CAOV3细胞的凋亡率增加到68.3%，而OVCAR3细胞的凋亡率增加到54.4%。 图 2. 用青蒿琥酯和纳维托克治疗后诱导细胞凋亡。( A ) 用青蒿琥酯处理 CAOV3 和 OVCAR3 细胞 48 小时，然后分析细胞凋亡。与未处理的对照相比，平均凋亡细胞百分比（误差线 = SEM）。使用非配对双尾 t 检验进行统计分析。( B ) 用青蒿琥酯和纳维托克单独和联合处理 48 小时的卵巢癌细胞，分析其凋亡诱导情况。与未处理的对照相比，平均凋亡细胞百分比（误差线 = SEM）。使用单因素方差分析和 Dunnett 多重比较检验进行统计分析（与未处理的对照相比）（* p < 0.05；*** p < 0.001）。 随后，对整个卵巢癌细胞系进行了药物协同作用的正式分析。经过72小时的处理后，在所有测试的卵巢癌细胞系中观察到临床相关浓度下的细胞毒性药物协同作用，包括对Artesunate耐药的OV-90细胞。使用Loewe加成模型评估协同作用，我们发现组合治疗在CAOV3、OVCAR3、UWB1.289和OV-90细胞中显著优于非相互作用的零模型。此外，在UK1254类器官系中也观察到了显著的药物协同作用。为了确保Artesunate和Navitoclax的表观协同作用不依赖于模型，我们还使用了Bliss独立模型、零相互作用效能模型（ZIP）和最高单一药物模型（HSA）分析了我们的数据。对于所有测试的细胞系，Artesunate和Navitoclax在每种模型下都被认为具有协同作用，除了UWB1.289细胞，在其中组合被分类为加成。 图 3. 用青蒿琥酯和纳维托克拉治疗的卵巢癌细胞中的药物协同作用。在 ( A ) OVCAR3、( B ) UWB1.289、( C ) CAOV3、( D ) OV-90 和 ( E ) UK1254 细胞中，一系列青蒿琥酯和纳维托克拉药物浓度组合的 Loewe 协同得分的 3D 表面图。显示了矩阵中所有值的平均协同得分和相关的 p 值。 3.3 卵巢癌异种移植模型中的Artesunate与Navitoclax 体外观察到的药物协同作用促使我们进一步使用正交小鼠异种移植模型研究Artesunate和Navitoclax的组合治疗。生成CAOV3-luc细胞以使用全身生物发光成像监测小鼠中的腹腔肿瘤生长。简要地说，CAOV3细胞使用绿色荧光蛋白（GFP）和荧光素酶（rFLuc）共表达的慢病毒载体进行标记，并通过FACS和嘌呤霉素筛选具有稳定基因整合的细胞（CAOV3-luc）。在6周龄雌性BALB/c scid小鼠中建立了腹腔肿瘤异种移植，并通过每周的生物发光成像监测移植情况。 植入后五周，移植建立，32只CAOV3-luc肿瘤负担相等的小鼠被随机分配到四个治疗组：安慰剂对照组、单一Artesunate治疗组、单一Navitoclax治疗组和联合治疗组。制定了基于之前研究的剂量方案，以在小鼠异种移植模型中展示效力并将毒性最小化。治疗通过灌胃给药，每周5天，持续8周，Navitoclax剂量为50 mg/kg。Artesunate在前4周的剂量为50 mg/kg，随后由于较低剂量未显示出明显效力，增加到100 mg/kg，持续接下来的4周。治疗耐受性良好，观察到的药物相关毒性最小。在Navitoclax单一组的两只小鼠中有三次鼻出血事件，但无需干预即得到缓解。 图 4. 卵巢癌异种移植瘤中青蒿琥酯和纳维托克单独和联合使用的体内分析。（A）在治疗开始（第 0 周）和结束（第 9 周）用载体、单独青蒿琥酯、单独纳维托克或联合治疗的小鼠的肿瘤异种移植生物发光代表性图像。红色 X 表示在治疗期间死亡的小鼠。（B）载体（黑色）、单独青蒿琥酯（红色）、单独纳维托克（绿色）和联合（蓝色）治疗组从治疗前一周到治疗后 1 周的总排放量平均百分比变化（误差线 = SEM）与时间的关系图。（C）治疗后 1 周肿瘤异种移植生物发光总排放量的箱线图。线表示治疗组内的中值。使用Kruskal–Wallis 检验 ( p = 0.003) 和 Dunn 的多重比较检验进行统计分析 (* p < 0.05)。 图4A显示了治疗开始和结束时每个治疗组的肿瘤异种移植生物发光的代表性图像。图4B总结了相对于治疗前水平的总发射变化的定量（平均值±标准误）。在治疗的第4至第8周期间，安慰剂和单一Artesunate治疗组相比于Navitoclax单一治疗组和联合治疗组显示出更高的肿瘤进展率。在治疗期间，安慰剂对照组的一只小鼠因第10天明显的异氟烷过量暴露而死亡，并从研究中剔除。另一只安慰剂治疗的小鼠在治疗第6周死于疾病。其余30只小鼠在整个研究期间存活。治疗结束后的一周，测量了生物发光，并发现联合治疗组的小鼠中位总发射量显著低于安慰剂和单一Artesunate治疗组。单一Navitoclax治疗组与其他治疗组之间或安慰剂与单一Artesunate治疗组之间未观察到显著差异。 4. 讨论 卵巢癌仍然是最致命的妇科恶性肿瘤，但新治疗方式的发展有限。尽管结果略有改善，但当前的前线治疗，包括铂类/紫杉烷双药组合，在近三十年内几乎没有显著变化。显然，寻找更好的卵巢癌治疗策略至关重要。 Artesunate是一种水溶性、口服可用的青蒿素半合成衍生物，已显示出对多种癌细胞的细胞毒性活性。我们目前的研究和先前的研究表明，Artesunate可以抑制人卵巢癌细胞系和肿瘤类器官的细胞增殖并诱导凋亡。青蒿素类还显示出增强卵巢癌细胞中铂类药物的细胞毒性作用。尽管抗癌活性的证据大多来自临床前研究，Artesunate在早期临床试验中也表现出临床活性。此外，青蒿素类，包括Artesunate，具有良好的耐受性，已被广泛用于全球范围内的疟疾一线治疗，未有严重不良事件的报告。这些数据支持进一步临床研究Artesunate作为癌症治疗的潜力。 Navitoclax属于一种称为BH3模拟物的药物类别，可增强凋亡的诱导。通过结合Bcl-2蛋白的BH3结构域，Navitoclax破坏了促凋亡蛋白BIM的隔离，导致其释放并最终引发凋亡。单一Navitoclax的临床评价一直未能取得理想效果，活性未达到预期，且显著的剂量限制性但可控的血小板减少症。在一项对小细胞肺癌患者的II期研究中，Rudin等人报告了2.6%的患者部分缓解，23.1%的患者病情稳定，41%的患者病情进展。此外，41%的研究对象发生了III–IV级血小板减少症。MONAVI-GINECO研究评估了Navitoclax单一疗法在复发性上皮性卵巢癌中的疗效。与小细胞肺癌的结果类似，2.2%的患者出现了部分缓解，32.6%的患者病情稳定，65.2%的患者病情进展。26%的患者发生了III–IV级血小板减少症，导致25%的受影响个体停药。Navitoclax单一治疗始终未能产生可接受的结果，这促使研究重点转向组合治疗策略，以增强疗效并避免剂量限制性毒性。 包括利妥昔单抗、达沙替尼、维莫非尼、伏立诺他、他莫昔芬等靶向药物在内的化疗药物与Navitoclax联合使用在实体瘤和血液癌症中显示出增强的疗效。Navitoclax增强了在2D和3D卵巢癌细胞培养中的卡铂和紫杉醇的体外活性，并在HRD卵巢癌细胞中与鲁卡帕利呈现协同作用。我们自己的工作表明，Navitoclax与Artesunate的组合在2D人卵巢癌细胞系以及一种新型高级别浆液性卵巢癌类器官模型中表现出显著的药物协同作用。 青蒿素类与Navitoclax的联合使用已在几种癌症模型中显示出优于单一治疗的效果，包括白血病和非小细胞肺癌。我们旨在证明Artesunate与Navitoclax是一种有前途的转移性卵巢癌治疗策略。如图3所示，各种卵巢癌细胞模型中，体外药物协同作用显著且一致。这包括Artesunate耐药细胞系OV-90、BRCA1突变细胞系UWB1.289以及患者衍生肿瘤类器官系UK1254。不幸的是，这些体外结果未能转化为动物模型。尽管体内研究显示联合治疗优于安慰剂和单一Artesunate治疗，但未优于单一Navitoclax。这表明Navitoclax在组合治疗中发挥了主要作用。 联合治疗未能优于单一Navitoclax是意料之外的，但可能有几个解释。首先，药物给药途径可能不适合最大化Artesunate的生物利用度。因此，Artesunate浓度可能低于在肿瘤部位实现药物协同作用所需的阈值。在健康个体中，口服Artesunate的绝对生物利用度估计仅为21.6%。可能使用静脉注射Artesunate的Navitoclax组合治疗更有效。其次，Artesunate的给药频率可能不足。报道的Artesunate在人类中的半衰期估计相对较短。文献回顾发现，几乎所有研究都估计口服治疗后的Artesunate半衰期小于1小时。短的消除半衰期进一步得到了报告的小分布容积的支持。我们的体内研究可能需要增加口服Artesunate的给药频率，以达到肿瘤内部所需的Navitoclax药物协同作用浓度。最后，可能允许肿瘤进展到对Artesunate不再敏感的程度。正如小分布容积所示，Artesunate在不易灌注的组织中分布可能有限。腹膜和网膜血管丰富，提供了充足的机会将Artesunate从血浆灌注到腹腔。尽管我们使用了能够充分药物暴露的转移性卵巢癌正交腹腔模型，CAOV3-luc细胞在治疗前已允许移植超过4周。这可能允许大转移灶的建立，阻碍Artesunate进入较大的肿瘤结节。另一种策略是提前启动组合治疗，针对微小转移灶和循环肿瘤细胞，这可能产生预期的协同作用。因此，这可能表明Artesunate与Navitoclax的组合在临床上更适合用于尚未发生远处转移的患者的辅助治疗。 5. 结论 如前所述，Navitoclax与Artesunate在体外以临床可达到的浓度协同杀死卵巢癌细胞。这种药物组合可能有助于满足卵巢癌治疗的紧迫需求，但还需要进行临床前优化。由于缺乏有效剂量和给药方式的共识，Artesunate的临床应用受到限制。然而，Artesunate作为疟疾治疗的几十年使用经验表明其具有良好的安全性，这可能在与合适药物（如Navitoclax）联合使用时转化为有利的治疗指数。继续对这种治疗组合进行临床前研究对于实现其在卵巢癌中的治疗潜力至关重要。 附录材料：以下支持信息可以从https://www.mdpi.com/article/10.3390/cancers16071321/s1下载，表S1: 使用各种协同模型评估Artesunate和Navitoclax的协同评分。 作者贡献： 概念化，J.R.M.、R.A. 和 J.M.K.；方法学，J.R.M.、R.A. 和 K.S.H.；形式分析，J.R.M.、R.A. 和 K.S.H.；调查，J.R.M.、R.A.、C.D.C. 和 K.S.H.；原稿撰写，J.R.M. 和 R.A.；审阅和编辑，J.R.M.、R.A.、C.D.C.、K.S.H.、C.S.D. 和 J.M.K.；监督，C.S.D. 和 J.M.K.；资金获取，J.M.K.。所有作者已阅读并同意已发布版本的手稿。 资金支持： 此研究得到了美国国立卫生研究院国家癌症研究所肯塔基大学Markey癌症中心的资助，资助编号为P30CA177558。 伦理声明： 动物研究的方案已获得肯塔基大学机构动物护理和使用委员会的批准。 数据可用性声明： 本文中所述的数据可应要求从通讯作者处获得。 致谢： 此研究得到了肯塔基大学Markey癌症中心（P30CA177558）生物样本采购与转化病理学以及流式细胞仪与免疫监测共享资源的支持。肯塔基大学实验室动物资源部提供了额外支持。 利益冲突： Jill M. Kolesar已获得来自Loxo@Lilly和Artemilife的研究支持，并且是VesiCure Technologies和Helix Diagnostics的创始人和股东。资助者未参与研究设计、数据收集、分析或解释，手稿的撰写或发表结果的决策。 cancers-16-01321.pdf

这张图片显示了一位名为鲁珀特的患者的治疗方案，以及治疗后的进展记录。内容如下： 鲁珀特的治疗方案 诊断为第4期结肠癌（肺部和肝脏均有肿瘤） 医生预计生存时间为6个月 治疗方案： Fenbendazole（芬苯达唑）：222mg，每天三次 Ivermectin（伊维菌素）：5mg，每天一次 CBD胶囊：25mg，配合Hemp提取物胶囊 Quercetin（槲皮素）：500mg，每天一次 Tumeric（姜黄）：1000mg，每天一次 Chlorella Tablets（小球藻片）：2-4片，每天 补血剂或铁片 维生素E：180mg 维生素C：500mg 维生素D 超级B复合维生素配合维生素C Curcumin（姜黄素） SourSop Extractor（刺果番荔枝提取物）：每天一勺 Grape Seed Extract（葡萄籽提取物）：500mg，每天一次 杏仁：每天约3颗（不要再多） Essiac Tea（艾西亚茶）：每天3-4盎司 SourSop Tea（刺果番荔枝茶）：每天一杯热茶 SourSop/Graviola Pulp（刺果番荔枝果肉）：每天做成冰沙 Propolis（蜂胶）：12颗软胶囊，每隔一天服用一次 Beet Root Powder（甜菜根粉）：每隔一天用水混合服用 治疗进展记录： 第4天：咳嗽停止 第7天：皮肤颜色恢复正常 第9天：癌症引起的瘙痒消失 第11天：血红蛋白从8上升到9 第13天：肝脏上的斑点消失 第21天：血红蛋白从6上升到9 第26天：开始形成坚硬的固体粪便 第45天：血红蛋白从6上升到10.3 第87天：肿瘤标志物从20.5降到7.2，肺部肿瘤变为良性，结肠壁变得更厚 图片中的内容描述了鲁珀特在接受该治疗方案后的逐步改善过程。 避风港395 病案与分享 二 问：我找不到芬苯达唑，请问阿苯达唑可以代替芬苯达唑做抗癌治疗吗？如果可以，请问应该吃多少毫克？ （ #芬苯达唑 #阿苯达唑 ） 答：可以，因为这些达唑都是属于咪唑类，一类的，就是分子结构有点差异。但基本上是差不多的抗寄生虫药。你就按照药品说明书。因为你是用的阿苯达唑，阿苯达唑其实就是墙内的肠虫清，史克肠虫清就是阿苯达唑。你按照那个说明书，其实美国的抗癌患者用了芬苯达唑，也是按照芬苯达唑的抗寄生虫的药品用药建议剂量去服用的，只不过服用时间长一点。通常像这种抗寄生虫药都是一次性服用两三天，而抗癌要服用的时间比较长。通常是那位非小细胞肺癌的患者，他是用了每周三到四天，所以你不妨用相似的用药方法，建议的剂量去服用，通常是一周三到四天，然后你给一个休药期。 https://gettr.com/post/p39ulcrbe49 史克肠虫清 https://gettr.ink/Z3aEHn

Open Letter from the PAYMAP Community to American Politicians Dear American Politicians, We are members of the PAYMAP community, and we write this open letter to express our deep concern about the case against Mr. Guo Wengui（Miles Guo）and our expectations for your fair judgment. As ordinary citizens, we believe that justice and transparency are the cornerstones of a democratic society. However, in the case of Mr. Guo（Miles Guo）, we have serious doubts about some of the actions taken by the Department of Justice. Mr. Guo Wengui（Miles Guo）has long been dedicated to exposing the corruption and human rights abuses of the Chinese Communist Party (CCP), which has made him a thorn in their eyes. We cannot ignore the fact that several key officials involved in Mr. Guo's case within the U.S. Department of Justice were appointed in 2021. This raises concerns about whether the prosecution of Mr. Guo has been influenced by political motives. As some members of our community believe, with the upcoming U.S. election, if certain key figures lose the election, the actions against Mr. Guo Wengui（Miles Guo）may lose their backing. After all, these so-called enforcers of "judicial justice" might simply be individuals fulfilling their duties under specific circumstances without truly holding a comprehensive understanding of the bigger picture. We firmly believe that the American legal system is founded on principles of justice, transparency, and fairness. However, as Mr. Guo himself has said, true victory comes from procedural justice. If there are any irregularities in the evidence collection and prosecution process, this alone could undermine the fairness of the entire case. Our sole goal is to dismantle the CCP, not to create enemies everywhere. For those who may have found themselves in difficult situations due to external pressure or questionable benefits, we hope they will recognize the broader context and choose the right path. We do not wish to target these individuals; our singular focus remains on addressing the larger threat. We are not blindly supporting Mr. Guo Wengui（Miles Guo）but rather advocating for procedural justice and a fair trial. We earnestly urge you, as American politicians, to pay attention to this case and ensure that all judicial procedures are conducted with transparency and fairness. Finally, we hope that you will reassess this case, release Mr. Guo Wengui（Miles Guo）, and grant him a fair trial. This is not only for Mr. Guo's personal freedom but also to uphold the credibility and justice of the American legal system. We ask for your attention and action. Sincerely, Roger, Founder of PayMap August 20, 2024 PAYMAP社区致美国政客的公开信 尊敬的美国政客们： 我们是PAYMAP社区的成员，今天我们写这封公开信，是为了表达我们对郭文贵先生案子的深切关注，以及对您们正义判断的期待。作为普通的公民，我们相信法律的公正与透明是民主社会的基石。然而，在郭文贵先生的案件中，我们对司法部的一些行动产生了质疑。 郭文贵先生长期以来以揭露中共的腐败与人权问题为己任，这让他成为了中共的眼中钉。我们无法忽视的是，在美国司法部的某些关键岗位上，出现了一些与郭文贵案相关的官员，这些官员大多是在2021年上任的。这一事实不得不让我们联想到，郭文贵先生的被起诉，是否有着政治背景的操控。 正如我们社区中的一些成员所认为的那样，在当前的政治气氛下，美国即将迎来一场新的选举。如果在这场选举中，某些关键人物败选，那么与郭文贵先生相关的行动可能会失去其背后的支持。毕竟，这些所谓的“司法正义”的执行者，或许只是处于特定环境下被动履行职责的人，并未真正掌握全局的判断力。 我们深信，美国的法律体系是基于正义、透明和公平的原则。然而，正如郭文贵先生曾提到的那样，真正的胜利源于程序正义。如果在取证和起诉的过程中，存在着任何程序上的不公正操作，那么这本身就足以颠覆整个案件的公正性。 我们惟一的目标是推翻中共(CCP)，而不是到处数敌。对于那些可能因为外界压力或不当利益而陷入困境的人，我们希望他们能够识大体、顾大局，选择光明的道路。我们并不想针对这些人，我们的唯一目标始终是那个更大的隐患。 我们并非盲目支持郭文贵先生，而是基于对程序正义的信仰，对公正审判的渴望。我们诚恳地呼吁您们，作为美国的政客，能够关注这一案件，并确保在整个过程中，所有的司法程序都是透明、公正的。 最后，我们希望您们能够重新审视这一案件，释放郭文贵先生，给他一个公正的审判。这不仅是为了郭文贵先生个人的自由，也是为了维护美国法律体系的信誉与公正。 敬请关注，并采取行动。 此致 PayMap 创始人 罗杰 2024年8月20日 Open Letter from the PAYMAP Community to American Politicians.pdf

This describes the strategies used by the Chinese Communist Party (CCP) to control and guide information dissemination and public opinion through various layers of media: First Layer (Domestic Media): Surface information disseminated to the general public through national media such as "People's Daily," "Xinhua News Agency," and "CCTV News," promoting basic slogans, directions, and policy stances. Second Layer (Domestic Media): Surface information aimed at specific interest groups and individuals of particular status, conveying political attitudes and signals. Third Layer (Domestic Media): Official interpretation of information, using outlets like "Global Times," Phoenix Television, Sohu, NetEase, and Baidu Headlines to guide further thoughts and behaviors of the public interested in first-layer information. Fourth Layer (Domestic Media): Secondary processing of information, disseminating content to different age groups who may not be interested in or sensitive to surface information, using platforms such as Weibo, WeChat, TikTok, Kuaishou, and Bilibili. This includes entertainment information, subtly influencing subconscious thoughts. Fifth Layer (Domestic Media): Tertiary processing of information, using platforms like Weibo, Bilibili, and Douban to create topics, both positive and negative, and influence daily thinking and judgment through coordinated messaging, comments, and narrative shaping. Sixth Layer (Domestic Media): Reverse guidance of information in times of information crisis or credibility issues, diverting attention from the crisis by creating fake leaks or distractions, using tactics such as scapegoating, sacrificing minor issues to protect major ones, and even self-criticism to construct a heroic narrative. Seventh Layer (Foreign Media): Positive guidance of information, creating internationalized messages through overseas media outlets or experts to further influence the ideology of the overseas public or those crossing the digital borders. Eighth Layer (Foreign Media): Reverse guidance of information through platforms like YouTube, Twitter, and outlets associated with dissident movements, presenting three parts truth and seven parts falsehood. This includes attacking its propaganda system, using low-level black humor, mockery, and extreme content to gradually incite dislike among the public, eventually leading them to distrust these foreign media. Ninth Layer (Foreign Media): Enhanced reverse guidance through platforms like YouTube and Twitter, crafting an image of objective and rational media, presenting seven parts truth and three parts falsehood. Generally avoiding certain discussions, maintaining an image of objectivity and neutrality, releasing credible information that is not available domestically, but during critical events, guiding public opinion and diverting attention to mislead the public. Note: The above refers to identifiable information creators or those whose creators can be traced back. However, a significant portion of daily decision-making by the public might still be influenced by uncontrollable information sources, such as "I've heard," "my friend said," or "someone said." This type of decision-making behavior is very useful for the Chinese Communist Party. Note: The above refers to identifiable information creators or those who can be traced back through various means. However, many everyday decisions made by the general public likely come from uncontrollable sources of rumor, such as "I heard," "my classmate said," or "someone said." Such decision-making behaviors are particularly useful for the Chinese Communist Party. 中共宣传的九层次信息操作策略来控制和引导公众舆论的方式 Screenshot shared by netizens 网友截图 第一层（国内媒体）：表层信息，通过《人民日报》、《新华社》、新闻联播等全国媒体向普通民众传播的基本口号、方向、政策站队。 第二层（国内媒体）：表层信息，针对特定的利益团体和特定身份的人群传递政治态度与政治讯号。 第三层（国内媒体）：信息的官方解读，通过《环球时报》、凤凰卫视、搜狐、网易、百度头条等对第一层信息感兴趣的民众进行进一步的思想引导与行为引导。 第四层（国内媒体）：信息的二次加工，通过微博、微信、抖音、快手、B站等平台中对表层信息不感兴趣或不敏感的不同年龄层制播放信息，包括娱乐信息，进行日常潜意识引导。 第五层（国内媒体）：信息的三次加工，通过微博、B站、豆瓣等强调复型平台，平时经营制造话题，有正面有负面，连同特定的人海战术刷屏、回帖、带节奏，影响观众的日常的思维判断。 第六层（国内媒体）：信息的反向引导，在信息失控或公信力危机爆发时，通过伪装成个体爆料的形式转移危机关注点，含卒保车，寻找替锅对象，制造爆料，引媒替间争办对拗民衅骇惧得以狡，为避免核心问题，甚至不惜断臂自黑，塑造英雄，收割线成如约。 第七层（境外媒体）：信息的正向引导，制造国际化包装的信息，以海外媒体的形象或海外专家学者的身份进行正向的宣传，使得境外的民众或各网络越境的民众进一步接受意识形态的影响。 第八层（境外媒体）：信息的反向引导，通过油管、推特、〇〇功、海外民运塑造负面信息，三分真七分假，主攻攻击自己的宣传系统；刻意低级黑、恶搞、极端偏激暴虐的信息，引发网络越境的民众逐渐对其厌恶，逐渐排斥，最终将海外媒体视为不可信的宣传。 第九层（境外媒体）：信息的反向引导加强，通过油管、推特塑造客观理性的媒体，七分真三分假，平时不涉某讨论，维持客观中立的分析，力刻意喧哗，有意放出部分墙内不可见的可信的真消息，但在关键的重大事件出现时，带风向，转移矛盾，有意误导民众。 注: 以上所指是指有明确信息制造者，或者通过手段可以反向追踪信息制造者。 然而大量日常民众的行为决策，很可能还来自于不可控信息源的耳语传播，比如“我听说”“我同学说”“有人说”，而这种行为决策，对于中国共产党来说是非常有用的。

对中国在我们时代最具毁灭性的大流行病COVID-19中的角色追责（中文翻译） https://gettr.ink/tNFWzr 摘要 传统基金会的无党派中国与COVID-19委员会成立的目的是：审查与世界上最具毁灭性的大流行病之一相关的事实和情况，评估和计算中国政府造成的人力和经济损失，并提出追责的建议。 执行摘要 COVID-19大流行对世界造成了巨大的人员和经济成本，这些影响将持续几代人。在大流行之后，全球有2800万人丧生，梦想破灭，弱势群体陷入贫困，经济遭受了数万亿美元的损失。仅美国就估计有110万人死亡，损失达18万亿美元。 传统基金会召集了无党派中国与COVID-19委员会（以下简称委员会），以开展事实调查，确定美国因大流行遭受的巨大损失，审查有关病毒起源和传播的所有证据，基于中国的科学和运营环境提出法律选项，并根据调查结果提供政策建议。委员会的报告不排除许多其他政府、机构和个人可能在大流行中扮演了辅助角色，但发现中国在反对诚实、透明和问责方面独树一帜，这种行为是COVID-19大流行的直接原因。 委员会在报告中记录了多项与中国政府宣传的叙述相矛盾的重要事实。委员会发现，现有证据的平衡倾向于认为大流行是由于武汉病毒研究所（WIV）的一次研究相关事故而非武汉市场出售的野生动物所致。 截至2023年12月，COVID-19大流行在美国的总成本已达到18.007万亿美元。 中共的系统性掩盖 改变世界的七周 自2019年12月起，至少在那时，中国官员本可以表现出诚意并履行其国际承诺，努力防止国内流行病成为全球大流行。然而，他们选择了另一条道路。关键事实如下： 2019年12月，中国官员知道新病毒有人传人的情况。 中国当局积极压制医疗人员、记者和其他中国公民的警告，有时甚至将他们关押。 自2019年12月27日起，中国当局扣押了SARS-CoV-2的基因组序列。 中国当局向世界卫生组织（WHO）隐瞒了病毒的类型、感染人数的真实数据以及已证实的人传人情况，直到全世界无法再忽视疫情的严重性。 中国当局下令销毁可能提供证据的实验室样本。 中国当局对学术研究人员和科学家发布禁言令，禁止他们分享关于病毒的信息。 2020年1月11日，一位中国科学家违抗命令在线发布了基因组序列，才让其他国家有机会开始开发测试、药物和疫苗。 尽管有证据表明病毒可以无症状传播，中国官员仍允许国际航班从武汉和其他中国城市继续飞行，助长了全球传播。 中国官员阻止了国际调查病毒起源的努力。 越来越多的证据表明，SARS-CoV-2在2019年秋季就在武汉开始传播。医院的前线临床医生很快意识到他们治疗的不寻常肺炎可能是传染性的。一位医生，张丽博士后来写道，到12月底，“人传人的迹象已经非常明显。”

本文短链接：https://gettr.ink/tNFWzr 源文章链接（英文）：https://www.heritage.org/china/report/holding-china-accountable-its-role-the-most-catastrophic-pandemic-our-time-covid-19 源文PDF链接（英文）： https://www.heritage.org/sites/default/files/2024-07/SR286_1.pdf 摘要 传统基金会的无党派中国与COVID-19委员会成立的目的是：审查与世界上最具毁灭性的大流行病之一相关的事实和情况，评估和计算中国政府造成的人力和经济损失，并提出追责的建议。 传统基金会无党派中国与COVID-19委员会 主席 John Ratcliffe, 法学博士，第6任美国国家情报总监和前美国德克萨斯州第4区国会议员。 委员 Robert C. O’Brien，美国全球战略公司主席，第27任美国国家安全顾问。 Heidi Heitkamp，芝加哥大学政治学院院长，前美国北达科他州参议员。 Matthew Pottinger，防御民主基金会中国项目主席，第32任美国副国家安全顾问。 Robert R. Redfield, 医学博士，病毒学家，前疾病控制与预防中心主任和有毒物质与疾病登记署署长。 Jamie Metzl，一共享世界创始人兼主席，前国家安全委员会和国务院官员，世界卫生组织人类基因组编辑专家咨询委员会成员。 John Yoo, 法学博士，加州大学伯克利分校法律学院Emanuel S. Heller教授。 Robert Kadlec, 医学博士，医生，前卫生与公共服务部助理部长。 David Feith，战略与国际研究中心兼职高级研究员，前东亚和太平洋事务副助理国务卿。 主席致辞 传统基金会的无党派中国与COVID-19委员会成立的目的是：审查与世界上最具毁灭性的大流行病之一相关的事实和情况，评估和计算中国政府造成的人力和经济损失，并提出追责的建议。 我们准备了这份报告和随后的建议供美国总统、国会和美国人民考虑。由共和党和民主党成员组成的九人委员会共同起草了这份报告，且没有异议。 我们工作的目标是追求真相、促进问责、保障美国人民的利益和福祉。为此，我们设立了四个独特的努力方向，旨在揭示事实、评估影响并确定可行的措施。 数据分析 委员会进行了严格的数据分析，以确定美国因COVID-19遭受的广泛人力和经济成本。目标是全面了解疫情对美国社会的影响。 事实调查 委员会的工作包括全面审查公开来源的事实和可用证据。我们审查了过去四年中美国国会、调查记者和中国公民提供的数百份文件和报告。在此过程中，我们审阅、咨询并考虑了来自全球网络的无数权威书籍、科学论文和个人作品，发现了重要材料。我们还举办了两次虚拟听证会，并与参与美国政府2020年疫情应对工作的专家、数据分析师和官员进行了交流。这次深入调查的目的是建立一个清晰的叙述，说明2019年底至2020年初在中国发生的事件。 法律措施 为了追求问责和正义，委员会评估了已确立的法律和国际行动原因、原则和理论，以支持各种潜在的补救措施和案件选择。我们为应对COVID-19后果提供了法律行动指导。 行动建议 委员会制定了可行的建议，概述了美国政府应立即采取的措施，以追究中国责任并确保国家的保护和韧性。在近五年的不作为之后，我们呼吁总统和国会现在采取果断行动。 担任这个尊贵委员会的主席是我的荣幸和特权。我感谢我的同事们愿意提供他们的专业知识和服务。我们一起努力尊重国家的价值观和原则，确保公民的健康和福祉。 我也感谢传统基金会在召集我们无党派委员会时表现出的领导力和远见。 John Ratcliffe 主席，无党派中国与COVID-19委员会 第6任美国国家情报总监 前国会议员 2024年7月 执行摘要 COVID-19大流行对世界造成了巨大的人员和经济成本，这些影响将持续几代人。在大流行之后，全球有2800万人丧生，梦想破灭，弱势群体陷入贫困，经济遭受了数万亿美元的损失。仅美国就估计有110万人死亡，损失达18万亿美元。 传统基金会召集了无党派中国与COVID-19委员会（以下简称委员会），以开展事实调查，确定美国因大流行遭受的巨大损失，审查有关病毒起源和传播的所有证据，基于中国的科学和运营环境提出法律选项，并根据调查结果提供政策建议。委员会的报告不排除许多其他政府、机构和个人可能在大流行中扮演了辅助角色，但发现中国在反对诚实、透明和问责方面独树一帜，这种行为是COVID-19大流行的直接原因。 委员会在报告中记录了多项与中国政府宣传的叙述相矛盾的重要事实。委员会发现，现有证据的平衡倾向于认为大流行是由于武汉病毒研究所（WIV）的一次研究相关事故而非武汉市场出售的野生动物所致。 委员会发现，中国政府没有采取适当措施确保WIV不受污染。注意到实验室的几位科学家可疑地生病，中国政府在疫情爆发初期的关键时期隐瞒了有关疾病的高度相关信息。委员会记录了中国政府销毁样本、隐藏记录、监禁提出基本问题的中国记者、对中国科学家实施封口令、并猛烈阻止对疫情起源的任何有意义的国际调查。委员会还发现中国发布了虚假数据。尽管中国签署了一项国际协议，要求其向世界卫生组织通报公共卫生紧急情况并提供及时、准确和详细的信息，但这些行为仍然发生。 所有政府和机构都必须全面审查在COVID-19大流行前后采取的行动，并采取适当的纠正措施，以最大限度地减少当前和未来的风险。虽然美国的这一进程尚未达到应有的水平，但美国政府的行政和立法部门已经采取了重要步骤。需要做的更多。中国的行为与其他国家和机构不同，这给中国、美国和世界带来了巨大且不必要的风险。 鉴于中国拒绝实行问责，包括在国际机构中的阻挠行为，像本委员会这样的努力至关重要。虽然承认其他国家和机构存在不足，但本报告力图评估中国的责任并建议措施追究中国的责任。委员会发现多个法律依据可以追究中国国家和各种中国企业的责任。委员会还概述了美国政府可以实施的17项政策建议，以加强威慑、透明度和问责。 虽然委员会主要在美国背景下分析大流行的成本及美国应如何追究中国责任，但其结论不限于美国。我们鼓励其他国家使用本委员会创建的模型，调查大流行对其社会的人员和经济成本，并探索如何追究中国的责任。 正如在任何正常运作的国内法律体系中，建立问责和责任是基本工具一样，这些原则也必须在这一背景下应用。面对前所未有的全球挑战，替代方案是对未来更严重的大流行进行危险的赌博，这可能导致数百万甚至数十亿人丧生。 大流行的前所未有的全球成本 COVID-19大流行被认为是世界历史上七大最致命的瘟疫之一，对全球造成了巨大的人员和经济成本。国际货币基金组织的负责人称其为“前所未有的危机”。 在查看美国的具体成本估算之前，有必要了解大流行在全球范围内的影响。例如，截至2024年6月，《经济学人》估计全球因COVID-19的超额死亡人数已达2800万，包括超过110万美国人。 除了巨大的人员损失外，大流行造成的经济影响也极为严重。2020年，全球GDP下降了3.4%。同年约90%的国家经济产出收缩。 世界银行将这一经济动荡称为“一个多世纪以来最大的全球经济危机”，并指出全球贫困“首次在一代人中上升”。2020年至2021年间，估计有9700万人陷入贫困。低收入国家受到的打击尤为严重。 全球失业率在2020年飙升至6.5%，高于前一年的5.4%。根据世界银行的一项调查，失业率并不平等地分布在不同人口群体中，女性失业率高于男性。大流行导致2020年全球损失了相当于2.55亿个全职工作时间。这些损失在拉丁美洲和加勒比地区、南欧和南亚尤为严重。大流行的影响持续至今：非洲和阿拉伯世界的几个低收入地区在2023年的失业率预计仍高于大流行前的水平。 儿童在COVID-19中承受了不成比例的负担。联合国称大流行为“我们75年历史上对儿童最大的危机”。不仅儿童面临疾病和死亡，他们还经历了家庭的失去、因隔离和学校关闭而造成的孤立、食物不安全以及无法获得非病毒相关疾病的医疗服务。 教育受到的打击最为严重。2020年大流行高峰期，全球超过15亿儿童停课。到2022年，仍有超过6.16亿儿童受到全面或部分学校关闭的影响。据估计，2022年2月，中低收入国家70%的10岁儿童功能性文盲，而大流行前这一比例为57%。经济合作与发展组织（OECD）高收入国家的儿童也经历了显著的学习损失：2022年，OECD国家中25%的15岁学生被认为表现不佳。 在心理健康方面，大流行期间全球重大抑郁症病例增加了27.6%，焦虑症病例增加了25.6%。最容易患心理疾病的是年轻人和女性。一些国家的这些精神障碍病例甚至翻了一番。随着人们面对死亡、疾病、隔离、悲伤、失去工作和收入以及普遍的不确定性，家庭和社区的社会结构解体。 长时间COVID是一种至少影响10%至20%感染者的经常致残的疾病，影响各个年龄段的人群，包括儿童。仅在美国，就有约600万儿童患有这种疾病。 已识别的长时间COVID症状超过200种，影响多个器官系统。广泛的清单包括疲劳、呼吸急促、神经认知效应和自主神经障碍等多器官、多系统、复发-缓解症状。尽管神经效应曾被认为罕见，但这些病例在成人和儿童中变得越来越普遍。 此外，患有长时间COVID的个体还观察到嗅球、大脑、心脏、肺部和其他部位的各种放射学异常。长时间COVID还可以引发其他慢性健康状况，如糖尿病和心脏或肝脏疾病。疾病负担从轻微症状到严重残疾不等，这使得它成为一个巨大的、持续的全球卫生挑战。 大流行的全球成本确实巨大，但由于缺乏个别国家的成本数据，本报告仅关注美国的美元成本。委员会鼓励其他国家的组织和政府使用各自国家的统计数据计算类似数字，并与美国一起追究中国共产党（CCP）的财政责任。 COVID-19 大流行在美国的成本 本节旨在帮助政府官员和公众了解这场毁灭性大流行在美国的真实成本。 总成本 委员会估计，截至2023年12月，COVID-19大流行在美国的总成本已达到18.007万亿美元。表1显示了按主要类别划分的总成本。 参考：根据美联储的数据，2022年美国财富的总净值为135.555万亿美元。这意味着，到目前为止，大流行的总美元成本约占美国财富的13%。以下各节将逐项分析每个类别的成本计算。 死亡 可以使用一种称为“统计生命价值”（VSL）的衡量标准来计算COVID-19死亡的货币成本。VSL衡量的是个人必须支付多少额外报酬才能承担某些活动带来的额外死亡风险。 VSL数据可以从市场或调查数据中推断出来。例如，如果一份工作每年有万分之一的额外死亡风险，但比类似工作每年多支付1000美元，那么VSL就是1000万美元。每10000名工人将集体获得1000万美元（10000名工人每人每年额外支付1000美元），平均来说，其中一人将死亡。因此，1000万美元是为了一个生命风险支付的。 VSL不应与终身收入或工作产生的利润混淆。它是一种衡量个人愿意接受的小幅度死亡风险增加以换取收入增加的标准。 将COVID-19爆发视为增加死亡风险的事件，我们可以使用VSL来估算一个美元数字，如果在爆发后将这些钱分发给所有美国家庭，将被视为对增加的死亡风险的公平补偿。然而，并非每一次死亡都意味着相同的剩余生命损失。显然，老年人的剩余寿命平均少于年轻人。此外，COVID-19并未同等影响所有年龄组，对老年人影响更大。 因此，我们使用一个统计生命年（VSLY）的恒定值来计算不同年龄组的VSL，并将VSLYs加总到统计上预期的剩余寿命年数。该方法将每一年的生命等同对待。 在我们的计算中，我们使用的VSLY为50万美元，这与美国卫生与公众服务部使用的数字一致。远期的VSLY数字通过折现率转换为现值。折现率调整了货币的时间价值，因为未来的美元比现在的美元价值低。表2中的VSL数字基于3%的折现率。 美国疾病控制与预防中心（CDC）收集了包括与COVID-19相关死亡在内的所有美国死亡的每周临时统计数据。从大流行开始到2020年，COVID-19是导致984,716人死亡的主要原因，同时COVID-19也是1,138,763人多重原因之一。 然而，有些死于COVID的人可能从未检测出阳性。其他人可能由于与大流行无直接关系的原因而死亡——例如，面临风险的个体可能因担心暴露于COVID-19而避免就医，或者医疗服务提供者可能延迟服务。 因此，为了获得COVID导致的生命损失的更全面数字，我们查看了CDC对与COVID-19相关的“超额死亡”的追踪——即每周死亡人数超过如果未发生大流行本应预期的死亡人数。我们使用CDC按年龄组分列的超额死亡人数来捕捉不同年龄段死亡风险增加的变化。 表2展示了CDC按年龄组划分的临时死亡数据。COVID爆发前的死亡率计算为2017-2019年的平均率，并在“2017-2019年每10万人平均死亡率”一栏中显示。美国在COVID期间经历的较高死亡率显示为“2020-2022年每10万人平均死亡率”一栏中的平均值。将平均死亡率变化百分比乘以“2020-2022年平均人口”，再乘以3以涵盖三年的死亡人数，得出“三年超额死亡人数”。再一次，对于所有年龄类别，总计2020年至2022年间超额死亡1,476,457人。将每个年龄组的超额死亡人数乘以相应的VSL得出死亡增加的总成本。 调整为三年间疫情死亡风险变化后，使用每生命年价值（VSLY）为50万美元，得出总价值为8.625万亿美元。 收入损失：将疫情前的经济预测与疫情期间的实际数据进行比较，可以估算出疫情对整个经济的影响。虽然这不是一个完美的衡量标准，因为同期经济前景也发生了其他变化，但疫情应代表过去几年新信息的主要部分。 通过比较实际国内生产总值（GDP）数据与国会预算办公室（CBO）2020年1月发布的基线预测来计算经济损失，后者是在疫情爆发前计算和发布的。 GDP衡量的是美国境内生产的商品和服务的价值，从而衡量美国人从这种生产中获得的收入。需要注意的是：(1) 名义GDP可以分为实际GDP，实际GDP按不变价格计算商品和服务的价值，隐含GDP平减指数衡量总体价格水平的变化；(2) 实际GDP和隐含平减指数的变化应分开跟踪，以便不会将没有实质性收益的价格水平上升误认为是实际收入的增加。 为了计算疫情对实际GDP的影响，我们取当前实际GDP数据与CBO基线的差值，并乘以隐含GDP平减指数。这生成一个按疫情前预期价格水平计算实际产出的数据序列。从CBO 2020年1月的名义GDP基线中减去该替代序列，计算出控制通货膨胀后的国家收入损失，这在下面的一个独立部分中计算。 将疫情三年间的名义GDP差异相加，总共减少了1.825万亿美元的美国总产出。从2020年第一季度到2022年第四季度，实际GDP平均比2020年初的预测低2.5%。 慢性病：对于大多数人来说，COVID-19感染会导致几天类似流感的症状，然后恢复正常。然而，一些患者报告感染后症状持续数月。这被称为“长期新冠”。 根据CDC和人口普查局的调查，大约15%的美国成年人曾感染长期新冠。美国卫生与公众服务部，疾病控制与预防中心，国家卫生统计中心新闻稿，“Nearly One in Five American Adults Who Have Had COVID-19 Still Have ‘Long COVID’”，2022年6月22日最后审查，https://www.cdc.gov/nchs/pressroom/nchs_press_releases/2022/20220622.htm（2024年6月29日访问）。该来源的数据来自美国人口普查局和其他联邦机构如CDC进行的家庭调查。 美国成年人口为2.609亿，这相当于4020万例。 长期新冠的典型持续时间仍然未知。然而，最近的估计表明，大多数症状在一年内会消失。Barak Mizrahi等人，“Long COVID Outcomes at One Year After Mild SARS-CoV-2 Infection: Nationwide Cohort Study”，BMJ 2023, 380, e072529, https://www.bmj.com/content/380/bmj-2022-072529（2024年6月29日访问）。 长期新冠相关损害的相关经济衡量指标是质量调整生命年（QALY）。Matthew D. Adler，“QALYs and Policy Evaluation: A New Perspective”，Yale Journal of Health Policy, Law, and Ethics, Vol. VI, No.1 (2006)，https://openyls.law.yale.edu/bitstream/handle/20.500.13051/6066/04_6YaleJHealthPolyL_Ethics1_2006_.pdf（2024年6月29日访问）。 QALY计算的是良好健康的年份数，每年评分在1（完美健康）和0（死亡）之间。我们使用哈佛大学经济学家David Cutler和前美国财政部长Lawrence Summers使用的相同质量调整生命年的降低值，他们基于慢性阻塞性肺疾病的比较，使用每例长期新冠的损害值为-0.25到-0.35。David M. Cutler和Lawrence H. Summers，“The COVID-19 Pandemic and the $16 Trillion Virus”，JAMA, Vol. 324, No. 15 (2020), pp. 1495–1496，https://jamanetwork.com/journals/jama/fullarticle/2771764（2024年6月30日访问）。 使用长期新冠病例代表0.70 QALY一年和我们之前使用的每生命年价值50万美元，总计美国在疫情三年间因长期新冠造成的损失为6.0万亿美元。 心理健康：CDC和美国人口普查局的调查数据显示，自COVID爆发以来，大约25%的成年人报告了焦虑或抑郁的症状。美国卫生与公众服务部，疾病控制与预防中心，国家卫生统计中心，美国人口普查局，“Household Pulse Survey, 2020–2024: Anxiety and Depression”，最后审查于2024年6月14日，https://www.cdc.gov/nchs/covid19/pulse/mental-health.htm（2024年6月29日访问）。 这种情况是否由疾病本身或各国为应对疾病实施的政策引起的基本无关紧要，因为如果没有这种疾病，就不会采取这些措施。CDC数据显示，焦虑和抑郁症状与COVID-19相关病例的普遍程度之间存在联系。Haomiao Jia等人，“National and State Trends in Anxiety and Depression Severity Scores Among Adults During the COVID-19 Pandemic—United States, 2020–2021”，美国卫生与公众服务部，疾病控制与预防中心，发病率和死亡率每周报告，Vol. 70, No. 40 (2021年10月8日)，pp. 1427–1432，https://www.cdc.gov/mmwr/volumes/70/wr/mm7040e3.htm?s_cid=mm7040e3_w（2024年6月29日访问）。 2020年7月至2021年1月间，焦虑和抑郁的普遍程度达到35%以上。美国卫生与公众服务部，疾病控制与预防中心，国家卫生统计中心，美国人口普查局，“Household Pulse Survey, 2020–2024: Anxiety and Depression.” 使用2.609亿成年人口，相当于6500万（25%）到9100万（35%）例焦虑或抑郁。 CDC表示，每年抑郁症通常影响1600万成年人，约占人口的6%，焦虑症常与抑郁症伴随。美国卫生与公众服务部，疾病控制与预防中心，“Mental Health Conditions: Depression and Anxiety”，最后审查于2023年10月13日，https://www.cdc.gov/tobacco/campaign/tips/diseases/depression-anxiety.html（2024年6月29日访问）。 这意味着，疫情三年间导致了额外的4900万例抑郁或焦虑（使用低端数值25%进行计算）。 估计患者愿意支付的抑郁治疗费用约占家庭收入的10%。Jürgen Unützer等人，“Willingness to Pay for Depression Treatment in Primary Care”，Psychiatric Services, Vol. 54, No. 3 (2003年3月)，pp. 340–345，https://ps.psychiatryonline.org/doi/full/10.1176/ps.54.3.340（2024年6月29日访问）。 愿意支付是合适的衡量标准，因为它捕捉到了为了让人们在没有COVID的情况下过得一样好所需的公平补偿的全部价值。结合2022年中位家庭收入74,580美元，心理健康成本约为1.096万亿美元（4900万例乘以每年7,458美元的治疗费用，再乘以三年）。 教育：GDP衡量的是一个经济体在每个时间段内生产的商品和服务的市场价值。不在市场上定价的服务，如公共教育，按其成本计入GDP。疫情期间，许多学校转为远程学习以满足社交距离要求。教师继续工作，因此其对GDP的贡献没有变化。 然而，远程学习的效果远不如传统的课堂学习。疫情期间，学生的标准化评估测试成绩下降，且尚未恢复到疫情前的水平。2022年全国教育进步评估的四年级和八年级数学平均分比2019年分别下降了五分和八分。Jake Bryant, Emma Dorn, Leah Pollack, and Jimmy Sarakatsannis, “COVID-19 Learning Delay and Recovery: Where Do US States Stand?” McKinsey & Company, January 11, 2023, https://www.mckinsey.com/industries/education/our-insights/covid-19-learning-delay-and-recovery-where-do-us-states-stand（2024年6月29日访问）。 平均阅读成绩普遍下降了三分。 这些教育损失相当于学生在他们的教育中落后了四分之一到四分之三的学年。Ben Chapman and Douglas Belkin, “Pandemic Learning Loss Could Cost Students $70,000 in Lifetime Earnings,” The Wall Street Journal, December 27, 2022, https://www.wsj.com/articles/pandemic-learning-loss-could-cost-students-70-000-in-lifetime-earnings-11672148505（2024年6月29日访问）。 使用每年8700亿美元的公立小学和中学支出数据，这相当于损失了2180亿美元到6530亿美元的教育价值。对于我们的损失计算，我们将高端和低端数字的平均值取为4350亿美元。 结论：COVID-19疫情对美国造成了令人震惊的损失，无论是人命还是经济方面。总估计成本为18.007万亿美元，这是这场全球健康危机对国家造成的深远影响的明确提醒。通过理解和承认这些成本，我们可以为追究那些因疏忽或明显行动加剧疫情严重性的人提供基础。 追究中国政府的责任 委员会集中评估了中国共产党（CCP）在COVID-19疫情中的作用。第一部分是审查关于中国科学和操作环境的现有事实和证据。第二部分是审查中国当局为掩盖真相所采取的行动。 科学和操作环境 在仔细审查现有证据后，委员会认为COVID-19疫情很可能源于中国武汉的一次研究相关事件。中国政府掩盖了大量相关记录，并阻碍了所有可信的国际调查努力，但现有证据强烈支持研究相关事故的说法。 尽管理论上COVID-19可能是通过野生动物的自然传播（动物传人）出现的，Jonathan E. Pekar等人，“The Molecular Epidemiology of Multiple Zoonotic Origins of SARS-CoV-2”，Science, Vol. 377, No. 6609 (2022年7月26日)，pp. 960–966，https://www.science.org/doi/10.1126/science.abp8337（2024年7月1日访问）。 或在湿市场的溢出，Michael Worobey等人，“The Huanan Market Was the Epicenter of SARS-CoV-2 Emergence”，Zenodo, February 26, 2022, https://zenodo.org/records/6299116（2024年7月1日访问）。 （溢出是指病毒起源于动物然后传染给人类），尽管经过四年的广泛测试，但没有任何证据支持这些假说。支持这些假说的人集中在早期病例的空间分析、市场出现的两个谱系的指控以及易感动物的存在。然而，这些假说面临许多重大挑战。Worobey等人在Science发表的论文，Michael Worobey等人，“The Huanan Seafood Wholesale Market in Wuhan Was the Early Epicenter of the COVID-19 Pandemic”，Science, Vol. 377, No. 6609 (2022年7月26日)，pp. 951–959，https://www.science.org/doi/10.1126/science.abp8715（2024年7月1日访问）。 声称市场起源的决定性证据后来被两位不同作者的同行评审文章统计否决。Dietrich Stoyan和Sung Nok Chiu，“Statistics Cannot Prove that the Huanan Seafood Wholesale Market Was the Early Epicenter of the COVID-19 Pandemic”，arXiv preprint, 2022年8月22日，https://europepmc.org/article/ppr/ppr537695（2024年7月1日访问）；Dietrich Stoyan和Sung Nok Chiu，“Statistics Did Not Prove that the Huanan Seafood Wholesale Market Was the Early Epicenter of the COVID-19 Pandemic”，Journal of the Royal Statistical Society Series A: Statistics in Society, 2024年1月16日，https://academic.oup.com/jrsssa/advance-article-abstract/doi/10.1093/jrsssa/qnad139/7557954（2024年7月1日访问）。 2024年最终发布的早期病例数据完全驳斥了双重溢出论，并指出病毒单次引入人类引发了大流行。Jia-Xin Lv等人，“Evolutionary Trajectory of Diverse SARS-CoV-2 Variants at the Beginning of COVID-19 Outbreak”，Virus Evolution, Vol. 10, No. 1 (2024)，https://academic.oup.com/ve/article/10/1/veae020/7619252?login=false（2024年7月1日访问）。 在市场上从未发现感染动物的证据。Jesse D. Bloom，“Association Between SARS-CoV-2 and Metagenomic Content of Samples from the Huanan Seafood Market”，Virus Evolution, Vol. 9, No. 2 (2023)，https://academic.oup.com/ve/article/9/2/vead050/7249794（2024年7月1日访问）；Jesse D. Bloom，“Importance of Qualifying the Number of Viral Reads in Metagenomic Sequencing of Environmental Samples from the Huanan Seafood Market”，Virus Evolution, Vol. 10, No. 1 (2024)，https://academic.oup.com/ve/article/10/1/vead089/7504441（2024年7月1日访问）；William J. Liu等人，“Surveillance of SARS-CoV-2 at the Huanan Seafood Market”，Nature, 2023年4月5日，https://www.nature.com/articles/s41586-023-06043-2（2024年7月1日访问）；世界卫生组织，WHO-Convened Global Study of Origins of SARS-CoV-2: China Part | Joint WHO–China Study, 14 January–10 February 2021, published March 30, 2021，https://reliefweb.int/report/world/who-convened-global-study-origins-sars-cov-2-china-part-joint-who-china-study-14（2024年7月1日访问）；Lv等人，“Evolutionary Trajectory of Diverse SARS-CoV-2 Variants at the Beginning of COVID-19 Outbreak.” 在其他病毒暴发中，这类证据通常很快就在这些动物的分销渠道和最终目的地的多个地方被发现。Esam I. Azhar等人，“Evidence for Camel-to-Human Transmission of MERS Coronavirus”，The New England Journal of Medicine, Vol. 370, No. 26 (2014年6月26日)，https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa1401505（2024年7月1日访问）；美国卫生与公众服务部，疾病控制与预防中心，“Prevalence of IgG Antibody to SARS-Associated Coronavirus in Animal Traders—Guangdong Province, China, 2003”，发病率和死亡率每周报告，Vol. 52, No. 41 (2003年10月17日)，pp. 986–987，https://archive.ph/iWceZ#selection-289.0-289.113（2024年7月1日访问）；Samy Kasem等人，“Cross-Sectional Study of MERS-CoV-Specific RNA and Antibodies in Animals that Have Had Contact with MERS Patients in Saudi Arabia”，Journal of Infection and Public Health, Vol. 11, No. 3 (2018年5月–6月)，pp. 331–338，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7102853/（2024年7月1日访问）；Robert Roos，“Jordanian, Saudi Camels Have MERS-CoV-Like Antibodies”，University of Minnesota, Center for Infectious Disease Research and Policy, 2013年12月12日，https://www.cidrap.umn.edu/mers-cov/jordanian-saudi-camels-have-mers-cov-antibodies（2024年7月1日访问）；Ming Wang等人，“SARS-CoV Infection in a Restaurant from Palm Civet”，Emerging Infectious Diseases, Vol. 11, No. 12 (2005年12月)，pp. 1860–1865，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3367621/（2024年7月1日访问）。 其他研究观察到，在市场上发现的传播证据并没有区分在人类中的超级传播事件和自然溢出。Bloom，“Association Between SARS-CoV-2 and Metagenomic Content of Samples from the Huanan Seafood Market”；Virginie Courtier-Orgogozo和Francisco A. de Ribera，“SARS-CoV-2 Infection at the Huanan Seafood Market”，Environmental Research, Vol 214, Pt. 1 (2022年11月)，https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0013935122010295?via%3Dihub（2024年7月1日访问）；Steven E. Massey, Adrian Jones, Daoyu Zhang, Yuri Deigin, and Steven B. Quay，“Unwarranted Exclusion of Intermediate Lineage A-B SARS-CoV-2 Genomes Is Inconsistent with the Two-Spillover Hypothesis of the Origin of COVID-19”，Microbiological Research, Vol 14, No. 1 (2023)，pp. 448–453，https://www.mdpi.com/2036-7481/14/1/33（2024年7月1日访问）。 遗传和早期病例数据似乎表明，在与市场相关的暴发之前，病毒已经在人类中传播。Jesse D. Bloom，“Recovery of Deleted Deep Sequencing Data Sheds More Light on the Early Wuhan SARS-CoV-2 Epidemic”，Molecular Biology and Evolution, Vol. 38, No.12 (2021年12月)，pp. 5211–5224，https://archive.ph/TOpwk#selection-2199.0-3157.62（2024年7月1日访问）；Chaolin Huang等人，“Clinical Features of Patients Infected with 2019 Novel Coronavirus in Wuhan, China”，The Lancet, Vol. 395, No. 10223 (2020年2月15日)，pp. 497506，https://www.thelancet.com/journals/lancet/article/PIIS0140-6736(20)30183-5/fulltext（2024年7月1日访问）；Lv等人，“Evolutionary Trajectory of Diverse SARS-CoV-2 Variants at the Beginning of COVID-19 Outbreak.” 尽管SARS-CoV-2病毒理论上可能是由人与野生动物接触自然产生的，Pekar等人，“The Molecular Epidemiology of Multiple Zoonotic Origins of SARS-CoV-2.” 但仍然没有证据表明直接由蝙蝠或中间物种的自然传播。 逻辑和常识：导致COVID-19大流行的病毒，正式名称为SARS-CoV-2，首先在2019年秋季出现在中国武汉。这座有1100万人口的城市距离可能携带病毒的马蹄蝠的自然栖息地大约一千英里远，并且离与病毒溢出相关的中国南部热带地区也很远。此外，武汉位于中国较少有人食用野生动物且野生动物交易较少的地区。 尽管武汉离相关的马蹄蝠自然栖息地和与2003年SARS暴发相关的动物分销渠道相距甚远，但病毒却在那里出现，而且没有其他独立的引入。同时，这座城市是中国病毒学研究的主要中心，拥有多个病毒学和公共卫生研究所，包括武汉病毒研究所（WIV）。武汉病毒研究所，“关于WIV”，http://english.whiov.cas.cn/About_Us2016/Brief_Introduction2016/（2024年7月1日访问）。 WIV拥有世界上最大的SARS样冠状病毒收集，并在低标准安全条件下进行操控这些病毒的高风险研究。Aksel Fridstrøm，“中国研究人员在不安全的条件下创造了新的冠状病毒”，Minerva, 2021年5月27日，https://www.minerva.no/china-drastic-sars-cov-2/chinese-researchers-created-new-corona-viruses-under-unsafe-conditions/381476（2024年7月2日访问）。 这些研究包括用这些新创造的病毒感染动物，包括人源化小鼠。Xing-Lou Yang等人，“Isolation and Characterization of a Novel Bat Coronavirus Closely Related to the Direct Progenitor of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus”，Journal of Virology, Vol. 90, No. 6 (2016年3月)，pp. 3253–3256，https://journals.asm.org/doi/10.1128/jvi.02582-15（2024年7月2日访问）；石正丽，“Reply to Science Magazine”，2020年，第7页，https://www.science.org/pb-assets/PDF/News%20PDFs/Shi%20Zhengli%20Q&A-1630433861.pdf（2024年7月2日访问）。参见Jon Cohen，“武汉冠状病毒猎人石正丽发表意见”，Science, Vol. 389, No. 6503 (2020年7月31日)，pp. 487–488，https://www.science.org/doi/pdf/10.1126/science.369.6503.487（2024年7月2日访问）。 虽然WIV自称是民用机构，Andrew Kerr，“‘蝙蝠女’否认中国军方参与武汉实验室已使中国与美国情报界发生冲突”，Daily Caller, 2021年3月23日，https://dailycaller.com/2021/03/23/shi-zhengli-denies-chinese-military-wuhan-lab/（2024年7月1日访问）。 但美国政府在2021年初表示，WIV曾与中国军方合作发表文章和秘密项目，包括实验室动物实验和冠状病毒实验。Eva Dou，“武汉实验室的机密工作使寻找大流行起源变得复杂”，The Washington Post, 2021年6月22日，https://www.washingtonpost.com/world/asia_pacific/wuhan-lab-leak-secret-coronavirus/2021/06/22/b9c45940-cf08-11eb-a224-bd59bd22197c_story.html（2024年7月1日访问）。 外界很难确切了解该研究所进行的实验，但我们知道，自2003年SARS暴发后，WIV成为国际冠状病毒研究的焦点。美国国务院，“事实表：武汉病毒研究所的活动”。 石正丽，WIV新发传染病中心主任，她和她的同事们曾基因工程合成嵌合SARS样冠状病毒，这些病毒在感染人源化小鼠时，有时比从自然界收集的病毒更具毒性。Sharon Lerner, Mara Hvistendahl, and Maia Hibbett，“NIH文件提供了美国资助武汉功能获得研究的新证据”，The Intercept, 2021年9月9日，https://theintercept.com/2021/09/09/covid-origins-gain-of-function-research/（2024年7月2日访问）。 石和WIV的其他人进行了这种工作在生物安全二级（BSL-2）水平，Bob Kadlec, Bob Foster, and 117th GOP HELP [Health, Education, Labor, and Pensions] Committee Staff, Muddy Waters: The Origins of COVID-19 Report: Executive Summary, 2023年4月17日，第9页，https://www.marshall.senate.gov/wp-content/uploads/MWG-EXECUTIVE-SUMMARY-4.17-Final-Version.pdf（2024年7月2日访问）。 远低于石前美国合作者病毒学家Ralph Baric在生物安全三级（BSL-3）水平进行的工作。Rowan Jacobsen，“深入探讨美国与武汉相关的危险蝙蝠病毒工程”，MIT Technology Review, 2021年6月29日，https://www.technologyreview.com/2021/06/29/1027290/gain-of-function-risky-bat-virus-engineering-links-america-to-wuhan/（2024年7月2日访问）。 BSL-2级别对于进行高风险病毒实验来说是严重不足的。国际科学家共识认为此类研究应至少在BSL-3级别进行，理想情况下在BSL-4级别进行。 此外，SARS-CoV-2病毒包含的独特特征和属性表明其研究相关起源。或许所有这些特征中，最引人注意的是弗林切割位点。弗林切割位点在这种冠状病毒亚属（称为Sarbecovirus）中从未见过。Valentin Bruttel, Alex Washburne, and Antonius VanDongen，“内切酶指纹显示SARS-CoV-2的合成起源”，bioRxiv preprint, 发布于2022年10月20日，https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.18.512756v1.full.pdf（2024年7月2日访问）；Yujia Alina Chan and Shing Hei Zhan，“SARS-CoV-2刺突蛋白中的弗林切割位点的出现”，Molecular Biology and Evolution, Vol. 39, No. 1 (2022年1月)，https://academic.oup.com/mbe/article/39/1/msab327/6426085（2024年7月2日访问）；Alina Chan，“为什么大流行可能在实验室开始的五个关键点”，The New York Times, 2024年6月3日，https://www.nytimes.com/interactive/2024/06/03/opinion/covid-lab-leak.html（2024年7月2日访问）；Hyeryun Choe and Michael Farzan，“SARS-CoV-2首次适应人类的方式”，Science, Vol. 372, No. 6541 (2021年4月30日)，pp. 466–467，https://observatoriocovid19.sv/doc/biblioteca/internac/Adaptation_sars_covid.pdf（2024年7月2日访问）。 研究发现弗林切割位点是SARS-CoV-2致病的关键。Bryan A. Johnson等，“弗林切割位点是SARS-CoV-2致病的关键”，bioRxiv preprint, 2020年8月26日，https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32869021/（2024年7月2日访问）；Bryan A. Johnson等，“弗林切割位点的缺失削弱了SARS-2-CoV-2的致病性”，Nature, Vol. 591, No. 7849 (2021年3月)，pp. 293–299，https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33494095/（2024年7月2日访问）；Siu-Ying Lau等，“在S1/S2连接处删除的减弱型SARS-CoV-2变种”，Emerging Microbes & Infections, Vol. 9, No. 1 (2020年12月)，pp. 837–842，https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32301390/（2024年7月2日访问）；Thomas P. Peacock等，“SARS-CoV-2刺突蛋白中的弗林切割位点是雪貂传播的必要条件”，Nature Microbiology, Vol. 6, No. 7 (2021年7月)，pp. 899–909，https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33907312/（2024年7月2日访问）。 有很强的证据表明大流行病毒是从武汉的研究中出现的，科学家们在那里提议将弗林切割位点插入新型SARS样冠状病毒中。 武汉病毒研究所的生物安全记录不足。在疫情暴发前，WIV的安全协议存在大量问题，这是不可忽视的。 例如，2017年和2018年，美国驻北京大使馆官员向国务院发送电报，警告WIV的安全问题。这些警告被忽视了。电报非常有预见性，特别提到了实验室在SARS样蝙蝠冠状病毒和人类感染性研究方面的敏感性。David Feith在“调查COVID-19起源，第二部分”的证词，众议院监督和问责委员会冠状病毒大流行特别小组委员会，“Investigating the Origins of COVID-19, Part 2”，2023年4月18日，https://docs.house.gov/meetings/VC/VC00/20230418/115744/HHRG-118-VC00-Wstate-FeithD-20230418.pdf（2024年7月2日访问）。 在美国政府对武汉的另一次访问中，一位国家过敏和传染病研究所的官员了解到WIV没有操作高安全性生物安全四级（BSL-4）实验室的经验，必须“从零开始学习”。Katherine Eban，“秘密警告武汉研究在疫情前”，Vanity Fair, 2023年11月21日，https://www.vanityfair.com/news/2023/11/covid-origins-warnings-nih-department-of-energy（2024年7月1日访问）。 中国疾控中心主任高福博士在2019年3月的《生物安全与健康》期刊上发表社论，警告自然、意外和故意生物威胁的潜在风险。他特别提到实验室风险： “批准的生物隔离和生物安全协议的不合规可能导致病原体意外或故意释放到环境中……[G]病原体的基因改造，可能扩展宿主范围以及增加传播性和毒性，可能带来流行病的新风险……[如]合成的蝙蝠起源SARS样冠状病毒[获得了增加感染人类细胞的能力。”George F. Gao，“For a Better World: Biosafety Strategies to Protect Global Health”，Biosafety and Health, Vol. 1, No. 1 (2019年6月)，pp. 1–3，https://doi.org/10.1016/j.bsheal.2019.03.001（2024年7月2日访问）。 2019年7月，WIV领导人警告他们面临“紧急问题”。Report，“A Complex and Grave Situation”: A Political Chronology of the SARS_CoV-2 Outbreak, 2023，第6页，https://www.rubio.senate.gov/wp-content/uploads/_cache/files/790b6d70-7150-4f0f-a8b9-01ea45d3b1d1/EAB44A6CA6190D31041C0037E9C5E589.05.01.23-origin-report-clean-v1-11.pdf（2024年7月2日访问）。报告由参议员Marco Rubio（R-FL）办公室于2023年5月16日发布。新闻稿，“Rubio Releases Groundbreaking COVID Origins Report”，2023年5月16日，https://www.rubio.senate.gov/rubio-releases-groundbreaking-covid-origins-report/（2024年7月2日访问）。 尽管与该研究所相关的生物安全问题和松散的安全协议，危险的病毒研究仍在进行中。 美国国务院在2021年1月的一份事实表中指出，它“有理由相信”WIV内部有几名科学家在2019年秋季生病了。美国国务院，“事实表：武汉病毒研究所的活动”。 这些科学家据报道表现出与COVID-19或常见季节性疾病一致的症状，尽管WIV领导声称那里没有工作人员和学生感染。Ibid. 随后美国新闻报道披露了关于三名WIV研究人员在武汉公开承认COVID-19疫情爆发之前病倒的更多信息。 2018年DEFUSE提案与2019年SARS-CoV-2病毒的匹配 2021年，在线研究网络DRASTIC发布了与2018年3月提交给美国政府的研究项目DEFUSE相关的关键文件细节。该项目旨在通过操纵武汉病毒研究所（WIV）中的冠状病毒，这与后来被识别为SARS-CoV-2的遗传特征惊人地相似。 研究资料与链接 Daoyu Zhang et al., “DRASTIC—An Analysis of Project DEFUSE,” ResearchGate, September 2021, ResearchGate链接 (访问日期：2024年7月2日) Sharon Lerner 和 Mara Hvistendahl, “New Details Emerge About Coronavirus Research at Chinese Lab,” The Intercept, September 6, 2021, The Intercept链接 (访问日期：2024年7月2日) 美国政府拒绝资助 美国国防高级研究计划局（DARPA）的生物技术办公室项目经理James Gimlett在一份总结中表示，政府拒绝资助这一提案。 James Gimlett, Program Manager, Biological Technologies Office, “PM Summary Sheet: Source Selection Sensitive,” U.S. Department of Defense, Defense Advanced Research Projects Agency, DARPA链接 (访问日期：2024年7月2日) 该提案本应是纽约的EcoHealth Alliance组织、武汉病毒研究所、新加坡国立大学杜克医学院和北卡罗来纳大学的联合研究项目。 后续文件与研究发现 2023年12月，美国知情权组织的研究人员获得的额外文件显示，DEFUSE提案的早期草稿进一步强调了其与SARS-CoV-2的关联。 Annette Gartland, “Scientists Say EcoHealth Alliance’s DEFUSE Proposal Was a Blueprint for SARS-CoV-2,” Changing Times, January 19, 2024, Changing Times链接 (访问日期：2024年7月2日) Emily Kopp, “American Scientists Misled Pentagon on Research at the Wuhan Institute of Virology,” U.S. Right to Know, December 18, 2023, US Right to Know链接 (访问日期：2024年7月2日) 相关评论与文献 北卡罗来纳大学研究员Ralph Baric在DEFUSE提案的早期草稿中评论道：“在中国，可能在生物安全2级（BSL-2）下培养这些病毒。如果美国研究人员知道了，可能会非常惊讶。” Emily Kopp, “American Scientists Misled Pentagon on Research at the Wuhan Institute of Virology.” See also enclosure, “Combined Records_Redacted pdf (1,412 pages),” attached to letter from Judy Cearley, U.S. Geological Survey, Government Information Specialist, to Emily Anne Kopp, U.S. Right to Know, “Re: U.S. Geological Survey (USGS) Freedom of Information Act (FOIA) Tracking # DOI-USGS-2023-000257—Response,” December 5, 2023, p. 171, US Right to Know链接 (访问日期：2024年7月2日) WIV科学家的论文遗漏 令人怀疑的是，在2020年2月COVID-19爆发后，WIV科学家在《自然》上发表了一篇关于该病毒的论文，但遗漏了其最重要和新颖的特征：furin裂解位点。 Peng Zhou et al., “A Pneumonia Outbreak Associated with a New Coronavirus of Probable Bat Origin,” Nature, Vol. 579 (2020), pp. 270–273, Nature链接 (访问日期：2024年7月2日) 相关研究与报道 Sharon Lerner and Maia Hibbett, “Leaked Grant Proposal Details High-Risk Coronavirus Research,” The Intercept, September 23, 2021, The Intercept链接 (访问日期：2024年7月2日) 这一遗漏尤其令人不解，因为Shi在DEFUSE提案中的参与以及她之前的出版物都应该使她熟悉furin裂解位点。 Chan, “Why the Pandemic Probably Started in a Lab, in 5 Key Points”; Yang Yang et al., “Two Mutations Were Critical for Bat-to-Human Transmission of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus,” Journal of Virology, Vol. 89, No. 17 (September 1, 2015), pp. 9119–9123, NCBI链接 (访问日期：2024年7月2日) 尽管美国政府没有批准DEFUSE提案，但研究人员经常为已经开始的工作寻求资助。WIV无需依赖美国政府的资金即可独立进行这种危险的研究。在没有经验丰富的外国参与者的情况下，中国可以在BSL-2级别自由进行研究，而几乎没有风险管理约束。 Chan, “Why the Pandemic Probably Started in a Lab, in 5 Key Points” 这种认为武汉可以在没有美国资助的情况下进行研究的观点在Anthony Fauci博士的文章中提到。 中共的系统性掩盖 改变世界的七周 自2019年12月起，至少在那时，中国官员本可以表现出诚意并履行其国际承诺，努力防止国内流行病成为全球大流行。然而，他们选择了另一条道路。关键事实如下： 2019年12月，中国官员知道新病毒有人传人的情况。 中国当局积极压制医疗人员、记者和其他中国公民的警告，有时甚至将他们关押。 自2019年12月27日起，中国当局扣押了SARS-CoV-2的基因组序列。 中国当局向世界卫生组织（WHO）隐瞒了病毒的类型、感染人数的真实数据以及已证实的人传人情况，直到全世界无法再忽视疫情的严重性。 中国当局下令销毁可能提供证据的实验室样本。 中国当局对学术研究人员和科学家发布禁言令，禁止他们分享关于病毒的信息。 2020年1月11日，一位中国科学家违抗命令在线发布了基因组序列，才让其他国家有机会开始开发测试、药物和疫苗。 尽管有证据表明病毒可以无症状传播，中国官员仍允许国际航班从武汉和其他中国城市继续飞行，助长了全球传播。 中国官员阻止了国际调查病毒起源的努力。 越来越多的证据表明，SARS-CoV-2在2019年秋季就在武汉开始传播。医院的前线临床医生很快意识到他们治疗的不寻常肺炎可能是传染性的。一位医生，张丽博士后来写道，到12月底，“人传人的迹象已经非常明显。” 武汉的反应与初期应对 中国CDC的承认 中国CDC主任高福在2021年3月21日的采访中承认：“武汉的医生报告了早期病例，但这些并未进入我们的全国疾病报告网络。” Dali L. Yang, 《武汉：新冠疫情在中国如何失控》, New York: Oxford University Press, 2024, p. 69 实验室安全措施的改变 几个月前，即2019年9月，武汉病毒研究所更改了其安全协议，订购了一台昂贵的新型空气焚烧炉和通风系统，并在深夜神秘地撤下了包含22,000个蝙蝠病毒样本的在线数据库。 Katherine Eban and Jeff Kao, “COVID-19 Origins: Investigating a ‘Complex and Grave Situation’ Inside a Wuhan Lab,” ProPublica, October 28, 2022, ProPublica链接 (访问日期：2024年7月1日) U.S. House of Representatives, Committee on Foreign Affairs, “The Origins Of COVID-19: An Investigation of the Wuhan Institute of Virology,” 117th Cong., 1st Sess., August 2021, p. 5, Foreign Affairs链接 (访问日期：2024年7月1日) WIV研究人员感染 许多报道表明，WIV的研究人员在2019年秋季感染了病毒。2021年美国情报报告称，病毒在2019年11月之前就已经在武汉传播。其他数据显示，2019年更早时期就有病例出现。 U.S. Department of State, “Fact Sheet: Activity at the Wuhan Institute of Virology.” Michael R. Gordon and Warren P. Strobel, “Lab Leak Most Likely Origin of Covid-19 Pandemic, Energy Department Now Says,” The Wall Street Journal, February 26, 2023, WSJ链接 (访问日期：2024年7月1日) Gilles Demaneuf, “SAGO Presentation: Limitations of the Official 2019 Wuhan Cases (Based on Primary Sources),” August 2023, p. 145, ResearchGate链接 (访问日期：2024年7月1日) 中国政府的反应 中国官方报告声称，2019年12月1日发现了武汉的首例患者。后来又改为12月8日。然而，《南华早报》获得的中国政府文件显示，11月已有9个病例，最早的病例出现在2019年11月17日。 Josephine Ma, “Coronavirus: China’s First Confirmed Covid-19 Case Traced Back to November,” South China Morning Post, March 13, 2020, SCMP链接 (访问日期：2024年7月2日) 信息控制与压制 在疫情初期，中国政府利用强大的宣传机器控制和操纵关于病毒的信息。2019年12月1日，中文社交媒体上“非典”和“呼吸急促”的使用开始增加，到12月29日达到顶峰。第二天，武汉当地当局向医疗机构发布了紧急通知，禁止发布未经授权的疫情信息。该禁令在社交媒体上迅速传播，当地当局的紧急通知迅速在社交媒体上广泛传播。医护人员甚至因戴口罩而受到批评，而当时中国否认病毒有人传人，这导致了不必要的死亡和进一步的传播。 Zaheer Allam, “The First 50 days of COVID-19: A Detailed Chronological Timeline and Extensive Review of Literature Documenting the Pandemic,” Chapter 1 in Surveying the Covid Pandemic and its Implications: Urban Health, Data Technology and Political Economy (Cambridge, MA: Elsevier, 2020), p. 2, NCBI链接 (访问日期：2024年7月2日) Demaneuf, “SAGO Presentation: Limitations of the Official 2019 Wuhan Cases (Based on Primary Sources),” p. 184; Julia Hollingsworth and Yong Xiong, “The Truthtellers,” CNN, February 2021, CNN链接 (访问日期：2024年7月2日); Alice Su, “A doctor Was Arrested for Warning China About the Coronavirus. Then He Died of It,” Los Angeles Times, February 6, 2020, LA Times链接 (访问日期：2024年7月2日) 医护人员的压制与逮捕 最初尝试分享病毒信息的医生被警察拘留，被迫承认“散布谣言”。中国记者和活动家也因试图向国人和外界讲述武汉内部的真相而被监禁。中国公民讲述的故事与官方叙述截然不同。 Hollingsworth and Xiong, “The Truthtellers” CCP的信息隐瞒与虚假数据 中共隐瞒信息，发布虚假数据，并拒绝分享关于医护人员感染情况的信息，这对于理解传播模式和制定遏制策略至关重要。2019年12月24日，武汉中央医院的医生从一位肺炎患者的肺中提取了液体样本，并将其送至中国基因组公司Vision Medicals进行测试。大约在同一时间，当地医生将至少八个其他患者样本送到包括华大基因在内的多个中国基因组公司。 Gao Yu et al., “In Depth: How Early Signs of a SARS-Like Virus Were Spotted, Spread, and Throttled,” Caixin Global, February 29, 2020, Caixin链接 (访问日期：2024年7月2日); Gao Yu et al., “How Early Signs of the Coronavirus Were Spotted, Spread and Throttled in China,” The Straits Times, updated February 28, 2020, Straits Times链接 (访问日期：2024年7月2日) 医护人员的隔离 2019年12月25日，两家武汉医院的医护人员因疑似病毒性肺炎被隔离，提供了人传人的额外证据。12月27日，Vision Medicals通过电话向医院和中国CDC报告了几乎完整的基因组序列。基因组序列也被分享给北京中国医学科学院病原生物学研究所进行进一步分析。结果表明，这是一种蝙蝠来源的类似SARS的冠状病毒，且同源性非常高。华大基因于12月29日完成了新型冠状病毒的基因组测序。实验室测试结果都指向了一种类似SARS的病毒。 Demaneuf, “SAGO Presentation: Limitations of the Official 2019 Wuhan Cases (Based on Primary Sources),” p. 93 中国国家卫生委员会的行动 同一时间，中国国家卫生委员会下令商业实验室销毁或上交病毒样本，并下令研究结果仅在官方批准后才能发布。 Josh Chin, “China Told Labs to Destroy Coronavirus Samples to Reduce Biosafety Risks,” The Wall Street Journal, May 16, 2020, WSJ链接 (访问日期：2024年7月2日); Emily Kopp, “Beijing Ordered Destruction of Early Coronavirus Samples, Secret Memo Shows,” U.S. Right To Know, June 27, 2023, US Right to Know链接 (访问日期：2024年7月2日) 武汉卫生委员会的确认 2019年12月30日，武汉卫生委员会确认了一种不明原因的病毒，并向医院、诊所和其他医疗设施发布了严格禁止发布任何关于这种新疾病的治疗信息的命令。 David P. Steensma and Robert A. Kyle, “Dr. Li Wenliang: Wuhan ‘Whistleblower’ and Early COVID-19 Victim,” Mayo Clinic Proceedings, Vol. 97, No. 7 (July 2022), pp. 1409–1410, NCBI链接 (访问日期：2024年7月2日) 中国政府的进一步反应 WHO的回应 2020年1月3日，中国官方向WHO提供了有关武汉不明原因病毒性肺炎病例的信息，并告诉WHO，他们不清楚其原因。同日，国家卫生委员会向实验室发送秘密备忘录，禁止未经授权的科学家进行病毒研究并向公众披露信息。 World Health Organization, “Listing of WHO’s Response to COVID-19,” last updated January 29, 2021, WHO链接 (访问日期：2024年7月2日) 中国官方的行动 2020年1月1日，国家卫生委员会命令WIV不得透露关于疫情的任何信息，如测试、实验数据和结果，甚至不能透露给合作机构和技术服务公司。基因组公司也被告知停止测序，销毁样本，并不得传达任何信息。 Demaneuf, “SAGO Presentation: Limitations of the Official 2019 Wuhan Cases (Based on Primary Sources),” p. 13 and 103 人传人的确认 2020年1月11日，由上海公共卫生临床中心的张永振领导的团队在美国网站Virological.org上发布了基因组序列。两天后，中国官方强制关闭了他的实验室，进行“整改”。 Edward Holmes, “Novel 2019 Coronavirus Genome,” posted January 2020, Virological链接 (访问日期：2024年7月2日); Smriti Mallapaty, “Chinese Virologist Who Was First to Share COVID-19 Genome Sleeps on Street After Lab Shuts,” Nature, updated May 3, 2024, Nature链接 (访问日期：2024年7月2日) 中国的航空交通控制 据《环球时报》报道，习近平于2020年1月22日下令对武汉和湖北省其他城市实施交通管制和人员流动限制。封锁于次日开始。但为时已晚。到1月23日，武汉已有700万人在1月期间因春节假期离开，病毒在30多个城市和26个国家蔓延。 “Xi’s Instructions on Wuhan Lockdown Lay Cornerstone of China’s Victory Against COVID-19,” Global Times, June 7, 2020, Global Times链接 (访问日期：2024年7月2日) 习近平的指示阻止了武汉飞往其他中国城市的航班，但允许国际航班继续飞行。 U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, “Control of Communicable Diseases; Foreign Quarantine,” Interim Final Rule with Request for Comments, Federal Register, Vol. 85, No. 29 (February 12, 2020), pp. 7874–7880, Federal Register链接 (访问日期：2024年7月2日) 国际航班与病毒传播 北京的行动助长了病毒在国界之外的传播，尽管他们知道其致命性和人传人性质。在美国政府于2020年1月31日限制旅行之前，已有1300个从武汉飞往美国17个城市的直飞航班。 Steve Eder, Henry Fountain, Michael H. Keller, Muyi Xiao, and Alexandra Stevenson, “430,000 People Have Traveled from China to U.S. Since Coronavirus Surfaced,” The New York Times, April 4, 2020, NY Times链接 (访问日期：2024年7月2日) 其他重要事实 北京对关键信息的隐瞒和审查不仅影响了中国自身的人口或中国的旅行者，也影响了全球科学界。武汉病毒研究所包含超过22,000个样本的数据库在2019年9月被撤下。这一数据库本来是追踪SARS-CoV-2起源的最有用工具，但从未向美国研究人员公开。 Chan, “Why the Pandemic Probably Started in a Lab, in 5 Key Points”; Charles Small, Billy Bostickson, and Gilles Demaneuf, “An Investigation into the WIV Databases that Were Taken Offline,” ResearchGate, February 2021, ResearchGate链接 (访问日期：2024年7月2日) 习近平的指示与应对 2020年2月3日，习近平在政治局常委会上发表讲话，回顾了他从1月7日政治局常委会会议开始的疫情应对指示。他说：“各级党委和政府必须坚决服从中央的统一指挥、统一协调、统一调度，做到令行禁止。”因此，习近平早在1月7日就发布了关于疫情爆发的重要指示，尽管他在很长一段时间内仍继续对中国公众和其他世界领导人掩盖和淡化此事。 个人防护装备（PPE）的囤积 在疫情初期，北京指示位于中国和海外的中国公司在国际市场上采购数百万个防护口罩、医用长袍和手套并运回中国大陆。中国当局将外国公司的供应链和生产能力国有化，包括通用汽车和3M公司，以生产医用物资，同时拒绝为其产品颁发出口许可证。 Final Report, The Origins of the Covid Global Pandemic, Including the Roles of the Chinese Communist Party and the World Health Organization, Minority Staff, Committee on Foreign Affairs, U.S. House of Representatives, 116th Cong., 2nd Sess., 2020, p. 5, Foreign Affairs链接 (访问日期：2024年7月2日) 在美国获得病毒基因组之前，中共显然已经在进行疫苗研发。北京军事医学科学院（AMMS）第五研究所所长周育森少将与武汉病毒研究所有合作，可能在疫情前曾在武汉病毒研究所工作。周育森是一个成就卓著的冠状病毒疫苗学家。2020年2月24日，他提交了首批COVID-19疫苗专利之一，这需要访问SARS-CoV-2的序列和活病毒。研究方法与专利表明，疫苗研究最晚在2019年11月开始。周在2020年5月初提交研究预印本并初步测试疫苗后神秘去世。官方没有对他的去世进行确认。 Zhou Yusen et al., “Novel Coronavirus COVID-19 Vaccine, Preparation Method and Application Thereof,” China Patent CN111333704B, filed February 24, 2020, and issued January 12, 2021, Google Patents链接 (访问日期：2024年7月2日) 法律责任与FSIA FSIA的适用 中国作为WHO国际卫生条例的签署国，在收集有关COVID-19传播的数据和通知WHO方面负有责任。根据FSIA，中国政府及其附属机构应对COVID-19疫情造成的损害承担责任。需要克服FSIA豁免的主要事实调查和法律责任领域包括： 商业活动豁免：基于商业活动引起的行为。 人身伤害或死亡豁免：在美国境内发生的外国国家的侵权行为。 国际恐怖主义豁免：在美国境内发生的国际恐怖主义行为。 自愿放弃豁免权：外国国家可以放弃其FSIA豁免权。 可能的诉讼对象与案例如下： 中国南方航空公司 中国东方航空公司 中国国药集团（Sinopharm） 具体的可能诉因包括： 过失：针对中国和在美国开展业务的类似商业实体提出的普通法过失诉讼。 严格责任：对武汉病毒研究所等相关被告提出的进行异常危险活动的严格责任诉讼。 公共妨害：对中国、南方航空、东方航空等直接在美国运营的实体提出的普通法公共妨害诉讼。 反竞争行为：根据联邦或州法律对中国的反竞争行为提出的诉讼。 欺诈性失实陈述：对中国南方航空和中国东方航空提出的有关COVID-19的公共评论的普通法欺诈性失实陈述诉讼。 民事RICO违法行为：根据18 U.S.C. § 1961等对中国南方航空和中国东方航空提出的民事Racketeer and Corrupt Organization Act（RICO）违法行为诉讼。 请求的救济措施 初步救济应包括Mareva禁令/冻结令，以防止资产转移。最终救济应包括：恢复/不当得利、任何授权的民事罚款、实际、直接和/或间接损害赔偿、诉讼费用和预判利息。尽管法院可能无法颁布某些形式的禁止性救济，但应考虑所有可行的法律救济。 FSIA修订 委员会认为，正确理解的FSIA（外国主权豁免法）并不会阻止对中国及其工具机构提出诉讼。然而，为了明确起见，委员会认为国会应通过立法，在全球大流行病导致超过一百万美国公民和居民过量死亡并由外国国家引起的特殊情况下，取消外国主权的豁免。 这种方法是有先例的。《反恐怖主义赞助者正义法》（Justice Against Sponsors of Terrorism Act）于2016年通过，回应了对FSIA过度限制美国人对9/11寻求司法救济的强烈关注。值得注意的是，该法案在总统巴拉克·奥巴马的否决后仍通过了。 有些人考虑直接针对中国过去的行为提出法案，取消其相对于COVID-19的豁免。这涉及与主权豁免的习惯国际法一致性的复杂决策。它还涉及取消FSIA豁免会对经济产生重大影响，使中国公司在美国开展业务变得更加困难。因此，委员会建议采取一种中间道路——取消对COVID-19大流行病规模的全球灾难在美国产生重大影响的情况下的FSIA豁免。建议的语言如下： 美国地区法院对任何寻求针对外国国家因在美国发生的任何鲁莽行为或疏忽（包括故意隐瞒相关信息或延迟报告信息的行为）导致或严重加剧的全球大流行病而造成的身体或经济损害的案件拥有原始和排他性管辖权，无论该行为或疏忽发生在何处；前提是生物制剂是导致在美国造成超过一百万过量死亡的直接或间接原因。 这种条款可以作为对现有FSIA框架的修订插入。需要考虑其他修订以提供陪审团审判、惩罚性赔偿、资产扣押和服务的便利性。一个关于资产扣押的想法是使用FSIA中的恐怖主义例外作为先例，该例外允许任何赢得国家恐怖主义赞助者赔偿判决的美国人对该国家本身及其控制的任何国有企业的商业资产执行判决。这一想法在与中国国家支持的知识产权盗窃有关的拟议FSIA修订中被提出，也同样适用于这个拟议的流行病例外。 应考虑某种机制，通过该机制，如果国家利益需要，美国可以暂停对FSIA所作的任何例外的操作。一种可能的方法是修改《迷人的贝特西法案》（The Charming Betsy approach）。根据这种方法，FSIA的修改不适用于总检察长和国务卿亲自提交证书证明该行动违反美国利益的任何案件。可以为他们的考虑提供因素，例如该国家是否进行了全面、不受限制的调查并公开了调查结果。 美国应对COVID-19大流行中中国责任的政策建议 有足够的证据表明中国共产党在COVID-19大流行中的核心作用，美国需要采取领导行动促进问责、赔偿和未来的全球公共卫生。不作为只会激励中共继续其不透明、不合作甚至敌对的行为。唐纳德·特朗普总统和乔·拜登总统都承诺追究中共的责任，国会议员也做出了类似承诺，但没有任何实际行动。是时候履行这些承诺了。 对国会的建议 成立两党美国国家COVID-19委员会。 国会应创建一个委员会并通过预算抵销为其提供资金。曾经有努力建立类似于9/11委员会的委员会，但这些努力停滞了。我们认为，建立这样一个委员会是至关重要的。委员会将是多方面的，其职责包括审查中国的疏忽和掩盖行为以及评估美国在COVID-19到达后实施的国内政策。我们强烈鼓励其他国家也成立自己的委员会进行类似审查，以追究中国的责任。 创建两党赔偿/补偿工作组以处理对中国的索赔。 美国公民因COVID-19经历的痛苦和痛苦应得到中国的赔偿。历史上，已经建立了几种公认的模式来评估责任并抵消由于政府的侵略或疏忽而造成的大规模损害。这些模型包括德国大屠杀赔偿会议和涵盖伊拉克1990年入侵科威特的联合国赔偿委员会。国会提出的《中共COVID-19责任法案》如果通过，本可以用来从中国获取赔偿。工作组可以与建议中的国家COVID-19委员会合并，或作为独立实体设立。 为针对中华人民共和国的民事诉讼提供途径。 国会必须探索扩大美国联邦法院管辖权的机会，使其能够对中国个人或机构提出美国民事诉讼类似于2023年提出的《中共不法死亡责任法案》，这将通过减少对中国的利息或债务来提供赔偿，或通过减少对中国的外援资金来提供赔偿。 BIOSECURE法案和其他建议 通过BIOSECURE法案以开始将美国政府和商业供应链与中国国家支持的公司脱钩。 该法案将限制美国政府和美国政府承包商继续与与中共、国家和军队有联系的中国“生物技术关注实体”进行业务。 Introduced early this year with bipartisan support in the House and Senate, the bill is still pending in both chambers. 减少美国对中国等外国生产大流行相关需求如PPE和药品的依赖，最终也将增强美国的弹性。这种增强的弹性反过来有利于美国的国家安全和公共卫生利益。 通过立法对所有在中国的美国政府生物医学和相关研究活动进行审计。 目标是确保美国不会资助在没有充分安全和保安设备和协议的情况下进行的危险研究，也不会资助可能被中国军方和安全部门武器化的研究。这一标准将适用于所有由美国联邦拨款或接受联邦资金的教育和研究机构支持的未来和现有生物医学和相关研究活动。所有现有研究的赞助商将有一年时间来反驳其研究构成不可接受的风险的推定。 由于中国研究人员继续在标准不合格的生物安全级别实验室进行高度致命和风险极大的研究，美国纳税人的钱不应该用于资助在一个不遵守基本研究和透明度协议的国家的研究。这些问题既是政治和系统性的，也至少是技术和科学性的，因为单一党制专制政权控制着中国的所有科学活动。 修订《化学和生物武器控制和战争消除法》以对不维护其生物设施且拒绝提供数据的实体实施两阶段制裁。 例如武汉病毒研究所和中国科学院，这些实体未能保持基本的安全标准，也未能共享相关数据。可以对这些实体实施两阶段制裁制度。在确定发生生物或化学事件后，可以在一段时间内采取补救措施。国会可以下令调查该事件，并可以确定该事件是否由外国实体的严重或重大疏忽造成。 与国家新兴生物技术委员会密切合作。 由国会设立并负责审查新兴生物技术和相关技术如何塑造国防部的当前和未来活动的咨询委员会将于2024年12月提供行动建议。我们预计这些建议将非常重要，并建议同时考虑我们和他们的建议。 建议总统采取的措施 一、要求中国将COVID-19的起源进行全面、不受限制的科学和法医调查。 国际专家需要开展研究，并以公开透明的方式分享结果。迄今为止，中国政府禁止对疫情起源进行正式调查。2020年，美国、盟国和国际科学家多次呼吁中国提供所有可用的信息，以确定新型病毒的来源，从而评估其致命性和传播路径，并开始开发疫苗和治疗方法。2021年，七国集团（G-7）峰会的领导人呼吁进行透明、专家主导的COVID-19研究。但这一研究未能实现。相反，中国阻挠了世界卫生组织（WHO）新发病原体起源科学咨询小组（SAGO）的工作。中国持续的掩盖和积极阻止任何有意义的调查，不仅对COVID-19受害者及其家属是一种侮辱，也对国际和平与安全构成威胁。 二、对与COVID-19掩盖行为相关的中国官员和实体实施经济制裁。 根据李文亮全球公共卫生问责法案和2023年冠状病毒起源验证、调查和确定法案的精神，美国政府应对被认定直接参与COVID-19信息扭曲和隐瞒行为的高级中国官员，以及协助和支持这些行为的个人实施制裁。此外，国务卿和财政部长应调查对武汉病毒研究所、中国科学院、国家卫生委员会、军事医学科学院、中国医学科学院、武汉生物制品研究所及其广泛的国家、学术和商业附属机构的制裁，原因是这些机构与COVID-19掩盖行为有关，并且参与了未申报的、可能违反美国总统第13382号行政命令的中国军事生物武器研究和开发活动。 三、承认COVID-19大流行是一场划时代的事件，类似于核时代的开启，需要在美国法律、政策、外交、政府、商业和学术事务上进行相应的重大变革。 过去10到15年间出现的功能获得技术——通过这种技术，最致命的病毒可能与最具传染性的病毒融合——似乎对人类生命构成了物种级别的风险。功能获得技术在潜在流行病病原体上的风险在于，任何地方的一次错误——更不用说某些国家或非国家行为者的故意行为——都足以引发灾难。一旦具有足够传染性和致命性的病毒从实验室泄漏，人类可能无能为力。正如广岛和长崎投下原子弹需要建立新的国内和国际规范、标准和机构一样，COVID-19的例子足以引发公众关注和政策创新，涉及从功能获得资金到实验室安全标准、国际透明度规范、技术控制等方面。然而，几乎没有任何此类创新发生。克服这一失败是国家领导人的基本义务。 四、将生物技术列为美国对华出境投资的限制性行业，依据2023年8月的第14105号行政命令。 该命令应扩大到包括生物技术，国会应通过立法加强对美国政府和私营部门在中国生物技术领域投资的限制。中国最近颁布了一系列广泛的政策变化，越来越将生物研究重新定义为国家安全框架的一部分。2017年，北京表示，作为“军民融合”计划的一部分，政府将为生物研究提供特别资金——该计划旨在将民用技术和研究纳入解放军的军事用途。美国能源部官员警告国家卫生研究院（NIH）的同行，基因编辑技术及其可能被敌对外国对手（包括中国）使用的国家安全风险。因此，美国政府必须通过任何新的出境投资机制或国会通过的法律，密切审查美国在中国的生物技术投资。 五、要求美国情报界优先收集和分析COVID-19起源的数据，与包括“五眼联盟”伙伴（英国、加拿大、澳大利亚和新西兰）在内的盟友合作。 作为这一过程的一部分，进行内部“经验教训”评估，并邀请独立的科学和国家安全专家参与，以研究自COVID-19爆发以来情报相关的不足以及生物安全和生物监测的总体情况。生物情报（BIOINT）应成为美国情报界的核心学科，具备高度多样化的来源和方法。 作为这一过程的附加部分，完全（且迟来的）遵守2023年COVID-19起源法。该法要求国家情报总监办公室（ODNI）“解密任何和所有有关武汉病毒研究所与2019冠状病毒病（COVID-19）起源的潜在联系的信息”，并向国会提交一份非机密报告“仅对总监认为必要以保护来源和方法的信息进行编辑”。 六、大幅增强早期检测和准备能力。 美国宣布了一个五年计划，以应对下一次大流行，其2024年美国全球健康安全战略旨在将美国的正式全球健康安全合作伙伴从19个国家扩大到50个，并通过改进检测、监测、实验室能力和免疫接种来增强合作伙伴识别和应对疾病的能力。该“全政府”战略承诺在地方、国家、区域和国际层面利用私营和公共部门的力量，强化健康和研究系统。这是一个良好的开端，但需要做的远不止这些。行政部门机构应提供防止未来大流行事件的全球协议，并明确说明不遵守这些协议的后果。 总统应促进一个以生物威胁检测为中心的公私合作伙伴关系。总统还应尝试在可信赖的盟友和伙伴的帮助下使这一网络全球化。建立一个针对自然或人为病原体和疫情的有效早期预警系统必须成为国家防御和国家安全的核心功能，而不仅仅是美国及其伙伴的公共卫生活动。生物监测和生物情报（BIOINT）可以且必须具备在临床病例积累到医院之前检测到潜在流行病病原体的能力。它还必须使用情报来源和方法以及下一代基因组分析技术，开发一种可靠区分自然病原体和人工增强病原体的方法，作为威慑的关键第一步。美国必须获得一种生物威胁来源归因能力，类似于其核威胁来源归因的能力。 七、建立新的科学研究和合作框架，与盟友和伙伴建立集体韧性。 举办一次总统峰会，与盟友和伙伴共同审视COVID-19的影响，并启动一项全面的集体韧性战略，以应对未来的疫情和/或生物威胁。虽然中国一直是美国的主要研究伙伴，但中共的行为表明，美国是时候在科学合作中更好地优先考虑安全和国家安全，包括优先与那些分享研究诚信和安全价值观的盟友和伙伴进行合作。 八、对中国违反世界卫生组织国际卫生条例（IHR）施加重大成本。 中国违反了国际卫生条例的第6和第7条。第6条要求国家首先向世卫组织通报公共卫生紧急情况，并提供所有及时、准确和详细的公共卫生信息。第7条将这一要求扩展到包括国家在其领土内发现可能构成国际公共卫生紧急情况的意外或异常公共卫生事件，即使起源或来源未知。必须追究中国对192个国家故意违反其签署的具有法律约束力的协议的责任。不可想象任何全球疫情条约如果允许中国无视其国际承诺并在没有惩罚的情况下引发灾难性的全球疫情，能取得成功。 九、考虑暂停或撤销1979年与中国签订的科技协议（STA）。 自2023年8月以来，STA一直处于临时月度延续状态。虽然STA是一个非约束性的合作协议，但自2018年最后一次续签以来，局势已完全改变。中国不仅继续阻挠对COVID-19起源的任何可信调查，还颁布了一系列新的、具有攻击性的中国法律，严重限制了美国科学家、学者和研究人员与中国同行合作的能力。中国的军民融合政策在技术的军用和民用之间不做区分，从而使中国能够继续进行国际科学合作，同时隐瞒这种合作也有助于中国军队的现代化。 十、核实中国是否遵守《生物武器公约》（BWC）。 《生物武器公约》的第I和第III条确认需要防止开发、制造或获得任何“没有预防、保护或其他和平目的”的生物剂、毒素、武器或设备，并“不得转让或以任何方式协助、鼓励或诱使任何人制造或以其他方式获得生物武器”。 虽然《生物武器公约》于1975年生效并禁止了一整个类别的武器，但它缺乏正式的核查协议和程序。1987年，公约缔约国建立了一项年度数据交换，称为信心建立措施（CBMs）。中国于1984年成为BWC缔约国，美国国务院自1993年以来对中国遵守公约提出了质疑和关注。中国自1989年以来每年提交CBMs，包括最近在2023年提交的。然而，中国的CBM报告从未披露中国曾经拥有进攻性生物武器计划，也未在公开或外交渠道中承认其过去的进攻性生物武器努力。然而据报道，中国已经武器化了蓖麻毒素、肉毒毒素和炭疽、霍乱、鼠疫和兔热病的细菌剂。中国的军事医学机构一直在进行研究，以识别、测试和表征具有双重用途（民用和军用）应用的多种有毒家族。中国的年度CBMs不包括关于这些军事实验室进行的病原体和海洋及动物毒素双重用途生物研究的信息。 结论 全球范围内，COVID-19大流行造成2800万人死亡，整个经济体破裂，弱势群体陷入贫困，还引发了心理健康危机。整整一代人的教育经历被打断。仅在美国，疫情就造成超过一百万人死亡，估计给国家造成18万亿美元的损失。成千上万的成年人和儿童仍在遭受长新冠病症的折磨。 灾难的范围和规模要求我们了解这种致命病毒的起源及其传播的情况。正是基于这一目的，跨党派中国与COVID-19委员会的调查发现，证据表明病毒是武汉实验室事故的结果。报告还详细记录了中国在疫情爆发初期几周和几个月内的行动。 事实上，中国政府没有负责任或透明地行事。他们掩盖了有关COVID-19的高度相关信息——包括疾病何时何地开始——对其公众、科学界和世界。中国政府销毁证据，积极封杀自己的科学家，因提问而逮捕记者，并阻止国际社会调查COVID-19的起源。他们参与了这些行为，尽管签署了一项国际协议，要求他们准确、及时地向世界卫生组织通报这种公共卫生紧急情况。 在中国没有自我问责的情况下，鉴于其在国际机构中的阻挠作用，委员会认为，只有追究中国政府对其过失和恶行的责任，才能为中国政府及其他政府提供行为不同的激励和动力。美国政府必须实施我们提出的建议。委员会还希望其他政府能够从我们的工作中获得灵感，并在其各自的背景下采用这一模式。现在采取大胆行动，总比在更致命的大流行爆发时问自己为什么没有做更多要好。 委员会成员简介 SR286 Ratcliffe 约翰·拉特克利夫，主席 约翰·拉特克利夫担任非党派中国与COVID-19委员会主席。此前，他曾担任第六任美国国家情报总监（DNI），是总统唐纳德·J·特朗普的主要情报顾问，也是美国情报界的最高官员。在任期间，拉特克利夫总监成功协调和部署了情报和军事资产，消灭了多名指定的恐怖主义领导人，因此被授予国家安全勋章，这是国家在情报和国家安全领域的最高荣誉。 在被提名和确认为DNI之前，约翰·拉特克利夫曾担任德克萨斯州第四国会选区的美国众议员超过五年，期间是众议院情报、国土安全和司法委员会的成员。 拉特克利夫总监还曾在乔治·W·布什政府中任职，最初被任命为德克萨斯州东区的反恐首席，后来被司法任命为美国检察官，从2007年至2008年担任该地区的最高联邦执法官员。 从2008年到2014年，拉特克利夫总监与前美国司法部长约翰·阿什克罗夫特共同创立了Ashcroft Sutton Ratcliffe LLP律师事务所，为国家和国际安全问题提供战略法律建议。目前，拉特克利夫总监在多个董事会和咨询委员会中任职，致力于提高美国的国家安全态势。 SR286 OBrien 罗伯特·C·奥布莱恩 罗伯特·C·奥布莱恩是美国全球战略有限责任公司（American Global Strategies LLC）的联合创始人兼主席，曾任第27任美国国家安全顾问（2019-2021）。奥布莱恩在任期间，作为总统的主要顾问，负责美国的外交政策和国家安全事务，并对国防和工业基地问题进行了重新关注。他是长期的海上力量和355艘舰船海军的倡导者，曾在任期内访问主要造船厂、防务工厂以及世界各地的驻军基地。 在奥布莱恩担任国家安全顾问期间，美国促成了中东的历史性《亚伯拉罕协议》，促进了塞尔维亚和科索沃之间的经济正常化，推动了北约盟国的国防支出增加，并加强了与印太地区盟国的合作。 在担任NSA之前，奥布莱恩是总统人质事务特使，具有大使级别的个人身份，直接参与了超过25名被拘留者和人质的回归工作。奥布莱恩还曾担任美国国务院公共-私人伙伴关系正义改革项目的联合主席。 奥布莱恩还曾在2008年至2011年担任美国文化财产咨询委员会的总统任命成员。2005年，他被乔治·W·布什总统提名并获得美国参议院一致确认，担任第60届联合国大会的美国代表。职业早期，奥布莱恩在联合国安全理事会担任高级法律官员，处理第一次海湾战争后针对伊拉克的索赔。 奥布莱恩是洛杉矶Larson LLP律师事务所的创始合伙人，该事务所是全国知名的诉讼精品律所。他在职业生涯中担任过数十起国际诉讼的律师和仲裁员。 奥布莱恩荣获国家安全勋章、国家情报杰出服务勋章、国防部杰出公共服务勋章、国家防卫勋章、法国荣誉军团勋章（骑士级）、中华民国（台湾）特种大绶卿云勋章以及科索沃总统优异奖章。 2021年，国家海军博物馆授予奥布莱恩“海洋自由奖”。同年，他与前国务卿迈克·蓬佩奥因在《亚伯拉罕协议》及其他任内成就而获得理查德·尼克松基金会的“和平建筑师奖”。2020年，《亚伯拉罕协议》签署后，以色列代表在耶路撒冷约翰·F·肯尼迪纪念森林为奥布莱恩种植了一棵树。2019年，奥布莱恩获得了米瑞亚姆和谢尔顿·阿德尔森奖。加州大学伯克利法学院授予奥布莱恩“斯特凡·A·里森菲尔德纪念奖”，以表彰他在国际法领域的杰出贡献。 2022年7月，奥布莱恩当选理查德·尼克松基金会董事会主席。他还与蓬佩奥共同主持尼克松关于保守现实主义和国家安全的研讨会。 奥布莱恩拥有加州大学伯克利法学院的法学博士学位，以及加州大学洛杉矶分校的政治学学士学位。 SR286 Heitkamp 海蒂·海特坎普 玛丽·凯瑟琳·“海蒂”·海特坎普是非党派中国与COVID-19委员会的成员。她于2023年1月成为芝加哥大学政治研究所的主任。她曾是北达科他州的美国参议员（2013-2019），是北达科他州民主党-非党派联盟党成员，是北达科他州首位女性参议员。海特坎普还担任过第28任北达科他州总检察长（1992-2000）和第20任北达科他州税务专员（1986-1992）。截至2022年，她是最后一位代表北达科他州的民主党国会议员和持有州级职位的民主党人。 离开参议院后，海特坎普成为CNBC的特约撰稿人和哈佛大学肯尼迪学院政治研究所的访问学者。2019年4月，她与同样在2018年连任失败的印第安纳州参议员乔·唐纳利共同发起了“一个国家项目”，旨在帮助民主党重新与农村选民建立联系。海特坎普拥有北达科他大学的学士学位和路易斯·克拉克法学院的法学博士学位。 SR286 Pottinger 马修·波廷杰 马修·波廷杰是非党派中国与COVID-19委员会的成员。他也是胡佛研究所的访问学者和防御民主基金会中国项目的主席。波廷杰曾在特朗普总统执政期间（2019-2021）担任美国副国家安全顾问。在此之前，他担任国家安全委员会亚洲事务高级主任，领导政府在印太地区的工作及其对华政策的转变。 波廷杰是美国海军陆战队的老兵，曾在2007年至2010年期间在伊拉克和阿富汗作战。他曾是路透社和《华尔街日报》驻中国的记者（1998-2005）。 波廷杰毕业于马萨诸塞大学阿默斯特分校。他还是2024年出版的《沸腾的护城河：捍卫台湾的紧急步骤》一书的共同作者和编辑。 SR286 Metzl 杰米·梅茨尔 杰米·梅茨尔是非党派中国与COVID-19委员会的成员。他是一位领先的技术和医疗保健未来学家，“同一世界”全球社会运动的创始人兼主席，大西洋理事会的高级研究员，NextMed Health的教员以及奇点大学的专家。他的公共服务经验涵盖了克林顿政府期间在美国国家安全委员会和国务院任职，曾在参议院外交关系委员会担任当时主席乔·拜登的工作人员，以及在柬埔寨的联合国工作。 梅茨尔被任命为世界卫生组织人类基因组编辑专家咨询委员会成员。他是多部作品的作者，包括《超级融合：基因、生物技术和人工智能革命如何改变我们的生活、工作和世界》和《黑客达尔文：基因工程与人类的未来》。 梅茨尔在多家生物技术和其他公司的咨询委员会任职。他拥有牛津大学的博士学位、哈佛大学的法学学位以及布朗大学的本科文凭。 SR286 Yoo 约翰·余 约翰·余是非党派中国与COVID-19委员会的成员。他是加州大学伯克利分校的伊曼纽尔·海勒法学教授和德克萨斯大学奥斯汀分校公民领导学院的访问教授。他还是美国企业研究所的非驻所高级研究员。约翰·余曾在美国司法部任职，负责911事件后的国家安全和反恐问题，并担任过美国参议院司法委员会的总法律顾问。他曾为最高法院法官克拉伦斯·托马斯和联邦上诉法官劳伦斯·西尔伯曼担任书记官。 他是《最高法院政治不正确指南》（与罗伯特·德拉亨提合著）、《捍卫者：特朗普的总统权力斗争》和《攻击点：预防战争、国际法和全球福利》的作者。他还是多家新闻媒体的常驻撰稿人，发表了100多篇学术期刊文章。 余教授毕业于耶鲁法学院，并以最优等成绩毕业于哈佛学院。 SR286 Redfield 罗伯特·雷德菲尔德 罗伯特·雷德菲尔德博士是一位著名的病毒学家，曾担任美国疾病控制与预防中心主任和有毒物质与疾病登记局局长（2018-2021）。 目前，雷德菲尔德博士是马里兰大学医学院的兼职教授。他在慢性病毒感染和传染病，尤其是艾滋病的临床研究和临床护理方面活跃了30多年。他曾担任美国军方艾滋病研究计划中的逆转录病毒研究部创始主任，并在美国陆军医疗队服役20年后退休。退役后，他与威廉·布拉特纳博士和罗伯特·C·加洛博士共同创立了马里兰大学人类病毒学研究所，并担任马里兰大学医学院的传染病主任和医学副主任。雷德菲尔德博士在艾滋病科学研究方面做出了多项重要早期贡献，包括揭示异性恋传播的重要性，开发了沃尔特·里德艾滋病感染分期系统，并证明艾滋病在所有阶段均有活跃的病毒复制。 除了研究工作外，雷德菲尔德博士还监督了一个广泛的临床项目，为巴尔的摩/华盛顿特区社区的5000多名艾滋病患者提供护理和治疗。雷德菲尔德博士曾于2005年至2009年担任总统艾滋病顾问委员会成员，并于2006年至2009年担任国际分委会主席。他曾是国家卫生研究院艾滋病研究办公室顾问委员会成员、国家卫生研究院福格蒂国际中心顾问委员会成员以及食品药品监督管理局抗感染剂顾问委员会成员。 雷德菲尔德博士于1973年获得乔治城大学文理学院理学学士学位。随后他进入乔治城大学医学院，并于1977年获得医学博士学位。 SR286 Kadlec 罗伯特·卡德莱克 罗伯特·卡德莱克博士是非党派中国与COVID-19委员会的成员。他的职业生涯致力于生物防御和公共卫生，并曾担任参议员理查德·伯尔的疫情准备和生物安全高级政策顾问。卡德莱克博士还曾在国防部和白宫任职，从2017年至2021年在美国卫生与公共服务部担任应急准备助理部长。 卡德莱克博士拥有美国空军学院的学士学位、均一服务大学的医学博士学位和热带医学与卫生学硕士学位、乔治城大学的国家安全研究硕士学位以及内布拉斯加大学医学中心的荣誉科学博士学位。 SR286 Feith 大卫·费思 大卫·费思是非党派中国与COVID-19委员会的成员。他也是新美国安全中心的兼职高级研究员。费思在美国国务院东亚局（2019-2021）工作，包括担任美国东亚和太平洋事务副助理国务卿，监督多边事务办公室和地区及安全政策办公室的工作。费思还曾在2017年至2019年担任国务卿政策规划小组成员，就与中国和印太地区国家的关系提供建议，并因此获得了卓越荣誉奖。 费思此前曾在《华尔街日报》工作，担任香港的社论作家（2013-2017）和纽约的专栏编辑（2010-2013）。他还曾为美国空军提供咨询，并在2011年出版了《教授美国：公民教育的案例》一书。他曾在美国参议院和众议院作证，并在《华盛顿邮报》、《纽约时报》、《外交事务》、《评论》和其他出版物上发表文章。他拥有哥伦比亚大学的历史学学士学位。 致谢 传统基金会的中国与COVID-19问题非党派委员会感谢所有支持我们完成本报告的重要工作的人们。 首先，我们必须感谢传统基金会主席Kevin Roberts博士及基金会领导层，包括执行副总裁Derrick Morgan、首席运营官Eric Korsvall、参谋长Wes Coopersmith、Kathryn和Shelby Cullom Davis国家安全与外交政策研究所副总裁Victoria Coates博士、国内政策副总裁Roger Severino、宪政政府研究所副总裁John Malcolm、政府关系副总裁Eric Teetsel以及战略传播副总裁Mary Vought，正是他们的支持使得这一切成为可能。 我们还要感谢专家和学者们的支持，他们包括：亚洲研究中心主任Jeff Smith、监督项目主任Mike Howell、数据分析中心主任Parker Sheppard、亚洲研究中心高级研究员Erin Walsh、Edwin Meese III法律和司法研究中心副主任Charles Stimson、执行副总裁办公室的杰出研究员Steven Bradbury、监督项目首席法律顾问Kyle Brosnan、J.D. Sam Dewey和Edwin Meese III法律和司法研究中心法律研究员Jack Fitzhenry。 特别感谢高级编辑William T. Poole、政策出版物主任Therese Pennefather、网络开发和印刷制作政策制作经理Jay Simon、数据图形服务政策制作经理John Fleming和市场总监Elizabeth Fender，以及Matthew Tragesser、Jeremy Hayes、Brian Gottstein、Crystal Boham、Ericka Morris、Andrew Harding、Kathy Gudgel、Ilan Hulkower、Elliot Nazar和Molly Black，他们在项目完成过程中提供了巨大的帮助。 最后，我们要感谢提供宝贵建议的外部专家们，包括Alina Chan博士、Gary Osen和Gilles Demaneuf。 John Ratcliffe 主席 中国与COVID-19问题非党派委员会 华盛顿特区 2024年7月 法律附录 引言 首先，任何针对中国或其受控公司实体为COVID-19病毒造成的破坏而追究责任的行动，都必须考虑到外国主权豁免法（FSIA）所带来的障碍。FSIA反映了国会的意愿，即外国国家及其工具和代理人“应免于美国和各州法院的管辖”，除非符合某些例外情况。尽管这些障碍非常严峻，但本备忘录认为，基于中国政府及其工具采取的积极隐瞒COVID-19起源和威胁的事实，这些障碍可以克服。 本备忘录首先分析了根据FSIA对中国及其受控实体提出潜在诉讼的可能原因及相关事实调查领域。尽管有几种设计用于通过FSIA的潜在诉讼原因，但FSIA是追究COVID-19（或任何其他类似未来全球大流行病）责任的一个巨大的障碍。许多取决于原告是否能够确保他们开发和整理了克服FSIA豁免所需的关键相关事实。如果被迫，该问题将提交美国最高法院，法院很可能会最终裁定中国及其工具享有豁免。因此，在提出现行法律下的可能诉讼原因后，本备忘录建议对FSIA进行修订或例外，以便在全球大流行的特殊背景下实现直接追究责任。在这种修订下，可以不受任何限制地提出相同的诉讼原因。 I. FSIA下的可能诉讼原因 A. FSIA的范围 “外国国家”被定义为包括国家本身及其“政治分支”（即主要从事治理职能的机构）。它还包括国家的“机构或工具”，这些是由外国国家直接拥有多数股权或其他所有权利益的独立法人或实体。在公司所有权调查中，最高法院要求国家直接所有；中间所有权不足。见Dole Food. Co. v. Patrickson, 538 U.S. 468, 480 (2003)。 在此，FSIA的广泛豁免有四个例外是相关的。 首先，根据“商业活动例外”，外国国家在以下情况下不享有豁免权： 基于外国国家在美国境内从事的商业活动；或基于外国国家在美国境外从事的商业活动而在美国境内执行的行为；或基于外国国家在美国境外从事的商业活动而在美国境内产生直接效果的行为。28 U.S.C. § 1605(a)(2)。 当外国政府不是以市场监管者的身份，而是以私人市场参与者的身份行事时，活动即为“商业活动”。在某些情况下，效果是直接的，即如果它是被告活动的直接后果。唯一在此理论下存活的COVID-19索赔是根据这一理论提出的。 第二，对于“在美国境内发生的因外国国家或其任何官员或雇员在其职务范围内的侵权行为或疏忽而导致的个人伤害、死亡或财产损失”，不享有豁免权。相关的“整个侵权行为”必须发生在美国境内。但是，这一例外也有一个例外，适用于行为基于“无论是否滥用自由裁量权的行为”或相关索赔来源于“恶意起诉、滥用程序、诽谤、诋毁、失实陈述、欺诈或干扰合同权利”的情况下。在FSIA术语中，“自由裁量行为”是一种故意的政策判断。值得注意的是，有些权威认为“明显违反人道原则的行为”不能成为有效的自由裁量权行使。 第三，对于“在美国境内发生的国际恐怖主义行为”不享有豁免权。FSIA采用刑法对国际恐怖主义的定义。具体来说，18 U.S.C. §2331(1)规定的活动： (A) 涉及暴力行为或危害人类生命的行为，违反了美国或任何州的刑法，或者如果在美国或任何州的管辖范围内实施，将构成刑事犯罪； (B) 旨在—(i) 恐吓或胁迫平民；(ii) 通过恐吓或胁迫影响政府政策；或 (iii) 通过大规模破坏、暗杀或绑架影响政府的行为； (C) 主要发生在美国境外，或者在实施手段、企图恐吓或胁迫的人群或活动地点方面跨越国界。 第四，外国国家（或其组成部分）可以放弃其FSIA豁免。见28 U.S.C. §1605(a)(1)。 即使FSIA的豁免被克服，FSIA对任何诉讼原因还提出了四个额外的复杂问题。 首先，FSIA提供了一个特定的送达程序（个人管辖权所必需的）。见28 U.S.C. §1608。中国政府擅长在这些程序下复杂化送达过程。最终，送达程序不太可能构成难以克服的障碍，但可能需要国务院的合作和法院的动议程序。 即使没有FSIA豁免，它绝对禁止惩罚性赔偿。见id. at §1606。它几乎肯定禁止许多形式的禁令救济，包括预期的救济。 FSIA授予联邦地方法院对任何涉及“外国国家”的诉讼的原始管辖权。见id. at §1600。任何州法院的诉讼可以基于此移送。见id. at §1441(d)。此类诉讼应在没有陪审团的情况下审理。见id. at §§1441(d), 1600(d)。 独立于责任，FSIA对判决的执行提供了许多限制。一般规则是“美国境内的财产”免于“扣押、逮捕和执行”。见id. at §1609; 见id. at §1611（某些资产如中央银行的财产享有绝对豁免）。在此，存在一个例外，即“用于商业活动的财产”。见28 U.S.C. § 1610(a)(2)。另一个更广泛的例外适用于“从事商业活动的外国国家的机构或工具的任何美国财产”，其中“判决涉及的索赔不受第1605(a)(2)或(5)节的豁免...无论该财产是否参与了引起索赔的行为。”见28 U.S.C. § 1610(b)(2)。 本备忘录不涉及可能在外国法院（例如伦敦高等法院）出现的发现或扣押问题。 B. 潜在当事人 中华人民共和国（PRC）。中国是一个亚洲主权国家。尽管其主权地位，外国主权豁免法并未使中国免于因COVID-19病毒传播而引起的索赔和指控。中国的行为和疏忽导致了COVID-19的全球传播，这些行为是侵权、商业性质的，并且不享有自由裁量权豁免，它们在美国境内直接造成了人身伤害、财产损失和死亡。基于此类行为的索赔属于28 U.S.C. § 1605(a)(2)和28 U.S.C. § 1605(a)(5)规定的主权豁免例外。 除了中国，其他被告将根据其是否符合适用的FSIA例外而选择，主要是直接在美国从事商业活动并与可诉行为有关。 中国南方航空公司（China Southern Airlines Company LTD）。中国南方航空公司在美国开展业务，因此受美国管辖。该公司在广州注册和总部，是一个由中国政府持有多数股份的国有企业。中国南方航空公司由国务院国有资产监督管理委员会直接监督。其向美国证券交易委员会提交的文件表明，“中国政府在公司中的利益...可能与股东的利益相冲突。”中国南方航空公司在全球范围内运营，包括洛杉矶、纽约和旧金山等美国城市。通过中国南方航空公司，中国从事拥有和运营面向全球货运和旅行者的民用航空公司这一传统商业活动。作为其在美国运营航班的条件，中国南方航空公司放弃了其主权豁免。见14 C.F.R. § 375.26。 中国东方航空公司（China Eastern Airlines Company LTD）。中国东方航空公司在美国开展业务，因此受美国管辖。该公司在上海注册和总部，是一个由中国政府持有多数股份的国有企业。该航空公司的网站将其列为“中国三大国有骨干航空公司之一”。中国东方航空公司在国际上运营，包括芝加哥、洛杉矶、纽约和旧金山等美国目的地。通过中国东方航空公司，中国从事拥有和运营面向全球货运和旅行者的民用航空公司这一传统商业活动。作为其在美国运营航班的条件，中国东方航空公司放弃了其主权豁免。见14 C.F.R. § 375.26。 C. 具体的可能诉讼原因 第一诉讼原因：根据适用州法律的过失行为 法院：此索赔可在任何具有个人管辖权和审判地的法院提起。联邦地方法院对涉及“外国国家”的任何诉讼具有原始管辖权。见28 U.S.C. § 1603(a)。外国国家可能会利用这一管辖权将任何州法院诉讼移送至联邦法院。见id. at § 1441(d)。 当事人： 原告： 待定。 被告： 中国及其在美国从事商业活动的类似商业实体、中国南方航空公司和中国东方航空公司。 基本相关事实： 武汉病毒研究所（WIV）是一个由中国科学院监督和指导的研究机构，从事的生物研究导致了过去十多年中不为自然界所知的新型SARS样病毒的产生。与COVID-19大流行相关的病毒最相似的病毒是在距离武汉约1000英里的蝙蝠中发现的。实验室已知通过感染动物样本并通过动物、蝙蝠和人类细胞对这些病毒进行了基因重组和再构建。然后这些病毒在嵌合的雪貂和人类基因改造的小鼠上进行了测试，直到它们适应了其宿主种类并变得更具传染性。到2019年，武汉病毒研究所的科学家们发布了一个包含超过22000种野生动物样本信息的数据库，但该数据库于2019年9月关闭，并且即使在大流行开始后也没有与美国研究人员分享。 尽管中国官员在2019年12月初就知道这种新病毒可以通过人传人传播，但他们直到2020年1月20日才公开否认这一关键事实。基因组测序在12月26日至27日完成，并指出该病毒是SARS样病毒。此信息与中国医学科学院的病原生物学研究所共享。然而，中国政府隐瞒了有关疾病的重要信息——例如感染人数和病毒类型——并且只是向世界卫生组织（WHO）报告称有“不明原因的肺炎病例”。在此之前，政府对学术研究人员和科学家发布了禁言令，禁止他们分享关于病毒的信息。地方当局通知医疗机构不得披露“未经授权”的信息。 这项命令远非理论上的。医生李文亮在命令发布的同一天通过在线聊天群组与其他科学家分享了有关疾病的信息。李医生警告称，揭露真相者正在被地方当局沉默和惩罚。李医生和其他七名揭露者后来因谣言传播被逮捕。中国政府继续以鲁莽和混淆的方式行事，即使在此之后。北京在2020年1月3日发布正式命令，要求已对病毒进行测序的实验室销毁病毒样本，并禁止在获得正式批准前发布其研究结果。 同一天，中国官员直接向世界卫生组织报告了来自武汉的“未知原因的病毒性肺炎”病例，但再次强调他们不清楚是什么导致了这种疾病。 在中国南方航空公司发布任何关于COVID-19的警告之前一个多月，中国官员已经了解COVID-19的传播危险。作为中国政府直接运营的商业工具，中国南方航空公司和中国东方航空公司知道或应该知道COVID-19对人类健康构成了独特的严重和传染性风险。然而，在一个多月的时间里，中国南方航空公司保持正常运营，继续在中国和美国之间运送乘客。在2020年1月，至少有39万人，包括许多搭乘中国南方航空公司和中国东方航空公司的乘客，从中国大陆前往美国。 中国南方航空公司和中国东方航空公司知道，飞机上的近距离接触会增加COVID-19传播的风险，乘客不会意识到这些危险，而警告可能会有效地降低风险。然而，中国南方航空公司直到2020年1月31日才公开宣布保护措施，这些措施仅限于“戴口罩”，显然不够充分。中国东方航空公司在1月23日首次限制从武汉起飞的航班，这比中国政府了解到武汉病毒感染风险已经明确的时间晚了将近一个月。这些航空公司被告鲁莽或疏忽地未能在COVID-19初期传播期间采取适当的安全程序，尽管他们极有可能了解潜在的危险。更具体地说，这些航空公司疏忽地未能警告乘客COVID-19的危险。此外，尽管他们知道COVID-19及其人传人传播的高率，但这些航空公司被告在从高感染地区向美国旅行的乘客中没有采取任何限制措施。由于被告不仅隐瞒了有关病毒的信息，还实际将病毒运送到美国，被告的商业行为和疏忽是美国居民随后患病和死亡的直接原因。 法律论点摘要： 被告根据世界卫生组织指南和其他客观标准，具有在即将到来的灾难中合理告知公众和合理保持安全程序的非自由裁量义务。中国通过未能在进行高风险病毒研究时行使应有的谨慎、疏忽地误报自2019年11月以来已知的病毒事实、允许来自已知COVID-19感染地区的个人出国旅行以及通过中国南方航空公司和中国东方航空公司将感染者运送到美国，直接导致了COVID-19在美国的传播。作为被告在美国境内和境外的商业活动的直接和近因，数百万美国人遭受了人身和财产损失。 重要的是要详细说明被告商业行为的主导地位。注意细致地说明无论是通过航班还是其他方式，被告在美国采取了行动。还要注意详细说明这些行为如何“直接导致”所主张的损害。 第二诉讼原因：根据州法律对异常危险活动的严格责任 法院： 此索赔可在任何具有个人管辖权和审判地的法院提起。联邦地方法院对涉及“外国国家”的任何诉讼具有原始管辖权。见28 U.S.C. § 1603(a)。外国国家可能会利用这一管辖权将任何州法院诉讼移送至联邦法院。见id. at § 1441(d)。 当事人： 原告： 待定。 被告： 中国及其他直接相关的被告，如武汉病毒研究所。 基本相关事实： 武汉，中国，是中国病毒学研究的领先中心，拥有多个病毒学和公共卫生研究所，包括武汉病毒研究所（WIV）。武汉病毒研究所拥有全球最大的SARS样冠状病毒收藏，并在安全条件不充分的情况下进行高风险病毒研究。他们的研究包括感染包括人源化小鼠在内的动物。武汉病毒研究所成为2003年SARS爆发后国际冠状病毒研究的焦点。武汉病毒研究所新兴传染病中心的研究人员基因工程重组了SARS样冠状病毒，这些病毒在感染人源化小鼠时有时比自然界收集的病毒更具毒性。研究人员在生物安全等级2（BSL-2）进行此类工作。这对于进行高风险病毒实验来说严重不足。国际科学家一致认为此类研究至少应在BSL-3级别进行，理想情况下在BSL-4级别进行。 此外，SARS-CoV-2病毒包含的独特特征和属性表明其具有研究相关起源。或许所有这些特征中，最引人注目的是裂解酶切割位点。这一位点在这一冠状病毒亚属（称为Sarbecovirus）中从未出现过。研究发现，裂解酶切割位点是SARS-CoV-2致病性的关键。研究表明，裂解酶切割位点对于SARS-CoV-2致病性至关重要。有充分的理由认为，大流行病毒来自武汉的研究，科学家提出将裂解酶切割位点插入新型SARS样冠状病毒中。 在疫情爆发前武汉病毒研究所安全协议不足的长期记录不能被忽视。例如： 美国大使馆官员在2017年和2018年向国务院发送电报，警告武汉病毒研究所的安全问题，但这些警告被忽视了。这些电报预见了实验室对SARS样蝙蝠冠状病毒和人类感染性的研究工作的敏感性。美国政府在武汉访问期间，国家过敏症和传染病研究所（NIAID）的一名官员了解到，武汉病毒研究所没有操作高安全性生物安全等级BSL-4实验室的经验，必须“从零开始学习一切”。中国疾病预防控制中心主任高福博士在2019年3月发表的社论中警告了潜在的自然、意外和故意生物威胁。他特别指出了实验室风险： “未遵守批准的生物隔离和生物安全协议可能导致病原体意外或故意释放到环境中。...[病原体的基因修改，可能扩大宿主范围并增加传播和毒力，可能导致新的流行病风险...例如合成的蝙蝠源SARS样冠状病毒[获得了]感染人类细胞的能力增强。” 2019年7月，武汉病毒研究所领导人警告称他们面临“紧迫问题”。尽管存在生物安全担忧和与研究所相关的安全协议松懈，但危险的病毒研究仍在进行。 美国国务院在2021年1月的事实表中指出，它“有理由相信”2019年秋天有几名科学家“在武汉病毒研究所内部生病”。这些科学家报告的症状与COVID-19或常见季节性疾病一致，尽管武汉病毒研究所领导声称那里的工作人员和学生没有感染。随后美国新闻文章披露了更多关于三名武汉病毒研究所研究人员的信息，他们在武汉公开承认COVID-19爆发前生病。 法律论点摘要： 任何从事异常危险活动的人都应对由此活动导致的伤害负责，即使他采取了最大的预防措施。最近的证据表明，武汉病毒研究所和中国实验室进行的冠状病毒研究和生物安全问题明确表明，中国从事了异常危险的活动。这些活动不是一个主权国家的行为，而是一个市场参与者的行为，提供资金以推动科学实验中的危险商业风险。关键是要证明武汉病毒研究所的相关研究不是典型国家公共卫生机构的行为，而是商业生物研究。大规模感染、不受控制的传播和生命损失的经济损失是中国决定在一个有已知安全问题的实验室进行研究而创造出致命的合成病毒的直接和可预见结果。必须仔细说明支持“直接效果”的事实（28 U.S.C. § 1605(a)(2)）。这可能是一个事实上的巨大障碍。 第三诉讼原因：根据州法律的公共滋扰 法院： 此索赔可在任何具有个人管辖权和审判地的法院提起。联邦地方法院对涉及“外国国家”的任何诉讼具有原始管辖权。见28 U.S.C. § 1603(a)。外国国家可能会利用这一管辖权将任何州法院诉讼移送至联邦法院。见id. at § 1441(d)。 当事人： 原告： 待定。 被告： 中国、中国南方航空公司、中国东方航空公司以及其他在美国直接运营的实体。 基本相关事实： 中国资助并指挥对冠状病毒的高风险病毒研究，包括SARS CoV-2，这些研究导致了COVID-19大流行，并且研究的安全协议已知不充分。当疾病开始感染人群时，中国政府没有限制其传播，而是试图隐瞒其来源和严重性。同时，中国通过中国南方航空公司和中国东方航空公司继续商业航班出国，有效地将病毒输出到包括美国在内的国家。 法律论点摘要： 被告的行为和疏忽造成了“对公共卫生、公共安全、公共安宁、公共舒适或公共便利的重大干扰”。被告集体运营的商业航空公司在明知或鲁莽地将致命的、高度传染性的病毒运送到美国的情况下，造成了数万亿美元的经济损失、无数的感染和非致命伤害，以及超过一百万美国人的死亡。 第四诉讼原因：根据州法律在个人防护设备囤积和销售中的反竞争行为 法院： 此索赔可在任何具有个人管辖权和审判地的法院提起。联邦地方法院对涉及“外国国家”的任何诉讼具有原始管辖权。见28 U.S.C. § 1603(a)。外国国家可能会利用这一管辖权将任何州法院诉讼移送至联邦法院。见id. at § 1441(d)。 当事人： 原告： 待定。 被告： 中国。 基本相关事实： 中国在关于COVID-19的起源和病毒传播性上保持对世界其他国家的无知，尽管中国非常清楚病毒的传播性。武汉中央医院的艾芬医生自2020年1月1日起指示医院工作人员佩戴N95口罩以防止传播风险。从2020年1月23日至1月30日，中国启动了全球面罩供应的大量采购，进口了共5600万个呼吸器和面罩。中国同时禁止个人防护设备出口国外，并努力购买世界其他国家的大部分供应。中国售出的少量个人防护设备是有缺陷的和不合格的，因为中国将优质材料留给自己，而将有缺陷的设备以高价出售给包括美国在内的其他国家。中国还控制了为美国客户如3M生产个人防护设备的工厂。然后中国将这些工厂的生产指向国内用途。 法律论点摘要： 中国有责任不囤积个人防护设备，不向医疗提供者提供无效的个人防护设备。中国在个人防护设备市场中的商业行为对市场中的其他参与者，包括美国的医疗提供者，造成了财务伤害，也对缺乏足够个人防护设备的人的身体造成了伤害。中国依靠反竞争行为，不仅给予了中国在应对COVID-19影响方面的不正当优势，还通过不可预见的需求从美国客户手中榨取了超额利润，而这一需求是中国自己的鲁莽行为造成的。 第五诉讼原因：根据州法律的欺诈性失实陈述 法院： 此索赔可在任何具有个人管辖权和审判地的法院提起。联邦地方法院对涉及“外国国家”的任何诉讼具有原始管辖权。见28 U.S.C. § 1603(a)。外国国家可能会利用这一管辖权将任何州法院诉讼移送至联邦法院。见id. at § 1441(d)。 当事人： 原告： 待定。 被告： 中国南方航空公司、中国东方航空公司。 基本相关事实： 作为中国政府的工具，中国南方航空公司和中国东方航空公司对病毒的危险性有足够的了解，但未发布公开警告，并在美国采取预防措施以阻止传染前数周保持正常业务运营。 法律论点摘要： 公司关于COVID-19的公共评论值得在欺诈性失实陈述的侵权索赔下采取行动。“一个人为引诱他人采取行动或不行动而欺诈性地作出事实、意见、意图或法律的失实陈述，对因他人合理依赖失实陈述而造成的经济损失承担责任。”作为拥有关于COVID-19的真实程度和严重性以及在美国普遍了解病毒的严重性之前的信息的国有中国企业，因为他们的公共声明失实地陈述了病毒的严重性，特别是病毒是新的，情况不稳定，尽管中国在病毒的严重性方面有明确的了解。 第六诉讼原因：根据18 U.S.C. § 1961及以后条款的民事RICO违规行为 法院： 此索赔可在任何具有个人管辖权和审判地的法院提起。联邦地方法院对涉及“外国国家”的任何诉讼具有原始管辖权。见28 U.S.C. § 1603(a)。外国国家可能会利用这一管辖权将任何州法院诉讼移送至联邦法院。见id. at § 1441(d)。 当事人： 原告： 待定。 被告： 中国南方航空公司、中国东方航空公司。 基本相关事实： 从2019年秋季到2020年1月20日，中国政府对国际社会做出了一系列故意失实陈述，包括病毒的起源未知，中国研究人员尚未识别或测序病毒，病毒既不具有人传人也不具有无症状传播的特征。这些航空公司被告重复了这些虚假声明，并欺诈性地隐瞒了乘客和外国监管机构传播COVID-19的危险。 法律论点摘要： 中国政府与航空公司被告一起从事了一系列的欺诈和反竞争行为，进一步了违反18 U.S.C. § 1961及以后条款的犯罪企业。被告的犯罪行为模式持续了数月，使被告能够垄断个人防护设备市场，并从继续进行跨国运输感染者中获利，包括运送到美国的多个地点。被告的欺诈性失实陈述和反竞争行为是原告在个人防护设备市场上经济损失的唯一直接原因（如果适用于原告），也是数百万世界各地包括美国的个人患病和死亡的近因。 要指控RICO企业，原告必须指控所有被告都在追求共同的目的。然而，在将航空公司作为国家工具的指控与指控它们是RICO目的真正独立的犯罪行为者之间存在紧张关系。民事RICO要求指控行为的连续性。在这里，原告可能仅限于指控“已完成”的连续性。在这种情况下，相对较短的时间范围（几个月）和这可能被视为单一计划的可能性对该索赔的可行性提出了挑战。如果原告能合理地指控武汉病毒研究所的活动相当于根据18 U.S.C. § 175开发生物武器，该索赔可能会得到加强。 D. 请求的救济 为了初步救济，原告应寻求玛瑞娃禁令/冻结令以避免资产流失。对于最终裁决，原告应寻求 (i) 返还/返还；(ii) 任何授权的民事罚款；(iii) 实际、直接和/或间接损害赔偿；(iv) 诉讼费用；(v) 判决前利息。对于预期的禁令救济，法院是否可以下达此类救济存在疑问，尽管密苏里州在其针对中国的COVID投诉中寻求“禁令救济”和“消除滋扰”。 II. 修改《外国主权豁免法》。 尽管如前所述，本备忘录认为根据《外国主权豁免法》可以对中国及其机构提出诉讼，但潜在的政府原告（即使是美国）会认为，要提出一个能在《外国主权豁免法》下生效并符合其程序规定的诉讼，实在是太难且不确定。因此，可能有必要出台立法，以在当前全球COVID-19疫情的特殊背景下，取消外国主权的豁免权。对此类做法已有大量先例。《打击恐怖主义资助者法》（2016年法规第130号）正是为了回应《外国主权豁免法》在某些情况下对美国人寻求司法救济的过度限制而通过的。 例如，请参见Juliet Eilperin和Karoun Demirjian的文章《国会推翻奥巴马对允许9/11受害者起诉沙特阿拉伯法案的否决》，发表于《华盛顿邮报》2016年9月28日，网址：https://www.washingtonpost.com/politics/congress-thwarts-obama-on-bill-allowing-911-lawsuits-against-saudi-arabia/2016/09/28/a93e31ba-859b-11e6-ac72-a29979381495_story.html（访问时间：2024年7月7日）。 值得注意的是，该法案是在时任总统巴拉克·奥巴马的否决下通过的。 初步的推动力可能是提出一项直接针对中国及其过去行为的法案，取消其在COVID-19相关事宜上的豁免权。参议员Josh Hawley的《为冠状病毒受害者争取正义法案》就是这样一个例子。 参见S. 3662，《追究中国共产党感染美国人责任法案》，第116届国会，于2020年5月7日提出，网址：https://www.congress.gov/bill/116th-congress/senate-bill/3662/text（访问时间：2024年7月7日）。 自然法和衡平法的诸多方面都支持这种做法。尽管如此，这也引发了长期支撑豁免权的重大问题：即如何在所有国家和所有情况下制定适用的国际习惯法。诚然，通常适用于外国豁免权考量的习惯性克制——即“鹅酱可能变成天鹅酱”——在这里可能没有太多的应用，因为中国被认为是无法无天的。但更广泛的问题在于正义必须显而易见。因此，尽管将中国置于“你应受你自己制定的血腥法律的审判”这一条款下具有吸引力，但最终仍被视为剥夺公权。因此，我们建议采取中间路线——废除《外国主权豁免法》，并在联邦地区法院提供原始和专属管辖权，包括陪审团审判——适用于COVID-19疫情规模的世界性灾难。可能的条款如下： 美国地区法院应对任何涉及对外国国家追讨金钱赔偿的案件拥有原始和专属管辖权，涉及在美国发生的由于外国国家的任何鲁莽行为或疏忽（包括故意忽视及时报告信息的必要性或故意隐瞒相关信息）造成或大大加剧的任何全球性疫情，无论行为或疏忽发生在何处；前提是，导致全球性疫情的生物制剂在美国造成的死亡人数超过100万人。 这种规定可以插入现有的《外国主权豁免法》框架中，也可以作为在这种情况下完全废除《外国主权豁免法》的一部分。如果对现有的《外国主权豁免法》框架进行了修订，则需要进行确认修订，以提供陪审团审判、惩罚性赔偿、资产扣押和简化服务。可以提供诉因，但这在大多数《外国主权豁免法》案件中并不是障碍；一旦豁免被取消，诉因就会大量涌现。应考虑是否允许美国接管任何诉讼。任何此类立法活动都应谨慎调校，以避免任何表明责任不在《外国主权豁免法》下的暗示，以确保任何提议的立法未通过时不会被用来表明《外国主权豁免法》会阻碍诉讼。 对中国在我们时代最具毁灭性的大流行病COVID-19中的角色追责 （中文翻译）.pdf CN_SR286_1AI自动翻译.pdf

The RICO Verdict against Miles Guo (CCP Enemy No.1) & the Chinese Whistleblowers Movement | WHISTLE BLOWERS 7.20.24 @12pm EST

The jury has found Miles Guo guilty. This is a tragic outcome for an INNOCENT man. This NY jury has again shown that you cannot get a fair trial in NY. Remember, that the Prosecution ADMITTED to working with the CCP in preparing for the case. Heroes "Three Musketeers" Imprisoned A. Miles Guo (郭文贵), member of the New Federal State of China, imprisoned on 2023/03/15. B. Peter Navarro (皮特·纳瓦罗), American, imprisoned on 2024/03/20. C. Steve Bannon (史蒂夫·班农), American, imprisoned on 2024/07/01. .responsive-iframe-container { position: relative; padding-bottom: 66.25%; /* 16:9 aspect ratio */ height: 0; overflow: hidden; max-width: 100%; background: #000; border-radius: 10px; } .responsive-iframe-container iframe { position: absolute; top: 0; left: 0; width: 100%; height: 100%; border: 0; } 1/11/2023 Miles Guo: All those cases and illegitimate investigations against Miles Guo and all fellow fighters of the Whistleblowers’ Movement were based on fraudulent information and evidence; Chinese Communist Party has weaponized the U.S. judicial system; if the U.S. does not get to the bottom of these and expose the truth, no one in the U.S. will be safe

China’s $18 Trillion Economic COVID Attack on the American Economy A new nonpartisan report from the Heritage Foundation titled "Holding China Accountable for Its Role in the Most Catastrophic Pandemic of Our Time: COVID-19" reveals the devastating economic impact on the American economy following China's release of the coronavirus to the world. The report details the "Seven Weeks That Changed the World," during which "Chinese officials could have acted in good faith and fulfilled their international commitments to prevent the domestic epidemic from becoming a global pandemic. They consistently chose not to do so." The report also analyzes the impact of COVID-19 on the American economy, resulting in losses exceeding $18 trillion. 中国对美国经济发动 18 万亿美元经济的新冠病毒攻击 美国传统基金会无党派委员会关于中国和新冠病毒的一份新报告“追究中国在我们这个时代最灾难性的大流行：新冠病毒中的作用”，显示了中国向世界释放新冠病毒后对美国经济造成的毁灭性经济影响。 该报告详细介绍了“改变世界的七周”，当时“中国官员本可以表现出诚意并履行其国际承诺，试图防止国内流行病演变为全球流行病。他们一直选择不这样做。” 该报告还分析了新冠病毒对美国经济造成超过 18 万亿美元损失的影响。 Holding China Accountable for Its Role in the Most Catastrophic Pandemic of Our Time: COVID-19 https://www.heritage.org/china/report/holding-china-accountable-its-role-the-most-catastrophic-pandemic-our-time-covid-19

Dear friends, The most important thing is to stay close to Jesus Christ and the Holy Spirit. Jesus Christ has paid a great price for our sins, and He is our Savior and the source of our hope. No matter how busy or challenging your life may be, spending time with the Lord is the most valuable decision you can make in your life. For those who have not yet accepted Jesus Christ as their personal Savior, I sincerely invite you to open your hearts and receive this unconditional love and salvation. Jesus Christ gave His life for you and me on the cross; His love is endless, and His grace is free. As long as you are willing to believe and accept, He will give you a new life and eternal hope. For our brothers and sisters in Christ, we also need to stay vigilant and remember the Lord's teachings. Before ascending to heaven, Jesus Christ commanded us to share His love and hope with others, and His return is the hope and expectation of every believer. We must pursue holiness with a devout and reverent heart, uphold our faith, and be a shining light and salt of the earth, bearing good witness for the Lord. Time is running out. Let us live each day in the love of the Lord and strive to share this love with more people. May we all be found faithful and good servants when the Lord returns. May God bless you, and may the love of Jesus Christ always be with us. Amen. 亲爱的朋友们， 最重要的是与耶稣基督和圣灵保持亲近。耶稣基督已经为我们的罪付出了极大的代价，祂是我们的救主和希望的源泉。无论你现在的生活多么忙碌或充满挑战，花时间与主亲近是你一生中最有价值的决定。 对于那些还没有接受耶稣基督为个人救主的朋友们，我真诚地邀请你们打开心扉，接受这无条件的爱和救赎。耶稣基督在十字架上为你我舍命，祂的爱是无尽的，祂的恩典是免费的。只要你愿意相信并接受，祂就会赐给你新的生命和永恒的盼望。 对于已经信主的弟兄姐妹们，我们同样需要保持警醒，牢记主的教导。耶稣基督在升天前命令我们将祂的爱和希望传递给他人，祂的再来是我们每一个信徒的盼望和期待。我们要以虔诚和敬畏的心继续追求圣洁，坚守信仰，成为光和盐，为主作美好的见证。 时间紧迫，让我们每一天都活在主的爱中，并努力将这份爱分享给更多的人。愿我们都能在主的再来时被祂称为忠心和良善的仆人。 愿神赐福你们，愿耶稣基督的爱常与我们同在。 阿们。

Three months ago, a prophecy came true ｜三个月前的预言成真 Trump will be shot, with an injury to his right ear... It really happened! ｜川普将会受到枪击，右耳伤伤... 他真的发生了！ Additionally: the collapse of the US dollar... issues with cryptocurrencies｜还有：美元崩溃...加密货币等问题 Cancer is about to be cured... (These pieces of information are very familiar, especially regarding artemisinin... stem cell technology, etc.)｜癌症即将会被治愈... (这些信息，真的很熟悉，特别是关于青蒿素...干细胞技术等 ) That's right, all of this is happening... A Cov19 vaccine disaster is breaking out, and there will be a massive number of deaths (in China, over 100 million people might die due to the Cov19 toxic vaccines and other reasons)... The global economic collapse, the truth about the Cov19 vaccine is exposed, people no longer trust the government, and all fiat currencies anchored to government credit lose their value. 没错，这一切都在发生着... Cov19疫苗灾难爆发，将会有大量的人死亡（在中国接下来可能会有超过1亿人将会因Cov19毒疫苗等原因死去）... 世界经济崩溃，Cov19疫苗真相曝光，人们不在相信政府，所有以政府信用为锚定的法定货币不再有价值。 Cov19 vaccine disaster + government currency collapse, the solution: Artemisinin is the antidote to the vaccine + Himalaya.Exchange digital currency and HimalayaPay payment tool ! Cov19疫苗灾难+政府货币崩溃，解决方案：青蒿素是疫苗解药+Himalaya.Exchange数字货币及HimalayaPay支付工具! The world's number one disaster: Cov19 vaccine disaster 世界排名第一的灾难：Cov19疫苗灾难 Artemisinin (artemisinin derivative: "artesunate" has the best detoxification effect) is the antidote to the vaccine! 青蒿素(青蒿素衍生物：“青蒿琥脂” 疫苗解毒效果最佳 )是疫苗解药！ About Cov19 to our English-speaking friends 关于Cov19病毒和Cov19疫苗的风险和解决方案 (Regarding the risks and solutions of the Cov19 virus and Cov19 vaccines) Economic and financial disaster|经济和金融灾难 Himalaya Exchange |喜马拉雅交易所（Himalaya.exchange ） Himalaya Dollar Himalaya Coin Himalaya Pay

Short Link : https://gettr.ink/APp5Ab The invention relates to novel applications of the defined artemisinin ingredients or a composition of the artemisinin ingredients, namely, the novel applications in the skin care field of mammals. According to the novel applications, the bad state of the skin of the mammals is eliminated or alleviated so that the healthy and beauty of the skin are enhanced through the means of regulating the keratinization disorder, inhibiting hyperpigmentation, resisting cicatrization, delaying skin aging, maintaining the skin elasticity, resisting inflammation, stopping bleeding, easing pain, and resisting bacteria and skin parasites. The benefits are proved through the means of obviously preventing or alleviating the keratosis disease symptoms including acne, furfur and the like, preventing or reducing fine lines and wrinkles of the skin, and preventing or alleviating the grey yellow and dim color of the skin. The benefits are realized through the means of applying the artemisinin ingredients, the composition of the artemisinin ingredients, or the skin care compositions (including health products, household chemicals, and health care products or medicines) containing the artemisinin ingredients or the composition of the artemisinin ingredients to the mammals. The applications of the artemisinin ingredients or the composition of the artemisinin ingredients are expanded to the field of skin care, so that great contribution is made to the health undertaking of people. 本发明涉及到所定义的青蒿素类成分或其组合物的新应用，即在哺乳动物皮肤护理领域中的新应用。其通过提供调节异常角化、抑制色素沉着、抗瘢痕形成、延缓皮肤衰老、保持皮肤弹性、抗炎、止血、镇痛、抗菌及皮肤寄生虫等益处，消除或缓解哺乳动物皮肤不良状态以增强皮肤的健康与美丽。所述益处由明显预防或缓解痤疮脱屑等角化疾病症状、预防或减少皮肤细纹皱纹、预防或缓解皮肤灰黄暗淡等来证明。所述的益处通过向哺乳动物施用青蒿素类成分或其组合物或包含青蒿素类成分或其组合物的护肤组合物如健康产品、日化产品、保健品或药品来实现。本发明将青蒿素类成分或其组合物的用途拓展于皮肤护理领域，使其为人民健康事业做出更大的贡献。 Artemisine composition or combinations thereof new opplication in the treatment of skin Technical field The present invention relates to a kind of new opplication of defined artemisine composition or combinations thereof, i.e., in skin of mammal The new opplication of skin nursing field includes：a）Prevention acted on by correcting dyskeratosis, postpone and/or treat mammal acne, The keratosiss caused by dyskeratosis such as dandruff, desquamation prurituss, dry chap, psoriasises, scleroderma, perifollicular keratosises Disease；b）By the lip of the softening of promotion cutinization or submissive mammal, skin, hair, refer to toenail, hoof etc., and promote suckling Animal lip, skin, hair, refer to the renewal of toenail, hoof etc., adjust their oiliness and gloss；c）By anti-pigmentation Promote skin lightening ruddy, prevention, delay and/or treatment mammal skin blackening, sallow dimness, mottle, acne print, Exposure to Sunlight are damaged The appearance of the pigmentation symptom such as wound, inflammation damnification；d）By the effect prevention of anti-cicatrization, postpone and/or treat suckling to move Thing scytitiss stimulate the cicatrix symptoms such as the cicatrix growth, acne print that the cicatrix that injury is caused grows, environmental stimuli injury is caused Occur；e）Skin elasticity effect is kept to strengthen skin elasticity and gloss, prevention, delay and/or treatment suckling by slow down aging Animal skin microgroove, wrinkle, sagging, atrophy, swelling, the appearance of corse sweat pore；f）Posted by antibacterium, antifungal, anti-skin Infested effect keeps the cleaning of mammal skin, and prevention, delay and/or treatment antibacterial, funguses, dermatozoon etc. are caused Mammal skin defective mode；G) by antiinflammatory, analgesia, hemostasis etc. effect elimination or alleviation scytitiss red and swollen heat pain, The defective modes such as bleeding；h）By promoting keratinization, correcting dyskeratosis, anti-pigmentation, suppress cicatrization, delaying skin old Change, keep skin elasticity, antiinflammatory, analgesia, hemostasis, antibacterium, antifungal, anti-dermatozoon etc. a series of to skin of mammal The beneficial effect of skin, eliminates or alleviates mammal skin defective mode so as to provide enhanced skin health and beauty. By by the skin care compositionss of the artemisine composition containing safe and effective amount or combinations thereof such as health-oriented products, day Change product, health product or medicine etc. to be administered on the mammal for needing this kind of effect, these methods achievable and benefit. Background technology As the high speed development people of economy and society are also improved with beautiful requirement therewith to health, especially skin is protected Reason receives more extensive concern, and the feature and safety of skincare product is put forward higher requirement.Perplex people at present The skin problem of people masses is mainly：Acne, desquamation, the dimness blackening of skin sallow, sagging, the microgroove wrinkle that relaxes, residual cicatrix Acne print, red and swollen heat pain etc..Therefore with facial cream, facial film, Cleansing Foam, bath oil, shampoo, skin ointments agent etc. as representative on market Skin nursing products, with the addition of mostly to solve the active component of various skin problems.But these compositions are people mostly Work synthesis source, advocates natural today nature is pursued, and the activity of the natural origin of the various skin problems of energy effectively solving becomes Point, with extremely public expectation the features such as little of its green, environmental protection, safe, toxic and side effects and its consumption demand also exists Constantly increase. Arteannuin is the present that Chinese Traditional Medicine gives the people of the world, safeguards people from world to preventing and treating the infectious diseases such as malaria People's health is significant.Slaughtering cry of a deer researcher within 2015 and Nobel prize's soul is obtained because of arteannuin, shows Accreditation of the whole world to artemisine composition, is that China's traditional medicine culture goes to the world, recognizes process by the people of the world In a monument.Artemisine composition has become the study hotspot of countries in the world at present, to its antitumor, parasiticide, controls Treat the effect such as systemic lupus erythematosus (sle) to conduct in-depth research.But above research all launches around drug research, For the elite that response country is deeply excavated in pools of traditional Chinese medicine, the unique advantage of Chinese medicine, propulsion Chinese medicine modern times are given full play to Change, the call for promoting Chinese medicine to go to the world, applicant is carried out widely to artemisine composition in line with rigorous realistic attitude Pharmacodynamics screening is studied, to making artemisine composition preferably be serviced by society. Applicant carries out extensive Pharmacodynamics screening with artemisine composition or combinations thereof, and has surprisingly found that arteannuin Constituents or combinations thereof have promotion keratinization on mammal skin, correct dyskeratosis, suppression pigmentation, suppression scar Trace generation, delay skin aging, holding skin elasticity, elimination red and swollen heat pain, killing skin vermiform mite etc. have notable benefit Skin care active.Therefore applicants have discovered that the artemisine composition of safe and effective amount or combinations thereof and containing safe and effective amount Artemisine composition or combinations thereof skin care compositionss dermatosis or skin defective mode can be provided preventative or Therapeutic treatment.For example, applicant has found that artemisine composition or combinations thereof have prevention, postpone and/or the treatment food in one's mouth The hyperkeratotic conditions caused by dyskeratosis such as newborn animal acne, dandruff, psoriasises, scleroderma, perifollicular keratosises；Soften or The lip of submissive mammal, skin, hair, refer to toenail, hoof etc., and promote mammal lip, skin, hair, refer to toenail, hoof etc. Renewal, adjust their oiliness and gloss；Prevention, postpone and/or treatment mammal skin blackening, sallow dimness, mottle, The appearance of the pigmentation symptom such as acne print, sun exposure damage, inflammation damnification；Prevention, delay and/or treatment mammal skin scar Trace, the appearance of the cicatrix symptom such as acne print；Prevent, postpone and/or treat mammal skin microgroove, wrinkle, sagging, atrophy, swell The appearance of swollen, corse sweat pore；Keep the cleaning of mammal skin, prevention, delay and/or treatment antibacterial, funguses, skin parasitism Mammal skin defective mode caused by worm etc.；By promoting keratinization, correcting dyskeratosis, anti-pigmentation, suppression scar Trace formation, delay skin aging, holding skin elasticity, antiinflammatory, analgesia, hemostasis, antibacterium, antifungal, anti-dermatozoon etc. A series of effects beneficial to mammal skin, eliminate or alleviate mammal skin defective mode so as to provide enhanced skin Skin health and beauty.The above innovation for finding to advance health-oriented products, daily chemical products, health product or medicine, and will be right Public physical and mental healths and daily life produce far-reaching influence. Content of the invention The first aspect of the invention is to provide a kind of new opplication of defined artemisine composition or combinations thereof, I.e. in the new opplication of skin care applications；The second aspect of the invention be to provide a kind of skin care compositionss its include safety and have The artemisine composition of effect amount or combinations thereof and Dermatology and other active additives pharmaceutically acceptable and substrate；The present invention The 3rd aspect be to provide a kind of eliminate or alleviate mammal skin defective mode with provide enhanced skin health with Beautiful method, methods described includes to apply defined artemisine composition or combinations thereof or the present invention to mammal Skin care compositionss. Artemisine composition as herein described or combinations thereof refer to arteannuin and its derivant and correlative and they Salt is included but is not limited to, arteannuin, dihydroarteannuin, artesunate, sodium artesunate, Artemether, arteether, arteannuin C13 Derivant, arteannuin C12Derivant, arteannuin C4Derivant, deoxidation bridge arteannuin structure related compound, demethylation arteannuin Structure related compound, de- ketonic oxygen arteannuin structure related compound, steroid arteannuin structure related compound, lactams green grass or young crops Artemisin structure related compound, open loop arteannuin structure related compound, 4,5- epoxy carbon for arteannuin structure related compound, Arteannuin structure simplifies thing, other arteannuin structure related compounds and their salt；Or the group containing artemisine composition Compound or extract are included but is not limited to, Chinese medicine Herba Artemisiae Annuae（ARTEMISIAE ANNUAE HERBA）And its product, plant Artemisia annua （Artemisia annuaL.）And its product, other Compositae artemisias (Artemisia Linn. Sensu stricto, excl. Sect. Seriphidium Bess.) plant and its product, Herba Artemisiae Annuae tissue culture medium, artemisinin mother liquid etc.；Or be selected from The arbitrary composition of mentioned component.The source of artemisine composition or combinations thereof can be synthesis or include naturally but do not limit In natural product extraction, chemical complete synthesis, molecular design, biosynthesiss, histiocyte culture, fungal transformation, metabolic pathway Etc. approach. Skin as herein described refers to that the skin of mammal and its accessory organ include but is not limited to, skin, sweat gland, skin Adipose gland, fingernail, toenail, hair, lip, epidermis, corium etc.. Skin care compositionss as herein described refer to the artemisine composition comprising safe and effective amount or combinations thereof and skin Learn constituted with other active additives pharmaceutically acceptable and substrate various health-oriented products, cosmetics of everyday use, medicine, health product Etc. including but is not limited to, Emulsion class cosmetics, watery class cosmetics, powder class cosmetics, cream kind cosmetics, aerosol class are made up Product, hair based article, beauty class cosmetics, soaps, facial film, curative effect class cosmetics, sun-proof class cosmetics, tablet, powder, ball Agent, ointment, membranous patch, gel, capsule, granule, effervescent, fumigant, slow releasing agent etc. and other skin nursings are used Product. Safe and effective amount as herein described refers to that the person skilled of this area is rationally judged using artemisine composition Or combinations thereof be enough to produce significant beneficial effect, and the amount be enough to avoid serious untoward reaction again, that is, provide rational Effective hazard ratio, its content is preferably from about 0.0001%～90%, even more preferably about 0.01%～35%, and most preferably about 1%～22% wherein The percentage ratio is counted with composition quality as 100%. Skin defective mode as herein described is referred to due to the skin life caused by the intrinsic factor of body or extrinsic factor The state that reason health is weakened with aesthetic appearance is included but is not limited to, and abnormal cutaneous keratinization, desquamation prurituss, skin sallow are dark Light, skin darkening, skin aging are lax, skin lines wrinkle, skin turgor are thickened, atrophoderma is sagging, corse sweat pore, skin Inflammation is red and swollen, skin greasing is coarse, dry skin chap, dermatorrhagia pain, skin are caused by inflammation or environmental stimuli injury Pigmentation, skin by inflammation or environmental stimuli injury cause cicatrix growth etc..The acne of such as mammal, dandruff, The hyperkeratotic conditions caused by dyskeratosis such as psoriasises, scleroderma, perifollicular keratosises；Mammal lip, skin, hair, Refer to dry and chap of the skin or the excess oiliness of toenail, hoof etc.；Mammal skin blackening, sallow dimness, mottle, acne print, sun exposure damage, The appearance of the pigmentation symptom such as inflammation damnification；Mammal skin cicatrix, the appearance of the cicatrix symptom such as acne print；Skin of mammal Skin microgroove, wrinkle, sagging, atrophy, the appearance of corse sweat pore；Mammal skin is drawn by antibacterial, funguses, dermatozoon etc. Defective mode for rising etc.. Enhanced skin health as herein described is referred to as skin defective mode is mitigated or eliminated with beauty and makes skin Physiological health and aesthetic appearance recover or further enhance including but not limited to, a）By correcting dyskeratosis effect prevention, postponing and/or treat mammal acne, dandruff, desquamation prurituss, dry chap Split, the hyperkeratotic conditions caused by dyskeratosis such as psoriasises, scleroderma, perifollicular keratosises； b）By the lip of the softening of promotion cutinization or submissive mammal, skin, hair, refer to toenail, hoof etc., and promote suckling Animal lip, skin, hair, refer to the renewal of toenail, hoof etc., adjust their oiliness and gloss； c）Promote skin lightening ruddy by anti-pigmentation, prevention, delay and/or treatment mammal skin blackening, The appearance of the pigmentation symptoms such as sallow dimness, mottle, acne print, sun exposure damage, inflammation damnification； d）By the effect prevention of anti-cicatrization, postpone and/or treat the cicatrix that the injury of mammal skin inflammatory stimulus is caused Cicatrix growth that growth, environmental stimuli injury are caused, the appearance of the cicatrix symptom such as acne print； e）Skin elasticity effect is kept to strengthen skin elasticity and gloss by slow down aging, prevention, delay and/or treatment suckling are moved Thing skin lines, wrinkle, sagging, atrophy, swelling, the appearance of corse sweat pore； f）By antibacterium, antifungal, anti-dermatozoon effect keep mammal skin cleaning, prevention, postpone and/or Mammal skin defective mode caused by treatment antibacterial, funguses, dermatozoon etc.； G) eliminated by the effect such as antiinflammatory, analgesia, hemostasis or alleviate the defective modes such as scytitiss red and swollen heat pain, bleeding； h）By promoting keratinization, correcting dyskeratosis, anti-pigmentation, suppression cicatrization, delay skin aging, keep skin A series of works beneficial to mammal skin such as elasticity, antiinflammatory, analgesia, hemostasis, antibacterium, antifungal, anti-dermatozoon With, eliminate or alleviate mammal skin defective mode so as to provide enhanced skin health and beauty. Administration as herein described refers to include but is not limited to by various route of administration, partial smearing, Local out dressing, mouth The mode such as taking, fumigate makes artemisine composition as herein described or combinations thereof or skin care compositionss as herein described act on skin Skin. Other active additives as herein described and substrate refer to known in the field in current skin protection cosmetics of everyday use, medicine Applied in product, health product, healthy product or possible application the wide scope in addition to artemisine composition and combinations thereof Other optional active additives and substrate are included but is not limited to, oily raw material, silty raw material, colloid raw material, solvent materials, water Soluble polymer, preservative, thickening agent, acid-base class regulator, antioxidant, wetting agent, astringent, sunscreen, antibacterial, tune Reason agent, cracking-off agent, opacifier, prurituss, frosting agent, surfactant, skin transferral agent, skin feeling agent, Skin Soothing Agent, Skin healing agent, nourishing additive agent, trace element and hormoness additive, biological active substanceies additive, synthesis class nutrition add Plus agent, bioactive peptide, natural extract, additive biology, quintessence oil, essence, spice, pigment, coloring agent, adhesive, disintegrating agent, Filler, lubricant, wetting agent, osmotic pressure regulator, stabilizer, fluidizer, correctivess, suspending agent, coating material, figuration Agent, absorbent, diluent, flocculant and deflocculant, filter aid, release blocker, microcapsule, microsphere, liposome etc. and he Combination. Dermatology as herein described refers to the compositionss and its contains component be applied to and suckling with pharmaceutically acceptable Animal skin contacts, without excessive toxicity, incompatibility, unstability, atopic reaction etc.；Or be applied in process Various route of administration are contacted with mammalian organism, anti-without excessive toxicity, incompatibility, unstability, allergia Should wait. The acceptable substrate of pharmacology as herein described refers to that described substrate will not produce impact to pharmacological experiment, can With appropriate dispersion artemisine composition or combinations thereof, and as the negative control group in experiment. By following non-limiting examples, specific embodiments of the present invention will be further described now and carry out Illustrate, example is served only for explaining the present invention, is not intended to limit the scope of the present invention.Content described herein is only this Basic explanation under spirit and range of condition, its object is to make those skilled in the art it will be appreciated that the present invention Content is simultaneously implemented according to this, it is impossible to only limit the scope of the claims of the present invention with following examples, to according to technical solution of the present invention Those of ordinary skill for, according to disclosed spirit, any equivalent transformation or modification are carried out to the present invention, Protection scope of the present invention all should be belonged to. Embodiment 1：The preparation of arteannuin protective skin cream. Following component can be made into arteannuin protective skin cream by the existing production technology of protective skin cream. Component Mass fraction % Component Mass fraction % Dihydroarteannuin 2.00 Vaseline 6.00 Lanoline 4.00 American Avocado Tree oil 4.00 Hexadecanol 2.00 Essence In right amount Hexadecanol polyoxyethylene ether 1.50 Deionized water Add to 100.00 Embodiment 2：The preparation of arteannuin shampoo. Following component can be made into arteannuin shampoo by the existing production technology of shampoo. Component Mass fraction % Component Mass fraction % Arteannuin 3.00 Stearic acid 5.00 Sodium lauryl sulphate 20.00 Sodium hydroxide 0.75 Oleum Cocois single ethanol amide 1.00 Essence In right amount Propylene glycol monostearate 2.00 Deionized water Add to 100.00 Embodiment 3:The preparation of Herba Artemisiae Annuae facial film. Following component can be made into Herba Artemisiae Annuae facial film by the existing production technology of facial film. Component Mass fraction % Component Mass fraction % Herba Artemisiae Annuae extract 10.00 Glycerol 5.00 Polyvinylpyrrolidone 2.00 Ethanol 10.00 Carboxymethyl cellulose 3.00 Essence In right amount Polyethylene Glycol 15.00 Deionized water Add to 100.00 Experimental example 1：Artemisine composition of the present invention or the antiinflammatory action of combinations thereof Artemisine composition or combinations thereof are with the acceptable substrate dispersion of pharmacology.Kunming mouse 24 is taken, is randomly divided into 2 Group, i.e. matrix control group and 2% artemisine composition or combinations thereof group, each 12 per organizing.Dimethylbenzene 0.05mL is applied to mice Auris dextra, administer locally to respectively at 15min, 30min, 45min after stimulation the substrate of each group equivalent and 2% artemisine composition or its Compositionss, the disconnected neck of 60min puts to death animal, cuts left and right auricular concha, is taken at the same position of two ears with the card punch of diameter 8mm respectively Lower auricle weighs quality, is compared with the calculating each group auricular concha swelling degree of poor quality of two auricles. 1. artemisine composition of table or the acutely inflamed impact of combinations thereof xylol induced mice auricular concha (mean ± SD) Group Number of elements Swelling Matrix control group 12 55.8±3.27 2% artemisine composition or combinations thereof group 12 22.5±2.96 P<0.01, compare with matrix control group There is antiinflammatory action by the visible artemisine composition of table 1 or combinations thereof, there were significant differences with matrix control group. Experimental example 2：Artemisine composition of the present invention or the analgesic activity of combinations thereof Artemisine composition or combinations thereof are with the acceptable substrate dispersion of pharmacology.Kunming mouse 30 is taken, is randomly divided into 2 Group, i.e. matrix control group and 2% artemisine composition or combinations thereof group, each 15 per organizing.Administer locally to the substrate of each group equivalent Cover with preservative film after 2% artemisine composition or combinations thereof administration, untie after immobilization with adhesive tape 30min, cleaned with normal saline Medicine, then dry, newly to prepare immediately 2.5% formalin, 30 μ L is wiped to the right metapedes back of the body subcutaneous injection of mice with dry absorbent cotton.Injection first After aldehyde, immediate record is licked per only mice first and licks the number of times for stinging right metapedes in the incubation period and 10min for stinging right metapedes. 2. artemisine composition of table or combinations thereof PARA FORMALDEHYDE PRILLS(91,95) cause the impact (mean ± SD) of mice pain Group Number of elements Incubation period/s Sufficient number of times is licked in 10min Matrix control group 15 7.9±1.55 25.4±5.2 2% artemisine composition or combinations thereof group 15 13.2±3.25 14.9±5.4 P<0.01, compare with matrix control group There is analgesic activity by the visible artemisine composition of table 2 or combinations thereof, there were significant differences with matrix control group. Experimental example 3：Artemisine composition of the present invention or the anastalsis of combinations thereof Artemisine composition is with the acceptable solvent dispersion of pharmacology.Kunming mouse 24 is taken, is randomly divided into 2 groups, i.e. substrate Matched group and 2% artemisine composition or combinations thereof group, each 12 per organizing.Mice is fixed in Mus cylinder, tail point portion 2cm soaks Steep in 2% artemisine composition or combinations thereof solution or solvent, administration time 30min, after the 2h of interval, repeat administration 1 time. After last dose 30min, cut with profit and cut off at tail point 1.5cm in mice, when starting meter record bleeding when blood flows out naturally Between, drop of blood was drawn every 5 seconds with the cotton balls that oneself weighs in advance, until bleeding stops (depletion of blood when cotton balls is inhaled) naturally.Count as the following formula Calculate each group animal bleeds amount:Amount of bleeding=band blood cotton balls weight one initial cotton balls weight (mg). The anastalsis (mean ± SD) that 3. artemisine composition of table or combinations thereof dock to mice Group Number of elements Bleeding time/s Amount of bleeding/mg Matrix control group 12 124.7±11.68 45.3±12.1 2% artemisine composition or combinations thereof group 12 113.1±12.77 25.3±8.7 P<0.05, compare with matrix control group There is anastalsis by the visible artemisine composition of table 3 or combinations thereof, there were significant differences with matrix control group. Experimental example 4：Artemisine composition of the present invention or the antibacterial actions of combinations thereof Antibacterial group has or not colony growth through cultivating observation after 48h, with the medicine least concentration of the aseptic elder that is born as medicine most Low Mlc (MIC). 4. artemisine composition of table or combinations thereof are to common causative antibacterial minimum inhibitory concentration Strain name MIC/g% Staphylococcus aureuses 1.1 Propionibacterium acness 0.9 Bacillus pyocyaneus 1.1 Lactobacilluss 1.0 By the visible artemisine composition of table 4 or combinations thereof to common causative antibacterial, especially cause the golden yellow of dermatosis Staphylococcuses, propionibacterium acness, bacillus pyocyaneus have certain inhibitory action. Experimental example 5：Artemisine composition of the present invention or the antifungic action of combinations thereof Funguses group does not increase through cultivating the bacterium scope for observing dibbling after 72h, and tapers into drying, is bacterial strain by Drug inhibition Least concentration (MIC). 5. artemisine composition of table or combinations thereof are to common skin funguses minimum inhibitory concentration Strain name MIC/g% Pityrosporum furfur 0.9 Candida albicans 0.9 Epidermophyton 1.1 There is certain inhibitory action by the visible artemisine composition of table 5 or combinations thereof to common dermatophytess. Experimental example 6：The anti-vermiform mite effect of artemisine composition of the present invention or combinations thereof Artemisine composition or combinations thereof are with the acceptable substrate dispersion of pharmacology.Paste overnight method using adhesive tape to obtain Human Demodex, is randomly divided into substrate group and 2% artemisine composition or combinations thereof group, per group 12.Inhaled with micropipettor The substrate of equivalent and 2% artemisine composition or each 200 μ L medicinal liquid Deca of combinations thereof are taken on wave carrier piece, with push jack by medicinal liquid Uniformly spread out, demodectic adhesive tape will be detected and be affixed on microscope slide, it is ensured that medicinal liquid is fully contacted with polypide.Then microscope slide is put In growth cabinet (30 DEG C of temperature, humidity 75%), basis of microscopic observation vermiform mite death condition after 12h.Dead criterion: Continuous Observation 1min under 400 power microscopes, demodicid mite body huge legendary turtle limb or the motionless person of sufficient pawl are tentatively judged as death, continue after 30min to see Examine still motionless person and be defined as death. 6. artemisine composition of table or combinations thereof are to demodectic killing action Group Number of elements Dead number of elements Mortality rate Matrix control group 12 0 0% 2% artemisine composition or combinations thereof group 12 10 83% There is significant killing action to vermiform mite by the visible artemisine composition of table 6 or combinations thereof. Experimental example 7：Artemisine composition of the present invention or the keratinization adjustment effect of combinations thereof Artemisine composition or combinations thereof are with the acceptable substrate dispersion of pharmacology.Take Kunming mouse 30, male and female half and half, It is randomly divided into substrate group and 2% artemisine composition or combinations thereof group.2 groups of mices distinguish the substrate of partial smearing equivalent daily Cover with preservative film after 2% artemisine composition or combinations thereof administration, untie after immobilization with adhesive tape 30min, cleaned with normal saline Medicine, then wiped with dry absorbent cotton dry, continuous 21 days, two times a day.Animal was put to death in the 22nd day, at root of the tail 2cm, taking rat-tail table Skin, fixes paraffin embedding with 10% formalin, and HE is dyeed, in the tail scale of light each mice of Microscopic observation.All scale epidermises There is continuously rows of granular cell person, be referred to as the scale for having granular layer to be formed, granular cell is flat or rhombus cell in epidermis Constituted, full of the cutin granule that thick deep basophilia, HE dyeing are transparent in avy blue in endochylema.Count rat-tail epidermis 100 Granular layer is had to form number in scale. The impact (mean ± SD) that 7. artemisine composition of table or combinations thereof are formed to mice rat-tail granular cell Group Number of elements Rat-tail per 100 scales in granular layer form number Matrix control group 15 7.3±1.1 2% artemisine composition or combinations thereof group 15 13.8±1.7 P<0.05, compare with matrix control group Played the role of to promote keratinization, corrected dyskeratosis, with matrix control group by the visible artemisine composition of table 7 or combinations thereof There were significant differences. Experimental example 8：The delay skin aging effect of artemisine composition of the present invention or combinations thereof Artemisine composition or combinations thereof are with the acceptable substrate dispersion of pharmacology.With people's normal skin fibroblast （NHDF）Secondary Culture obtains the preferable culture fluid of cell concentration for testing.The cell of culture is inoculated into Tissue Culture Dish In, cultivate 24h, whne cell growth to occupy culture dish area 80% when, suck culture medium, PBS one time, be subsequently adding 300（μL）PBS, is sealed with hyaline membrane, thinks 144mJ/cm2Exposure dose UVB irradiating cell 40s is clear with PBS immediately after irradiation Wash one time, be inoculated in the culture fluid of 2% artemisine composition or combinations thereof and blank culture fluid respectively, cultivate at 37 DEG C 72h.Wherein 1ml culture fluid is taken, for suppressing collagen protein catabolic enzyme（MMP-L1）The measure of generation, 1mL is used for cell survival The measure of power.The experiment is repeated 3 times.The collagen protein catabolic enzyme growing amount in culture fluid is determined using immune ELISA kit. 8. artemisine composition of table or inhibitory action of the combinations thereof to collagen protein catabolic enzyme Group MMP-L1 pheron quality mean concentration MMP-L1 enzyme generates suppression ratio Blank control group 0.17 - 2% artemisine composition or combinations thereof group 0.07 - MMP-L1 enzyme generates suppression ratio - 58.8% Obvious suppression Skin Cell collagen protein is had to decompose zymogenesis by the visible artemisine composition of table 8 or combinations thereof, With skin anti-aging and the function of strengthening skin elasticity. Experimental example 9：Artemisine composition of the present invention or the anti-pigmentation of combinations thereof Artemisine composition or combinations thereof are with the acceptable substrate dispersion of pharmacology.Cavia porcelluss 6 are taken, is gone per only back part of animal Hair, takes 2 from region, and UVB is irradiated and irradiated from UVB light source, and irradiation total amount is 2500mJ/cm2, irradiate 2 area equation Region start coating after one week, the substrate of partial smearing equivalent and 2% artemisine composition or combinations thereof respectively, continuous 21 My god, two times a day.With Multi-functional skin survey during respectively in UVB pre-irradiation, after irradiating 1 week, 2 weeks, 3 weeks and 4 weeks after 1 week and medication The color change in each region of examination instrument measurement guinea pig back skin, carries out objective comparison.Biopsy divide as Microscopic observation after 4 weeks Analysis.Dyeed with Schmorl method, high power lenses count per square millimeter of epidermis cell number containing melanin granule of per part of sample.With Imokawa Method is dyeed, and high power lenses count per square millimeter of stratum basale number containing dopa-positive melanocytes of per part of sample. 9. artemisine composition of table or combinations thereof irradiate the impact (mean) of the measure of guinea pig skin color value to UVB Group Pre-irradiation After irradiation Medication 1 week Medication 2 weeks Medication 3 weeks Medication 4 weeks Matrix control group 30 59 59 58 60 58 2% artemisine composition or combinations thereof group 31 58 56 51 47 41 P<0.05, medication is compared for 4 weeks with matrix control group 10. artemisine composition of table or combinations thereof have the pigmented inhibitory action of Cavia porcelluss (mean ± SD) to UVB Group The melanocyte of the DOPA positive（Individual/mm2） Cell containing melanin granule（Individual/mm2） Matrix control group 773.18±68.52 2801.13±180.72 2% artemisine composition or combinations thereof group 566.97±82.67 2136.14±192.35 P<0.05, compare with matrix control group By table 9,10 visible artemisine compositions or combinations thereof have resisting mammal pigmentation. Experimental example 10：The anti-cicatrix of skin formation effect of artemisine composition of the present invention or combinations thereof Artemisine composition or combinations thereof are with the acceptable substrate dispersion of pharmacology.12 Japan large ear rabbits are anaesthetized, In bilateral rabbit ear veutro, lateral margin upper and lower parts do the square cutout of 2 diameter about 1cm, slit space 2.0cm, removal respectively Rabbit ear skin and subcutaneous tissue and perichondrium, cartilage-preserving, gauze pressing stops blooding.Substrate group will be randomly divided into per only ear wound surface With 2% artemisine composition or combinations thereof group, the gauze piece external application 5 of substrate or 2% artemisine composition or combinations thereof is soaked with Minute simultaneously retains, rear gauze wrapping, adopts same method dressing within 3,6,9,12,15,18,21 days after surgery.Wound surface is after surgery 12 days visible wound granulation tissue growths, the whole scar healings of 28 days visible wound surface, healing starts to occur being higher by surface for latter 18 days Hypertrophic cicatrix.Put to death animal within postoperative 50 days, specimen is cut, 10% formalin is fixed, cut into slices after paraffin embedding, HE is dyeed. 3 high power fields (× 200 times) being randomly selected in HE dyeing per a section, counts the fibroblast number in the constituent parts visual field, take Meansigma methodss.Calculate scar hyperplasia index（Hypertrophic Index, HI）：HE staining tissue slides use micrometer under low power lens Chi is measured, and calculates scar hyperplasia index by formula HI=A/B.The vertical height of A=cicatrix projection peak to credulous bone surface；B= The vertical height of cicatrix periphery normal skin skin edge to credulous bone surface. When 50 days, the visible substrate group wound healing district's groups of perusal are knitted apparently higher than surrounding normal skin, show as cicatrix Central authorities are in papillae, and in pale red, matter is tough, and hypertrophy block is higher by surface.2% artemisine composition or the healing of combinations thereof group Area is slightly above normal skin, and color and luster is thin.HE staining tissue slides observe visible substrate group cicatrix blood capillary proliferation substantially, become Fiber finer karyon is big, intensive hypertrophy, be located at corium holostrome, collagen arrangement disorder.2% artemisine composition or combinations thereof group scar Trace tissue is relatively thin, and surfacing, level are in order, fibroblast significantly reduces. Anti- cicatrix of skin formation effect (mean ± SD) of 11. artemisine composition of table or combinations thereof Group Scar hyperplasia index Fibroblast number Matrix control group 3.18±0.86 86.01±2.87 2% artemisine composition or combinations thereof group 1.79±0.77 39.78±2.63 P<0.05, compare with matrix control group Resisting mammal cicatrix of skin is had to form effect by the visible artemisine composition of table 11 or combinations thereof. Experimental example 11：Artemisine composition of the present invention or therapeutical effect of the combinations thereof to rabbit Acne Model Artemisine composition or combinations thereof are with the acceptable substrate dispersion of pharmacology.Male New Zealand rabbits 22 are taken, random point For substrate group and 2% artemisine composition or combinations thereof group.To preserved skin 2cm at 2 groups of new zealand rabbit ears medial surface syrinx openings × 2cm scope, smears coal tar 1 time daily, each 0.5mL, continuous 2 weeks.After 2 weeks, take skin at 2 new zealand rabbit modelings and live Inspection, pathology section examination, determine that model is formed.The left ear of 2 groups of animals distinguishes substrate and 2% arteannuin of partial smearing equivalent daily Constituents or combinations thereof, continuous 14 days, two times a day.Perusal in 15th day is simultaneously lived in animal ears corresponding site bark fetching skin Inspection, piece of tissue with 10% formalin fix, 10% nitric acid decalcification, paraffin embedding, section, HE is dyeed, tissues observed under the light microscopic Learn and change. Histology's criterion of experimental acne：(-) no acne, infundibulum only has loose keratinocyte；(+) hair follicle The a small amount of keratinocyte being sticked together of infundibulum accumulation, funnel is not expanded；In (++) hair follicle, the cutin thromboembolism of moderate, stretches Enter sebaceous gland duct, with the hypertrophy of sebaceous gland duct, funnel is expanded；In (+++) hair follicle, close cutin thromboembolism causes hair follicle Severe is expanded, the obvious hypertrophy of sebaceous gland duct epithelium, and part sebaceous gland occurs dissolving time. Perusal：Rabbit ear coating is after 2 weeks, it is seen that at Oleic acid, local organization is substantially coarse, thicken, hardening, and follicular orifice has Black keratotic plug, in blackhead shape, when opening coal tar crust, it is seen that attachment hair follicle keratotic plug thereon, its lower visible open increase Follicular orifice, follicular orifice swell in papulosquamous.After 2% artemisine composition or combinations thereof group medication 14 days, whole flap thickness Thinning, pliability increases, and local follicular orifice keratotic plug and acne are reduced, and pimple flattens minimizing, has part keratotic plug to leave a little after coming off The follicular orifice of shape depression.After substrate group medication 14 days, ear's still visible obvious hair follicle keratotic plug, follicular orifice bump pad is slightly put down. Om observation：After modeling 2 weeks, it is seen that hyperkeratosiss, the hypergranulosis of epidermis and follicular epithelium, acanthosiss, The hair follicle of adjacent expansion mutually merges, and follicular orifice and infundibulum are full of keratinization material, and extend to sebaceous gland, and follicular orifice keratotic plug is blocked up Plug, infundibulum of hair follicle portion full of keratinization material and expands in gyalectiform, and dermis telangiectasis are obvious, and perifollicolar diffuses scattered In inflammatory cell infiltration, based on small round cell, and a small amount of neutrophilic granulocyte.2% artemisine composition or combinations thereof group are used After medicine 14 days, epidermis is slightly thickened, and follicular orifice is slightly expanded, and is had loose keratinization material filling on a small quantity, is had no that infundibulum of hair follicle portion expands Big such as gyalectiform, less dermal inflammation cellular infiltration.After substrate group medication 14 days, it is seen that hyperkeratosiss, epidermis and follicular epithelium Granular layer, spinous layer still hypertrophy substantially, follicular orifice and infundibulum still see keratinization material buildup, infundibulum expands such as gyalectiform, intradermal There is more inflammatory cell infiltration. There are correction dyskeratosis, resisting mammal Cuo by result above and the visible artemisine composition of table 12 or combinations thereof The effect of skin ulcer. 12. artemisine composition of table or combinations thereof are histopathologic impact (mean) on rabbit experiment ear acne P<0. 05, compare with matrix control group. Claims (10) Hide Dependent 1. a kind of new opplication of artemisine composition or combinations thereof, i.e. new opplication in mammal skin nursing field, It is characterized in that described artemisine composition or combinations thereof refer to arteannuin and its derivant and correlative and their salt Class is included but is not limited to, arteannuin, dihydroarteannuin, artesunate, sodium artesunate, Artemether, arteether, arteannuin C13Spread out Biological, arteannuin C12Derivant, arteannuin C4Derivant, deoxidation bridge arteannuin structure related compound, demethylation arteannuin knot Structure related compound, de- ketonic oxygen arteannuin structure related compound, steroid arteannuin structure related compound, lactams Herba Artemisiae Annuae Plain structure related compound, open loop arteannuin structure related compound, 4,5- epoxy carbon are for arteannuin structure related compound, green grass or young crops Artemisin structure simplifies thing, other arteannuin structure related compounds and their salt；Or the combination containing artemisine composition Thing or extract are included but is not limited to, Chinese medicine Herba Artemisiae Annuae（ARTEMISIAE ANNUAE HERBA）And its product, plant Artemisia annua （Artemisia annuaL.）And its product, other Compositae artemisias (Artemisia Linn. Sensu stricto, excl. Sect. Seriphidium Bess.) plant and its product, Herba Artemisiae Annuae tissue culture medium, artemisinin mother liquid etc.；Or be selected from The arbitrary composition of mentioned component. 2. the skin care compositionss containing artemisine composition or combinations thereof such as health-oriented products, daily chemical products, health product or medicine Deng the new opplication in mammal skin nursing field, it is characterised in that containing the as claimed in claim 1 of safe and effective amount Artemisine composition or combinations thereof, and Dermatology and other active additives pharmaceutically acceptable and substrate. 3. artemisine composition as described in right 1～2 is arbitrary or combinations thereof or skin care compositionss are protected in mammal skin The new opplication in reason field, it is characterised in that the source of artemisine composition or combinations thereof can be synthesis or naturally including but not It is limited to, natural product extraction, chemical complete synthesis, molecular design, biosynthesiss, histiocyte culture, fungal transformation, metabolism are led to The approach such as road. 4. artemisine composition as described in claims 1 to 3 is arbitrary or combinations thereof or skin care compositionss are in skin of mammal The new opplication of skin nursing field, it is characterised in that the content of artemisine composition or combinations thereof in skin care compositionss is preferably About 0.0001%～90%, even more preferably about 0.01%～35%, most preferably about 1%～22% wherein the percentage ratio be with compositionss Quality is 100% meter. 5. artemisine composition as described in Claims 1 to 4 is arbitrary or combinations thereof or skin care compositionss are in skin of mammal The new opplication of skin nursing field, it is characterised in that other active additives that can add and substrate refer to known in the field At present skin protection cosmetics of everyday use, medicine, health product, applied in healthy product or possible application except artemisine composition and its group Other optional active additives of wide scope beyond compound and substrate are included but is not limited to, oily raw material, silty raw material, glue Matter raw material, solvent materials, water-soluble polymer, preservative, thickening agent, acid-base class regulator, antioxidant, wetting agent, convergence Agent, sunscreen, antibacterial, conditioner, cracking-off agent, opacifier, prurituss, frosting agent, surfactant, skin transferral agent, skin Skin sensory agent, Skin Soothing Agent, skin healing agent, nourishing additive agent, trace element and hormoness additive, biological active substanceies Additive, synthesis class nourishing additive agent, bioactive peptide, natural extract, additive biology, quintessence oil, essence, spice, pigment, Toner, adhesive, disintegrating agent, filler, lubricant, wetting agent, osmotic pressure regulator, stabilizer, fluidizer, correctivess, help Suspension, coating material, excipient, absorbent, diluent, flocculant and deflocculant, filter aid, release blocker, microcapsule, micro- Ball, liposome etc. and their combination. 6. artemisine composition as described in Claims 1 to 5 is arbitrary or combinations thereof or skin care compositionss are in skin of mammal The new opplication of skin nursing field, it is characterised in that described skin care compositionss are included but is not limited to, health-oriented products, cosmetics of everyday use, Medicine, health product, Emulsion class cosmetics, watery class cosmetics, powder class cosmetics, cream kind cosmetics, aerosol class cosmetics, Hair based article, beauty class cosmetics, soaps, facial film, curative effect class cosmetics, sun-proof class cosmetics, tablet, powder, pill, soft Unguentum, membranous patch, gel, capsule, granule, effervescent, fumigant, slow releasing agent etc. and other skin care implements. 7. artemisine composition as described in claim 1～6 is arbitrary or combinations thereof or skin care compositionss are in skin of mammal The new opplication of skin nursing field, it is characterised in that described application refers to skin defective mode be mitigated or eliminated and makes the life of skin Reason health is recovered with aesthetic appearance or is further enhanced including but not limited to, a）By correcting dyskeratosis effect prevention, postponing and/or treat mammal acne, dandruff, desquamation prurituss, dry chap Split, the hyperkeratotic conditions caused by dyskeratosis such as psoriasises, scleroderma, perifollicular keratosises； b）By the lip of the softening of promotion cutinization or submissive mammal, skin, hair, refer to toenail, hoof etc., and promote suckling Animal lip, skin, hair, refer to the renewal of toenail, hoof etc., adjust their oiliness and gloss； c）Promote skin lightening ruddy by anti-pigmentation, prevention, delay and/or treatment mammal skin blackening, The appearance of the pigmentation symptoms such as sallow dimness, mottle, acne print, sun exposure damage, inflammation damnification； d）By the effect prevention of anti-cicatrization, postpone and/or treat the cicatrix that the injury of mammal skin inflammatory stimulus is caused Cicatrix growth that growth, environmental stimuli injury are caused, the appearance of the cicatrix symptom such as acne print； e）Skin elasticity effect is kept to strengthen skin elasticity and gloss by slow down aging, prevention, delay and/or treatment suckling are moved Thing skin lines, wrinkle, sagging, atrophy, swelling, the appearance of corse sweat pore； f）By antibacterium, antifungal, anti-dermatozoon effect keep mammal skin cleaning, prevention, postpone and/or Mammal skin defective mode caused by treatment antibacterial, funguses, dermatozoon etc.； G) eliminated by the effect such as antiinflammatory, analgesia, hemostasis or alleviate the defective modes such as scytitiss red and swollen heat pain, bleeding； h）By promoting keratinization, correcting dyskeratosis, anti-pigmentation, suppression cicatrization, delay skin aging, keep skin A series of works beneficial to mammal skin such as elasticity, antiinflammatory, analgesia, hemostasis, antibacterium, antifungal, anti-dermatozoon With, eliminate or alleviate mammal skin defective mode so as to provide enhanced skin health and beauty. 8. a kind of elimination or alleviation mammal skin defective mode are to provide enhanced skin health and beautiful method, and which is special Levying is that methods described includes the arbitrary described artemisine composition of right 1～7 or combinations thereof or shield to be applied to mammal Skin compositionss. 9. pass through to apply artemisine composition or combinations thereof or the skin protection as described in claim 1～8 is arbitrary to mammal Compositionss, to eliminate or alleviate mammal skin defective mode so as to obtain enhanced skin health and beauty. 10. artemisine composition as described in claim 1～9 is arbitrary or combinations thereof or skin care compositionss are in skin of mammal The application of skin nursing field. Patent Citations (4) Publication numberPriority datePublication dateAssigneeTitle CN101282722A *2005-10-202008-10-08埃皮法姆有限责任公司Treatment and prevention of benign pigmented moles (naevi) using artemisinine and the derivatives thereof CN102883732A *2010-05-072013-01-16强生消费者公司Compositions comprising extracts of southernwood and an amine compound CN103961376A *2013-06-132014-08-06广西医科大学Pharmaceutical composition for controlling skin scars and preparation method thereof CN105267273A *2015-12-042016-01-27李清源Natural skin-protecting wound disinfectant and preparation method thereof Family To Family Citations * Cited by examiner, † Cited by third party Non-Patent Citations (5) Title 李琛琛: "抗疟药青蒿素及其衍生物相关药理作用研究进展", 《中国病原生物学杂志》 * 梁昊: "关于青蒿退热作用的中医临床与现代实验研究", 《医学信息》 * 王建新: "《化妆品植物原料大全》", 30 June 2012, 中国纺织出版社 * 金慧玲: "青蒿琥酯对体外培养角质形成细胞的影响", 《中国中医药科技》 * 隋婧: "青蒿体外止血活性部位筛选及其应用研究", 《重庆大学硕士学位论文》 * * Cited by examiner, † Cited by third party Cited By (8) Publication numberPriority datePublication dateAssigneeTitle CN107280996A *2017-08-242017-10-24郭志军A kind of face mask of traditional Chinese medicine and preparation method thereof and application method CN107412060A *2017-08-082017-12-01广州无添加主义化妆品有限公司A kind of sunscreen composition, its preparation method, Sun care spray and preparation method thereof CN108261379A *2018-04-262018-07-10张建华A kind of facial mask and preparation method thereof CN109939105A *2017-12-202019-06-28隐纱化妆品有限公司The purposes of qinghaosu and its derivative CN110013495A *2018-01-102019-07-16隐纱化妆品有限公司The composition for preventing and treating scytitis CN110115697A *2018-02-072019-08-13隐纱化妆品有限公司The composition of prevention and treatment scytitis containing cordyceps sinensis CN112043817A *2020-09-142020-12-08北京皓尔生物科技有限公司Anti-mite composition and application thereof CN114452229A *2022-01-282022-05-10中国中医科学院中药研究所Skin care composition containing artemisinin Family To Family Citations * Cited by examiner, † Cited by third party, ‡ Family to family citation 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artemisinin ingredients in skin care https://patents.google.com/patent/CN106420381A/en 青蒿素类成分或其组合物在皮肤护理中的新应用 技术领域 本发明涉及到所定义的青蒿素类成分或其组合物的一种新应用，即在哺乳动物皮肤护理领域的新应用包括：a）通过纠正异常角化作用预防、延迟和/或治疗哺乳动物痤疮、头屑、脱屑瘙痒、干燥皲裂、银屑病、硬皮病、毛囊周角化病等由异常角化所引起的角化病症；b）通过促进角化作用软化或柔顺哺乳动物的唇、皮肤、毛发、指趾甲、蹄等，并促进哺乳动物唇、皮肤、毛发、指趾甲、蹄等的更新，调节它们的油性与光泽；c）通过抗色素沉着作用促进皮肤亮白红润，预防、延迟和/或治疗哺乳动物皮肤变黑、灰黄暗淡、色斑、痘印、日晒损伤、炎症损伤等色素沉着症状的出现；d）通过抗瘢痕形成作用预防、延迟和/或治疗哺乳动物皮肤炎症刺激伤害造成的瘢痕生长、外界刺激伤害造成的瘢痕生长、痘印等瘢痕症状的出现；e）通过延缓衰老保持皮肤弹性作用增强皮肤弹性与光泽，预防、延迟和/或治疗哺乳动物皮肤细纹、皱纹、松垂、萎缩、肿胀、毛孔粗大的出现；f）通过抗细菌、抗真菌、抗皮肤寄生虫作用保持哺乳动物皮肤的清洁，预防、延迟和/或治疗细菌、真菌、皮肤寄生虫等所引起的哺乳动物皮肤不良状态；g) 通过抗炎、镇痛、止血等作用消除或缓解皮肤炎症红肿热痛、出血等不良状态；h）通过促进角化、纠正角化异常、抗色素沉着、抑制瘢痕形成、延缓皮肤老化、保持皮肤弹性、抗炎、镇痛、止血、抗细菌、抗真菌、抗皮肤寄生虫等一系列对哺乳动物皮肤有益的作用，消除或缓解哺乳动物皮肤不良状态从而提供增强的皮肤健康与美丽。 通过将含有安全有效量的青蒿素类成分或其组合物的护肤组合物如健康产品、日化产品、保健品或药品等施用到需要这类效果的哺乳动物上，可实现这些方法与益处。 背景技术 随着经济与社会的高速发展人们对健康与美丽的要求也随之提高，尤其是皮肤护理受到了更加广泛的关注，对护肤用品的功能性与安全性提出了更高的要求。目前困扰人民大众的皮肤问题主要是：痤疮、脱屑、皮肤灰黄暗淡变黑、松弛下垂、细纹皱纹、残留瘢痕痘印、红肿热痛等。因此市场上以面霜、面膜、洗面乳、沐浴乳、洗发露、皮肤软膏剂等为代表的皮肤护理产品，大多添加了用以解决各种皮肤问题的活性成分。然而这些成分大多为人工合成来源，在追求自然崇尚天然的今天，能有效解决各种皮肤问题的天然来源的活性成分，以其绿色、环保、安全性高、毒副作用小等特点倍受人民大众的期盼且其消费需求也在不断的增长。 青蒿素是传统中医药送给世界人民的礼物，对防治疟疾等传染性疾病维护世界人民健康具有重要意义。2015年屠呦呦研究员因青蒿素而获得诺贝尔生理学或医学奖，表明了全世界对青蒿素类成分的认可，是我国传统医药文化走向世界，为世界人民所认识进程中的一座丰碑。目前青蒿素类成分已成为世界各国的研究热点，对其抗肿瘤、抗寄生虫、治疗系统性红斑狼疮等作用进行了深入的研究。但是以上研究都是围绕药物研究而展开的，为响应国家深入发掘中医药宝库中的精华，充分发挥中医药的独特优势，推进中医药现代化，推动中医药走向世界的号召，申请者本着严谨求实的态度对青蒿素类成分进行广泛的药效学筛选研究，以期使青蒿素类成分更好的为社会大众所服务。 申请者以青蒿素类成分或其组合物进行广泛的药效学筛选，并惊奇的发现青蒿素类成分或其组合物在哺乳动物皮肤上具有促进角化、纠正角化异常、抑制色素沉着、抑制瘢痕生成、延缓皮肤老化、保持皮肤弹性、消除红肿热痛、杀灭皮肤蠕形螨等有着显著益处的皮肤护理活性。因此申请者发现安全有效量的青蒿素类成分或其组合物及含有安全有效量的青蒿素类成分或其组合物的护肤组合物可以对皮肤疾病或皮肤不良状态提供预防性或治疗性处理。例如，申请者已经发现青蒿素类成分或其组合物具有预防、延迟和/或治疗哺乳动物痤疮、头屑、银屑病、硬皮病、毛囊周角化病等由异常角化所引起的角化病症；软化或柔顺哺乳动物的唇、皮肤、毛发、指趾甲、蹄等，并促进哺乳动物唇、皮肤、毛发、指趾甲、蹄等的更新，调节它们的油性与光泽；预防、延迟和/或治疗哺乳动物皮肤变黑、灰黄暗淡、色斑、痘印、日晒损伤、炎症损伤等色素沉着症状的出现；预防、延迟和/或治疗哺乳动物皮肤瘢痕，痘印等瘢痕症状的出现；预防、延迟和/或治疗哺乳动物皮肤细纹、皱纹、松垂、萎缩、肿胀、毛孔粗大的出现；保持哺乳动物皮肤的清洁，预防、延迟和/或治疗细菌、真菌、皮肤寄生虫等所引起的哺乳动物皮肤不良状态；通过促进角化、纠正角化异常、抗色素沉着、抑制瘢痕形成、延缓皮肤老化、保持皮肤弹性、抗炎、镇痛、止血、抗细菌、抗真菌、抗皮肤寄生虫等一系列对哺乳动物皮肤有益的作用，消除或缓解哺乳动物皮肤不良状态从而提供增强的皮肤健康与美丽。以上发现必将推进健康产品、日化产品、保健品或药品的研发创新，并将对人民大众的身心健康和日常生活产生深远的影响。 发明内容 本发明的第一个方面在于提供所定义的青蒿素类成分或其组合物的一种新应用，即在皮肤护理领域的新应用；本发明的第二个方面在于提供一种护肤组合物其包含安全有效量的青蒿素类成分或其组合物及皮肤学与药学可接受的其他活性添加剂及基质；本发明的第三个方面在于提供一种消除或缓解哺乳动物皮肤不良状态以提供增强的皮肤健康与美丽的方法，所述方法包括向哺乳动物施用所定义的青蒿素类成分或其组合物或本发明的护肤组合物。 本文所述的青蒿素类成分或其组合物是指青蒿素及其衍生物和相关物及他们的盐类包括但不限于，青蒿素、双氢青蒿素、青蒿琥酯、青蒿琥酯钠、蒿甲醚、蒿乙醚、青蒿素C13衍生物、青蒿素C12衍生物、青蒿素C4衍生物、脱氧桥青蒿素结构相关化合物、脱甲基青蒿素结构相关化合物、脱羰基氧青蒿素结构相关化合物、甾类青蒿素结构相关化合物、内酰胺青蒿素结构相关化合物、开环青蒿素结构相关化合物、4,5-环氧碳代青蒿素结构相关化合物、青蒿素结构简化物、其他青蒿素结构相关化合物及他们的盐类；或含有青蒿素类成分的组合物或提取物包括但不限于，中药青蒿（ARTEMISIAE ANNUAE HERBA）及其制品、植物黄花蒿（Artemisia annua L.）及其制品、其他菊科蒿属(Artemisia Linn. Sensu stricto, excl. Sect. Seriphidium Bess.)植物及其制品、青蒿组织培养液、青蒿素母液等；或选自上述成分的任意组合物。青蒿素类成分或其组合物的来源可以是合成或自然包括但不限于，天然产物提取、化学全合成、化学半合成、生物合成、组织细胞培养、真菌转化、代谢通路等途径。 本文所述的皮肤是指哺乳动物的皮肤及其附属器官包括但不限于，皮肤、汗腺、皮脂腺、指甲、趾甲、毛发、唇、表皮、真皮等。 本文所述的护肤组合物是指包含安全有效量的青蒿素类成分或其组合物及皮肤学与药学可接受的其他活性添加剂及基质所组成的各种健康产品、日化用品、药品、保健品等包括但不限于，乳剂类化妆品、水状类化妆品、粉类化妆品、膏霜类化妆品、气溶胶类化妆品、发用类制品、美容类化妆品、皂类、面膜、疗效类化妆品、防晒类化妆品、片剂、散剂、丸剂、软膏剂、贴膜剂、凝胶剂、胶囊剂、颗粒剂、泡腾剂、熏蒸剂、缓释剂等及其他皮肤护理用品。 本文所述的安全有效量是指本领域的相关技术人员合理判断使用青蒿素类成分或其组合物足以产生显著的有益效果，且该量又足以避免严重的不良反应，即提供合理的效险比，其含量优选为约0.0001%～90%，更优选为约0.01%～35%，最优选为约1%～22%其中所述百分比是以组合物质量为100%计。 本文所述的皮肤不良状态是指由于机体的内在因素或外在因素所引起的皮肤生理健康与美学外观减弱的状态包括但不限于，皮肤角化异常、皮肤脱屑瘙痒、皮肤灰黄暗淡、皮肤变黑、皮肤衰老松弛、皮肤细纹皱纹、皮肤肿胀增厚、皮肤萎缩下垂、毛孔粗大、皮肤炎症红肿、皮肤油腻粗糙、皮肤干燥皲裂、皮肤出血疼痛、皮肤受炎症或外界刺激伤害造成的色素沉着、皮肤受炎症或外界刺激伤害造成的瘢痕生长等。例如哺乳动物的痤疮、头屑、银屑病、硬皮病、毛囊周角化病等由异常角化所引起的角化病症；哺乳动物唇、皮肤、毛发、指趾甲、蹄等的干燥龟裂或过度油腻；哺乳动物皮肤变黑、灰黄暗淡、色斑、痘印、日晒损伤、炎症损伤等色素沉着症状的出现；哺乳动物皮肤瘢痕，痘印等瘢痕症状的出现；哺乳动物皮肤细纹、皱纹、松垂、萎缩、毛孔粗大的出现；哺乳动物皮肤由细菌、真菌、皮肤寄生虫等所引起的不良状态等。 本文所述的增强的皮肤健康与美丽是指由于减轻或消除皮肤不良状态而使皮肤的生理健康与美学外观恢复或进一步增强包括但不限于， a）通过纠正异常角化作用预防、延迟和/或治疗哺乳动物痤疮、头屑、脱屑瘙痒、干燥皲裂、银屑病、硬皮病、毛囊周角化病等由异常角化所引起的角化病症； b）通过促进角化作用软化或柔顺哺乳动物的唇、皮肤、毛发、指趾甲、蹄等，并促进哺乳动物唇、皮肤、毛发、指趾甲、蹄等的更新，调节它们的油性与光泽； c）通过抗色素沉着作用促进皮肤亮白红润，预防、延迟和/或治疗哺乳动物皮肤变黑、灰黄暗淡、色斑、痘印、日晒损伤、炎症损伤等色素沉着症状的出现； d）通过抗瘢痕形成作用预防、延迟和/或治疗哺乳动物皮肤炎症刺激伤害造成的瘢痕生长、外界刺激伤害造成的瘢痕生长、痘印等瘢痕症状的出现； e）通过延缓衰老保持皮肤弹性作用增强皮肤弹性与光泽，预防、延迟和/或治疗哺乳动物皮肤细纹、皱纹、松垂、萎缩、肿胀、毛孔粗大的出现； f）通过抗细菌、抗真菌、抗皮肤寄生虫作用保持哺乳动物皮肤的清洁，预防、延迟和/或治疗细菌、真菌、皮肤寄生虫等所引起的哺乳动物皮肤不良状态； g) 通过抗炎、镇痛、止血等作用消除或缓解皮肤炎症红肿热痛、出血等不良状态； h）通过促进角化、纠正角化异常、抗色素沉着、抑制瘢痕形成、延缓皮肤老化、保持皮肤弹性、抗炎、镇痛、止血、抗细菌、抗真菌、抗皮肤寄生虫等一系列对哺乳动物皮肤有益的作用，消除或缓解哺乳动物皮肤不良状态从而提供增强的皮肤健康与美丽。 本文所述的施用是指通过各种给药途径包括但不限于，局部涂抹、局部外敷、口服、熏蒸等方式使本文所述的青蒿素类成分或其组合物或本文所述的护肤组合物作用于皮肤。 本文所述的其他活性添加剂及基质是指本领域所公知的在目前护肤日化用品、药品、保健品、健康品中已有应用或可能应用的除青蒿素类成分及其组合物以外的宽范围的任选的其他活性添加剂及基质包括但不限于，油质原料、粉质原料、胶质原料、溶剂原料、水溶性聚合物、防腐剂、增稠剂、酸碱类调节剂、抗氧化剂、保湿剂、收敛剂、防晒剂、杀菌剂、调理剂、剥脱剂、遮光剂、止痒剂、磨砂剂、表面活性剂、皮肤助渗剂、皮肤感觉剂、皮肤舒缓剂、皮肤愈合剂、营养添加剂、微量元素和激素类添加剂、生理活性物质添加剂、合成类营养添加剂、活性肽、天然提取物、生物学添加剂、精油、香精、香料、色素、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、助悬剂、包衣材料、赋形剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂、微囊、微球、脂质体等以及他们的组合。 本文所述的皮肤学与药学可接受的是指所述组合物及其含有组分适用于与哺乳动物皮肤相接触，而没有过度的毒性、不相容性、不稳定性、变应性反应等；或适用于在经过各种给药途径与哺乳动物机体相接触，而没有过度的毒性、不相容性、不稳定性、变应性反应等。 本文所述的药理学可接受的基质是指所述的基质不会对药理学实验产生影响，可以恰当的分散青蒿素类成分或其组合物，并作为实验中的阴性对照组。 现在将借助以下非限制性实例对本发明的具体实施方案作进一步的描述并进行举例说明，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。本文所述内容仅为本发明精神和范围条件下的基本说明，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以以下实施例来限定本发明的专利范围，对依据本发明技术方案的普通技术人员来说，依据本发明所揭示的精神实质对本发明进行任何等效变换或修饰，均应属于本发明的保护范围。 实施例1：青蒿素护肤霜的制备。 如下组分通过护肤霜现有生产工艺可制成青蒿素护肤霜。 组分 质量分数% 组分 质量分数% 双氢青蒿素 2.00 凡士林 6.00 羊毛脂 4.00 鳄梨油 4.00 十六醇 2.00 香精 适量 十六醇聚氧乙烯醚 1.50 去离子水 加至100.00 实施例2：青蒿素洗发露的制备。 如下组分通过洗发露现有生产工艺可制成青蒿素洗发露。 组分 质量分数% 组分 质量分数% 青蒿素 3.00 硬脂酸 5.00 十二烷基硫酸钠 20.00 氢氧化钠 0.75 椰子油单乙醇酰胺 1.00 香精 适量 丙二醇单硬脂酸酯 2.00 去离子水 加至100.00 实施例3: 青蒿面膜的制备。 如下组分通过面膜现有生产工艺可制成青蒿面膜。 组分 质量分数% 组分 质量分数% 青蒿提取物 10.00 甘油 5.00 聚乙烯吡咯烷酮 2.00 乙醇 10.00 羧甲基纤维素 3.00 香精 适量 聚乙二醇 15.00 去离子水 加至100.00 实验例1：本发明青蒿素类成分或其组合物的抗炎作用 青蒿素类成分或其组合物以药理学可接受的基质分散。取昆明种小鼠24只，随机分为2组，即基质对照组与2%青蒿素类成分或其组合物组，每组各12只。二甲苯0.05mＬ涂于小鼠右耳，刺激后分别于15min、30min、45min局部给予各组等量的基质与2%青蒿素类成分或其组合物，60min断颈处死动物，剪下左右耳壳，用直径8mm的打孔器分别在两耳的同一部位取下耳片称取质量，以两耳片的质量差计算各组耳壳肿胀度进行比较。 表1. 青蒿素类成分或其组合物对二甲苯所致小鼠耳壳急性炎症的影响(mean± SD) 组别 只数 肿胀度 基质对照组 12 55.8±3.27 2%青蒿素类成分或其组合物组 12 22.5±2.96 P<0.01，与基质对照组比较 由表1可见青蒿素类成分或其组合物有抗炎作用，与基质对照组有显著差异。 实验例2：本发明青蒿素类成分或其组合物的镇痛作用 青蒿素类成分或其组合物以药理学可接受的基质分散。取昆明种小鼠30只，随机分为2组，即基质对照组与2%青蒿素类成分或其组合物组，每组各15只。局部给予各组等量的基质与2%青蒿素类成分或其组合物给药后保鲜膜覆盖，胶布固定30min后解开，以生理盐水洗净药物，再用干药棉拭干，立即给小鼠右后足背皮下注射新配制的2.5%甲醛溶液30μL。注射甲醛后立即记录每只小鼠首次舔咬右后足的潜伏期及10min内舔咬右后足的次数。 表2. 青蒿素类成分或其组合物对甲醛致小鼠疼痛的影响(mean±SD) 组别 只数 潜伏期/s 10min内舔足次数 基质对照组 15 7.9±1.55 25.4±5.2 2%青蒿素类成分或其组合物组 15 13.2±3.25 14.9±5.4 P<0.01，与基质对照组比较 由表2可见青蒿素类成分或其组合物有镇痛作用，与基质对照组有显著差异。 实验例3：本发明青蒿素类成分或其组合物的止血作用 青蒿素类成分以药理学可接受的溶媒分散。取昆明种小鼠24只，随机分为2组，即基质对照组与2%青蒿素类成分或其组合物组，每组各12只。将小鼠固定于鼠筒中，尾尖部2cm浸泡于2%青蒿素类成分或其组合物溶液或溶媒中，给药时间30min，间隔2h后，重复给药1次。末次给药30min后，以利剪在小鼠距尾尖1.5cm处剪断，待血液自然流出时开始计录出血时间，每隔5秒用己事先称重的棉球吸取血滴，直至出血自然停止(棉球吸时无血)。按下式计算各组动物出血量:出血量=带血棉球重量一初始棉球重量(mg)。 表3. 青蒿素类成分或其组合物对小鼠断尾的止血作用(mean±SD) 组别 只数 出血时间/s 出血量/mg 基质对照组 12 124.7±11.68 45.3±12.1 2%青蒿素类成分或其组合物组 12 113.1±12.77 25.3±8.7 P<0.05，与基质对照组比较 由表3可见青蒿素类成分或其组合物有止血作用，与基质对照组有显著差异。 实验例4：本发明青蒿素类成分或其组合物的抗细菌作用 细菌组经培养48h后观察有无菌落生长，以无菌落生长者的药物最低浓度为药物的最低抑菌浓度(MIC)。 表4. 青蒿素类成分或其组合物对常见致病细菌最低抑菌浓度 菌种名 MIC/g% 金黄色葡萄球菌 1.1 痤疮丙酸杆菌 0.9 绿脓杆菌 1.1 乳酸杆菌 1.0 由表4可见青蒿素类成分或其组合物对常见致病细菌，尤其是引起皮肤疾病的金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌、绿脓杆菌有一定的抑制作用。 实验例5：本发明青蒿素类成分或其组合物的抗真菌作用 真菌组经培养72h后观察点种的菌范围不增大，且逐渐变小干燥，为菌株已被药物抑制的最低浓度(MIC)。 表5. 青蒿素类成分或其组合物对常见皮肤真菌最低抑菌浓度 菌种名 MIC/g% 糠秕孢子菌 0.9 白色念珠菌 0.9 表皮癣菌 1.1 由表5可见青蒿素类成分或其组合物对常见的皮肤真菌有一定的抑制作用。 实验例6：本发明青蒿素类成分或其组合物的抗蠕形螨作用 青蒿素类成分或其组合物以药理学可接受的基质分散。采用透明胶带粘贴过夜法获取人体蠕形螨，随机分成基质组和2%青蒿素类成分或其组合物组，每组12只。用微量移液器吸取等量的基质和2%青蒿素类成分或其组合物各200μL药液滴加于载波片上，用推片将药液均匀铺开，将检出蠕形螨的胶带贴于载玻片上，保证药液与虫体充分接触。然后将载玻片置于人工气候箱(温度30℃，湿度75%)，12h后显微镜下观察蠕形螨死亡情况。死亡判断标准:在400倍显微镜下连续观察1min，螨体鳌肢或足爪不动者初步判断为死亡，30min后继续观察仍不动者确定为死亡。 表6. 青蒿素类成分或其组合物对蠕形螨的杀灭作用 组别 只数 死亡只数 死亡率 基质对照组 12 0 0% 2%青蒿素类成分或其组合物组 12 10 83% 由表6可见青蒿素类成分或其组合物对蠕形螨有显著的杀灭作用。 实验例7：本发明青蒿素类成分或其组合物的角化调节作用 青蒿素类成分或其组合物以药理学可接受的基质分散。取昆明种小鼠30只，雌雄各半，随机分成基质组和2%青蒿素类成分或其组合物组。2组小鼠每天分别局部涂抹等量的基质与2%青蒿素类成分或其组合物给药后保鲜膜覆盖，胶布固定30min后解开，以生理盐水洗净药物，再用干药棉拭干，连续21天，一天2次。于第22天处死动物，在距尾根2cm处取鼠尾表皮，以10%甲醛溶液固定石蜡包埋，HE染色，在光镜下观察每个小鼠的尾部鳞片。凡鳞片表皮有连续成行的颗粒细胞者，称为有颗粒层形成的鳞片，颗粒细胞为表皮中扁平或菱形细胞所组成，胞浆内充满粗大深嗜碱性、HE染色呈深兰色透明的角质颗粒。计数鼠尾表皮100个鳞片中有颗粒层形成数。 表7. 青蒿素类成分或其组合物对小鼠鼠尾颗粒细胞形成的影响(mean±SD) 组别 只数 鼠尾每100个鳞片中颗粒层形成数 基质对照组 15 7.3±1.1 2%青蒿素类成分或其组合物组 15 13.8±1.7 P<0.05，与基质对照组比较 由表7可见青蒿素类成分或其组合物有促进角化、纠正异常角化的作用，与基质对照组有显著差异。 实验例8：本发明青蒿素类成分或其组合物的延缓皮肤老化作用 青蒿素类成分或其组合物以药理学可接受的基质分散。以人正常皮肤成纤维细胞（NHDF）传代培养得到细胞浓度较好的培养液用于实验。将培养的细胞接种到细胞培养皿中，培养24h，待细胞生长至占据培养皿面积80％时，吸去培养基，PBS清洗一遍，然后加入300（μL）PBS，以透明膜封口，以为144mJ／cm2照射剂量UVB照射细胞40s，照射后立即用PBS清洗一遍，分别接种到2%青蒿素类成分或其组合物的培养液与空白培养液中，在37℃培养72h。取其中1ml培养液，用于抑制胶原蛋白分解酶（MMP-L1）生成的测定，1mL用于细胞存活力的测定。该实验重复3次。利用免疫ELISA试剂盒测定培养液中的胶原蛋白分解酶生成量。 表8. 青蒿素类成分或其组合物对胶原蛋白分解酶的抑制作用 组别 MMP-L1酶蛋白质量平均浓度 MMP-L1酶生成抑制率 空白对照组 0.17 - 2%青蒿素类成分或其组合物组 0.07 - MMP-L1酶生成抑制率 - 58.8% 由表8可见青蒿素类成分或其组合物有明显抑制皮肤细胞胶原蛋白分解酶生成作用，具有皮肤抗老化与增强皮肤弹性的功能。 实验例9：本发明青蒿素类成分或其组合物的抗色素沉着作用 青蒿素类成分或其组合物以药理学可接受的基质分散。取豚鼠6只，每只动物背部去毛，取2个相离区域，UVB照射选用UVB光源照射，照射总量为2500mJ/cm2，照射2个面积相等的区域一周后开始涂药，分别局部涂抹等量的基质与2%青蒿素类成分或其组合物，连续21天，一天2次。分别在UVB照射前、照射后1周和用药后1周、2周、3周和4周时以多功能皮肤测试仪测量豚鼠背部皮肤各区域的颜色变化，进行客观比较。4周后组织活检并作镜下观察分析。以Schmorl法染色，高倍镜计数每份样品每平方毫米表皮含黑素颗粒细胞数。以Imokawa法染色，高倍镜计数每份样品每平方毫米表皮基底层含多巴阳性黑素细胞数。 表9. 青蒿素类成分或其组合物对UVB照射豚鼠皮肤颜色值的测定的影响(mean) 组别 照射前 照射后 用药1周 用药2周 用药3周 用药4周 基质对照组 30 59 59 58 60 58 2%青蒿素类成分或其组合物组 31 58 56 51 47 41 P<0.05，用药4周与基质对照组比较 表10. 青蒿素类成分或其组合物对UVB有豚鼠色素沉着的抑制作用(mean±SD) 组别 多巴阳性的黑素细胞（个/mm2） 含黑素颗粒的细胞（个/mm2） 基质对照组 773.18±68.52 2801.13±180.72 2%青蒿素类成分或其组合物组 566.97±82.67 2136.14±192.35 P<0.05，与基质对照组比较 由表9，10可见青蒿素类成分或其组合物有抗哺乳动物色素沉着作用。 实验例10：本发明青蒿素类成分或其组合物的抗皮肤瘢痕形成作用 青蒿素类成分或其组合物以药理学可接受的基质分散。将12只日本大耳白兔麻醉，在双侧兔耳腹侧内侧缘上、下部位分别做2个直径约1cm的正方形切口，切口间隔2.0cm，去除兔耳皮肤和皮下组织和软骨膜，保留软骨，纱布压迫止血。将每只耳朵创面随机分为基质组与2%青蒿素类成分或其组合物组，浸有基质或2%青蒿素类成分或其组合物的纱布块外敷5分钟并保留，后纱布包扎，在术后3、6、9、12、15、18、21天采用同样的方法换药。创面在术后12天可见创面肉芽组织生长，28天可见创面全部瘢痕愈合，愈合后18天开始出现高出皮面的增生性瘢痕。术后50天处死动物，切取标本，10%甲醛溶液固定，石蜡包埋后切片，HE染色。在HE染色每张切片随机选取3个高倍视野(×200倍)，计数各单位视野的成纤维细胞数，取平均值。计算瘢痕增生指数（Hypertrophic Index，HI）：HE染色组织切片于低倍镜下用测微尺测量，按公式HI=A/B计算瘢痕增生指数。A=瘢痕凸起最高点至耳软骨表面的垂直高度；B=瘢痕周边正常皮肤皮缘至耳软骨表面的垂直高度。 50天时肉眼观察可见基质组创面愈合区组织明显高于周围正常皮肤，表现为瘢痕中央呈乳头状突起，呈淡红色，质韧，增生块高出皮面。2%青蒿素类成分或其组合物组愈合区略高于正常皮肤，色泽较淡。HE染色组织切片观察可见基质组瘢痕毛细血管增生明显、成纤维细胞核大、密集增生、位于真皮全层、胶原排列紊乱。2%青蒿素类成分或其组合物组瘢痕组织较薄，表面平整、层次有序、成纤维细胞明显减少。 表11. 青蒿素类成分或其组合物的抗皮肤瘢痕形成作用(mean±SD) 组别 瘢痕增生指数 成纤维细胞数 基质对照组 3.18±0.86 86.01±2.87 2%青蒿素类成分或其组合物组 1.79±0.77 39.78±2.63 P<0.05，与基质对照组比较 由表11可见青蒿素类成分或其组合物有抗哺乳动物皮肤瘢痕形成作用。 实验例11：本发明青蒿素类成分或其组合物对家兔痤疮模型的治疗作用 青蒿素类成分或其组合物以药理学可接受的基质分散。取雄性新西兰兔22只，随机分为基质组与2%青蒿素类成分或其组合物组。对2组新西兰兔双耳内侧面耳管开口处备皮2cm×2cm范围，每日涂抹煤焦油1次，每次0.5mL，连续2周。2周后，取2只新西兰兔造模处皮肤活检、病理切片观察，确定模型形成。2组动物左耳每天分别局部涂抹等量的基质与2%青蒿素类成分或其组合物，连续14天，一天2次。第15天肉眼观察并于动物双耳相应部位取皮肤活检，组织块以10%福尔马林固定，10%硝酸脱钙，石蜡包埋，切片，HE染色，于光镜下观察组织学改变。 实验性粉刺的组织学判定标准：(-)无粉刺，漏斗部仅有松散的角化细胞；(+)毛囊漏斗部积聚少量的粘连在一起的角化细胞，漏斗不扩张；(++)毛囊中中等量的角质栓塞，伸入皮脂腺导管，伴随皮脂腺导管的增生，漏斗扩张；(+++)毛囊中紧密的角质栓塞引起毛囊重度扩张，皮脂腺导管上皮明显增生，部分皮脂腺发生退行变。 肉眼观察：兔耳涂药2周后，可见油酸处局部组织明显粗糙、增厚、变硬，毛囊口有黑色角栓，呈黑头粉刺状，揭开煤焦油痂时，可见附着其上的毛囊角栓，其下可见开放增大的毛囊口，毛囊口隆起呈丘疹状。2%青蒿素类成分或其组合物组用药14天后，整个皮片厚度变薄，柔软度增加，局部毛囊口角栓及粉刺减少，丘疹变平减少，有部分角栓脱落后遗留点状凹陷的毛囊口。基质组用药14天后，耳部仍可见明显的毛囊角栓，毛囊口隆起处略平。 光镜观察：造模2周后，可见角化过度，表皮和毛囊上皮的颗粒层增厚，棘层肥厚，相邻扩张的毛囊相互融合，毛囊口及漏斗部充满角化物质，并向皮脂腺延伸，毛囊口角栓堵塞，毛囊漏斗部充满角化物质并扩大呈壶状，真皮上层毛细血管扩张明显，毛囊周围弥漫散在炎性细胞浸润，以小圆形细胞为主，及少量中性粒细胞。2%青蒿素类成分或其组合物组用药14天后，表皮轻度增厚，毛囊口轻度扩张，有少量疏松角化物质充填，未见毛囊漏斗部扩大如壶状，较少真皮炎症细胞浸润。基质组用药14天后，可见角化过度，表皮及毛囊上皮的颗粒层、棘层仍增生明显、毛囊口及漏斗部仍见角化物质堆积，漏斗部扩大如壶状，真皮内有较多炎性细胞浸润。 由以上结果及表12可见青蒿素类成分或其组合物有纠正异常角化、抗哺乳动物痤疮的作用。 表12. 青蒿素类成分或其组合物对家兔实验性耳痤疮组织病理学的影响(mean) P<0. 05，与基质对照组比较。 Claims (10) Hide Dependent 1.青蒿素类成分或其组合物的一种新应用，即在哺乳动物皮肤护理领域中的新应用，其特征在于所述的青蒿素类成分或其组合物是指青蒿素及其衍生物和相关物及他们的盐类包括但不限于，青蒿素、双氢青蒿素、青蒿琥酯、青蒿琥酯钠、蒿甲醚、蒿乙醚、青蒿素C13衍生物、青蒿素C12衍生物、青蒿素C4衍生物、脱氧桥青蒿素结构相关化合物、脱甲基青蒿素结构相关化合物、脱羰基氧青蒿素结构相关化合物、甾类青蒿素结构相关化合物、内酰胺青蒿素结构相关化合物、开环青蒿素结构相关化合物、4,5-环氧碳代青蒿素结构相关化合物、青蒿素结构简化物、其他青蒿素结构相关化合物及他们的盐类；或含有青蒿素类成分的组合物或提取物包括但不限于，中药青蒿（ARTEMISIAE ANNUAE HERBA）及其制品、植物黄花蒿（Artemisia annua L.）及其制品、其他菊科蒿属(Artemisia Linn. Sensu stricto, excl. Sect. Seriphidium Bess.)植物及其制品、青蒿组织培养液、青蒿素母液等；或选自上述成分的任意组合物。 2.含有青蒿素类成分或其组合物的护肤组合物如健康产品、日化产品、保健品或药品等在哺乳动物皮肤护理领域中的新应用，其特征在于含有安全有效量的如权利要求1所述的青蒿素类成分或其组合物，及皮肤学与药学可接受的其他活性添加剂及基质。 3.如权利1～2任一所述的青蒿素类成分或其组合物或护肤组合物在哺乳动物皮肤护理领域的新应用，其特征在于青蒿素类成分或其组合物的来源可以是合成或自然包括但不限于，天然产物提取、化学全合成、化学半合成、生物合成、组织细胞培养、真菌转化、代谢通路等途径。 4.如权利要求1～3任一所述的青蒿素类成分或其组合物或护肤组合物在哺乳动物皮肤护理领域的新应用，其特征在于青蒿素类成分或其组合物在护肤组合物中的含量优选为约0.0001%～90%，更优选为约0.01%～35%，最优选为约1%～22%其中所述百分比是以组合物质量为100%计。 5.如权利要求1～4任一所述的青蒿素类成分或其组合物或护肤组合物在哺乳动物皮肤护理领域的新应用，其特征在于可加入的其他活性添加剂及基质是指本领域所公知的在目前护肤日化用品、药品、保健品、健康品中已有应用或可能应用的除青蒿素类成分及其组合物以外的宽范围的任选的其他活性添加剂及基质包括但不限于，油质原料、粉质原料、胶质原料、溶剂原料、水溶性聚合物、防腐剂、增稠剂、酸碱类调节剂、抗氧化剂、保湿剂、收敛剂、防晒剂、杀菌剂、调理剂、剥脱剂、遮光剂、止痒剂、磨砂剂、表面活性剂、皮肤助渗剂、皮肤感觉剂、皮肤舒缓剂、皮肤愈合剂、营养添加剂、微量元素和激素类添加剂、生理活性物质添加剂、合成类营养添加剂、活性肽、天然提取物、生物学添加剂、精油、香精、香料、色素、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、助悬剂、包衣材料、赋形剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂、微囊、微球、脂质体等以及他们的组合。 6.如权利要求1～5任一所述的青蒿素类成分或其组合物或护肤组合物在哺乳动物皮肤护理领域的新应用，其特征在于所述的护肤组合物包括但不限于，健康产品、日化用品、药品、保健品、乳剂类化妆品、水状类化妆品、粉类化妆品、膏霜类化妆品、气溶胶类化妆品、发用类制品、美容类化妆品、皂类、面膜、疗效类化妆品、防晒类化妆品、片剂、散剂、丸剂、软膏剂、贴膜剂、凝胶剂、胶囊剂、颗粒剂、泡腾剂、熏蒸剂、缓释剂等及其他皮肤护理用品。 7.如权利要求1～6任一所述的青蒿素类成分或其组合物或护肤组合物在哺乳动物皮肤护理领域的新应用，其特征在于所述的应用是指减轻或消除皮肤不良状态而使皮肤的生理健康与美学外观恢复或进一步增强包括但不限于， a）通过纠正异常角化作用预防、延迟和/或治疗哺乳动物痤疮、头屑、脱屑瘙痒、干燥皲裂、银屑病、硬皮病、毛囊周角化病等由异常角化所引起的角化病症； b）通过促进角化作用软化或柔顺哺乳动物的唇、皮肤、毛发、指趾甲、蹄等，并促进哺乳动物唇、皮肤、毛发、指趾甲、蹄等的更新，调节它们的油性与光泽； c）通过抗色素沉着作用促进皮肤亮白红润，预防、延迟和/或治疗哺乳动物皮肤变黑、灰黄暗淡、色斑、痘印、日晒损伤、炎症损伤等色素沉着症状的出现； d）通过抗瘢痕形成作用预防、延迟和/或治疗哺乳动物皮肤炎症刺激伤害造成的瘢痕生长、外界刺激伤害造成的瘢痕生长、痘印等瘢痕症状的出现； e）通过延缓衰老保持皮肤弹性作用增强皮肤弹性与光泽，预防、延迟和/或治疗哺乳动物皮肤细纹、皱纹、松垂、萎缩、肿胀、毛孔粗大的出现； f）通过抗细菌、抗真菌、抗皮肤寄生虫作用保持哺乳动物皮肤的清洁，预防、延迟和/或治疗细菌、真菌、皮肤寄生虫等所引起的哺乳动物皮肤不良状态； g) 通过抗炎、镇痛、止血等作用消除或缓解皮肤炎症红肿热痛、出血等不良状态； h）通过促进角化、纠正角化异常、抗色素沉着、抑制瘢痕形成、延缓皮肤老化、保持皮肤弹性、抗炎、镇痛、止血、抗细菌、抗真菌、抗皮肤寄生虫等一系列对哺乳动物皮肤有益的作用，消除或缓解哺乳动物皮肤不良状态从而提供增强的皮肤健康与美丽。 8.一种消除或缓解哺乳动物皮肤不良状态以提供增强的皮肤健康与美丽的方法，其特征在于所述方法包括向哺乳动物施用权利1～7任一所述的青蒿素类成分或其组合物或护肤组合物。 9.通过向哺乳动物施用如权利要求1～8任一所述的青蒿素类成分或其组合物或护肤组合物，以消除或缓解哺乳动物皮肤不良状态从而获得增强的皮肤健康与美丽。 10.如权利要求1～9任一所述的青蒿素类成分或其组合物或护肤组合物在哺乳动物皮肤护理领域的应用。 Patent Citations (4) Publication numberPriority datePublication dateAssigneeTitle CN101282722A *2005-10-202008-10-08埃皮法姆有限责任公司用青蒿素及其衍生物治疗和预防良性色素斑（痣） CN102883732A *2010-05-072013-01-16强生消费者公司包含青蒿提取物和胺化合物的组合物 CN103961376A *2013-06-132014-08-06广西医科大学一种防治皮肤瘢痕的药物组合物及其制备方法 CN105267273A *2015-12-042016-01-27李清源一种天然护肤伤口消毒液及其制备方法 Family To Family Citations * Cited by examiner, † Cited by third party Non-Patent Citations (5) Title 李琛琛: "抗疟药青蒿素及其衍生物相关药理作用研究进展", 《中国病原生物学杂志》 * 梁昊: "关于青蒿退热作用的中医临床与现代实验研究", 《医学信息》 * 王建新: "《化妆品植物原料大全》", 30 June 2012, 中国纺织出版社 * 金慧玲: "青蒿琥酯对体外培养角质形成细胞的影响", 《中国中医药科技》 * 隋婧: "青蒿体外止血活性部位筛选及其应用研究", 《重庆大学硕士学位论文》 * * Cited by examiner, † Cited by third party Cited By (8) Publication numberPriority datePublication dateAssigneeTitle CN107280996A *2017-08-242017-10-24郭志军一种中药面膜及其制备方法和使用方法 CN107412060A *2017-08-082017-12-01广州无添加主义化妆品有限公司一种防晒组合物、其制备方法、防晒喷雾剂及其制备方法 CN108261379A *2018-04-262018-07-10张建华一种面膜及其制备方法 CN109939105A *2017-12-202019-06-28隐纱化妆品有限公司青蒿素及其衍生物的用途 CN110013495A *2018-01-102019-07-16隐纱化妆品有限公司防治皮肤炎症的组合物 CN110115697A *2018-02-072019-08-13隐纱化妆品有限公司含冬虫夏草的防治皮肤炎症的组合物 CN112043817A *2020-09-142020-12-08北京皓尔生物科技有限公司一种抗螨虫的组合物及其应用 CN114452229A *2022-01-282022-05-10中国中医科学院中药研究所一种含有青蒿素的皮肤护理组合物 Family To Family Citations * Cited by examiner, † Cited by third party, ‡ Family to family citation Similar Documents PublicationPublication DateTitle CN106420381A2017-02-22青蒿素类成分或其组合物在皮肤护理中的新应用 CN105769698B2019-08-23一种不含防腐剂的化妆品组合物及其应用 CN105168038B2018-06-08金花葵花朵泥面膜及其制备方法 CN104306358B2015-11-18止痒祛疤涂膜剂 CN110876760B2022-09-30具有促进伤口愈合和/或疤痕修复功效的皮肤外用组合物 CN108135972B2022-07-01贻贝粘蛋白产品治疗和预防黑色素相关疾病中的应用 CN104523473B2017-11-28一种抗痤疮微乳体系及其制备方法 CN102302439B2013-01-23一种保健型沐浴液及其制备方法 CN110974830A2020-04-10一种用于预防、缓解或治疗皮肤过敏的外用组合物及其用途 CN110731921A2020-01-31具有祛痘功效的皮肤外用组合物 CN107303253A2017-10-31一种用于受损肌肤的修复剂及其制备方法 CN109833431A2019-06-04一种抑菌凝胶及其制备方法 CN109157470A2019-01-08一种祛痘除印美白护肤霜及其制备方法 CN109222534A2019-01-18一种枕套 CN105963243B2018-10-26一种治疗寻常痤疮的龙脑香樟精油缓释乳膏及其制备方法 KR101835799B12018-03-07프로폴리스를 유효성분으로 함유하는 화장품 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 화장품 CN111759896A2020-10-13一种木瓜总三萜的制药用途 CN103432049B2014-09-03一种具有除臭作用的组合物 CN114306526B2023-03-17一种复方苦丁茶中药提取物及其在制备沐浴露或洗手液中的应用 CN106511153B2020-02-04一种具有祛痘功效的纳米组合物及其化妆品或护肤品 CN102697835B2016-05-11治疗皮肤疾病的外用药剂 CN109364290A2019-02-22一种薰衣草精油脂质体液体创可贴及其制备方法 CN108096315A2018-06-01一种新一代抗痤疮复方药物的制备方法及制剂 CN106420399A2017-02-22一套激光美容术护理剂及其制备与使用方法 TWI679028B2019-12-11用於保養肌膚之表皮幹細胞及具有多種功能的中草藥組成物及其面膜 Priority And Related Applications Priority Applications (1) ApplicationPriority dateFiling dateTitle CN201610639349.9A2016-08-082016-08-08青蒿素类成分或其组合物在皮肤护理中的新应用 Applications Claiming Priority (1) ApplicationFiling dateTitle CN201610639349.9A2016-08-08青蒿素类成分或其组合物在皮肤护理中的新应用

The present invention provides application of the Artesunate as immunologic adjuvant in preparation rabies vacciness, and present invention firstly provides artemisinin derivative Artesunate (ART) is used as rabies vacciness adjuvant.The present invention passes through experimental studies have found that artemisinin derivative Artesunate (ART) is as rabies vacciness adjuvant can significantly increase its immunogenicity, can be used as new semple type rabies vaccine candidate adjuvant.The Artesunate (ART) of vaccine effect studies have shown that relatively low-dose of the invention can promote the immune effect of rabies vacciness, can reduce the cost of production vaccine.Vaccine effect studies have shown that artemisinin derivative Artesunate (ART) of the invention can generate better protection as rabies vacciness adjuvant. 本发明提供青蒿琥酯作为免疫佐剂在制备狂犬病疫苗中的应用，本发明首次提出将青蒿素衍生物青蒿琥酯(ART)作为狂犬病疫苗佐剂。本发明通过实验研究发现青蒿素衍生物青蒿琥酯(ART)作为狂犬病疫苗佐剂能显著增强其免疫原性，可以作为新型狂犬病疫苗候选佐剂。本发明的疫苗效果研究显示，较低剂量的青蒿琥酯(ART)能促进狂犬病疫苗的免疫效果，可以降低制作疫苗的成本。本发明的疫苗效果研究显示，青蒿素衍生物青蒿琥酯(ART)作为狂犬病疫苗佐剂能产生更好的保护力。 Application of the Artesunate as immunologic adjuvant in preparation rabies vacciness Technical field The invention belongs to molecular biosciences field of immunology.It is being prepared more particularly, to Artesunate as immunologic adjuvant Application in rabies vacciness. Background technique Hydrophobin (Rabies virus, RABV) is the strong people beast caused with the characteristics of infecting central nervous system Suffer from the rabic cause of disease of infectious disease altogether, once morbidity, lethality are up to 100%.China is rabic district occurred frequently, number of the infected It is only second to India, is in second place of the world.With the increase of domestic pets, the rabic control in China human world and prevention and treatment are still appointed Weight road is remote.However rabies pathogenesis is also imperfectly understood so far, also without treating rabic specific drug, so prevention is mad The most effective measure of dog disease is timely vaccine inoculation. Currently, be both at home and abroad the protein formulation purified for the rabies vacciness of the mankind, due to a lack of corresponding adjuvant, first It is secondary it is immune need to inject 3-5 needle, take one month.As for animal rabies vaccine, import inactivated vaccine have using it is safe, be easy to The advantages such as preservation, pollution-free danger.Although China's approved several moneys inactivated vaccines with independent intellectual property rights at present, because The factors such as higher of production-scale limitation and production cost, these inactivated vaccines hair more backward for Asia and African economy Price is too high for area in exhibition, limits them in the use of developing country, and most of economically developed city is still Preferred import inactivated vaccine.Domestic inactivated vaccine needs for animals further reduce the cost. Summary of the invention The defects of higher the technical problem to be solved by the present invention is to overcome existing vaccine cost and deficiency, provide Artesunate As application of the immunologic adjuvant in preparation rabies vacciness. The object of the present invention is to provide Artesunate (referred to as (ART)) as active constituent in preparation rabies vacciness adjuvant In application. By ART and hydrophobia strain mixed immunity mouse, immune in mouse of enhancing inactivation hydrophobin is answered It answers.And the recruitment evaluation of vaccine after identifying and mixing with vaccine, experimental result hair are further carried out as vaccine adjuvant to ART Existing, Artesunate can significantly increase the immunogenicity of rabies vacciness, can be used as new semple type rabies vaccine candidate adjuvant. In one embodiment of this invention, the Artesunate is as sole active agent. The present invention also provides a kind of rabies vacciness adjuvant, the rabies vacciness adjuvant includes Artesunate. In one embodiment of this invention, the Artesunate is as sole active agent. The present invention also provides application of the Artesunate in preparation rabies vacciness, and the Artesunate is as adjuvant. The present invention also provides a kind of vaccine compositions, and it includes the hydrophobin strains and Artesunate of inactivation. In one embodiment of this invention, the hydrophobin strain of the inactivation is selected from CVS-11 strain, rHEP-dG poison Strain, SAD plants, CTN-1 plants, PV plants, at least one of FluryLEP plants.Certainly, above-mentioned strain, all rabies diseases are not limited to Poison strain is suitable for the present invention. In one embodiment of this invention, in the vaccine composition hydrophobin strain and Artesunate amount ratio It is 0.9 × 105~1.1 × 105The μ of FFU:120~130 g. In one embodiment of this invention, the content of hydrophobin strain is 1.0 × 10 in the vaccine composition5~ 1.1×105The μ of FFU:120~130 g. In one embodiment of this invention, the dosage of Artesunate is 5 μ g/g the weight of animals in the vaccine composition.It is green The dosage of artemisic succinate is determined according to the weight of animals such as mouse, and by taking mouse as an example, actual use concentration is 5 μ g/g mouse weights, If every mouse weight is about 25g, the dosage of Artesunate is about 125 μ g. In one embodiment of this invention, further include dimethyl sulfoxide (DMSO), other solvents can also be used, DMSO exists When dissolving the reagent of some good water solubilities, solute effect is more preferable. In one embodiment of this invention, Artesunate (g) in the vaccine composition: dimethyl sulfoxide (mL)=1:(8 ~12), preferably 1:10. It in one embodiment of this invention, further include PBS buffer solution.PBS buffer solution has effects that physiological saline, in stabilization More advantageous, pH 7.20-7.40 in terms of albumen. In one embodiment of this invention, by volume, Artesunate in the vaccine composition: PBS buffer solution=1: (90~110), preferably 1:100. The present invention also provides application of the Artesunate in preparation rabies vacciness.The rabies vacciness is for preventing or controlling Treat people or the rabies of other animals. Optionally, the Artesunate is as adjuvant. Term " adjuvant " is the pharmacy or immunological reagent or composition for changing other agent efficacies, refer in a broad sense from Body does not provide wide spectrum substance that is immune, but can increasing the immunogenicity of the antigen of co-administration.Adjuvant can be added to vaccine In, increase the quantity and lasting protection of antibody by increasing immune response, to reduce the external of injection to the maximum extent Substance.Adjuvant can also be used for improving the effect of vaccine, be changed by helping to the immune anti-of certain types of immune system cell It answers, for example, according to the purpose of vaccine, by activating T cell rather than the B cell of secretory antibody.Therefore, adjuvant can be advantageously Adjust cytokine-expressing/secretion, antigen presentation, type of immune response etc..In the present invention, the situation of the term refers to work For the compound or composition of the carrier or auxiliary substance of immunogene and/or other drugs reactive compound. Wherein above-mentioned " antigen ", which is typically meant that, can be identified by immune system and can for example be adapted to by being formed to be used as Property immune response a part antibody or antigen specific T-cell come trigger antigen specific immune reaction substance.Antigen It is divided into two classes: comlete antigen and incomplete antigen according to property.Comlete antigen (complete antigen) abbreviation antigen, is one The existing immunogenicity of class, and have immunoreactive substance, such as most protein, bacterium, virus, bacterial exotoxin and intestines poison Element etc..Incomplete antigen, that is, haptens (hapten) is that only have immunoreactivity, and the substance of non-immunogenicity, such as absolutely mostly The hydrolysate and all lipoids of number polysaccharide (capsular polysaccharide of such as pneumococcus), capsular polysaccharide. The invention has the following advantages: Present invention firstly provides artemisinin derivative Artesunate (ART) is used as rabies vacciness adjuvant. The present invention passes through experimental studies have found that artemisinin derivative Artesunate (ART) can be shown as rabies vacciness adjuvant The immunogenicity for writing enhancing rabies vacciness, can be used as new semple type rabies vaccine candidate adjuvant. The Artesunate (ART) of vaccine effect studies have shown that relatively low-dose of the invention can promote exempting from for rabies vacciness Epidemic disease effect can reduce the cost of production vaccine. Vaccine effect studies have shown that artemisinin derivative Artesunate (ART) of the invention is used as rabies vacciness adjuvant Better protection can be generated. Detailed description of the invention Fig. 1 is shown as a kind of chemical formula of artemisinin derivative Artesunate (ART). Fig. 2, which is shown as ART, influences statistical chart to KM mouse weight, while setting up PBS control group. Peripheral blood anti-rabies virus neutralizing antibody water after mouse is immunized in the CVS-11 that Fig. 3 is shown as combining ART inactivation Flat statistical chart, while setting up PBS control group (P < 0.05 *). Peripheral blood anti-rabies virus neutralizing antibody water after mouse is immunized in the rHEP-dG that Fig. 4 is shown as combining ART inactivation Flat statistical chart, while setting up PBS control group (P < 0.05 *). Fig. 5 is shown as the survival rate statistical chart of CVS-11 attack mouse after ART is immunized mouse 14 days as vaccine adjuvant. Specific embodiment The present invention is further illustrated below in conjunction with Figure of description and specific embodiment, but embodiment is not to the present invention It limits in any form.Unless stated otherwise, the present invention uses reagent, method and apparatus routinely try for the art Agent, method and apparatus. Unless stated otherwise, following embodiment agents useful for same and material are commercially available. Currently, the World Health Organization is recommended to use inactivation rabies vacciness according to its safety, in order to develop it is more effective and Cheaper inactivated vaccine, we, which can take, improves the means such as virus titer or the better adjuvant of searching. Fig. 1 is shown as the chemical formula of artemisinin derivative Artesunate (ART) used by following embodiment, Artesunate (ART) No. CAS is 88495-63-0, molecular formula: C19H28O8, molecular weight: 384.42, No. EINECS: 618-170-5. Artesunate used in following embodiment is purchased from TCI AmericaPortland company (Tokyo chemical conversion industry Co., Ltd.). Artemisinin derivative Artesunate (ART) adjuvant in following embodiment, is the CVS-11 or rHEP-dG with inactivation Strain is mixed with ART, forms rabies virus vaccine. Specifically: ART is initially dissolved in DMSO, and the CVS-11 in PBS with inactivation is dissolved in when then using in vivo Or rHEP-dG hydrophobin mixing.According to Artesunate (g): DMSO (mL)=1:10 ratio, the i.e. Artesunate of 1g are molten In 10mL DMSO, the Artesunate being then dissolved in DMSO is redissolved in PBS buffer solution solution, Artesunate and PBS The volume ratio of buffer is 1:100, and PBS buffer solution is phosphate buffer, pH 7.2-7.4. Use the ART as adjuvant, rabies vacciness induction can be promoted to generate in higher anti-rabies virus and anti- Body, and better protecting effect is generated, reduce the cost of Canine vaccine. Specifically, in the immunologic adjuvant, Artesunate is the dosage and 1.0 × 10 by 5 μ g/g mouse weights5FFU inactivation CVS-11 or rHEP-dG mixing, by right leg gastrocnemius intramuscular injection be immunized mouse after collect peripheral blood, utilize neutralize experiment Study anti-rabies virus neutralize antibody titers. In addition, artemisinin derivative Artesunate (ART) also exists in the application as vaccine adjuvant or in terms of preparing vaccine Within protection scope of the present invention. Artemisinin derivative Artesunate (ART) is initially dissolved in DMSO, is dissolved in PBS when then using in vivo In, it is used after being mixed with CVS-11 the or rHEP-dG hydrophobin of inactivation.The immunologic adjuvant Artesunate is by 5 μ g/g Dosage is mixed with the CVS-11 of inactivation or rHEP-dG, collects serum after mouse is immunized by right leg gastrocnemius intramuscular injection, is used Neutralize experiment detection anti-rabies virus neutralize antibody titers.The present invention is also to ART side effect, ART Adjuvanted vaccines immunogenicity It is studied with the biological characteristics such as malicious protection are attacked, to assess the safety and effect of its as vaccine adjuvant.The results show that ART will not generate significant side effect as new vaccine adjuvant in Mice Body, and ART can significantly increase vaccine as adjuvant Immunogenicity promotes vaccine-induced body to generate the anti-rabies virus neutralizing antibody with Vaccine effectiveness, can preferably protect Protect the attack that body resists lethal rabies virus. In terms of specific research method, the present invention utilizes immunology the relevant technologies, has studied in Mice Body ART as novel The recruitment evaluation of vaccine adjuvant. Embodiment 1 The research that novel rabies virus vaccine adjuvant ART influences mouse weight SPF grade Kunming (KM) mouse of 3-4 week old is divided into 2 groups, i.e. ART group and PBS control group, every group comprising 6 small Mouse.ART is injected with the dosage of 5 μ g/g by the right leg gastrocnemius muscle of mouse, and control group injects equivalent PBS.It is every after administration The weight of its detection mouse, monitors 15 days altogether.By the weight before respectively injecting on the weight ratio of all mouse, weight ratio is studied Example situation of change.As shown in Figure 2, the results showed that, ART not will lead to treatment mouse weight and mitigate, this is similar to PBS treatment.More Importantly, there is not abnormal symptom in treatment mouse.Therefore, the ART treatment that dosage is 5 μ g/g is safe to mouse. Embodiment 2 Artesunate (ART) in the intracorporal immunogenicity of KM mouse and attacks malicious Protective strategy to rabies vacciness 1, experimental method CVS-11 and rHEP-dG are inactivated with UV respectively.Then ART is mixed with the CVS-11 of inactivation or rHEP-dG, PBS is used as vehicle control.The SPF grade kunming mouse of 6~7 week old is divided into 4 groups, i.e., ART+CVS-11 group, PBS+CVS-11 group, ART+rHEP-dG group and PBS+rHEP-dG control group, every group includes 6 mouse.The right leg gastrocnemius injection of every mouse of experimental group 1.0×105The hydrophobin of FFU inactivation and the mixture of ART, the volume of mixture are 200 μ L, and ART's contains in mixture Measuring is 5 μ g ART/g mouse weights, Artesunate (g): dimethyl sulfoxide (mL)=1:10, by volume, Artesunate: PBS Buffer=1:100, control group intramuscular injection penetrate 1.0 × 105The hydrophobin of FFU inactivation and PBS mixture.7th after immune It and the 14th day acquisition peripheral blood, and by fluorescence antibody virus neutralization (FAVN) testing inspection serum anti-rabies virus And antibody level, rabies standard serum are purchased from the World Health Organization (WHO), detection method is in strict accordance with world animal health Organize the standard practice instructions of (World Organisation for Animal Health, OIE). 2, experimental result As shown in Figure 3, the results showed that, the hydrophobin that mouse generates is immunized with the CVS-11 joint ART of inactivation and neutralizes Antibody level is significantly higher than PBS control group.As shown in figure 4, the mad dog that mouse generates is immunized with the rHEP-dG joint ART of inactivation Sick virucidin's level is significantly higher than PBS control group. Fig. 3 and Fig. 4's the result shows that, when ART is applied to rabies vacciness as adjuvant, it is not limited to a certain specific Inactivation hydrophobin strain, but can be adapted for the hydrophobin strain of various inactivations. 3, further, in order to verify after mouse obtains high level immunity whether there is protection to strong virus attack, In CVS-11 strain living is passed through intramuscular injection infecting mouse by 14d after immune, while being arranged without immune rabies vacciness Control group, the morbidity and death condition of continuous 3 weeks observation mouse, records survival rate daily.As shown in Figure 5, the results showed that, it uses ART as adjuvant mouse than there is higher survival rate with the mouse of PBS control. The above results show that artemisinin derivative Artesunate (ART) enhances inactivation rabies epidemic disease when being used as adjuvant The immune response of seedling. The above embodiment is a preferred embodiment of the present invention, but embodiments of the present invention are not by above-described embodiment Limitation, other any changes, modifications, substitutions, combinations, simplifications made without departing from the spirit and principles of the present invention, It should be equivalent substitute mode, be included within the scope of the present invention. Claims (9) Hide Dependent 1. application of the Artesunate as active constituent in preparation rabies vacciness adjuvant. 2. rabies vacciness adjuvant according to claim 1, which is characterized in that the Artesunate as sole active at Point. 3. a kind of rabies vacciness adjuvant, which is characterized in that the rabies vacciness adjuvant includes Artesunate. 4. rabies vacciness adjuvant according to claim 3, which is characterized in that Artesunate is as sole active agent. 5. application of the Artesunate in preparation rabies vacciness, which is characterized in that the Artesunate is as adjuvant. 6. a kind of vaccine composition, which is characterized in that it includes the hydrophobin strains and Artesunate of inactivation. 7. vaccine composition according to claim 6, which is characterized in that the hydrophobin strain of the inactivation is selected from At least one of CVS-11 strain, rHEP-dG strain. 8. vaccine composition according to claim 6, which is characterized in that hydrophobin strain in the vaccine composition Amount ratio with Artesunate is 0.9 × 105~1.1 × 105The μ of FFU:120~130 g. 9. vaccine composition according to claim 8, which is characterized in that hydrophobin strain in the vaccine composition Amount ratio with Artesunate is 1.0 × 105~1.1 × 105The μ of FFU:120~130 g. Patent Citations (4) Publication numberPriority datePublication dateAssigneeTitle CN1758905A *2003-02-122006-04-12乔治敦大学Use of artemisinin for treating tumors induced by oncogenic viruses and for treating viral infections WO2010105096A2 *2009-03-112010-09-16University Of MassachusettsModulation of human cytomegalovirus replication by micro-rna 132 (mir132), micro-rna 145 (mir145) and micro-rna 212 (mir212) WO2014124430A1 *2013-02-112014-08-14Emory UniversityNucleotide and nucleoside therapeutic compositions and uses related thereto CN109675027A *2017-10-182019-04-26辽宁成大生物股份有限公司A kind of rabies vacciness adjuvant, vaccine composition and its application Family To Family Citations * Cited by examiner, † Cited by third party Non-Patent Citations (2) Title EGERUAN B. IMOUKHUEDE等: "LOW-LEVEL MALARIA INFECTIONS DETECTED BY A SENSITIVE POLYMERASE CHAIN REACTION ASSAY AND USE OF THIS TECHNIQUE IN THE EVALUATION OF MALARIA VACCINES IN AN ENDEMIC AREA", 《AMERICAN JOURNAL OF TROPICAL MEDICINE AND HYGIENE》 * 李小雯等: "青蒿琥酯抗病毒作用的研究进展", 《临床医药文献杂志》 * * Cited by examiner, † Cited by third party Cited By (1) Publication numberPriority datePublication dateAssigneeTitle CN114983999A *2022-06-092022-09-02四川大学New application and verification method of artemisinin and derivatives thereof Family To Family Citations * Cited by examiner, † Cited by third party, ‡ Family to family citation Similar Documents PublicationPublication DateTitle Hammerberg et al.1978Interaction between Taenia taeniaeformis and the complement system JP2562827B21996-12-11Adjuvant mixture CZ307075B62018-01-03A vaccine for the immunization of an animal against Mycoplasma hyopneumoniae infection KR20180054629A2018-05-24Methods and compositions for immuno-protection against over-the-pathogenic E. coli JP5848243B22016-01-27Immunogenic composition against dengue virus James et al.1988The influence of adjuvant on induction of protective immunity by a non-living vaccine against schistosomiasis. Dhungyel et al.2014Footrot vaccines and vaccination Marcinkiewicz et al.2018Eliminating factor H-binding activity of Borrelia burgdorferi CspZ combined with virus-like particle conjugation enhances its efficacy as a Lyme disease vaccine CN107073097A2017-08-18Double adjuvant vaccine compositions, preparation and use CN107296955B2021-11-23Immunogenic bordetella bronchiseptica compositions Relyveld et al.1983[3] Preparation of vaccines by the action of glutaraldehyde on toxins, bacteria, viruses, allergens, and cells KR0162074B11998-12-01Solutions containing antigen and zinc hydroxide or iron hydroxide as an adjuvant and processes for preparing such solutions KR19980025002A1998-07-06Improved Inactive Vaccine TWI648063B2019-01-21Composition and method for immunization against C. difficile CN110507819A2019-11-29Application of the Artesunate as immunologic adjuvant in preparation rabies vacciness CN100572532C2009-12-23A kind of duck plague vaccine and special strains thereof Grubhofer1995An adjuvant formulation based on N-acetylglucosaminyl-N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine with dimethyldioctadecylammonium chloride and zinc-L-proline complex as synergists Sampath et al.2005An immunogenicity study of a newly introduced purified Vero cell rabies vaccine (Abhayrab) manufactured in India Hosty et al.1959Human antirabies gamma globulin Panse et al.1964Passive immunity in experimental cholera CN110179975B2021-01-08Vegetable oil vaccine adjuvant and preparation method and application thereof CN101717779B2012-02-01Fusion protein suitable for anthrax antitoxin and vaccines WO2016036503A12016-03-10Antigen compositions and methods of use for treating extraintestinal pathogenic e. coli infections DK2376113T32014-12-08PREPARATIONS AND DOSAGE REGIMES WHICH INCLUDES A CLOSTRIDIUM VACCINE AND levamisole US6905712B22005-06-14Vaccine adjuvants comprising ginseng plant extract and added aluminum salt Priority And Related Applications Priority Applications (1) ApplicationPriority dateFiling dateTitle CN201910745298.1A2019-08-132019-08-13Application of artesunate as immunologic adjuvant in preparation of rabies vaccine Applications Claiming Priority (1) ApplicationFiling dateTitle CN201910745298.1A2019-08-13Application of artesunate as immunologic adjuvant in preparation of rabies vaccine https://patents.google.com/patent/CN110507819A/en 青蒿琥酯作为免疫佐剂在制备狂犬病疫苗中的应用 技术领域 本发明属于分子生物免疫学领域。更具体地，涉及青蒿琥酯作为免疫佐剂在制备狂犬病疫苗中的应用。 背景技术 狂犬病病毒(Rabies virus，RABV)是引起以侵染中枢神经系统为特点的烈性人兽共患传染病狂犬病的病原，一旦发病，致死率高达100％。我国是狂犬病的高发区，发病人数仅次于印度，高居世界第二位。随着家养宠物的增加，我国人间狂犬病的控制和防治依然任重道远。然而狂犬病致病机理至今还不完全清楚，也没有治疗狂犬病的特效药，所以预防狂犬病最有效的措施是及时接种疫苗。 目前，国内外用于人类的狂犬病疫苗为纯化的蛋白制剂，因缺乏相应的佐剂，第一次免疫需注射3-5针，需时一个月。至于动物狂犬病疫苗，进口灭活疫苗具有使用安全、易于保存、无污染危险等优势。我国目前虽然已批准了几款具有自主知识产权的灭活疫苗，但因生产规模的限制和生产成本的偏高等因素，这些灭活疫苗对于亚洲和非洲经济较落后的发展中地区来说价格太高，限制了它们在发展中国家的使用，而大部分经济发达的城市仍然首选进口灭活疫苗。国产兽用灭活疫苗需要进一步降低成本。 发明内容 本发明要解决的技术问题是克服现有疫苗成本较高等缺陷和不足，提供青蒿琥酯作为免疫佐剂在制备狂犬病疫苗中的应用。 本发明的目的是提供青蒿琥酯(简称(ART))作为活性成分在制备狂犬病疫苗佐剂中的应用。 将ART与狂犬病毒疫苗株混合免疫小鼠，增强灭活狂犬病病毒在小鼠中的免疫应答。并进一步对ART作为疫苗佐剂进行鉴定以及与疫苗混合后疫苗的效果评估，实验结果发现，青蒿琥酯可显著增强狂犬病疫苗的免疫原性，可以作为新型狂犬病疫苗候选佐剂。 在本发明的一实施例中，所述青蒿琥酯作为唯一活性成分。 本发明还提供一种狂犬病疫苗佐剂，所述狂犬病疫苗佐剂包含青蒿琥酯。 在本发明的一实施例中，所述青蒿琥酯作为唯一活性成分。 本发明还提供青蒿琥酯在制备狂犬病疫苗中的应用，所述青蒿琥酯作为佐剂。 本发明还提供一种疫苗组合物，其包含灭活的狂犬病病毒毒株和青蒿琥酯。 在本发明的一实施例中，所述灭活的狂犬病病毒毒株选自CVS-11毒株、rHEP-dG毒株、SAD株、CTN-1株、PV株、FluryLEP株中的至少一种。当然，不限于上述毒株，所有狂犬病病毒毒株均适用于本发明。 在本发明的一实施例中，所述疫苗组合物中狂犬病病毒毒株与青蒿琥酯的用量比为0.9×105～1.1×105FFU：120～130μg。 在本发明的一实施例中，所述疫苗组合物中狂犬病病毒毒株的含量为1.0×105～1.1×105FFU：120～130μg。 在本发明的一实施例中，所述疫苗组合物中青蒿琥酯的用量为5μg/g动物体重。青蒿琥酯的用量是根据小鼠等动物体重确定，以小鼠为例，实际使用浓度为5μg/g小鼠体重，如果每只小鼠体重约为25g，那么，青蒿琥酯的用量约为125μg。 在本发明的一实施例中，还包括二甲基亚砜(DMSO)，也可以采用其他溶剂，DMSO在溶解一些水溶性好的试剂时，溶解效果更好。 在本发明的一实施例中，所述疫苗组合物中青蒿琥酯(g)：二甲基亚砜(mL)＝1：(8～12)，优选为1:10。 在本发明的一实施例中，还包括PBS缓冲液。PBS缓冲液具有生理盐水功效，在稳定蛋白方面更具有优势，pH为7.20-7.40。 在本发明的一实施例中，按体积计，所述疫苗组合物中青蒿琥酯：PBS缓冲液＝1：(90～110)，优选为1：100。 本发明还提供青蒿琥酯在制备狂犬病疫苗中的应用。该狂犬病疫苗用于预防或治疗人或其他动物的狂犬病。 可选地，所述青蒿琥酯作为佐剂。 术语“佐剂”是改变其他药剂功效的药学或免疫学试剂或组合物，在广义上是指自身不提供免疫，但能够增加共同施用的抗原的免疫原性的广谱物质。佐剂可以添加到疫苗中，通过增加免疫应答来增加抗体的数量和持久的保护，从而最大限度地减少注射的外来物质。佐剂也可用于提高疫苗的效力，通过帮助改变对特定类型的免疫系统细胞的免疫反应，例如，根据疫苗的目的，通过激活T细胞而不是分泌抗体的B细胞。因此，佐剂可以有利地调节细胞因子表达/分泌、抗原呈递、免疫应答的类型等。在本发明中，该术语的情形是指作为免疫原和/或其他药物活性化合物的载体或辅助物质的化合物或组合物。 其中上述“抗原”典型地是指可以由免疫系统识别并能够例如通过形成作为适应性免疫应答的一部分的抗体或抗原特异性T-细胞来触发抗原特异性免疫反应的物质。抗原根据性质分为两类：完全抗原和不完全抗原。完全抗原(complete antigen)简称抗原，是一类既有免疫原性，又有免疫反应性的物质，如大多数蛋白质、细菌、病毒、细菌外毒素和肠毒素等。不完全抗原即半抗原(hapten)是只具有免疫反应性，而无免疫原性的物质，如绝大多数多糖(如肺炎球菌的荚膜多糖)、荚膜多糖的水解产物和所有的类脂等。 本发明具有以下有益效果： 本发明首次提出将青蒿素衍生物青蒿琥酯(ART)作为狂犬病疫苗佐剂。 本发明通过实验研究发现青蒿素衍生物青蒿琥酯(ART)作为狂犬病疫苗佐剂能显著增强狂犬病疫苗的免疫原性，可以作为新型狂犬病疫苗候选佐剂。 本发明的疫苗效果研究显示，较低剂量的青蒿琥酯(ART)能促进狂犬病疫苗的免疫效果，可以降低制作疫苗的成本。 本发明的疫苗效果研究显示，青蒿素衍生物青蒿琥酯(ART)作为狂犬病疫苗佐剂能产生更好的保护力。 附图说明 图1显示为一种青蒿素衍生物青蒿琥酯(ART)的化学式。 图2显示为ART对KM小鼠体重影响统计图，同时设立PBS对照组。 图3显示为将ART联合灭活的CVS-11免疫小鼠后外周血抗狂犬病病毒中和抗体水平统计图，同时设立PBS对照组(*P<0.05)。 图4显示为将ART联合灭活的rHEP-dG免疫小鼠后外周血抗狂犬病病毒中和抗体水平统计图，同时设立PBS对照组(*P<0.05)。 图5显示为ART作为疫苗佐剂免疫小鼠14天后CVS-11攻击小鼠的存活率统计图。 具体实施方式 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。 除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。 目前，世界卫生组织根据其安全性推荐使用灭活狂犬病疫苗，为了开发更有效和更便宜的灭活疫苗，我们可以采取提高病毒滴度或寻找更好的佐剂等手段。 图1显示为以下实施例所采用的青蒿素衍生物青蒿琥酯(ART)的化学式，青蒿琥酯(ART)的CAS号为88495-63-0，分子式：C19H28O8，分子量：384.42，EINECS号：618-170-5。 以下实施例中所使用的青蒿琥酯购于TCI AmericaPortland公司(东京化成工业株式会社)。 以下实施例中的青蒿素衍生物青蒿琥酯(ART)佐剂，是以灭活的CVS-11或rHEP-dG毒株与ART混合，形成狂犬病病毒疫苗。 具体地：ART首先溶解在DMSO中，然后在体内使用时溶解在PBS中与灭活的CVS-11或rHEP-dG狂犬病病毒混合。按照青蒿琥酯(g)：DMSO(mL)＝1:10的比例，即1g的青蒿琥酯溶解在10mL DMSO中，然后将溶解在DMSO中的青蒿琥酯再溶解到PBS缓冲液中，青蒿琥酯与PBS缓冲液的体积比为1:100，PBS缓冲液即为磷酸盐缓冲液，pH为7.2-7.4。 使用该ART作为佐剂，能够促进狂犬病疫苗诱导产生更高的抗狂犬病病毒中和抗体，且产生更好的保护效果，降低了犬用疫苗的成本。 具体地，该免疫佐剂中，青蒿琥酯是按5μg/g小鼠体重的剂量与1.0×105FFU灭活的CVS-11或rHEP-dG混合，通过右腿腓肠肌肌内注射免疫小鼠后收集外周血，利用中和实验研究抗狂犬病病毒中和抗体效价。 另外，青蒿素衍生物青蒿琥酯(ART)在作为疫苗佐剂或制备疫苗方面的应用，也在本发明的保护范围之内。 青蒿素衍生物青蒿琥酯(ART)首先溶解在DMSO中，然后在体内使用时溶解在PBS中，与灭活的CVS-11或rHEP-dG狂犬病病毒混合后使用。该免疫佐剂青蒿琥酯是按5μg/g的剂量与灭活的CVS-11或rHEP-dG混合，通过右腿腓肠肌肌内注射免疫小鼠后收集血清，采用中和实验检测抗狂犬病病毒中和抗体效价。本发明还对ART副作用、ART佐剂疫苗免疫原性和攻毒保护力等生物学特性进行研究，以评估其作为疫苗佐剂的安全性和效果。结果显示，ART作为新型疫苗佐剂在小鼠体内不会产生显著的副作用，ART作为佐剂能显著增强疫苗的免疫原性，促进疫苗诱导机体产生具有保护效力的抗狂犬病病毒中和抗体，能够更好的保护机体抵抗致死性狂犬病病毒的攻击。 具体研究方法方面，本发明利用免疫学相关技术，研究了在小鼠体内ART作为新型疫苗佐剂的效果评估。 实施例1 新型狂犬病病毒疫苗佐剂ART对小鼠体重影响的研究 将3-4周龄的SPF级昆明(KM)小鼠分为2组，即ART组和PBS对照组，每组包含6只小鼠。ART以5μg/g的剂量通过小鼠右腿腓肠肌肌肉进行注射，对照组注射等量PBS。给药后每天检测小鼠的体重，一共监测15天。将所有小鼠的体重比上各自注射前的体重，研究体重比例变化情况。如图2所示，结果表明，ART不会导致治疗小鼠体重减轻，这与PBS治疗相似。更重要的是，治疗小鼠没有出现异常症状。因此，剂量为5μg/g的ART治疗对小鼠是安全的。 实施例2 青蒿琥酯(ART)对狂犬病疫苗在KM小鼠体内的免疫原性及攻毒保护研究 1、实验方法 分别将CVS-11和rHEP-dG用UV灭活。然后将ART与灭活的CVS-11或rHEP-dG混合，PBS用作佐剂对照。6～7周龄的SPF级昆明系小鼠分为4组，即ART+CVS-11组、PBS+CVS-11组、ART+rHEP-dG组和PBS+rHEP-dG对照组，每组包含6只小鼠。实验组每只小鼠右腿腓肠肌注射1.0×105FFU灭活的狂犬病病毒和ART的混合物，混合物的体积为200μL，混合物中ART的含量为5μg ART/g小鼠体重，青蒿琥酯(g)：二甲基亚砜(mL)＝1：10，按体积计，青蒿琥酯：PBS缓冲液＝1：100，对照组肌注射1.0×105FFU灭活的狂犬病病毒和PBS混合物。在免疫后第7天和第14天采集外周血，并且通过荧光抗体病毒中和(FAVN)试验检测血清抗狂犬病病毒中和抗体水平，抗狂犬病标准血清购自世界卫生组织(WHO)，检测方法严格按照世界动物卫生组织(World Organisation for Animal Health,OIE)的标准操作规程。 2、实验结果 如图3所示，结果表明，用灭活的CVS-11联合ART免疫小鼠产生的狂犬病病毒中和抗体水平显著高于PBS对照组。如图4所示，用灭活的rHEP-dG联合ART免疫小鼠产生的狂犬病病毒中和抗体水平显著高于PBS对照组。 图3和图4的结果表明，ART作为佐剂应用于狂犬病疫苗时，并不局限于某一种特定的灭活狂犬病病毒毒株，而是可以适用于各种灭活的狂犬病病毒毒株。 3、进一步地，为了验证小鼠获得高水平免疫力后是否具有对强毒攻击的保护，在免疫后第14d将活的CVS-11毒株通过肌肉注射感染小鼠，同时设置没有免疫狂犬病疫苗的对照组，连续3周观察小鼠的发病及死亡情况，每天记录存活率。如图5所示，结果表明，用ART作为佐剂的小鼠比用PBS对照的小鼠具有更高的存活率。 上述结果表明，青蒿素衍生物青蒿琥酯(ART)在用作佐剂时增强了灭活狂犬病疫苗的免疫应答。 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。 Claims (9) 1.青蒿琥酯作为活性成分在制备狂犬病疫苗佐剂中的应用。 2.根据权利要求1所述的狂犬病疫苗佐剂，其特征在于，所述青蒿琥酯作为唯一活性成分。 3.一种狂犬病疫苗佐剂，其特征在于，所述狂犬病疫苗佐剂包含青蒿琥酯。 4.根据权利要求3所述的狂犬病疫苗佐剂，其特征在于，青蒿琥酯作为唯一活性成分。 5.青蒿琥酯在制备狂犬病疫苗中的应用，其特征在于，所述青蒿琥酯作为佐剂。 6.一种疫苗组合物，其特征在于，其包含灭活的狂犬病病毒毒株和青蒿琥酯。 7.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其特征在于，所述灭活的狂犬病病毒毒株选自CVS-11毒株、rHEP-dG毒株中的至少一种。 8.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物中狂犬病病毒毒株与青蒿琥酯的用量比为0.9×105～1.1×105FFU：120～130μg。 9.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物中狂犬病病毒毒株与青蒿琥酯的用量比为1.0×105～1.1×105FFU：120～130μg。 Patent Citations (4) Publication numberPriority datePublication dateAssigneeTitle CN1758905A *2003-02-122006-04-12乔治敦大学青蒿素在治疗致癌病毒诱导的肿瘤和治疗病毒感染中的应用 WO2010105096A2 *2009-03-112010-09-16University Of MassachusettsModulation of human cytomegalovirus replication by micro-rna 132 (mir132), micro-rna 145 (mir145) and micro-rna 212 (mir212) WO2014124430A1 *2013-02-112014-08-14Emory UniversityNucleotide and nucleoside therapeutic compositions and uses related thereto CN109675027A *2017-10-182019-04-26辽宁成大生物股份有限公司一种狂犬病疫苗佐剂、疫苗组合物及其应用 Family To Family Citations * Cited by examiner, † Cited by third party Non-Patent Citations (2) Title EGERUAN B. IMOUKHUEDE等: "LOW-LEVEL MALARIA INFECTIONS DETECTED BY A SENSITIVE POLYMERASE CHAIN REACTION ASSAY AND USE OF THIS TECHNIQUE IN THE EVALUATION OF MALARIA VACCINES IN AN ENDEMIC AREA", 《AMERICAN JOURNAL OF TROPICAL MEDICINE AND HYGIENE》 * 李小雯等: "青蒿琥酯抗病毒作用的研究进展", 《临床医药文献杂志》 * * Cited by examiner, † Cited by third party Cited By (1) Publication numberPriority datePublication dateAssigneeTitle CN114983999A *2022-06-092022-09-02四川大学一种青蒿素及其衍生物的新用途、验证方法 Family To Family Citations * Cited by examiner, † Cited by third party, ‡ Family to family citation Similar Documents PublicationPublication DateTitle Hammerberg et al.1978Interaction between Taenia taeniaeformis and the complement system JP2562827B21996-12-11アジュバント混合物 CZ307075B62018-01-03Vakcína pro imunizaci zvířete vůči infekci Mycoplasma hyopneumoniae KR20180054629A2018-05-24장외 병원성 e. 콜리에 대한 면역 보호를 위한 방법 및 조성물 JP5848243B22016-01-27デングウイルスに対する免疫原性組成物 James et al.1988The influence of adjuvant on induction of protective immunity by a non-living vaccine against schistosomiasis. 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The invention relates to effects and application of artemisinin and its derivative in inhibition of platelet-derived growth factor receptor A. Particularly, artemisinin and its derivative directly act on a molecular target platelet-derived growth factor receptor A (PDGFR alpha) of a tumor and combines with PDGFR alpha on a cell membrane to inhibit activation of tyrosine kinase at the intracellular domain of PDGFR alpha, inhibit protein stability of PDGFR alpha, and promote a ubiquitin-dependent proteasome mediated degradation process. The artemisinin and its derivative has dose-dependent cell growth inhibition and migration invasion inhibition effects on PDGFR alpha highly expressed tumor cells, and also can inhibit activation of signaling pathways PI3K/AKT and MAPK/ERK. 本发明涉及青蒿素及其衍生物在抑制血小板衍生生长因子受体A中的作用及其应用，具体地，青蒿素及其衍生物直接作用于肿瘤的分子靶标血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)，与细胞膜上的PDGFRα结合，抑制PDGFRRα胞内段的酪氨酸激酶的活化，抑制PDGFRα的蛋白稳定性，促进泛素依赖的蛋白酶体介导的降解过程，对于高表达PDGFRα的肿瘤细胞具有剂量依赖的细胞生长抑制和迁移侵袭抑制作用，也可以抑制信号通路PI3K/AKT和MAPK/ERK的活化。 Effect and the application thereof in suppressing platelet derived growth factor receptor A of arteannuin and derivant thereof Technical field The present invention relates to biomedicine field, particularly, the present invention relates to effect and the application thereof in suppressing platelet derived growth factor receptor A of arteannuin and derivant thereof. Background technology Herba Artemisiae Annuae has another name called Herba Artemisiae annuae (Artemisia anaua L), belongs to Compositae, is the annual herb plant.Arteannuin is the sesquiterpene lactones class antimalarial agent that China pharmacy worker extracted from the Chinese medicine Herba Artemisiae Annuae in early 1970s.In view of traditional quinine class medicine generally runs into the Drug resistance problem, arteannuin and its derivant have replaced them at present, become antimalarial main flow medicine in the world.An endoperoxide bridge is arranged on the macro ring of arteannuin, under the catalysis of ferrous ion or heme, can emit the free radical centered by carbon.Intracellular protein and nucleic acid are dead after by these free radical alkanisations.Plasmodium colonizes in the erythrocyte, contains in a large number the hemes from hemoglobin, thereby arteannuin easy being activated very, and then plasmodium is killed.Arteannuin and its derivant, as dihydroartemisinine, Artemether, arteether and artesunate etc. has been widely used in malaria treatment, and more artemisinin derivative is developed. The antimalarial active of arteannuin and derivant thereof has obtained universally acknowledged, have rapid-action, drug effect is high, less toxic side effect and other advantages.Except being widely used in malaria treatment, artemisinin-based drug also has other multiple pharmacological effect, as anti-schistosome function, arrhythmia, relieving asthma, effects such as antiendotoxin, antiallergic action, anti-lupus erythematosus, immunosuppressant. Along with deepening continuously to arteannuin and derivatives active research thereof, it is found that, this compounds is inhibited and excellent curative to the growth of kinds of tumor cells, yet its concrete action target spot and coherent signal path and mechanism of action are also indeterminate.Therefore this area presses for and understands the effect in tumor always of arteannuin and derivant thereof. Summary of the invention The purpose of this invention is to provide the effect in suppressing platelet derived growth factor receptor A of arteannuin and derivant thereof. Another object of the present invention provides arteannuin and derivant thereof as the application of platelet derived growth factor receptor A inhibitor/antagonist. Another object of the present invention provides the method for external treatment tumor. In a first aspect of the present invention, provide a kind of arteannuin and derivant thereof for the preparation of suppressing to be selected from down the medicine of group disease or the purposes of medicine sensitizer: PDGFR α positive tumor, vascular conditions or fibrous lesions. In another preference, described PDGFR α positive tumor cell is the positive ovarian cancer cell of PDGFR α or PDGFR α masculine liver cancer cell. At second portion of the present invention, provide the purposes of a kind of arteannuin and derivant thereof, for the preparation of inhibitor or the antagonist of platelet derived growth factor receptor A (PDGFR α). In another preference, described platelet derived growth factor receptor A (PDGFR α) comes from the people. In another preference, described inhibitor or antagonist also are used for: (i) activation of inhibition PDGFR α tyrosine kinase; And/or The protein stability that (ii) suppresses PDGFR α; And/or (iii) promote the degraded of the proteasome mediation that PDGFR α ubiquitin relies on; And/or (vi) suppress the activation of PDGFR α positive tumor cell signal path PI3K/AKT and MAPK/EPK. In another preference, described artemisinin derivative is selected from down group: Artemether, dihydroartemisinine, artesunate, two hydrogen Artemether, arteether etc. In another preference, described artemisinin derivative is dihydroartemisinine. In a third aspect of the present invention, provide a kind of external non-therapeutic ground to suppress the active method of platelet derived growth factor receptor A (PDGFR α), comprise step: with arteannuin and/or artemisinin derivative and cells contacting, thus platelet derived growth factor receptor A (PDGFR α) in inhibition or the antagonism cell. In another preference, described contact is in the presence of arteannuin and/or artemisinin derivative, cultivates described cell. In another preference, described cell comprises tumor cell, preferably comprise PDGFR α positive tumor cell, more preferably comprise the positive ovarian cancer cell of PDGFR α or hepatoma carcinoma cell, as ovarian cancer cell A2780, ovarian cancer cell OVCAR3, hepatoma carcinoma cell Hep3B. In another preference, described method also is used for following at least a kind of application: External non-therapeutic ground suppresses the activation of PDGFR α tyrosine kinase; External non-therapeutic ground suppresses the protein stability of PDGFR α; External non-therapeutic ground promotes the degraded of the proteasome mediation that PDGFR α ubiquitin relies on; External non-therapeutic ground suppresses the activation of signal path PI3K/AKT and MAPK/EPK; With External non-therapeutic suppresses the growth of PDGFR α positive tumor cell. In a fourth aspect of the present invention, a kind of purposes of preparation combination is provided, described preparation combination comprises: (I) contain the preparation of arteannuin and/or artemisinin derivative; With (II) contain the preparation of gemcitabine or carboplatin, The combination of described preparation for the preparation of: (a) pharmaceutical composition or the medicine box of inhibition platelet derived growth factor receptor A; Or (b) prevent and/or treat pharmaceutical composition or the medicine box of tumor. In another preference, described preparation comprises: tablet, capsule, suppository, injection. In another preference, described tumor is PDGFR α positive tumor. In a fifth aspect of the present invention, a kind of method of the PDGFR of preventing and/or treating alpha associated disorders is provided, wherein said disease is relevant with expression excessively or the hyperactivity of PDGFR α, described method comprises step: use arteannuin and/or artemisinin derivative for the object of needs, or use the pharmaceutical composition that contains arteannuin and/or artemisinin derivative. In another preference, described PDGFR alpha associated disorders comprises tumor (PDGFR α positive tumor), as ovarian cancer or hepatocarcinoma. In another preference, PDGFR α positive tumor is the positive ovarian cancer of PDGFR α or PDGFR α masculine liver cancer. In another preference, described using comprises: in the tumor, intravenous injection, oral tablet, lumbar injection etc. In another preference, described object is mammal. In a sixth aspect of the present invention, a kind of method is provided, described method is used in the body or growth, migration and the invasion and attack of the activation of vitro inhibition PDGFR α tyrosine kinase, the protein stability of inhibition PDGFR α, the degraded that promotes the proteasome mediation that PDGFR α ubiquitin relies on, the activation that suppresses signal path PI3K/AKT and MAPK/EPK and/or inhibition PDGFR α positive tumor cell, and described method comprises step: use arteannuin and/or artemisinin derivative for the object of needs. In a seventh aspect of the present invention, a kind of test kit for the ovarian cancer pathological grading is provided, described test kit comprises the reagent that detects in vitro tissue PDGFR alpha expression amount. In should be understood that within the scope of the present invention, above-mentioned each technical characterictic of the present invention and can making up mutually between specifically described each technical characterictic in below (eg embodiment), thus constitute new or optimized technical scheme.As space is limited, this tired stating no longer one by one. Description of drawings Following accompanying drawing is used for explanation specific embodiments of the present invention, and is not used in the scope of the invention that restriction is defined by claims. Fig. 1 shows that PDGFR α can be used as the direct action target of arteannuin and derivant thereof; Wherein, Fig. 1 a is the vitro kinase experiment, the result shows that arteannuin and derivant arteannuin (ART) thereof, dihydroartemisinine (DHA), artesunate (ARM), Artemether (ARS) can suppress the activity of PDGFR α born of the same parents the inner (aa550-end) tyrosine kinase; Fig. 1 b is surface plasma resonance (SPR) experiment, the result shows, dihydroarteannuin (DHA) can mutually combine with PDGFR α bag outer end (aa24-524) albumen, the positive contrast of Suo Lafeini (Sorafenib), known its can be in conjunction with the activity that suppresses PDGFR α; Fig. 1 c is the experiment of biotin-avidin affinity purification, and the result shows that the DHA of labelling biotin can mutually combine with PDGFR α in the A2780 cell, thereby is come out by affinity purification; Fig. 1 d is that area of computer aided is built with pattern and oppositely butt joint experiment (Computer Assisted Homology modeling and docking), the result shows, dihydroarteannuin (DHA) can be fitted to PDGFR α bag outer end PDGF binding site, simultaneously also can be fitted to it and wrap inner ATP-binding site, block its kinase activator; Fig. 1 e-Fig. 1 f shows that dihydroarteannuin can effectively suppress activity and the protein expression of PDGFR α among PDGFR α positive cell A2780 and the OVCAR3, and little to phosphorylation and the protein level influence of PDGFR β; Fig. 1 g-Fig. 1 i shows that dihydroarteannuin can accelerate the protein degradation of PDGFR α, and this process is the proteasome mediation that ubiquitin relies on. Fig. 2 has shown that arteannuin and derivant thereof have growth and the transfer ability of the ovarian cancer cell that suppresses the PDGFRa positive; Wherein, Fig. 2 a shows, after giving medicine irritation 48h, arteannuin and derivant thereof do not have obvious growth to people's normal ovarian epithelial cell IOSE144 and suppress ability, less for the SK-OV3 cytotoxicity, but A2780 and OVCAR3 for the PDGFRa positive have the ability that suppresses more by force, and wherein the effect of arteannuin and dihydroartemisinine is the most remarkable; Fig. 2 b is the cell migration experiment, the result shows, the low concentration short time is handled (12h) ovarian cancer cell, and arteannuin and derivant thereof can suppress the transfer ability of PDGFRa positive cell A2780 effectively, and do not have obvious inhibition ability for the cell SK-OV3 of PDGFRa feminine gender; Fig. 2 c has shown that the dihydroarteannuin of variable concentrations is to the cyto-inhibition of 5 kinds of cell lines (IOSE144, A2780, OVCAR3, OVCAR5, SK-OV3); Fig. 2 d has shown that the dihydroarteannuin of variable concentrations is to the influence of the cell migration of 3 kinds of cell lines (A2780, OVCAR3, SK-OV3); Fig. 2 e has shown that the dihydroarteannuin of variable concentrations is to the influence of the cell invasion of 2 kinds of cell lines (A2780, OVCAR3). Fig. 3 shows that arteannuin and derivant thereof have growth and the transfer ability of the hepatoma carcinoma cell that suppresses the PDGFRa positive; Wherein, Fig. 3 a shows, in the normal hepatic cell line of people (7702 and LO2) and hepatoma cell line (Hep3B, HepG2,7721,7404, LM3,97L, 97M, Huh-7), has only Hep3B high expressed PDGFRa; Fig. 3 b shows that low concentration dihydroarteannuin (3 μ M) (12h) is in short-term handled the Hep3B cell, can significantly suppress its migration and invasive ability; Fig. 3 c is the cell growth experiment, and the result shows that the Hep3B cell of the PDGFRa positive is more responsive for dihydroarteannuin, and other cells are lower for the dihydroarteannuin sensitivity. Fig. 4 shows that dihydroarteannuin can suppress growth and the transfer of mice original position ovarian cancer model; Wherein, Fig. 4 a demonstration dihydroarteannuin is treated mice, and the malignant progression that suppresses ovarian cancer effectively can be arranged; Fig. 4 b shows, compares with matched group, and the situation of the lung cancer metastasis of dihydroarteannuin treatment group mice reduces greatly, and along with the increase of dose, the treatment situation is more good; The two blue and green artemisin of Fig. 4 c demonstration variable concentrations is treated mice, and the situation that send out in the tumor abdominal cavity (lungs, liver, intestinal) obtains obvious suppression; Fig. 4 d is immunohistochemical experiment, and the result shows that its modality process (EMT) of cell that dihydroarteannuin is handled is inhibited; Fig. 4 e is immunoblot experiment, and the result shows that dihydroarteannuin can effectively suppress expression and the phosphorylation of PDGFRa, and downstream signal path PI3K/AKT and MAPK-ERK are suppressed. Fig. 5 has shown the sensitization of arteannuin and derivant and a line chemotherapeutic; Wherein, to be HepG2 and Hep3B cell handle experiment with arteannuin or dihydroarteannuin individual processing or associating gemcitabine to Fig. 1 a, the result shows, gemcitabine acts on HepG2 and Hep3B cell separately, has certain apoptosis facilitation, arteannuin associating gemcitabine all has the effect of remarkable apoptosis facilitation to HepG2 and Hep3B cell, and two medicine association lists reveal synergism; Fig. 5 b shows, DHA and CBP drug combination had the potentiation facilitation to the OVCAR-3 apoptosis after 24 hours, unite the apoptosis rate that apoptosis rate after 500 μ M CBP (1155%) effect is significantly higher than independent usefulness 1 μ M DHA (266%) or 500 μ M CBP (528%) with the DHA of 1 μ M, and surpassed the apoptosis additive effect of two kinds of chemical compounds, be a kind of potentiation, the A2780 cell has shown additive effect to therapeutic alliance; Fig. 5 c shows, when with the DHA coupling, CBP has significantly suppressed the vigor of ovarian cancer cell, when cellular exposure during in 1 μ M CBP and 1 μ M DHA, the survival rate of A2780 cell has just reduced by 69%, OVCAR-3 cell survival and has then reduced 72%, by contrast, it is more insensitive to treatment that the IOSE144 cell then seems, survival rate had only reduced about 28% when two kinds of medicines all share with 1 μ M; Fig. 5 d is hepatoma carcinoma cell Hep3B and the experiment of HepG2 transplanted tumor in nude mice, the result shows, all has antitumor action in arteannuin and the dihydroarteannuin list medicine body, the cancer suppressing action of dihydroarteannuin is better than arteannuin, arteannuin and dihydroarteannuin all can increase the cancer suppressing action of gemcitabine, associating gemcitabine therapeutic effect is better than single medicine, and especially dihydroarteannuin shows significant chemotherapy sensitization; Fig. 5 e is in ovarian cancer cell A2780 and the experiment of OVCAR3 transplanted tumor in nude mice, the result shows, DHA (dosage be 10 with 25mg/kg) causes A2780 heteroplastic transplantation tumor 24% and 41% growth inhibited (comparing with the matched group of giving normal saline) (P＜0.05) respectively, and OVCAR-3 model 14% and 37% tumor growth suppress (P＜0.05); Be suppressed 56% (A2780) and 46% (OVCAR-3) only for the treatment group tumor growth of single CBP, drug combination (25mg/kgDHA) group then all produces 70% tumor growth and suppresses (P＜0.05) in A2780 and OVCAR-3 animal tumor. Fig. 6 shows the expression of PDGFR α and the relation of ovarian cancer pathology rank and transfering state; Wherein, Fig. 6 a shows, compares with the low level ovarian cancer, and in the high-level ovarian cancer case, the expression of tumor cell and Interstitial cell PDGFR α on every side significantly increases; Fig. 6 b is PDGFR α coloration result, and the result shows that in high-level ovarian cancer case, the expression of PDGFR α significantly increases. The specific embodiment The inventor is through extensive and deep research, find the purposes of arteannuin and derivant thereof, inhibitor or antagonist for the preparation of platelet derived growth factor receptor A (PDGFR α), in addition, arteannuin and derivant thereof can also suppress the activation of PDGFR α tyrosine kinase, the protein stability that suppresses PDGFR α, promote the degraded of the proteasome mediation that PDGFR α ubiquitin relies on, suppress the activation of signal path PI3K/AKT and MAPK/EPK, suppress the growth of PDGFR α positive tumor cell, migration and invasion and attack, the sensitizer that can also be used for the treatment of PDGFR α positive tumor.Finished the present invention on this basis. Term Ovarian cancer Ovarian cancer is grave danger of global WomanHealth.In the U.S., ovarian cancer has become women's cancer of the 4th lethal.Though diagnosed 5 annual survival rates of sending out ovarian cancer patients early stage in disease can reach 80%-90%, be diagnosed as the ovarian cancer patients survival rate in late period but only less than 25%, in addition, most of ovarian cancer patients are that ovarian cancer is to late period diagnosing out.The mortality rate many decades in the past of ovarian cancer patients does not have to take place too big change at present, therefore in oncotherapy and prognosis, seek effective therapeutic scheme, strengthening tumor cell is research worker and clinical practice personnel target for a long time to the sensitivity of chemotherapeutics and the drug resistance that overcomes tumor. Hepatocarcinoma Hepatocarcinoma is one of modal malignant tumor, and China is the district occurred frequently of hepatocarcinoma, and its sickness rate has risen to second of malignant tumor.Because the early hepatocarcinoma symptom is not obvious, during therefore the most patient of making a definite diagnosis has been in, late period.The first-selection treatment of primary hepatocarcinoma is excision, and along with the raising for the treatment of technology, 5 years survival rates of postoperative have been increased to 50%-60% at present, but because an excision application diameter is no more than 5cm, the cancer number is no more than 3 small liver cancer.In addition, whether be fit to blood vessel enrichment degree and the individual patient difference that direct excision also depends on the cancer position, these restrictions cause the hepatocarcinoma about 90% to be not suitable for operative treatment.Even can excise hepatocarcinoma, it is that main comprehensive therapy also is necessary that postoperative implements to get involved chemotherapy.Yet at present, rarely have medicine can effectively suppress the growth of hepatocarcinoma and further deterioration, hepatocarcinoma is low to the response rate of traditional chemotherapeutics, the toxic and side effects highly significant, so the slow development of chemotherapy is the main cause of restriction antitumor drug clinical practice.Therefore for chemotherapy of tumors, press for and seek better chemical-therapy synergistic agent and better therapeutic scheme, thereby improve tumor to the sensitivity of chemotherapy, reduce it to the drug resistance of chemotherapy. Platelet derived growth factor and receptor thereof Platelet derived growth factor (Platelet derived growth factor, PDGF) be that a class can be synthesized the somatomedin of justacrine in the extracellular matrix, have cell division, propagation, the migration of multiple tissues such as promoting fibrocyte, smooth muscle cell, the ability of sticking of increase cell, in people's fetal development and normal physiological activity, bringing into play important effect.PDGF activates platelet derived growth factor receptor (PDGFR) with autocrine and paracrine form and plays a role. PDGFR comprises tyrosine kinase receptor PDGFR α and the PDGFR β of two kinds of similar, and wherein the abnormal activation of PDGFR α and multiple disease are closely related, and particularly, the PDGFR relevant disease can be divided three classes: 1. tumor Because PDGFR (particularly PDGFR α) is present in the kinds of tumors, it may be as a new treatment target spot.The generation that has been found that kinds of tumors is relevant with the excessive activation of PDGFR (particularly PDGFR α), as ovarian cancer, glioma, carcinoma of prostate; In addition, in some tumors, exist the sudden change of PDGFR to activate, as the chronic myeloid leukemia of dermatofibrosarcoma protuberans, gastrointestinal stromal tumor, Bcr-Abl feminine gender, hypereosinophilic syndrome etc. 2. vascular conditions Discover, PDGF and PDGFR etc. exist overexpression and excessive activation phenomenon in multiple vascular conditions, as atherosclerosis and restenosis, pulmonary hypertension, retinal vasculopathy etc., the symptom of above-mentioned disease can be effectively alleviated in the activation that suppresses the PDGFR signal path, increases its therapeutic effect. 3. fibrous lesions The PDGF-PDGFR signal path plays an important role in multiple fibrous lesions process, as pulmonary fibrosis, hepatic fibrosis and liver cirrhosis, skin fiber hypertrophy (scleroderma), renal fibrosis, myocardial fibrosis etc., wherein the propagation of the Interstitial cell of PDGF-PDGFR signal path mediation is the common trait of this chronic inflammatory disease. In the above-mentioned three class diseases, the PDGF-PDGFR signal path plays an important role, and wherein PDGFR β has mainly mediated the vascular system pathological changes, and PDGFR α has mainly mediated the pathological changes of Interstitial cell and fibroblast driving.(Johanna Andrae, et al.Role of platelet-derived growth factors in physiology and medicine, Genes Dev.2008; 22:1276-1312; Zhang Xiuhua etc., platelet derived growth factor receptor and tumor. life sciences, Vol.18, No.3 Jun., 2006) Arteannuin and derivant thereof Artemisinine is the sesquiterpene lactones medicine that peroxy-radical is arranged that extracts from the Chinese medicine Artemisia annua L., because arteannuin is complicated macromole, chemical total man worker is difficult to synthetic, therefore mainly is biosynthesis and artificial the extraction at present. The biosynthesis of sesquiterpenoidss such as arteannuin carries out in Cytoplasm, approach belongs to Plant Isoprenoid Metabolic Pathway, can be divided into three goes on foot greatly: form FPP by acetic acid, synthetic sesquiterpene, formation arteannuin again lactonizes, be specially: FPP → 4,11-diene sesquiterpene → artelinic acid → dihydroartemisinic acid → dioxy artelinic acid peroxide → arteannuin. The chemical formula of the artemisinin derivative that arteannuin and this area are several frequently seen is as follows: The application of arteannuin and derivant thereof The invention provides arteannuin and derivant thereof for the preparation of the inhibitor of platelet derived growth factor receptor A (PDGFR α) or the purposes of antagonist. In another preference, arteannuin and derivant thereof also are used for: (i) activation of inhibition PDGFR α tyrosine kinase; And/or The protein stability that (ii) suppresses PDGFR α; And/or (iii) promote the degraded of the proteasome mediation that PDGFR α ubiquitin relies on; And/or (vi) suppress the activation of PDGFR α positive tumor cell signal path PI3K/AKT and MAPK/EPK; And/or (v) suppress growth, migration and the invasion and attack of PDGFR α positive tumor cell; And/or (vi) preparation suppresses medicine or the sensitizer of PDGFR α positive tumor; And/or (vii) medicine or the sensitizer of vascular conditions and fibrous lesions treated in preparation. In a preference of the present invention, provide a kind of external non-therapeutic ground to suppress the active method of platelet derived growth factor receptor A (PDGFR α), comprise step: with arteannuin and/or artemisinin derivative and cells contacting, thus platelet derived growth factor receptor A (PDGFR α) in inhibition or the antagonism cell. Described contact is in the presence of arteannuin and/or artemisinin derivative, cultivates described cell.Cell comprises tumor cell, preferably comprises PDGFR α positive tumor cell, more preferably comprises the positive ovarian cancer cell of PDGFR α or hepatoma carcinoma cell, as ovarian cancer cell A2780, ovarian cancer cell OVCAR3, hepatoma carcinoma cell Hep3B.In another preference, described method also is used for following at least a kind of application: external non-therapeutic ground suppresses the activation of PDGFR α tyrosine kinase; External non-therapeutic ground suppresses the protein stability of PDGFR α; External non-therapeutic ground promotes the degraded of the proteasome mediation that PDGFR α ubiquitin relies on; External non-therapeutic ground suppresses the activation of signal path PI3K/AKT and MAPK/EPK; Growth with external non-therapeutic inhibition PDGFR α positive tumor cell. The present invention also provides a kind of method of the PDGFR of preventing and/or treating alpha associated disorders, wherein said disease is relevant with expression excessively or the hyperactivity of PDGFR α, described method comprises step: use arteannuin and/or artemisinin derivative for the object of needs, or use the pharmaceutical composition that contains arteannuin and/or artemisinin derivative.The PDGFR alpha associated disorders comprises tumor (PDGFR α positive tumor), as ovarian cancer or hepatocarcinoma.In another preference, described using comprises: in the tumor, intravenous injection, oral tablet, lumbar injection etc.Described object is mammal (as the people). Medicament composition and application thereof The present invention also provides medicament composition, and in a preference, described preparation combination comprises: (I) contain the preparation of arteannuin and/or artemisinin derivative; (II) contain the preparation of gemcitabine or carboplatin, The combination of described preparation for the preparation of: (a) suppress pharmaceutical composition or the medicine box of platelet derived growth factor receptor A; Or (b) prevent and/or treat pharmaceutical composition or the medicine box of tumor. Described preparation comprises tablet, capsule, suppository, injection; Described pharmaceutical preparation is used for prevention and treatment PDGFR α positive tumor. Medicament composition of the present invention can be solid or liquid.But solid preparation comprises powder, tablet, pill, capsule, cachet, suppository and dispersible granule, and solid carrier can be one or more materials, and they can be used as diluent, correctives, adhesive, antiseptic, tablet disintegrant or coating material.In powder, carrier is the solid of fine branch, and the active constituent of chemical compound of the present invention and fine branch is present in the mixture.In tablet, this chemical compound mixes with proper proportion with required bonding carrier, and is pressed into required shape and size.Preferentially contain 5 to 70% reactive compounds in powder and the tablet, suitable carrier is magnesium carbonate, magnesium stearate, Talcum, sugar, lactose, pectin, dextrin, starch, gelatin, carboxymethyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, low melting point is cured and cocoa butter etc.Equally, cachet or lozenge, tablet, powder, capsule, pill, cachet and lozenge can be the solid dosage formss that is suitable for oral administration.In order to prepare suppository, can be with the mixture melt of the cured butter oil acid glyceride of low melting point or cocoa butter, and by stirring this reactive compound component is evenly dispersed in wherein, the homogeneous mixture of fusing is poured into allowed its cooling in the sizeable mould then, and solidify thus.The preparation of solution form comprises solution, suspending agent and Emulsion, for example water or aqueous propylene glycol solution.For non-intestinal injecting fluid preparation, can in moisture polyglycol solution, prepare.Being suitable for oral aqueous solution can be by being dissolved in the water active constituent, and adds suitable coloring agent, correctives, emulsifying agent and thickening agent preparation as required.Be suitable for oral aqueous suspensions and can be scattered in by the active constituent with fine branch in the moisture stickum and prepare, as natural or rubber polymer, resin, methylcellulose, Carboxymethyl cellulose sodium and other suspensoids of knowing.These liquid forms comprise solution, suspensoid and Emulsion, and except active constituent, these preparations can contain coloring agent, correctives, stabilizing agent, buffer agent, synthetic or natural sweetener, dispersant, thickening agent and cosolvent etc.This pharmaceutical preparation preferentially is unit dosage forms, in this dosage form, this preparation is subdivided into the unit dose that contains an amount of active constituent, and this unit dose can be the preparation of packing, this packing contains a certain amount of preparation, as tablet, capsule and the powder in bottle or capsule of packing.This unit dosage forms can also be capsule, tablet, cachet or lozenge itself, or can there be any of these powder of the right quantity in the packaged form in it. The amount of active constituent can change according to the effectiveness of concrete application and active constituent in the unit dose formulations, treat for non-human mammal (as mice), can be with 0.01mg to about 0.5g, preferably 0.1 to about 3mg capsule is administered three times every day, and said composition can also contain other compatible therapeutic agents in case of necessity.Treatment for the people, can be according to patient's needs, changed by the chemical compound of sanatory seriousness and use, preferably, beginning is with the smaller dose treatment less than this chemical compound optimal dose, after this, increasing this dosage reaches optimum efficiency in a small amount, for the purpose of making things convenient for, total daily dose can be subdivided into again gradation administration in a day if desired.In a preference of the present invention, the dosage of administration of human is approximately between the 0.1/kg-0.5g/kg. Major advantage of the present invention: (1) arteannuin and derivant thereof can be for the preparation of inhibitor or the antagonisies of platelet derived growth factor receptor A (PDGFR α); (2) arteannuin and derivant thereof can suppress growth, migration and the invasion and attack of the activation of PDGFR α tyrosine kinase, the protein stability of PDGFR α, the activation that suppresses signal path PI3K/AKT and MAPK/EPK, inhibition PDGFR α positive tumor cell; (3) arteannuin and derivant thereof can promote the degraded of the proteasome mediation that PDGFR α ubiquitin relies on; (4) arteannuin and derivant thereof can be used for the sensitizer of PDGFR α positive tumor treatment. Below in conjunction with specific embodiment, further set forth the present invention.Should be understood that these embodiment only to be used for explanation the present invention and be not used in and limit the scope of the invention.The experimental technique of unreceipted actual conditions in the following example, usually according to people such as normal condition such as Sambrook, molecular cloning: laboratory manual (New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) condition described in, or the condition of advising according to manufacturer. Experimental technique and material 1. surface plasma resonance Surface plasma resonance (SPR) is a kind of optical phenomena, can be used to real-time tracking interaction between biomolecule under native state.In the experiment, with recombined human PDGFR α born of the same parents outer ends (Met1-Glu524) albumen, be bonded in biosensor surface, with the dihydroarteannuin solution of variable concentrations with have interactional chemical compound Suo Lafeini and SU11248 solution to inject and the biosensor surface of flowing through with PDGFR α always.Combination between biomolecule causes the increase of biosensor surface quality, causes refractive index to strengthen in same ratio, and the variation of reacting between biomolecule namely is observed, and this reaction is weighed with reacton (RU). 2. cell culture The non-tumorigenic epithelial cell IOSE-144 of people's ovary immortalization and ovarian cancer cell (A2780, OVCAR-3, SK-OV3, OVCAR-5) available from U.S. ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA).All cells requires (RPMI-1640 or DMEM culture fluid add 10% hyclone (GIBCO), 100IU/ml penicillin, 100IU/ml streptomycin) to cultivate in 37 ℃ of incubators of 5%CO2 according to the cultivation of ATCC. 3. cell growth inhibition test Cell growth and propagation inhibition test are by the CCK-8 measuring.Cell with the density cover plant in 3 * 103 every holes of cell in 96 orifice plates.After 12～18 hours, after handling 48 hours with the artemisine compounds of finite concentration gradient (0,1,5,10,25 μ M), add the cells growth activity evaluation after 10 μ L CCK-8 solution carry out drug treating in the every hole of 96 orifice plates, experiment is last by microplate reader (SpectraMax190microplate reader; Molecular Devices, the USA) light absorption (OD value) at measurement 450nm place (every experimental concentration arranges three multiple holes at least, tests triplicate at least at every turn). 4. cell migration, invasion and attack experiment The migration of ovarian cancer cell and invasive ability are by the transwell measuring, the low concentration artemisinin derivative short time (12h) is handled ovarian cancer cell, cell (5 * 104) with similar number is resuspended in the culture medium of serum-free then, plantation is in transwell (when measuring the invasive ability of cell, transwell spreads matrigel in the upper strata) upper strata culturing room.With 10% hyclone culture medium as chemical chemoattractant.Approximately behind the 8-12h, Qian Yi cell is not wiped with cotton swab, the cell of migration is fixed dyeing, and carry out statistical analysis. 5.SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and protein immunoblot analysis DHA with variable concentrations handled cultured cell 24 hours, and collecting cell is also used cell pyrolysis liquid (RIPA buffer #9806, Cell Signaling) cracking.Change in 4 ℃ of centrifugal 15min with 13,000 afterwards, get supernatant and carry out follow-up analyzing and testing.Protein concentration is by test kit (the protein assay kit of Bio-Rad company; Hercules, CA) quantitative Tot Prot.Equal protein is carried out the separation of SDS-PAGE gel electrophoresis on every hole afterwards.Electrophoresis finishes, with the electrophoresis protein band be transferred to the pvdf membrane that methanol activated (Millipore, Bedford, MA) on.After the commentaries on classics film finishes, film seals with 5% skim milk (PBS dissolving), add primary antibodie and two anti-hatching (the BSA configuration with 5%) then, change with albumen development test kit (ECL plus system, Amersham Pharmacia Biotech) development by the protein band differential expression afterwards and analyze. 6. mice original position ovarian cancer heteroplastic transplantation tumor model body internal therapy experiment The female BALB/c (nu/nu) in four to six ages in week and raises in SPF level Animal House in accordance with regulations available from Shanghai Slac Experimental Animal Co., Ltd. (Shanghai Experimental Animal Center).All zoopery operations all obtain the approval of animal Ethics Committee of nutrition institute of the Chinese Academy of Sciences.。General steps is as follows: with the A2780 cell of luciferase labelling, be resuspended in RPMI 1640 culture medium of serum-free.Lumbar injection equivalent cell (～3 * 106 cells/0.2ml) is in the inside, abdominal cavity of mice then.Utilize IVIS Lumina bioluminescence system to monitor the growth of tumor situation in real time, and the body weight of record mice.Inject after 5 days, during according to the fluorescence intensity of tumor mice is divided into treatment group and matched group (every group of 8 mouse).Treatment group medicine DHA be dissolved in Oleum Ricini, ethanol and normal saline mixture (Cremophor EL: Ethanol: Saline=5: 5: 90, v/v/v) in, all medicines all pass through intraperitoneal administration.The dosage of DHA is 10 or the 25mg/kg body weight, and administration frequency is administration every day, rests weekly two days.The matched group injecting normal saline.In therapeutic process, utilize the living imaging system to monitor the growth of tumor situation in real time.After treatment finished, the careful taking-up moved abdominal tumor (removing fat and connective tissue), with PIPA solution (the 100mg tissue adds 1ml RIPA) homogenate.The tumor tissues homogenate liquid that obtains is analyzed requirement of experiment by above-mentioned protein immunoblot and is handled, and carries out protein immunoblot afterwards and detects; Or tumor tissues fixed and immunostaining. Embodiment 1 Arteannuin and derivant thereof suppress its phosphorylation activity directly in conjunction with PDGFR α, promote its degraded Utilize the experiment of PDGFR α vitro kinase, surface plasma resonance, area of computer aided are built with pattern and oppositely advanced persons such as equimolecular pharmacology and biophysics are tested in butt joint biology techniques and means, confirm that artemisinin derivatives can be directly in conjunction with PDGFR α, the receptor tyrosine kinase activity that suppresses PDGFR α, discover that simultaneously dihydroarteannuin can suppress the protein stability of PDGFR α in the PDGFR α positive cell, promote the degradation process that its ubiquitin relies on. Fig. 1 shows that arteannuin and derivant thereof can be directly in conjunction with PDGFR α, and PDGFR α is as the direct target of arteannuin and derivant effect thereof, and can suppress its phosphorylation activity, promotes its degraded.Vitro kinase experiment shows arteannuin and derivant thereof: arteannuin (ART), dihydroartemisinine (DHA), artesunate (ARM), Artemether (ARS) can suppress the activity of born of the same parents the inner (aa550-end) tyrosine kinase of PDGFR α (Fig. 1 a).Surface plasma resonance (SPR) experiment shows that dihydroarteannuin (DHA) can mutually combine with PDGFR α bag outer end (aa24-524) albumen, and Suo Lafeini (Sorafenib) is as positive control, known can be in conjunction with the activity (Fig. 1 b) that suppresses PDGFR α.The DHA of biotin-avidin affinity purification experiment show tags biotin can mutually combine with PDGFR α in the A2780 cell, thereby is come out (Fig. 1 c) by affinity purification.Area of computer aided is built and is oppositely docked experiment (Computer Assisted Homology modeling and docking) experiment and shows that dihydroarteannuin (DHA) can be fitted to PDGFR α bag outer end PDGF binding site with pattern, simultaneously also can be fitted to it and wrap inner ATP-binding site, block its kinase activator (Fig. 1 d).Fig. 1 e-Fig. 1 f has shown that dihydroarteannuin can effectively suppress activity and the protein expression of PDGFR α among PDGFR α positive cell A2780 and the OVCAR3, and little to phosphorylation and the protein level influence of PDGFR β.Fig. 1 g-Fig. 1 i experiment shows that dihydroarteannuin can accelerate the protein degradation of PDGFR α, and this process is the proteasome mediation that ubiquitin relies on. Embodiment 2 Arteannuin and derivant thereof suppress growth and the transfer of the tumor cell of the PDGFR α positive Utilize nude mice original position ovarian cancer heteroplastic transplantation tumor model, research dihydroarteannuin ovarian cancer resistance activity in animal body.The Proliferation of Human Ovarian Cell A2780 of luciferase labelling is injected into the abdominal cavity of Balb-c nude mice, sets up the former bit model of nude mice ovarian cancer, give the dihydroarteannuin treatment then: matched group (normal saline), low dose group (DHA 10mg/kg).High dose group (DHA 25mg/kg) is treated weekly five times, rests two days, gives for 6 treatment times in week altogether.Utilize growth and the transfer case of living imaging systematic observation mouse ovarian cancer during this time. A series of researchs by cellular level and animal level, show that artemisinin derivatives can suppress growth, migration and the invasion and attack (ovarian cancer and hepatocarcinoma) of the tumor cell of the PDGFR α positive effectively, and less for the inhibition ability of the growth of tumour cell of PDGF-B expression R α not and transfer ability.Concrete outcome is as follows: Fig. 2 shows that arteannuin and derivant thereof suppress growth and the transfer ability of the ovarian cancer cell of the PDGFRa positive.Particularly, shown in Fig. 1 e and Fig. 2 a, PDGFRa is at ovary normal cell epithelial cell IOSE144, and ovarian cancer cell SK-OV3 does not have among the OVCAR5 and expresses high expressed in ovarian cancer cell A2780 and OVCAR3; After giving medicine irritation 48h, the arteannuin of variable concentrations and derivant people normal ovarian epithelial cell IOSE144 thereof do not have obvious growth and suppress ability, less for the SK-OV3 cytotoxicity, but A2780 and OVCAR3 for the PDGFRa positive have the ability that suppresses more by force, and wherein the effect of arteannuin and dihydroartemisinine is the most remarkable.The cell migration experiment show lower concentration short time is handled (12h) ovarian cancer cell, arteannuin and derivant thereof can suppress the transfer ability of PDGFRa positive cell A2780 effectively, and do not have obvious inhibition ability (Fig. 2 b) for the cell SK-OV3 of PDGFRa feminine gender.Dihydroarteannuin suppresses the most obviously (Fig. 2 c-Fig. 2 e) for growth and the migration invasive ability of PDGFRa positive cells in the artemisinin derivative. Also obtained similar result in the hepatoma carcinoma cell, Fig. 3 shows that arteannuin and derivant thereof can suppress growth and the transfer ability of the hepatoma carcinoma cell of the PDGFRa positive.Particularly, numerous people's normal liver cells (7702 and LO2) and hepatoma cell line (Hep3B, HepG2,7721,7404, LM3,97L, 97M, Huh-7) in, (Fig. 3 is a) for Hep3B high expressed PDGFRa; Low concentration dihydroarteannuin (3 μ M) (12h) processing Hep3B cell in short-term can significantly suppress its migration and invasive ability (Fig. 3 b); The cell growth experiment shows that simultaneously the Hep3B cell of the PDGFRa positive is more responsive for dihydroarteannuin, and express on other PDGFRa ground and the hepatoma carcinoma cell of not having an expression for dihydroarteannuin sensitivity lower (Fig. 3 c). Zoopery assessment result (Fig. 4) shows, dihydroarteannuin has an inhibition ability for the growth of PDGFRa positive cell A2780 and transfer.Particularly, (Fig. 4 a) after two blue and green artemisins are treated the malignant progression that suppresses ovarian cancer effectively; Compare with the contrast group, the situation for shifting that gives dihydroarteannuin treatment group mice reduces greatly, and the situation that send out in the tumor abdominal cavity also obtains obvious suppression (Fig. 4 b, Fig. 4 c); SABC and immunoblot experiment show simultaneously, dihydroarteannuin can suppress expression and the phosphorylation of PDGFRa effectively, downstream signal path PI3K/AKT and MAPK-ERK are suppressed, matter modality process (EMT) be inhibited (Fig. 4 d, Fig. 4 e) between epithelium. Embodiment 3 The sensitization of arteannuin and derivant thereof and a line chemotherapeutic The external independent application of arteannuin and dihydroarteannuin all can significantly suppress growth, propagation and the migration invasive ability of ovarian cancer and hepatoma carcinoma cell.Whether present embodiment has the chemotherapy sensitizing effect to it is detected, arteannuin and dihydroarteannuin are united gemcitabine respectively and are acted on human liver cancer cell HepG2 and Hep3B, and the associating carboplatin acts on the inhibitory action of ovarian cancer A2780 and OVCAR3 observation drug combination cell growth.Result (Fig. 5) is as follows: HepG2, the Hep3B cell is with 10 μ mol/L arteannuin or dihydroarteannuin individual processing or unite 10 μ g/L gemcitabines processing 48 hours, carries out the apoptosis detection by quantitative as stated above.Particularly, gemcitabine list medicine acts on HepG2, and the Hep3B cell demonstrates certain apoptosis facilitation, and (Fig. 5 a), arteannuin associating gemcitabine is to HepG2, the Hep3B cell has the effect of remarkable apoptosis facilitation, and two medicine association lists reveal synergism, and (Fig. 5 a).DHA and CBP drug combination had potentiation facilitation (Fig. 5 b) to the OVCAR-3 apoptosis after 24 hours; Unite the apoptosis rate that apoptosis rate after 500 μ M CBP (1155%) effect is significantly higher than independent usefulness 1 μ M DHA (266%) or 500 μ M CBP (528%) with 1 μ M DHA, and surpassed the apoptosis additive effect of two kinds of chemical compounds, what demonstrate is a kind of potential potentiation.Yet what the A2780 cell showed therapeutic alliance is additive effect rather than synergy.This may be because their causes lower to the sensitivity of DHA chemical compound (Fig. 5 b, P＜0.05).The effect of longer time may produce better effect.Aspect the inhibition of cell proliferation vigor, when with the DHA coupling, CBP has suppressed the vigor of ovarian cancer cell very significantly.In fact, when cellular exposure during in the DHA of 1 μ M CBP and 1 μ M, the survival rate of A2780 cell has reduced by 69%, OVCAR-3 cell survival and has then reduced 72%.By contrast, it is more insensitive to treatment that the IOSE144 cell then seems, survival rate had only reduced about 28% (Fig. 5 c) when two kinds of medicines all share with 1 μ M. Cell experiment proof arteannuin and dihydroarteannuin all demonstrate for gemcitabine external, and carboplatin is handled killing and wounding and apoptosis-induced sensitization of cancerous cell.In addition, the transplanted tumor in nude mice experiment proves that further they are effective too for the chemotherapy of in-vivo tumour.Particularly, show in hepatoma carcinoma cell Hep3B and the experiment of HepG2 transplanted tumor in nude mice, all to have antitumor action in arteannuin and the dihydroarteannuin list medicine body as Fig. 5 d, the cancer suppressing action of dihydroarteannuin is better than arteannuin.Arteannuin and dihydroarteannuin all can increase the cancer suppressing action of gemcitabine, and associating gemcitabine therapeutic effect is better than single medicine, and especially dihydroarteannuin shows significant chemotherapy sensitization.In ovarian cancer cell A2780 and the experiment of OVCAR3 transplanted tumor in nude mice (Fig. 5 e), DHA (dosage be 10 with 25mg/kg) causes A2780 heteroplastic transplantation tumor 24% and 41% growth inhibited (comparing with the matched group of giving normal saline) (P＜0.05) respectively, and OVCAR-3 model 14% and 37% tumor growth suppress (P＜0.05); Be suppressed 56% (A2780) and 46% (OVCAR-3) only for the treatment group tumor growth of single CBP.Drug combination (25mg/kg DHA) group then all produces 70% tumor growth and suppresses (P＜0.05) in A2780 and OVCAR-3 animal tumor. Above cell and the experiment of animal level show, arteannuin and derivant thereof have the sensitization of good independent chemotherapy and associating one linearize treatment medicine, in conjunction with the artemisine derivative compound directly targeting PDGFRa bring into play this result of its anti-tumor activity, the prompting artemisinin-based drug can be used for clinical associating multiclass chemotherapeutics and treat tumour patient, and especially pathological diagnosis is the tumour patient of the PDGFRa positive Embodiment 4 PDGFR α is with pathological grading and shift relevant Present embodiment according to the clinical pathology diagnostic message strictness chosen 45 routine ovarian cancer patients' pathology sample, comprising 21 routine low level ovarian cancers (the clinical case rank is I-II, and moderate or highly differentiation do not have tangible lymph node, transfers such as abdominal cavity and nethike embrane); 24 routine high-level ovarian cancer patients (the clinical case rank is III-IV, and low differentiation has large-area lymphatic metastasis, abdominal cavity, nethike embrane, uterus, adnexa and other organ metastasis). The result shows (see figure 6), compares with the low level ovarian cancer, and in the high-level ovarian cancer case, the expression of tumor cell and Interstitial cell PDGFR α on every side significantly increases.Cell experiment shows, utilizes the gene perturbation technique of slow virus mediation that silence is carried out in the expression of PDGFR α among ovarian cancer cell A2780 and the OVCAR3, finds that the growth of tumor cell and migration invasive ability significantly reduce. Embodiment 5 Preparation of drug combination Compositions 1 Compositions 2 Discuss Existing discovery shows, PDGFR gene mutation or excessive activation can promote the transformation ability and then cause the generation of malignant tumor, as gastrointestinal stromal tumors (GISTs), and pulmonary carcinoma, carcinoma of prostate and breast carcinoma.Somatomedin such as PDGFR is combined the degraded that improves the iuntercellular adhesion molecule with its part, promote invasion by tumor cells and transfer, can also activate the VEGF in the microenvironment simultaneously, FGF and then promote angiogenesis have accelerated the malignant progression process of tumor.Zoopery and Clinical pathological study find that PDGFR α overexpression and activation have participated in generation and the evolution of ovarian cancer, with patient's pathology rank and poor prognosis significant correlation. Content of the present invention shows, compare with ovarian cancer patient's pathological tissue that low level shifts, the expression of PDGFR α significantly increases in extensive its cancerous cell of ovarian cancer patient that shifts of high-level generation and the mesenchyma stroma of tumors cell, this just shows that PDGFR α can be used as a target spot of ovarian cancer treatment. Find artemisinin derivatives among the present invention, especially arteannuin and dihydroarteannuin can directly be attached in the PDGFRa molecule, have both suppressed the receptor tyrosine kinase activity of PDGFRa, suppress the protein stability of PDGFRa again, promote its ubiquitin degraded. Molecule and zoopery show that the medicine of artemisine can be by suppressing multiple growth of tumor, migration and the invasive ability that PDGFRa and then inhibition comprise ovarian cancer and hepatocarcinoma.This result shows that artemisinin-based drug can be used as a kind of special inhibitor of PDGFR, is used for the tumour patient of PDGFRa sudden change clinically or excessive activation, comprises ovarian cancer, hepatocarcinoma, gastrointestinal stromal tumors (GISTs), acute leukemia etc.Artemisinin derivatives also has good anticancer sensitizing activity, for example artemisinin-based drug can significantly improve a line chemotherapeutic carboplatin, gemcitabines etc. are for the therapeutic effect of ovarian cancer and hepatocarcinoma, especially dihydroarteannuin has stronger chemotherapy sensitization to carboplatin and gemcitabine, its characteristics of high efficiency and low toxicity makes it to be expected to as chemotherapeutic sensitizer, is applied to the clinical combined chemotherapy of tumor. All quote in this application as a reference at all documents that the present invention mentions, just quoted as a reference separately as each piece document.Should be understood that in addition those skilled in the art can make various changes or modifications the present invention after having read above-mentioned teachings of the present invention, these equivalent form of values fall within the application's appended claims institute restricted portion equally. Claims (10) Hide Dependent 1. arteannuin and derivant thereof are for the preparation of suppressing to be selected from down the medicine of group disease or the purposes of medicine sensitizer: PDGFR α positive tumor, vascular conditions or fibrous lesions. 2. the purposes of an arteannuin and derivant thereof is characterized in that, for the preparation of inhibitor or the antagonist of platelet derived growth factor receptor A (PDGFR α). 3. purposes as claimed in claim 2 is characterized in that, described inhibitor or antagonist also are used for: (i) activation of inhibition PDGFR α tyrosine kinase; And/or The protein stability that (ii) suppresses PDGFR α; And/or (iii) promote the degraded of the proteasome mediation that PDGFR α ubiquitin relies on; And/or (vi) suppress the activation of PDGFR α positive tumor cell signal path PI3K/AKT and MAPK/EPK. 4. as the arbitrary described purposes of claim 1-2, it is characterized in that described artemisinin derivative is selected from down group: Artemether, dihydroartemisinine, artesunate, two hydrogen Artemether, arteether etc. 5. an external non-therapeutic ground suppresses the active method of platelet derived growth factor receptor A (PDGFR α), it is characterized in that, comprise step: with arteannuin and/or artemisinin derivative and cells contacting, thus platelet derived growth factor receptor A (PDGFR α) in inhibition or the antagonism cell. 6. the purposes of preparation combination, described preparation combination comprises: (I) contain the preparation of arteannuin and/or artemisinin derivative; With (II) contain the preparation of gemcitabine or carboplatin, It is characterized in that, the combination of described preparation for the preparation of: (a) pharmaceutical composition or the medicine box of inhibition platelet derived growth factor receptor A; Or (b) prevent and/or treat pharmaceutical composition or the medicine box of tumor. 7. purposes as claimed in claim 6 is characterized in that, described tumor is PDGFR α positive tumor. 8. method that prevents and/or treats the PDGFR alpha associated disorders, wherein said disease is relevant with expression excessively or the hyperactivity of PDGFR α, it is characterized in that, comprise step: use arteannuin and/or artemisinin derivative for the object of needs, or use the pharmaceutical composition that contains arteannuin and/or artemisinin derivative. 9. method, described method is used in the body or growth, migration and the invasion and attack of the activation of vitro inhibition PDGFR α tyrosine kinase, the protein stability of inhibition PDGFR α, the degraded that promotes the proteasome mediation that PDGFR α ubiquitin relies on, the activation that suppresses signal path PI3K/AKT and MAPK/EPK and/or inhibition PDGFR α positive tumor cell, it is characterized in that described method comprises step: use arteannuin and/or artemisinin derivative for the object of needs. 10. a test kit that is used for the ovarian cancer pathological grading is characterized in that, described test kit comprises the reagent that detects in vitro tissue PDGFR alpha expression amount. Patent Citations (1) Publication numberPriority datePublication dateAssigneeTitle CN102010421A *2010-11-192011-04-13沈阳药科大学Artemisinin derivatives and application thereof Family To Family Citations * Cited by examiner, † Cited by third party Non-Patent Citations (6) Title YAOJIAO, ET. AL.,: ""Dihydroartemisinin is an inhibitor of ovarian cancer cell growth"", 《ACTA PHARMACOL SIN》 * 文宏等: "青篙素治疗肺动脉高压的病理生理机制", 《医学综述》 * 王伟等: "血小板衍生生长因子及其受体在人肝细胞肝癌中的表达及意义", 《实用肿瘤杂志》 * 许光兰等: "青蒿琥酯对实验性肺纤维化大鼠治疗作用及其机理研究", 《临床医学工程》 * 谢兰等: ""血清血管内皮生长因子和血小板衍生生长因子的测定在卵巢肿瘤诊断中的价值"", 《WEST CHINA MEDICAL JOURNAL》 * 马捷等: "蒿甲醚、双氢青蒿素对小鼠硬皮病模型的影响", 《中国中药杂志》 * * Cited by examiner, † Cited by third party Cited By (5) Publication numberPriority datePublication dateAssigneeTitle CN104897887A *2015-06-022015-09-09南京师范大学In-vitro screening method for antineoplastic activity of artemisinin and derivatives of artemisinin CN105878233A *2014-11-122016-08-24南京中医药大学Application of artemisinin derivative in preparing medicine for treating hepatic fibrosis CN106668866A *2017-02-132017-05-17江苏省中医药研究院Medicinal composition for resisting non-small cell lung cancer, and application thereof CN109875996A *2019-03-072019-06-14南方医科大学Application of the qinghaosu in the drug of the human liver cancer Huh7 cell of preparation treatment PI3K/AKT/mTOR activation CN110787159A *2019-09-052020-02-14金乡县人民医院Application of sesquiterpene compound in preparation of medicine for treating gastrointestinal stromal tumor Family To Family Citations * Cited by examiner, † Cited by third party, ‡ Family to family citation Similar Documents PublicationPublication DateTitle Tewari et al.2022Natural products targeting the PI3K-Akt-mTOR signaling pathway in cancer: A novel therapeutic strategy Wu et al.2015Formononetin, a novel FGFR2 inhibitor, potently inhibits angiogenesis and tumor growth in preclinical models Gao et al.2013Tetrandrine suppresses cancer angiogenesis and metastasis in 4T1 tumor bearing mice Jin et al.2018The combined administration of parthenolide and ginsenoside CK in long circulation liposomes with targeted tLyp-1 ligand induce mitochondria-mediated lung cancer apoptosis Chen et al.2017Curcumin: a calixarene derivative micelle potentiates anti-breast cancer stem cells effects in xenografted, triple-negative 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receptor A and application thereof https://patents.google.com/patent/CN103251585A/en 青蒿素及其衍生物在抑制血小板衍生生长因子受体A中的作用及其应用 技术领域 本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及青蒿素及其衍生物在抑制血小板衍生生长因子受体A中的作用及其应用。 背景技术 青蒿又名黄花蒿(Artemisia anaua L)，属菊科，是一年生草本植物。青蒿素是我国药学工作者于20世纪70年代初从中药青蒿中提取的倍半萜内酯类抗疟药物。鉴于传统的奎宁类药物普遍遇到抗药性问题，青蒿素和它的衍生物目前已取代它们，成为世界上抗疟疾的主流药物。青蒿素的大环上有一个内过氧化物桥，在亚铁离子或亚铁血红素的催化下，会放出以碳为中心的自由基。细胞内的蛋白质和核酸被这些自由基烷化后死亡。疟原虫寄生在红血球内，含有大量来自血红蛋白的亚铁血红素，因而青蒿素很易被活化，进而将疟原虫杀死。青蒿素和它的衍生物，如二氢青蒿素，蒿甲醚，蒿乙醚及青蒿琥酯等已广泛应用于疟疾治疗，更多的青蒿素衍生物正在研制中。 青蒿素及其衍生物的抗疟活性已得到世界公认，具有起效快、药效高、毒副作用低等优点。除广泛应用于抗疟治疗外，青蒿素类药物还具有其它多种药理作用，如抗血吸虫作用、抗心律失常、平喘、抗内毒素、抗变态反应、抗红斑狼疮、免疫抑制等作用。 随着对青蒿素及其衍生物活性研究的不断深入，人们发现，该类化合物对多种肿瘤细胞的生长具有抑制作用和良好的治疗效果，然而，其具体作用靶点及相关信号通路及作用机制还不明确。因此本领域迫切需要了解青蒿素及其衍生物在一直肿瘤中的作用。 发明内容 本发明的目的是提供青蒿素及其衍生物在抑制血小板衍生生长因子受体A中的作用。 本发明的另一目的是提供青蒿素及其衍生物作为血小板衍生生长因子受体A抑制剂/拮抗剂的应用。 本发明的另一目的是提供体外治疗肿瘤的方法。 在本发明的第一方面，提供了一种青蒿素及其衍生物用于制备抑制选自下组疾病的药物或药物增敏剂的用途：PDGFRα阳性肿瘤、血管性疾病、或纤维性病变。 在另一优选例中，所述的PDGFRα阳性肿瘤细胞为PDGFRα阳性卵巢癌细胞或PDGFRα阳性肝癌细胞。 在本发明的第二部分，提供了一种青蒿素及其衍生物的用途，用于制备血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)的抑制剂或拮抗剂。 在另一优选例中，所述的血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)来自于人。 在另一优选例中，所述的抑制剂或拮抗剂还用于： (i)抑制PDGFRα酪氨酸激酶的活化；和/或 (ii)抑制PDGFRα的蛋白稳定性；和/或 (iii)促进PDGFRα泛素依赖的蛋白酶体介导的降解；和/或 (vi)抑制PDGFRα阳性肿瘤细胞信号通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化。 在另一优选例中，所述的青蒿素衍生物选自下组：蒿甲醚、二氢青蒿素、青蒿琥酯、双氢蒿甲醚、蒿乙醚等。 在另一优选例中，所述的青蒿素衍生物为二氢青蒿素。 在本发明的第三方面，提供了一种体外非治疗性地抑制血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)活性的方法，包括步骤：将青蒿素和/或青蒿素衍生物与细胞接触，从而抑制或拮抗细胞中血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)。 在另一优选例中，所述的接触是在青蒿素和/或青蒿素衍生物存在下，培养所述细胞。 在另一优选例中，所述的细胞包括肿瘤细胞，较佳地包括PDGFRα阳性肿瘤细胞，更佳地包括PDGFRα阳性卵巢癌细胞或肝癌细胞，如卵巢癌细胞A2780、卵巢癌细胞OVCAR3、肝癌细胞Hep3B。 在另一优选例中，所述方法还用于至少以下一种应用： 体外非治疗性地抑制PDGFRα酪氨酸激酶的活化； 体外非治疗性地抑制PDGFRα的蛋白稳定性； 体外非治疗性地促进PDGFRα泛素依赖的蛋白酶体介导的降解； 体外非治疗性地抑制信号通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化；和 体外非治疗性抑制PDGFRα阳性肿瘤细胞的生长。 在本发明的第四方面，提供了一种制剂组合的用途，所述制剂组合包括： (I)含青蒿素和/或青蒿素衍生物的制剂；和 (II)含吉西他宾或卡铂的制剂， 所述制剂组合用于制备： (a)抑制血小板衍生生长因子受体A的药物组合物或药盒；或 (b)预防和/或治疗肿瘤的药物组合物或药盒。 在另一优选例中，所述制剂包括：片剂、胶囊、栓剂、注射剂。 在另一优选例中，所述肿瘤为PDGFRα阳性肿瘤。 在本发明的第五方面，提供了一种预防和/或治疗PDGFRα相关疾病的方法，其中所述疾病与PDGFRα的过表达或活性过高有关，所述方法包括步骤：给需要的对象施用青蒿素和/或青蒿素衍生物，或施用含青蒿素和/或青蒿素衍生物的药物组合物。 在另一优选例中，所述的PDGFRα相关疾病包括肿瘤(PDGFRα阳性肿瘤)，如卵巢癌或肝癌。 在另一优选例中，PDGFRα阳性肿瘤为PDGFRα阳性卵巢癌或PDGFRα阳性肝癌。 在另一优选例中，所述的施用包括：瘤内、静脉注射、口服片剂、腹腔注射等。 在另一优选例中，所述的对象为哺乳动物。 在本发明的第六方面，提供了一种方法，所述方法用于体内或体外抑制PDGFRα酪氨酸激酶的活化、抑制PDGFRα的蛋白稳定性、促进PDGFRα泛素依赖的蛋白酶体介导的降解、抑制信号通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化、和/或抑制PDGFRα阳性肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭，所述方法包括步骤：给需要的对象施用青蒿素和/或青蒿素衍生物。 在本发明的第七方面，提供了一种用于卵巢癌病理分级的试剂盒，所述试剂盒包含检测离体组织PDGFRα表达量的试剂。 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。 附图说明 下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。 图1显示PDGFRα可以作为青蒿素及其衍生物的直接作用靶标；其中，图1a为体外激酶实验，结果显示，青蒿素及其衍生物青蒿素(ART)、二氢青蒿素(DHA)、青蒿琥酯(ARM)、蒿甲醚(ARS)可以抑制PDGFRα胞内端(aa550-末端)酪氨酸激酶的活性；图1b为表面等离子共振(SPR)实验，结果显示，双氢青蒿素(DHA)可以与PDGFRα包外端(aa24-524)蛋白相互结合，索拉菲尼(Sorafenib)为阳性对照，已知其可以结合抑制PDGFRα的活性；图1c为生物素-亲和素亲和纯化实验，结果显示，标记生物素的DHA可以与A2780细胞内PDGFRα相互结合，从而被亲和纯化出来；图1d为计算机辅助同型模建及反向对接实验(ComputerAssisted Homology modeling and docking)，结果显示，双氢青蒿素(DHA)可以嵌合到PDGFRα包外端PDGF结合位点，同时也可嵌合到其包内端ATP结合位点，阻断其激酶激活；图1e-图1f显示双氢青蒿素能够有效抑制PDGFRα阳性细胞A2780和OVCAR3中PDGFRα的活性和蛋白表达，而对PDGFRβ的磷酸化和蛋白水平影响不大；图1g-图1i显示双氢青蒿素可以加速PDGFRα的蛋白降解，这一过程是泛素依赖的蛋白酶体介导的。 图2显示了青蒿素及其衍生物具有抑制PDGFRa阳性的卵巢癌细胞的生长和迁移能力；其中，图2a显示，给予药物刺激48h后，青蒿素及其衍生物对人正常卵巢上皮细胞IOSE144无明显的生长抑制能力，对于SK-OV3细胞毒性较小，但对于PDGFRa阳性的A2780和OVCAR3具有较强抑制能力，其中青蒿素和二氢青蒿素的作用最为显著；图2b为细胞迁移实验，结果显示，低浓度短时间处理(12h)卵巢癌细胞，青蒿素及其衍生物能够有效地抑制PDGFRa阳性细胞A2780的迁移能力，而对于PDGFRa阴性的细胞SK-OV3无明显抑制能力；图2c显示了不同浓度的双氢青蒿素对5种细胞系(IOSE144、A2780、OVCAR3、OVCAR5、SK-OV3)的细胞抑制作用；图2d显示了不同浓度的双氢青蒿素对3种细胞系(A2780、OVCAR3、SK-OV3)的细胞迁移的影响；图2e显示了不同浓度的双氢青蒿素对2种细胞系(A2780、OVCAR3)的细胞侵袭的影响。 图3显示青蒿素及其衍生物具有抑制PDGFRa阳性的肝癌细胞的生长和迁移能力；其中，图3a显示，在人正常的肝细胞系(7702和LO2)和肝癌细胞系(Hep3B、HepG2、7721、7404、LM3、97L、97M、Huh-7)中，只有Hep3B高表达PDGFRa；图3b显示，低浓度双氢青蒿素(3μM)短时(12h)处理Hep3B细胞，能够显著抑制其迁移和侵袭能力；图3c为细胞生长实验，结果显示，PDGFRa阳性的Hep3B细胞对于双氢青蒿素更敏感，而其他细胞对于双氢青蒿素敏感程度较低。 图4显示双氢青蒿素能抑制小鼠原位卵巢癌模型的生长和转移；其中，图4a显示双氢青蒿素给予治疗小鼠，能有有效地抑制卵巢癌的恶性进展；图4b显示，与对照组相比，双氢青蒿素治疗组小鼠的肺癌转移的情况大大降低，且随着药量的增加，治疗情况越好；图4c显示不同浓度的双青青蒿素给予治疗小鼠，肿瘤腹腔播散的情况(肺脏、肝脏、肠)得到明显的抑制；图4d为免疫组化实验，结果显示，双氢青蒿素处理的细胞其形态转换过程(EMT)得到抑制；图4e为免疫印迹实验，结果显示，双氢青蒿素能够有效抑制PDGFRa的表达和磷酸化，下游信号通路PI3K/AKT和MAPK-ERK得以抑制。 图5显示了青蒿素及其衍生物与一线化疗药的增敏作用；其中，图1a为HepG2和Hep3B细胞用青蒿素或双氢青蒿素单独处理或联合吉西他宾处理实验，结果显示，吉西他宾单独作用于HepG2和Hep3B细胞，具有一定的凋亡促进作用，青蒿素联合吉西他宾对HepG2和Hep3B细胞都具有显著凋亡促进作用作用，两药联合表现出协同作用；图5b显示，DHA和CBP联合用药24小时后对OVCAR-3细胞凋亡有增效促进作用，用1μM的DHA联合500μM CBP(1155％)作用后的细胞凋亡率显著高于单独用1μM DHA(266％)或500μM CBP(528％)的细胞凋亡率，而且超过了两种化合物的凋亡累加效应，是一种增效作用，A2780细胞对联合治疗显示了累加效应；图5c显示，当与DHA联用时，CBP显著抑制了卵巢癌细胞的活力，当细胞暴露于1μM CBP和1μM DHA时，A2780细胞的存活率就降低了69％，而OVCAR-3细胞存活则减少了72％，相比之下，IOSE144细胞则显得对治疗较不敏感，两种药物均以1μM合用时存活率只降低了约28％；图5d为肝癌细胞Hep3B和HepG2裸鼠移植瘤实验，结果显示，青蒿素和双氢青蒿素单药体内均具有抗肿瘤作用，双氢青蒿素的抑癌作用强于青蒿素，青蒿素及双氢青蒿素均能增加吉西他宾的抑癌作用，联合吉西他宾治疗效果优于单药，尤其是双氢青蒿素表现出显著的化疗致敏作用；图5e为在卵巢癌细胞A2780和OVCAR3裸鼠移植瘤实验中，结果显示，DHA(剂量为10和25mg/kg)分别导致A2780异体移植肿瘤24％和41％的生长抑制(与给生理盐水的对照组相比)(P＜0.05)，OVCAR-3模型14％和37％肿瘤生长抑制(P＜0.05)；只给单一CBP的治疗组肿瘤生长被抑制了56％(A2780)和46％(OVCAR-3)，联合用药(25mg/kgDHA)组则在A2780和OVCAR-3动物肿瘤中均产生70％肿瘤生长抑制(P＜0.05)。 图6显示PDGFRα的表达与卵巢癌病理级别和转移状态的关系；其中，图6a显示，与低级别卵巢癌相比，高级别卵巢癌病例中，肿瘤细胞及周围的间质细胞PDGFRα的表达量显著增加；图6b为PDGFRα染色结果，结果显示，在高级别卵巢癌病例中，PDGFRα的表达显著增加。 具体实施方式 本发明人经过广泛而深入的研究，发现青蒿素及其衍生物的用途，用于制备血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)的抑制剂或拮抗剂，此外，青蒿素及其衍生物还可以抑制PDGFRα酪氨酸激酶的活化、抑制PDGFRα的蛋白稳定性、促进PDGFRα泛素依赖的蛋白酶体介导的降解、抑制信号通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化、抑制PDGFRα阳性肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭、还可以用于PDGFRα阳性肿瘤治疗的增敏剂。在此基础上完成了本发明。 术语 卵巢癌 卵巢癌是全世界的妇女健康的巨大威胁。在美国，卵巢癌已成为第四位致死性的女性癌症。虽然被诊断于病发早期的卵巢癌患者的5年存活率可以达到80％-90％，但是被诊断为晚期的卵巢癌患者存活率却只有不到25％，此外，大多数卵巢癌患者在诊断出是卵巢癌是已至晚期。目前卵巢癌患者的死亡率在过去的数十年没有发生太大的改变，因此在肿瘤治疗和预后中，寻找有效的治疗方案，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，和克服肿瘤的耐药性是研究人员和临床实践人员长期以来的目标。 肝癌 肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，我国是肝癌的高发区，其发病率已上升到恶性肿瘤的第二位。由于肝癌早期症状不明显，因此确诊的大多数病人已处于中、晚期。原发性肝癌的首选治疗是手术切除，随着治疗技术的提高，目前术后5年生存率已提高至50％-60％，但由于手术切除只适用直径不超过5cm、癌灶数目不超过3个的小肝癌。此外，是否适合直接手术切除还取决于癌灶部位的血管富集程度及病人个体差异，这些限制导致90％左右的肝癌不适合手术治疗。即使是可切除肝癌，术后实施以介入化疗为主的综合性治疗也是必要的。然而目前，鲜有药物能够有效抑制肝癌的生长和进一步恶化，肝癌对传统化疗药物的反应率低，毒副作用非常显著，因此化疗的缓慢发展是制约抗肿瘤药物临床应用的主要原因。因此对于肿瘤化疗来说，迫切需要寻求更好的化疗增效剂和更好的治疗方案，从而提高肿瘤对化疗的敏感度，降低其对化疗的耐药性。 血小板衍生生长因子及其受体 血小板衍生生长因子(Platelet derived growth factor，PDGF)是一类能够合成并分泌到细胞外基质中的生长因子，具有促进纤维细胞、平滑肌细胞等多重组织的细胞分裂、增殖、迁移、增加细胞的黏附能力，在人胚胎发育和正常生理活动中发挥着重要作用。PDGF以自分泌和旁分泌形式激活血小板衍生生长因子受体(PDGFR)而发挥作用。 PDGFR包含两种结构类似的酪氨酸激酶受体PDGFRα和PDGFRβ，其中PDGFRα的异常激活与多重疾病密切相关，具体地，PDGFR相关疾病可以分为三类： 1.肿瘤 由于PDGFR(特别是PDGFRα)存在于多种肿瘤中，它可能作为一个新的治疗靶点。已经发现，多种肿瘤的发生与PDGFR(特别是PDGFRα)的过度激活相关，如卵巢癌、神经胶质瘤、前列腺癌；此外，在一些肿瘤中存在PDGFR的突变激活，如隆突性皮肤纤维肉瘤、胃肠道间质瘤、Bcr-Abl阴性的慢性髓样白血病、嗜酸细胞增多综合征等等。 2.血管性疾病 研究发现，PDGF及PDGFR等在多种血管性疾病中存在过量表达和过度激活现象，如动脉粥样硬化和再狭窄、肺动脉高压、视网膜血管病变等，抑制PDGFR信号通路的激活可以有效缓解上述疾病的症状，增加其治疗效果。 3.纤维性病变 PDGF-PDGFR信号通路在多种纤维性病变过程中发挥重要的作用，如肺纤维化、肝纤维化和肝硬化、皮肤纤维增生(硬皮病)、肾纤维化、心肌纤维化等等，其中PDGF-PDGFR信号通路介导的间质细胞的增殖是该慢性炎症的共同特征。 上述三类疾病中，PDGF-PDGFR信号通路发挥重要的作用，其中PDGFRβ主要介导了血管系统病变，而PDGFRα主要介导了间质细胞和成纤维细胞驱动的病变。(Johanna Andrae，et al.Role of platelet-derived growth factors inphysiology and medicine，Genes Dev.2008；22：1276-1312；张秀华等，血小板源生长因子受体与肿瘤.生命科学，Vol.18，No.3 Jun.，2006) 青蒿素及其衍生物 青篙素是从中药青篙中提取的有过氧基团的倍半萜内酯药物，由于青蒿素是复杂的大分子，化学全人工很难合成，因此目前主要是生物合成和人工提取。 青蒿素等倍半萜类的生物合成在细胞质中进行，途径属于植物类异戊二烯代谢途径，可分为三大步：由乙酸形成FPP，合成倍半萜，再内酯化形成青蒿素，具体为：FPP→4，11-二烯倍半萜→青蒿酸→二氢青蒿酸→二氧青蒿酸过氧化物→青蒿素。 青蒿素和本领域几种常见的青蒿素衍生物的化学式见下： 青蒿素及其衍生物的应用 本发明提供了青蒿素及其衍生物用于制备血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)的抑制剂或拮抗剂的用途。 在另一优选例中，青蒿素及其衍生物还用于： (i)抑制PDGFRα酪氨酸激酶的活化；和/或 (ii)抑制PDGFRα的蛋白稳定性；和/或 (iii)促进PDGFRα泛素依赖的蛋白酶体介导的降解；和/或 (vi)抑制PDGFRα阳性肿瘤细胞信号通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化；和/或 (v)抑制PDGFRα阳性肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭；和/或 (vi)制备抑制PDGFRα阳性肿瘤的药物或增敏剂；和/或 (vii)制备治疗血管性疾病和纤维性病变的药物或增敏剂。 在本发明的一个优选例中，提供了一种体外非治疗性地抑制血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)活性的方法，包括步骤：将青蒿素和/或青蒿素衍生物与细胞接触，从而抑制或拮抗细胞中血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)。 所述的接触是在青蒿素和/或青蒿素衍生物存在下，培养所述细胞。细胞包括肿瘤细胞，较佳地包括PDGFRα阳性肿瘤细胞，更佳地包括PDGFRα阳性卵巢癌细胞或肝癌细胞，如卵巢癌细胞A2780、卵巢癌细胞OVCAR3、肝癌细胞Hep3B。在另一优选例中，所述方法还用于至少以下一种应用：体外非治疗性地抑制PDGFRα酪氨酸激酶的活化；体外非治疗性地抑制PDGFRα的蛋白稳定性；体外非治疗性地促进PDGFRα泛素依赖的蛋白酶体介导的降解；体外非治疗性地抑制信号通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化；和体外非治疗性抑制PDGFRα阳性肿瘤细胞的生长。 本发明还提供了一种预防和/或治疗PDGFRα相关疾病的方法，其中所述疾病与PDGFRα的过表达或活性过高有关，所述方法包括步骤：给需要的对象施用青蒿素和/或青蒿素衍生物，或施用含青蒿素和/或青蒿素衍生物的药物组合物。PDGFRα相关疾病包括肿瘤(PDGFRα阳性肿瘤)，如卵巢癌或肝癌。在另一优选例中，所述的施用包括：瘤内、静脉注射、口服片剂、腹腔注射等。所述的对象为哺乳动物(如人)。 药剂组合物及其应用 本发明还提供了药剂组合物，在一个优选例中，所述制剂组合包括： (I)含青蒿素和/或青蒿素衍生物的制剂；和(II)含吉西他宾或卡铂的制剂， 所述制剂组合用于制备：(a)抑制血小板衍生生长因子受体A的药物组合物或药盒；或(b)预防和/或治疗肿瘤的药物组合物或药盒。 所述制剂包括片剂、胶囊、栓剂、注射剂；所述药物制剂用于预防和治疗PDGFRα阳性肿瘤。 本发明的药剂组合物可以是固体或液体。固体制剂包括散剂、片剂、丸剂、胶囊、扁囊剂、栓剂和可分散颗粒剂，固体载体可以是一种或多种物质，它们可以作为稀释剂、矫味剂、黏合剂、防腐剂、片剂崩解剂或包囊材料。在散剂中，载体是微细分的固体，本发明的化合物与微细分的活性组份存在于混合物中。在片剂中，此化合物与所需的粘合载体以适当比例混合，并压制成所需的形状和大小。散剂和片剂中优先含有5至70％活性化合物，适宜的载体是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点腊和可可脂等。同样，扁囊剂或锭剂、片剂、散剂、胶囊、丸剂、扁囊剂和锭剂可以是适合于口服给药的固体剂型。为了制备栓剂，可以将低熔点腊乳脂肪酸甘油脂或可可脂的混合物熔化，并通过搅拌将此活性化合物组份均匀地分散在其中，然后将熔化的均匀混合物倒入大小合适的模中让其冷却，并由此固化。溶液形式的制剂包括溶液、悬浮剂和乳剂，例如水或含水丙二醇溶液。对于非肠道注射液体制剂，可以在含水聚乙二醇溶液中制备。适于口服的含水溶液可以通过将活性组份溶解于水中，并按照需要加入适宜的着色剂、矫味剂、乳化剂和增稠剂制备。适于口服的含水混悬剂可以通过将微细分的活性组份分散于含水粘性物质中制备，如天然或合成胶、树脂、甲基纤维素、羟甲基纤维素钠及其他熟知的混悬剂。这些液体形式包括溶液、混悬剂和乳剂，除活性组份外，这些制剂可含有着色剂、矫味剂、稳定剂、缓冲剂、合成或天然甜味剂、分散剂、增稠剂和助溶剂等。此药物制剂优先是单位剂型，在此剂型中，此制剂被再分为含适量活性组份的单位剂量，此单位剂量可以是包装的制剂，该包装含有一定量的制剂，如包装的片剂、胶囊和在小瓶或胶囊中的散剂。此单位剂型还可以是胶囊、片剂、扁囊剂或锭剂本身，或其可以存在包装形式中的适当数量的任何这些散剂。 单位剂量制剂中活性组份的量可根据具体的应用和活性组份的效力而变化，对于非人哺乳动物(如小鼠)治疗，可以将0.01mg至约0.5g，较佳地0.1至约3mg的胶囊每天给药三次，必要时该组合物还可以含其他相容的治疗剂。对于人的治疗，可以根据患者的需要、被治疗病症的严重性以及使用的化合物而变化，较佳地，开始以小于该化合物最佳剂量的较小剂量治疗，此后，小量增加此剂量达到最佳效果，方便起见，如果需要可将总日剂量再细分为一天内分次给药。在本发明的一个优选例中，给予人的剂量大约为0.1/kg-0.5g/kg之间。 本发明的主要优点： (1)青蒿素及其衍生物可以用于制备血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)的抑制剂或拮抗剂； (2)青蒿素及其衍生物可以抑制PDGFRα酪氨酸激酶的活化、PDGFRα的蛋白稳定性、抑制信号通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化、抑制PDGFRα阳性肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭； (3)青蒿素及其衍生物可以促进PDGFRα泛素依赖的蛋白酶体介导的降解； (4)青蒿素及其衍生物可以用于PDGFRα阳性肿瘤治疗的增敏剂。 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 实验方法和材料 1.表面等离子共振 表面等离子共振(SPR)是一种光学现象，可被用来实时跟踪在天然状态下生物分子间的相互作用。实验中，将重组人PDGFRα胞外端(Met1-Glu524)蛋白，键合在生物传感器表面，将不同浓度的双氢青蒿素溶液和一直与PDGFRα有相互作用的化合物索拉菲尼及SU11248溶液注入并流经生物传感器表面。生物分子间的结合引起生物传感器表面质量的增加，导致折射指数按同样的比例增强，生物分子间反应的变化即被观察到，这种反应用反应单位(RU)来衡量。 2.细胞培养 人卵巢永生化的非致瘤性上皮细胞IOSE-144和卵巢癌细胞(A2780，OVCAR-3，SK-OV3，OVCAR-5)购自美国ATCC(American Type CultureCollection，Manassas，VA)。所有细胞依据ATCC的培养要求(RPMI-1640或DMEM培养液加入10％胎牛血清(GIBCO)、100IU/ml青霉素、100IU/ml链霉素)于5％CO2的37℃培养箱中培养。 3.细胞生长抑制实验 细胞生长及增殖抑制试验通过CCK-8实验测定。细胞以3×103个细胞每孔的密度铺种于96孔板中。12～18小时后，以一定浓度梯度(0、1、5、10、25μM)的青蒿素类化合物处理48小时之后，在96孔板每孔中加10μL CCK-8溶液进行药物处理后的细胞生长活性评价，实验最后通过酶标仪(SpectraMax190microplate reader；Molecular Devices，USA)测量450nm处的光吸收(OD值)(每实验浓度至少设置三个复孔，每次实验至少重复三次)。 4.细胞迁移、侵袭实验 卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力通过transwell实验测定，低浓度青蒿素衍生物短时间(12h)处理卵巢癌细胞，然后将相同数目的细胞(5×104个)重悬在无血清的培养基中，种植到transwell(测定细胞的侵袭能力时，transwell上层铺上基质胶)上层培养室中。以10％胎牛血清培养基作为化学趋化剂。大约8-12h后，未迁移的细胞用棉签擦去，将迁移的细胞进行固定染色，并进行统计分析。 5.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹分析 以不同浓度的DHA处理培养细胞24小时，收集细胞并用细胞裂解液(RIPAbuffer #9806，Cell Signaling)裂解。之后以13,000转于4℃离心15min，取上清进行后续的分析检测。蛋白浓度通过Bio-Rad公司的试剂盒(protein assay kit；Hercules，CA)定量蛋白总量。之后每孔上等量蛋白进行SDS-PAGE胶电泳分离。电泳完毕，将电泳蛋白条带转移至甲醇活化过的PVDF膜(Millipore，Bedford，MA)上。转膜完毕后，膜以5％的脱脂牛奶(PBS溶解)封闭，然后后加一抗和二抗孵育(以5％的BSA配置)，之后通过蛋白条带表达差异变化以蛋白显影试剂盒(ECL plus system，Amersham Pharmacia Biotech)显影分析。 6.小鼠原位卵巢癌异体移植瘤模型体内治疗实验 四到六周龄的雌性BALB/c(nu/nu)购自上海斯莱克实验动物有限公司(Shanghai Experimental Animal Center)，并按规定饲养于SPF级动物房。所有动物实验操作均得到中科院营养所动物伦理委员会的批准。。大体步骤如下：将荧光素酶标记的A2780细胞，重悬于无血清的RPMI 1640培养基中。然后腹腔注射等量细胞(～3×106 cells/0.2ml)于小鼠的腹腔内部。利用IVIS Lumina生物荧光系统实时监测肿瘤的生长情况，并记录小鼠的体重。注射5天后，根据肿瘤的荧光强度时将小鼠平均分成治疗组和对照组(每组8只老鼠)。治疗组药物DHA溶解在蓖麻油、乙醇和生理盐水的混合物(CremophorEL∶Ethanol∶Saline＝5∶5∶90，v/v/v)中，所有药物均通过腹腔给药。DHA的给药剂量为10或25mg/kg体重，给药频率为每天给药，每周停歇两天。对照组注射生理盐水。在治疗过程中利用活体成像系统实时监测肿瘤的生长状况。治疗结束后，小心取出移腹部肿瘤(除掉脂肪和结缔组织)，以PIPA溶液(100mg组织加入1ml RIPA)匀浆。得到的肿瘤组织匀浆液按上述的蛋白免疫印迹分析实验要求进行处理，之后进行蛋白免疫印迹检测；或将肿瘤组织进行固定和免疫染色。 实施例1 青蒿素及其衍生物直接结合PDGFRα，抑制其磷酸化活性，促进其降解 利用PDGFRα体外激酶实验、表面等离子共振、计算机辅助同型模建及反向对接实验等分子药理学以及生物物理学等先进的生物学技术和手段，证实青蒿素类衍生物可以直接结合PDGFRα，抑制PDGFRα的受体酪氨酸激酶活性，同时研究发现双氢青蒿素可以抑制PDGFRα阳性细胞中PDGFRα的蛋白稳定性，促进其泛素依赖的降解过程。 图1表明，青蒿素及其衍生物能够直接结合PDGFRα，PDGFRα作为青蒿素及其衍生物作用的直接靶标，且能够抑制其磷酸化活性，促进其降解。体外激酶实验显示青蒿素及其衍生物：青蒿素(ART)、二氢青蒿素(DHA)、青蒿琥酯(ARM)、蒿甲醚(ARS)可以抑制PDGFRα的胞内端(aa550-末端)酪氨酸激酶的活性(图1a)。表面等离子共振(SPR)实验显示，双氢青蒿素(DHA)可以与PDGFRα包外端(aa24-524)蛋白相互结合，索拉菲尼(Sorafenib)做为阳性对照，已知可以结合抑制PDGFRα的活性(图1b)。生物素-亲和素亲和纯化实验显示标记生物素的DHA可以与A2780细胞内PDGFRα相互结合，从而被亲和纯化出来(图1c)。计算机辅助同型模建及反向对接实验(Computer Assisted Homology modeling anddocking)实验显示双氢青蒿素(DHA)可以嵌合到PDGFRα包外端PDGF结合位点，同时也可嵌合到其包内端ATP结合位点，阻断其激酶激活(图1d)。图1e-图1f显示了双氢青蒿素能够有效抑制PDGFRα阳性细胞A2780和OVCAR3中PDGFRα的活性和蛋白表达，而对PDGFRβ的磷酸化和蛋白水平影响不大。图1g-图1i实验显示双氢青蒿素可以加速PDGFRα的蛋白降解，这一过程是泛素依赖的蛋白酶体介导的。 实施例2 青蒿素及其衍生物抑制PDGFRα阳性的肿瘤细胞的生长和转移 利用裸鼠原位卵巢癌异体移植瘤模型，研究双氢青蒿素在动物体内的抗卵巢癌活性。将荧光素酶标记的人卵巢癌细胞A2780注射入Balb-c裸鼠的腹腔，建立裸鼠卵巢癌原位模型，然后给予双氢青蒿素治疗：对照组(生理盐水)，低剂量组(DHA 10mg/kg)。高剂量组(DHA 25mg/kg)每周治疗五次，停歇两天，共给予6周治疗时间。期间利用活体成像系统观察小鼠卵巢癌的生长和转移情况。 通过细胞水平和动物水平的一系列研究，显示青蒿素类衍生物能够有效地抑制PDGFRα阳性的肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭(卵巢癌和肝癌)，而对于不表达PDGFRα的肿瘤细胞生长和迁移能力的抑制能力较小。具体结果如下： 图2表明，青蒿素及其衍生物抑制PDGFRa阳性的卵巢癌细胞的生长和迁移能力。具体地，如图1e和图2a所示，PDGFRa在卵巢正常细胞上皮细胞IOSE144，卵巢癌细胞SK-OV3，OVCAR5中无表达，在卵巢癌细胞A2780和OVCAR3中高表达；给予药物刺激48h后，不同浓度的青蒿素及其衍生物人正常卵巢上皮细胞IOSE144无明显的生长抑制能力，对于SK-OV3细胞毒性较小，但对于PDGFRa阳性的A2780和OVCAR3具有较强抑制能力，其中青蒿素和二氢青蒿素的作用最为显著。细胞迁移实验显示低浓度短时间处理(12h)卵巢癌细胞，青蒿素及其衍生物能够有效地抑制PDGFRa阳性细胞A2780的迁移能力，而对于PDGFRa阴性的细胞SK-OV3无明显抑制能力(图2b)。青蒿素衍生物中双氢青蒿素对于PDGFRa阳性的细胞的生长和迁移侵袭能力抑制最为明显(图2c-图2e)。 肝癌细胞中也得到了类似的结果，图3表明，青蒿素及其衍生物能够抑制PDGFRa阳性的肝癌细胞的生长和迁移能力。具体地，在众多人正常肝细胞(7702和LO2)和肝癌细胞系(Hep3B，HepG2，7721，7404，LM3，97L，97M，Huh-7)中，Hep3B高表达PDGFRa(图3a)；低浓度双氢青蒿素(3μM)短时(12h)处理Hep3B细胞能够显著抑制其迁移和侵袭能力(图3b)；细胞生长实验同时显示PDGFRa阳性的Hep3B细胞对于双氢青蒿素更为敏感，而其他PDGFRa地表达和无表达的肝癌细胞对于双氢青蒿素敏感程度较低(图3c)。 动物实验评估结果(图4)表明，双氢青蒿素对于PDGFRa阳性细胞A2780的生长和转移的具有抑制能力。具体地，双青青蒿素给予治疗后能有有效地抑制卵巢癌的恶性进展(图4a)；与对照组别相比，给予双氢青蒿素治疗组小鼠的为转移的情况大大降低，肿瘤腹腔播散的情况也得到明显的抑制(图4b、图4c)；免疫组化和免疫印迹实验同时显示，双氢青蒿素能够有效地抑制PDGFRa的表达和磷酸化，下游信号通路PI3K/AKT和MAPK-ERK得以抑制，上皮间质形态转换过程(EMT)得到抑制(图4d、图4e)。 实施例3 青蒿素及其衍生物与一线化疗药的增敏作用 青蒿素及双氢青蒿素体外单独应用均能够显著抑制卵巢癌和肝癌细胞的生长、增殖和迁移侵袭能力。本实施例对其是否具有化疗增敏作用进行了检测，青蒿素及双氢青蒿素分别联合吉西他宾作用于人肝癌细胞HepG2和Hep3B，以及联合卡铂作用于卵巢癌A2780和OVCAR3观察联合用药对细胞生长的抑制作用。结果(图5)如下所示： HepG2，Hep3B细胞用10μmol/L青蒿素或双氢青蒿素单独处理或联合10μg/L吉西他宾处理48小时，按上述方法进行细胞凋亡定量检测。具体地，吉西他宾单药作用于HepG2，Hep3B细胞显示出一定的凋亡促进作用(图5a)，青蒿素联合吉西他宾对HepG2，Hep3B细胞具有显著凋亡促进作用作用，两药联合表现出协同作用(图5a)。DHA和CBP联合用药24小时后对OVCAR-3细胞凋亡有增效促进作用(图5b)；用1μM DHA联合500μM CBP(1155％)作用后的细胞凋亡率显著高于单独用1μM DHA(266％)或500μM CBP(528％)的细胞凋亡率，而且超过了两种化合物的凋亡累加效应，显示出的是一种潜在的增效作用。然而，A2780细胞对联合治疗则显示的是累加效应而不是增效效应。这可能是由于它们对DHA化合物的敏感度较低的缘故(图5b，P＜0.05)。更长时间的作用可能产生更好的效果。在细胞增殖活力抑制方面，当与DHA联用时，CBP非常显著地抑制了卵巢癌细胞的活力。事实上，当细胞暴露于1μM CBP和1μM的DHA时，A2780细胞的存活率降低了69％，而OVCAR-3细胞存活则减少了72％。相比之下，IOSE144细胞则显得对治疗较不敏感，两种药物均以1μM合用时存活率只降低了约28％(图5c)。 细胞实验证明青蒿素以及双氢青蒿素在体外都显示出对于吉西他宾，卡铂处理癌细胞的杀伤和诱导凋亡的增敏作用。此外，裸鼠移植瘤实验进一步证明它们对于体内肿瘤的化疗也一样有效。具体地，如图5d显示，在肝癌细胞Hep3B和HepG2裸鼠移植瘤实验中，青蒿素和双氢青蒿素单药体内均具有抗肿瘤作用，双氢青蒿素的抑癌作用强于青蒿素。青蒿素及双氢青蒿素均能增加吉西他宾的抑癌作用，联合吉西他宾治疗效果优于单药，尤其是双氢青蒿素表现出显著的化疗致敏作用。在卵巢癌细胞A2780和OVCAR3裸鼠移植瘤实验中(图5e)，DHA(剂量为10和25mg/kg)分别导致A2780异体移植肿瘤24％和41％的生长抑制(与给生理盐水的对照组相比)(P＜0.05)，OVCAR-3模型14％和37％肿瘤生长抑制(P＜0.05)；只给单一CBP的治疗组肿瘤生长被抑制了56％(A2780)和46％(OVCAR-3)。联合用药(25mg/kg DHA)组则在A2780和OVCAR-3动物肿瘤中均产生70％肿瘤生长抑制(P＜0.05)。 以上细胞和动物水平实验显示，青蒿素及其衍生物具有良好的单独化疗和联合一线化疗药物的增敏作用，结合青蒿素类衍生化合物可以直接靶向PDGFRa发挥其抗肿瘤活性这一结果，提示青蒿素类药物可以用于临床中联合多类化疗药物来治疗肿瘤病人，尤其是病理诊断为PDGFRa阳性的肿瘤病人 实施例4 PDGFRα与病理分级和转移相关 本实施例根据临床病理诊断信息严格选取了45例卵巢癌病人的病理样本，其中包括21例低级别卵巢癌(临床病例级别为I-II，中度或高度分化，无明显的淋巴结，腹腔和网膜等转移)；24例高级别卵巢癌病人(临床病例级别为III-IV，低分化，具有大面积的淋巴结转移，腹腔，网膜，子宫，附件及其他器官转移)。 结果显示(见图6)，与低级别卵巢癌相比，高级别卵巢癌病例中，肿瘤细胞及周围的间质细胞PDGFRα的表达量显著增加。细胞实验显示，利用慢病毒介导的基因干扰技术将卵巢癌细胞A2780和OVCAR3中PDGFRα的表达进行沉默，发现肿瘤细胞的生长和迁移侵袭能力显著降低。 实施例5 药物组合物的制备 组合物1 组合物2 讨论 已有发现表明，PDGFR基因突变或过度激活可以促进细胞的转化能力进而导致恶性肿瘤的发生，如胃肠间质瘤，肺癌，前列腺癌和乳腺癌。PDGFR与其配体结合提高细胞间黏附分子的降解，促进肿瘤细胞的侵袭和转移，同时还能激活微环境中的VEGF，FGF等生长因子进而促进血管生成，加速了肿瘤的恶性进展过程。动物实验和临床病理研究发现，PDGFRα过度表达和激活参与了卵巢癌的发生和发展过程，与病人的病理级别和不良预后显著相关。 本发明内容表明，与低级别未发生转移的卵巢癌病人病理组织相比，高级别发生大规模转移的卵巢癌病人其癌细胞和肿瘤间质细胞中PDGFRα的表达量显著增加，这就表明，PDGFRα可以作为卵巢癌治疗的一个靶点。 本发明中发现青蒿素类衍生物，尤其是青蒿素和双氢青蒿素可以直接结合到PDGFRa分子中，既抑制PDGFRa的受体酪氨酸激酶活性，又抑制PDGFRa的蛋白稳定性，促进其泛素化降解。 分子和动物实验显示，青蒿素类的药物可以通过抑制PDGFRa进而抑制包括卵巢癌和肝癌在内的多重肿瘤的生长、迁移和侵袭转移能力。该结果表明，青蒿素类药物可以作为PDGFR的一种特殊的抑制剂，用于临床上PDGFRa突变或过度激活的肿瘤病人，包括卵巢癌、肝癌、胃肠间质瘤、急性白血病等等。青蒿素类衍生物也具有良好的抗癌增敏活性，例如青蒿素类药物可以显著提高一线化疗药卡铂，吉西他滨等对于卵巢癌和肝癌的治疗效果，尤其是双氢青蒿素对卡铂和吉西他宾具有更强的化疗致敏作用，其高效低毒的特点使之有望作为化疗增敏剂，应用于肿瘤的临床联合化疗。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 Claims (10) 1.青蒿素及其衍生物用于制备抑制选自下组疾病的药物或药物增敏剂的用途：PDGFRα阳性肿瘤、血管性疾病、或纤维性病变。 2.一种青蒿素及其衍生物的用途，其特征在于，用于制备血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)的抑制剂或拮抗剂。 3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的抑制剂或拮抗剂还用于： (i)抑制PDGFRα酪氨酸激酶的活化；和/或 (ii)抑制PDGFRα的蛋白稳定性；和/或 (iii)促进PDGFRα泛素依赖的蛋白酶体介导的降解；和/或 (vi)抑制PDGFRα阳性肿瘤细胞信号通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化。 4.如权利要求1-2任一所述的用途，其特征在于，所述的青蒿素衍生物选自下组：蒿甲醚、二氢青蒿素、青蒿琥酯、双氢蒿甲醚、蒿乙醚等。 5.一种体外非治疗性地抑制血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)活性的方法，其特征在于，包括步骤：将青蒿素和/或青蒿素衍生物与细胞接触，从而抑制或拮抗细胞中血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)。 6.一种制剂组合的用途，所述制剂组合包括： (I)含青蒿素和/或青蒿素衍生物的制剂；和 (II)含吉西他宾或卡铂的制剂， 其特征在于，所述制剂组合用于制备： (a)抑制血小板衍生生长因子受体A的药物组合物或药盒；或 (b)预防和/或治疗肿瘤的药物组合物或药盒。 7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为PDGFRα阳性肿瘤。 8.一种预防和/或治疗PDGFRα相关疾病的方法，其中所述疾病与PDGFRα的过表达或活性过高有关，其特征在于，包括步骤：给需要的对象施用青蒿素和/或青蒿素衍生物，或施用含青蒿素和/或青蒿素衍生物的药物组合物。 9.一种方法，所述方法用于体内或体外抑制PDGFRα酪氨酸激酶的活化、抑制PDGFRα的蛋白稳定性、促进PDGFRα泛素依赖的蛋白酶体介导的降解、抑制信号通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化、和/或抑制PDGFRα阳性肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭，其特征在于，所述方法包括步骤：给需要的对象施用青蒿素和/或青蒿素衍生物。 10.一种用于卵巢癌病理分级的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含检测离体组织PDGFRα表达量的试剂。 Patent Citations (1) Publication numberPriority datePublication dateAssigneeTitle CN102010421A *2010-11-192011-04-13沈阳药科大学青蒿素类衍生物及其应用 Family To Family Citations * Cited by examiner, † Cited by third party Non-Patent Citations (6) Title YAOJIAO, ET. AL.,: ""Dihydroartemisinin is an inhibitor of ovarian cancer cell growth"", 《ACTA PHARMACOL SIN》 * 文宏等: "青篙素治疗肺动脉高压的病理生理机制", 《医学综述》 * 王伟等: "血小板衍生生长因子及其受体在人肝细胞肝癌中的表达及意义", 《实用肿瘤杂志》 * 许光兰等: "青蒿琥酯对实验性肺纤维化大鼠治疗作用及其机理研究", 《临床医学工程》 * 谢兰等: ""血清血管内皮生长因子和血小板衍生生长因子的测定在卵巢肿瘤诊断中的价值"", 《WEST CHINA MEDICAL JOURNAL》 * 马捷等: "蒿甲醚、双氢青蒿素对小鼠硬皮病模型的影响", 《中国中药杂志》 * * Cited by examiner, † Cited by third party Cited By (5) Publication numberPriority datePublication dateAssigneeTitle CN104897887A *2015-06-022015-09-09南京师范大学一种青蒿素及其衍生物抗肿瘤活性的体外筛选方法 CN105878233A *2014-11-122016-08-24南京中医药大学青蒿素衍生物在制备治疗肝纤维化药物中的应用 CN106668866A *2017-02-132017-05-17江苏省中医药研究院一种抗非小细胞肺癌的药物组合物及其应用 CN109875996A *2019-03-072019-06-14南方医科大学青蒿素在制备治疗PI3K/AKT/mTOR激活的人肝癌Huh7细胞的药物中的应用 CN110787159A *2019-09-052020-02-14金乡县人民医院一种倍半萜类化合物在制备治疗胃肠间质瘤药物中的用途 Family To Family Citations * Cited by examiner, † Cited by third party, ‡ Family to family citation Similar Documents PublicationPublication DateTitle Tewari et al.2022Natural products targeting the PI3K-Akt-mTOR signaling pathway in cancer: A novel therapeutic strategy Wu et al.2015Formononetin, a novel FGFR2 inhibitor, potently inhibits angiogenesis and tumor growth in preclinical models Gao et al.2013Tetrandrine suppresses cancer angiogenesis and metastasis in 4T1 tumor bearing mice Jin et al.2018The combined administration of parthenolide and ginsenoside CK in long circulation liposomes with targeted tLyp-1 ligand induce mitochondria-mediated lung cancer apoptosis Chen et al.2017Curcumin: a calixarene derivative micelle potentiates anti-breast cancer stem cells effects in xenografted, triple-negative breast cancer mouse models Khoobchandani et al.2021Green nanotechnology of MGF-AuNPs for immunomodulatory intervention in prostate cancer therapy Shi et al.2020Oxidative stress-driven DR5 upregulation restores TRAIL/Apo2L sensitivity induced by iron oxide nanoparticles in colorectal cancer Wang et al.2019Sotetsuflavone induces autophagy in non-small cell lung cancer through blocking PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in vivo and in vitro Peng et al.2018Oxyfadichalcone C inhibits melanoma A375 cell proliferation and metastasis via suppressing PI3K/Akt and MAPK/ERK pathways CN106963769B2019-10-25含pi3k抑制剂和perk抑制剂的药物组合物及其应用 CN100488500C2009-05-20Cox-2抑制剂预防免疫缺陷的用途 CN103251585B2016-01-27青蒿素及其衍生物在抑制血小板衍生生长因子受体a中的作用及其应用 Wang et al.2020The novel glycyrrhetinic acid–tetramethylpyrazine conjugate TOGA induces anti-hepatocarcinogenesis by inhibiting the effects of tumor-associated macrophages on tumor cells CN103230401B2016-01-20雷公藤内酯酮在抗血管新生药物中的应用 Su et al.2019N-arylpiperazine-containing compound (C2): An enhancer of sunitinib in the treatment of pancreatic cancer, involving D1DR activation Zhong et al.2023Ganoderma lucidum extract promotes tumor cell pyroptosis and inhibits metastasis in breast cancer CN110123809A2019-08-165-甲基-二氢苯并呋喃-咪唑盐类化合物在制药中的应用 CN109453164A2019-03-12一种抗肿瘤的联合用药物 CN101940569B2013-02-13含有索拉非尼和青蒿素及青蒿素类衍生物的药物组合物及其在制备治疗癌症的药物中的应用 CN101125140B2011-04-13二氢青蒿素在制备增强化疗药物抗肿瘤疗效的药物中的应用 CN107583054A2018-01-16隐丹参酮药物组合物及其在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用 Jia et al.2023Tumor Microenvironment-Responsive Nanoherb Delivery System for Synergistically Inhibition of Cancer Stem Cells CN110974835A2020-04-10雷公藤红素在抑制肿瘤血管生成拟态中的应用 CN108030777B2019-11-12氯胍在制备抗肿瘤药物中的应用 CN104083368A2014-10-08G-1在制备基于g蛋白偶联受体30的三阴性乳腺癌靶向药物方面的应用 Priority And Related Applications Priority Applications (1) ApplicationPriority dateFiling dateTitle CN201210034078.6A2012-02-152012-02-15青蒿素及其衍生物在抑制血小板衍生生长因子受体a中的作用及其应用 Applications Claiming Priority (1) ApplicationFiling dateTitle CN201210034078.6A2012-02-15青蒿素及其衍生物在抑制血小板衍生生长因子受体a中的作用及其应用

The invention discloses a kind of applications in the hepatoma Hep G 2 cells drug candidate of preparation treatment EMT activation.Qinghaosu has extensive biology and pharmacological action, and wherein effective antitumour effect causes extensive concern in recent years.The mechanism that qinghaosu plays specific anticancer activity is still unclear, this may limit its further development in preclinical and clinical setting.It is inhibited to hepatocellular carcinoma H22 that the present invention explores qinghaosu；And have found the mechanism of action of its anti-liver cancer and anti-, new method is provided for the treatment and diagnosis of liver cancer patient, is application based theoretical of the qinghaosu in clinical liver cancer treatment.Therefore, qinghaosu can be used as induction apoptosis of human hepatoma cell drug candidate and be researched and developed. 本发明公开了一种在制备治疗EMT激活的肝癌HepG2细胞候选药物中的应用。青蒿素具有广泛的生物和药理作用，其中有效的抗肿瘤作用近年来引起了广泛的关注。青蒿素发挥特定抗癌活性的机制仍不清楚，这可能限制其在临床前和临床环境中的进一步发展。本发明探索了青蒿素对肝癌细胞HepG2具有抑制作用；及发现了其抗肝癌的作用机制，为肝癌患者的治疗和诊断提供新方法，为青蒿素在临床肝癌治疗中的应用奠定理论基础。因此，青蒿素可作为诱导人肝癌细胞凋亡候选药物进行研究和开发。 Artemisinin is in the hepatoma Hep G 2 cells drug candidate of preparation treatment EMT activation Using Technical field The present invention relates to a kind of cancer treatment drugs, belong to biopharmaceutical technology, and in particular to a kind of qinghaosu exists Application in the hepatoma Hep G 2 cells drug candidate of preparation treatment EMT activation. Background technique One of the main reason for liver cancer (HCC) is global cancer related mortality, the liver cancer case more than 80% occur in The developing countries such as state and Africa.HCC has long latency, but while quickly growing usually to advanced stage is just diagnosed.These A possibility that feature is invaded plus its height causes the patient with the disease that cannot obtain the effective treatment.Non-operative treatment It is necessary, because the patient with big tumour (diameter > 5cm) or multiple lesions (> 3) is often unsuitable for hepatectomy.It is unfortunate , the activity of single chemotherapeutant is limited, with low-down treatment rate. Qinghaosu (ART) is a kind of natural products separated from plant ginghao (Artemesiaannua L), quilt It is widely used as anti-malaria medicaments.In recent years, ART and its derivative also have shown that with antitumaous effect, anticancer activity Main mechanism is to induce cell apoptosis.The selective anticancer potentiality and c-MYC, cdc25A, EGFR of qinghaosu and its derivative, The expression of the different moleculars such as gamma-glutamyl amine synzyme (GLCLR) is related.ART also plays in kinds cancer type and in vivo anti- Cancer effect. ART also adjusts the level of u-PA, MMP2, MMP7 and MMP9, all these all related to transfer.But qinghaosu is in liver Application and study on mechanism in cancer cell is still few, although detailed mechanism still needs to be illustrated. Summary of the invention Of the existing technology in order to solve the problems, such as, the purpose of the present invention is to provide a kind of biological therapy tumor candidate medicines Object qinghaosu is preparing the application in antitumor. The present invention is achieved through the following technical solutions: The present invention discloses a kind of application of qinghaosu in the hepatoma Hep G 2 cells drug candidate of preparation treatment EMT activation, Qinghaosu containing treatment effective dose pharmaceutically, the qinghaosu can be by inhibiting Beta- in hepatocellular carcinoma H22 Conversion of the catenin albuminous cell matter to cytoplasm, and then inhibit the generation of EMT, to inhibit the proliferation of HepG2. Application of the present invention, the qinghaosu be extracted from compound inflorescence plant Artemisia annua cauline leaf have peroxy A kind of colourless acicular crystal of the sesquiterpene lactone of group, molecular formula C15H22O5, belong to sesquiterpene lactone, preparing fusing point is 156- 157 DEG C, [a]D17=+66.3 ° (C=1.64 chloroform). Application of the present invention, concentration >=100 μM of the qinghaosu, the drug candidate can be made into tablet, system Preparation Method are as follows: 1) qinghaosu and starch are crossed into 80 meshes； 2) preparation of 10% starch slurry: 0.3g citric acid is dissolved in 20ml distilled water, and it is equal to add 2g starch dispersion Even, about 80 DEG C of heating makes starch gelatinization, uses after being cooled to temperature slurry； 3) fine powder of 30g qinghaosu is weighed in mortar, and 2g starch is added by several times and is ground for equivalent, is uniformly mixed, adds Enter appropriate amount of starch slurry and prepares softwood； 4) 20 mesh nylon mesh are prepared into wet granular, wet granular and 50~60 DEG C of oven drying 30min is carried out with 20 meshes Whole grain, particle is uniformly mixed with 1.5g talcum powder and 1g starch after whole grain, carries out punch die tabletting with 8mm punch die；Up to qinghaosu Tablet. Application of the present invention, the drug can be made into suspension injection, preparation method are as follows: 1) it takes oil for injection to be heated to 115~125 DEG C, keeps the temperature 1~2 hour, suspending agent is added, stirring and dissolving cools to 50 DEG C hereinafter, spare； 2) substance of step 1) is placed in colloid mills, 0.5~10.0g of qinghaosu is added, with the speed of 4000r/min Degree, suspension is made in high speed shear 30min, spare； 3) by the liquid of step 2), 0.1~5.0g of suspending agent, 0.05~0.5g of antioxidant, wetting agent are sequentially added 1.0~3.0g, flocculant 0.2~2.0g, it is stirring while adding, until substantially uniformity, then continuously grinding 10min, it is spare； 4) it by the liquid after the grinding of step 3), is placed in high pressure homogenizer, with pressure 50-55 megapascal, it is equal to carry out high pressure Matter, then, filling and sealing is packed to get 100mL sweet wormwood suspension injection. The invention has the advantages that and advantageous effects: 1) discovery qinghaosu is inhibited to human hepatoma HepG2 cell, and good time and concentration dependant is presented Property； 2) qinghaosu can induce the apoptosis of human hepatoma HepG2 cell； 3) qinghaosu can inhibit transhipment of the Beta-catenin from cytoplasm to nucleus, and then inhibit the generation of EMT, from And inhibit the invasion and transfer of tumour cell； The present invention provides scientific basis to develop new antitumor drug candidate, has important meaning to exploitation new Chinese medicine Justice. Detailed description of the invention Fig. 1 is that cell viability experiment detects qinghaosu to the Proliferation Ability of human hepatoma HepG2 cell in implementation column 1 of the present invention Effect. Fig. 2 is that cell clonal formation experiment detects qinghaosu to the proliferation of human hepatoma HepG2 cell in implementation column 1 of the present invention Inhibiting effect. Fig. 3 is the work that cell streaming experiment detection qinghaosu induces human hepatoma HepG2 cell's apoptosis in implementation column 2 of the present invention With. Fig. 4 is the expression that Western blot detects qinghaosu PARP albumen intracellular to HepG2 in implementation column 3 of the present invention Amount. Fig. 5 is that Western blot detects qinghaosu to Beta-catenin in HepG2 cytoplasm in implementation column 4 of the present invention The influence of albumen. Specific embodiment Below with reference to specific implementation column and the chart technical solution that the present invention will be described in detail, but the present invention be not limited in Under embodiment. The present invention provides a kind of biological therapy tumor candidate drug artemisinin and is preparing the application in antitumor.It is specifically related to A kind of qinghaosu inhibits Beta-catenin albumen in cytoplasm to the conversion of nucleus and then hepatoma Hep G 2 cells is induced to wither It dies；Cell strain used in the experiment in vitro is source of people liver cancer cells (HepG2). The low host toxicity of qinghaosu is the major impetus for developing qinghaosu as anticancer agent.Therefore it is the inventors discovered that green Artemisin has antihepatocarcinoma effect in human hepatoma HepG2 cell, can be used as the potential value of anti-liver cancer and anti-drug candidate exploitation. The present invention is tested by cell viability, cell clonal formation is tested, the experiment of cell streaming, Western blot reality It tests, the researchs such as immunofluorescence experiment confirm that qinghaosu has the mechanism of action of induction hepatocellular carcinoma H22 apoptosis. Testing qinghaosu used below is purchase in sigma company, the U.S.. Various test apparatuses and reagent are commercial goods, are that can buy to obtain by commercial sources.Wherein, qinghaosu It is made by effective component extracting in Chinese traditional herbs artemisia annua, in sigma company, the U.S., product type 361593 is green for purchase Artemisin content is 98%, and cell strain used in experiment in vitro is source of people liver cancer cells (HepG2), derives from U.S. ATCC cell Library. Embodiment 1: Tablet, preparation method is made in qinghaosu drug are as follows: 1) qinghaosu and starch are crossed into 80 meshes； 2) preparation of 10% starch slurry: 0.3g citric acid is dissolved in 20ml distilled water, and it is equal to add 2g starch dispersion Even, about 80 DEG C of heating makes starch gelatinization, uses after being cooled to temperature slurry； 3) fine powder of 30g qinghaosu is weighed in mortar, and 2g starch is added by several times and is ground for equivalent, is uniformly mixed, adds Enter appropriate amount of starch slurry and prepares softwood； 4) 20 mesh nylon mesh are prepared into wet granular, wet granular and 50~60 DEG C of oven drying 30min is carried out with 20 meshes Whole grain, particle is uniformly mixed with 1.5g talcum powder and 1g starch after whole grain, carries out punch die tabletting with 8mm punch die；Up to qinghaosu Tablet. Medication: Adult usual amounts: oral administration first takes 1g, takes within 6~8 hours 0.5g again, respectively takes within the 2nd, 3 0.5g, and the course for the treatment of 3 days, Total amount is 2.5g.Children 15mg/kg takes in 3 days according to the above method. Points for attention: First Trimester is used with caution. Embodiment 2: Suspension injection, preparation method is made in qinghaosu drug are as follows: 1) it takes oil for injection to be heated to 115~125 DEG C, keeps the temperature 1~2 hour, suspending agent is added, stirring and dissolving cools to 50 DEG C hereinafter, spare； 2) substance of step 1) is placed in colloid mills, 0.5~10.0g of qinghaosu is added, with the speed of 4000r/min Degree, suspension is made in high speed shear 30min, spare； 3) by the liquid of step 2), 0.1~5.0g of suspending agent, 0.05~0.5g of antioxidant, wetting agent 1.0 are sequentially added ~3.0g, flocculant 0.2~2.0g, it is stirring while adding, until substantially uniformity, then continuously grinding 10min, it is spare； 4) it by the liquid after the grinding of step 3), is placed in high pressure homogenizer, with pressure 50-55 megapascal, it is equal to carry out high pressure Matter, then, filling and sealing is packed to get 100mL sweet wormwood suspension injection. Medication: deep intramuscular injection: the 1st 200mg gives 100mg, each intramuscular injection 100mg on the the 2nd, 3 again after 6~8 hours, Accumulated dose 500mg (gives 100mg in other severe the 4th day) again.It is used in conjunction 3, daily intramuscular injection 300mg, total amount 900mg.Children 15mg/ Kg has been infused in 3 days according to the above method. Points for attention: First Trimester is used with caution. Compliance test result test example Test example 1-1 (inhibited proliferation of the qinghaosu to human hepatoma HepG2 cell) 1, Cell Viability Assay method measures cell Proliferation 1) it takes in logarithmic growth phase, the good HepG2 cell of growth conditions, it is (green containing 10%FBS and 1% with DMEM Mycin, 1% streptomysin) culture medium adjusts cell density to 3*104A/ml, is inoculated into 96 orifice plates, and every 100 μ L cell of hole is outstanding Liquid, while blank group is set, 37 DEG C, 5%CO2Overnight incubation. 2) after cell adherent growth well for 24 hours after, abandon old culture solution, the sweet wormwood diluted with DMEM culture medium be added Element, concentration are followed successively by 0 μM, 50 μM, 100 μM, 150 μM, 200 μM, and 6 repetitions are arranged in every kind of concentration.Negative control group adds equivalent DMEM.Be put into incubator cultivate respectively for 24 hours, 48h and 72h. 3) after drug effect to corresponding time point, 96 orifice plates are taken out from incubator, are separately added into 20 μ LCellTiter-Luminescent Cell Viability Assay, pays attention to being protected from light, and is put into incubator and is incubated for 10 points Zhong Hou uses the absorbance of Bio-Rad cell town and country detector measurement Luminescent. 4) cell survival rate (cell viability%)=(dosing group/negative control group) × 100%. Experiment in triplicate, calculates separately under different time qinghaosu to the inhibition situation of human hepatoma HepG2 cell. Test example 1-2(cell clonal formation experiment) 1) it prepares cell suspension: abandoning old culture medium, after PBS washes one time plus the pancreatin of 1mL 0.25% digests 3min, micro- When microscopic observation most cells are rounded, abandon pancreatin, add 2 times added by the complete medium of pancreatin amount terminate digestion, will be thin in bottle Born of the same parents gently blow down, and are transferred in 15mL centrifuge tube, and 1000rpm is centrifuged 5min. 2) supernatant is abandoned, fresh culture is added, 1/3 cell suspension is reserved seed for planting, remaining is spare. 3) cell count and bed board: after cell suspension piping and druming mixes, 10 μ L are drawn, blood counting chamber is added under the microscope It counts.The adjusted cell suspension of 2ml concentration is added to every hole of 12 orifice plates, cell number is 2000/hole, 37 DEG C are placed in, 5%CO2It is cultivated in incubator, keeps it adherent overnight. 4) dosing: discarding old culture medium, and the qinghaosu diluted with DMEM culture medium is added, and concentration is followed successively by 0 μM, 50 μ M, 3 repetitions are arranged in 100 μM, 150 μM, every kind of concentration. 5) by plate at 37 DEG C, 5%CO2It is lower to be incubated for 7 days to allow bacterium colony to grow.During prolonged incubation, every three days more Change the fresh complete medium of the qinghaosu (0 μM, 50 μM, 100 μM, 150 μM) containing various concentration.It is washed carefully with 1X PBS Twice, 0.01% crystal violet solution dyes born of the same parents.Gel Doc TM XR+Imager (Bio-Rad) captures image.In order to quantify to collect The rate to be formed is fallen, the staining cell of colony form is dissolved in 10% (v/v) acetic acid, the quantitative absorbance at 540nm. 6) data statistics: Cell colonies assay=(dosing group/negative control group) × 100%. Cell viability is as the result is shown: act on respectively for 24 hours, after 48h, 72h, qinghaosu energy dose-dependant and time dependence suppression The proliferation of HepG2 cell processed. By Figure 1A as it can be seen that the drug concentration in same action time is higher, the cell proliferation inhibition rate compared with blank control Also with increasing. By Figure 1B as it can be seen that when qinghaosu concentration is 100 μM, to the variant statistics of the inhibition of human hepatoma HepG2 cell Meaning. Cell clonal formation experimental result is shown: compared with blank control group, and qinghaosu increases human hepatoma HepG2 cell It grows and significantly inhibits.And when qinghaosu concentration is 100 μM, the Colony formings of liver cancer cells inhibit 50% with Under, and as qinghaosu concentration increases, inhibitory effect is better.Therefore subsequent experimental we choose qinghaosu concentration be 100 μM.Such as Shown in Fig. 2. Test example 2 The influence of cell streaming experiment detection qinghaosu induction human hepatoma HepG2 cell's apoptosis. 1) it takes in logarithmic growth phase, the good HepG2 cell of growth conditions, it is (green containing 10%FBS and 1% with DMEM Mycin, 1% streptomysin) culture medium adjusts cell density to 5*106A/ml, is inoculated into 6 orifice plates, every 100 μ L cell suspension of hole, While blank group is set, and 37 DEG C, 5%CO2Overnight incubation. 2) after cell adherent growth well for 24 hours after, abandon old culture solution, the sweet wormwood diluted with DMEM culture medium be added Element, concentration are followed successively by 0 μM, 100 μM, and 3 repetitions are arranged in every kind of concentration.Negative control group adds the DMEM of equivalent.It is put into incubator Culture is for 24 hours. 3) cell culture fluid is sucked out to a suitable centrifuge tube, PBS washing attached cell is primary, and it is thin that appropriate pancreatin is added Born of the same parents' digestive juice (EDTA can be contained) vitellophag.Incubation at room temperature is absorbed to when gently piping and druming can be such that attached cell blows and beats Pancreatin cell dissociation buffer.It need to avoid the excessive digestion of pancreatin. 4) cell culture fluid collected in step 2a is added, slightly mixes, is transferred in centrifuge tube, 1000g is centrifuged 5 minutes, Supernatant is abandoned, cell is collected, cell is gently resuspended with PBS and counts.Note: the cell culture fluid being added in step 1 on the one hand can To collect the cell that apoptosis or necrosis occurs to have suspended, the serum in another aspect cell culture fluid can effectively inhibit or Neutralize remaining pancreatin；Remaining pancreatin can digest and the Annexin V-PE for subsequent addition of degrading causes dyeing to fail. 5) cell for taking 5-10 ten thousand to be resuspended, 1000g are centrifuged 5 minutes, abandon supernatant, and 195 μ l Annexin V-PE knot is added It closes liquid and cell is gently resuspended. 6) 5 μ l Annexin V-PE are added, mix gently.Note: due to the difference of cell sample, apoptosis and degree of necrosis Difference, can according to preliminary result optimize Annexin V-PE usage amount. 7) room temperature (20-25 DEG C) is protected from light incubation 10-20 minutes, is subsequently placed in ice bath.Aluminium foil can be used to be protected from light. Cell can be resuspended 2-3 times during incubation to improve and mark effect. flow cytomery is carried out immediately. 9) data statistics. The above experiment is in triplicate. Experimental result is shown: the bis- dyes of Annexin V-FITC/PI are the results show that be 100 μM of works in qinghaosu drug concentration With for 24 hours when, compared with blank control, the apoptosis rate of experimental group increases.The apoptosis rate of control group HepG2 cell is respectively 13.36%, after 100 μM of qinghaosu processing for 24 hours, the apoptosis rate of experimental group HepG2 cell is 24.16%, and apoptosis rate is obvious It increases (Fig. 3). Test example 3 The variation of Western blot detection qinghaosu PARP protein expression intracellular to HepG2. The GAP-associated protein GAP of investigation has: PARP. 1) it takes in logarithmic growth phase, the good HepG2 cell of growth conditions, it is (green containing 10%FBS and 1% with DMEM Mycin, 1% streptomysin) culture medium adjusts cell density to 5*106A/ml, is inoculated into 6 orifice plates, every 100 μ L cell suspension of hole, While blank group is set, and 37 DEG C, 5%CO2Overnight incubation. 2) after cell adherent growth well for 24 hours after, abandon old culture solution, the sweet wormwood diluted with DMEM culture medium be added Element, concentration are followed successively by 0 μM, 100 μM, 200 μM of every kind of concentration 3 repetitions of setting.Negative control group adds the DMEM of equivalent.It is put into Incubator culture is for 24 hours. 3) cell is taken out from incubator, sops up culture medium, and the PBS that ice is gently added is cleaned one time, discards residual liquid. 4) it is washed one time with PBS, cell is collected by centrifugation, tries one's best and exhausts supernatant, it is spare to leave cell precipitation. 5) it uses BCA kit to survey protein concentration: using BSA to do standard curve as standard specimen, 2 μ l are added in 96 orifice plates 37 DEG C of reaction 30min of protein solution and 200ul BCA working solution (A:B=50:1) detect absorbance in 450nm with microplate reader, Concentration of specimens is calculated using absorbance concentration calculation formula.It is reference by the minimum sample of wherein concentration, by all samples concentration It adjusts consistent. 6) v/2 albuminous degeneration loading Buffer 95 DEG C of denaturation 10min in metal bath are added, after centrifugation can it is direct on Sample or long-term preservation are in -80 DEG C of refrigerators. 7) loading: westernblotting loading, every hole loading 20ul select hole count, voltage according to sample size 200V, time 30min or so (pre-prepared colloid). transferring film: the filter paper of one piece of long 9cm, the pvdf membrane of wide 6cm and two same sizes are cut, film is put and is soaked in methyl alcohol Bubble, filter paper, film, gel and filter paper " sandwich " formula place it is wet turn 250mA, 90min, it is cathode that glue surface is surveyed to black one, is sure not Position is misplaced, bearing mark is carried out. 9) it closes: film being placed on after closing 1h in the milk of TBST preparation 5%, TBST is cleaned 4 times, each 5min. 10) be incubated for primary antibody: primary antibody is diluted with the Sodium azide 1:1000 of 5% BSA+0.02%.4 DEG C of shaking tables are incubated overnight, Primary antibody dilution can be placed on -20 DEG C of preservations and be used for multiple times. 11) it cleans: being cleaned 4 times with TBST, be placed on shaking table, low speed rocks, each 10min. 12) be incubated for secondary antibody: secondary antibody is diluted with 5% milk that TBST is prepared by 1:5000, is placed on shaking table, is incubated at room temperature 2h.Secondary antibody diluent had better not Reusability. 13) it cleans: rocking cleaning 4 times, each 5min using TBST. 14) expose: development liquid kit A and B liquid press 1:1 adapted, in use, covering film reaction 1min or so is put into egg It is exposed in white imaging system. The above experiment is in triplicate. As the result is shown: compared with blank control, after qinghaosu is added, the intracellular PARP protein expression up-regulation of HepG2 is poor Different statistically significant (P < 0.05), qinghaosu can cross induction HepG2 Apoptosis.As shown in Figure 4. Test example 4 4-1 qinghaosu influences the variation of Beta-catenin protein expression in HepG2 cytoplasm. Beta-catenin protein expression in 1.Western Blot experiment detection HepG2 cytoplasm 1) it takes in logarithmic growth phase, the good HepG2 cell of growth conditions, it is (green containing 10%FBS and 1% with DMEM Mycin, 1% streptomysin) culture medium adjusts cell density to 5*106A/ml, is inoculated into 6 orifice plates, every 100 μ L cell suspension of hole, While blank group is set, and 37 DEG C, 5%CO2Overnight incubation. 2) after cell adherent growth well for 24 hours after, abandon old culture solution, the sweet wormwood diluted with DMEM culture medium be added Element, concentration are followed successively by 0 μM, 100 μM, 200 μM of every kind of concentration 3 repetitions of setting.Negative control group adds the DMEM of equivalent.It is put into Incubator culture is for 24 hours. 3) cell is taken out from incubator, sops up culture medium, and the PBS that ice is gently added is cleaned one time, discards residual liquid. 4) 200 microlitres of suppressor proteins extraction agent A for being added to PMSF are added in every 20 microlitres of cell precipitations. 5) the violent Vortex of most high speed 5 seconds, completely suspends cell precipitation and scatter.If (cell precipitation is not complete It suspends and scatter entirely, the vortex time can be appropriately extended.) 6) ice bath 10-15 minutes. 7) B10 microlitres of suppressor proteins extraction agent is added.The violent Vortex of most high speed 5 seconds, ice bath 1 minute. the violent Vortex of most high speed 5 seconds, 4 DEG C of 12,000-16,000g are centrifuged 5 minutes. 9) supernatant is drawn immediately into the plastic tube of a pre-cooling, the suppressor proteins as extracted.It can make immediately With can also freeze.(precipitating must not be touched, the supernatant of minimum volume can be retained above precipitating, so as not to touch it is heavy It forms sediment.Obtainable supernatant after suppressor proteins extraction agent A cracking of every 2,000,000 cell in 200 microlitres of this products, cell Starching protein concentration is about 2-5mg/ml, and different cells are different.) 10) for precipitating, remaining supernatant is exhausted completely, and 50 microlitres of Nuclear extract extracting examinations for being added to PMSF are added Agent.(pollution of suppressor proteins can be brought by not exhausting supernatant.) 11) violent Vortex 15-30 seconds of most high speed completely suspend cell precipitation and scatter.Then ice bath is put back to In, violent Vortex 15-30 seconds, totally 30 minutes of high speed again every 1-2 minutes. 12) 4 DEG C of 12,000-16,000g are centrifuged 10 minutes. 13) supernatant is drawn immediately into the plastic tube of a pre-cooling, the Nuclear extract as extracted.It can make immediately With can also be frozen with -70 DEG C. 14) the RIPA cell pyrolysis liquid (containing protease inhibitors) of 100 μ l is added, scrapes cell with cell spatula, inhales Into EP pipe, it is inserted into ice and cracks 1h, during which overturn makes cell cracking abundant several times. 15) EP pipe is placed on 14000rpm in 4 DEG C of centrifuges and is centrifuged 20min, take supernatant. 16) it uses BCA kit to survey protein concentration: using BSA to do standard curve as standard specimen, 2 μ l are added in 96 orifice plates 37 DEG C of reaction 30min of protein solution and 200ul BCA working solution (A:B=50:1) detect absorbance in 450nm with microplate reader, Concentration of specimens is calculated using absorbance concentration calculation formula.It is reference by the minimum sample of wherein concentration, by all samples concentration It adjusts consistent. 17) v/2 albuminous degeneration loading Buffer 95 DEG C of denaturation 10min in metal bath are added, it can be direct after centrifugation Loading or long-term preservation are in -80 DEG C of refrigerators. 18) loading: western blotting loading, every hole loading 20ul select hole count, voltage according to sample size 200V, time 30min or so (pre-prepared colloid). 19) transferring film: the filter paper of one piece of long 9cm, the pvdf membrane of wide 6cm and two same sizes are cut, film is put in methyl alcohol Impregnate, filter paper, film, gel and filter paper " sandwich " formula place it is wet turn 250mA, 90min, it is cathode that glue surface is surveyed to black one, is cut Position is not misplaced, bearing mark is carried out. 20) it closes: film being placed on after closing 1h in the milk of TBST preparation 5%, TBST is cleaned 4 times, each 5min. 21) be incubated for primary antibody: primary antibody is diluted with the Sodium azide 1:1000 of 5% BSA+0.02%.4 DEG C of shaking tables are incubated overnight, Primary antibody dilution can be placed on -20 DEG C of preservations and be used for multiple times. 22) it cleans: being cleaned 4 times with TBST, be placed on shaking table, low speed rocks, each 10min. 23) be incubated for secondary antibody: secondary antibody is diluted with 5% milk that TBST is prepared by 1:5000, is placed on shaking table, is incubated at room temperature 2h.Secondary antibody diluent had better not Reusability. 24) it cleans: rocking cleaning 4 times, each 5min using TBST. 25) expose: development liquid kit A and B liquid press 1:1 adapted, in use, covering film reaction 1min or so is put into egg It is exposed in white imaging system. The above experiment is in triplicate. 4-2 immunofluorescence experiment detects Beta-catenin protein expression in HepG2 cytoplasm 1) it takes in logarithmic growth phase, the good HepG2 cell of growth conditions, it is (green containing 10%FBS and 1% with DMEM Mycin, 1% streptomysin) culture medium adjusts cell density to 5*106A/ml, is inoculated into 6 orifice plates, every 100 μ L cell suspension of hole, While blank group is set, and 37 DEG C, 5%CO2Overnight incubation. 2) after for 24 hours, renew fresh DMEM culture medium, the qinghaosu that concentration is 100 μM, control group addition etc. is added in experimental group The DMSO of amount, culture is for 24 hours. 3) liquid is blotted, one layer of 2-3mm diluted 4% formaldehyde of PBS is then covered on cell. 4) cell 15 minutes are fixed at room temperature. 5) fixer is blotted, three times with PBS rinsing, 5 minutes every time. 6) seal sheet glass 60 minutes in Block buffer. 7) when seal sheet glass, the middle dilution ratio recommended, prepares primary antibody in antibody dilution buffer to specifications. Block buffer is sucked, the primary antibody after dilution is added. 9) it is incubated overnight at a temperature of 4 DEG C. 10) three times with PBS rinsing, 5 minutes every time. 11) after the secondary antibody dilution of fluorescein will be coupled with antibody dilution buffer, it is small that it is protected from light incubation sample 1-2 at room temperature When. 12) secondary antibody Hoechst is protected from light incubation 1-2 hours, and PBS is washed 3 times, and 5 minutes every time, 5% glycerol mounting was burnt in copolymerization Microscopically observation.Experiment is in triplicate. As the result is shown: Western blot experimental result is shown, compared with blank control, after qinghaosu is added, in HepG2 cytoplasm The up-regulation of Beta-catenin protein expression, difference is statistically significant (P < 0.05), and trendless changes in nucleus, qinghaosu Transhipment of the Beta-catenin from cytoplasm to nucleus can enough be inhibited excessively, and then inhibit the generation of EMT, to inhibit tumour thin The invasion and transfer (as indicated by figures 5 a-5b) of born of the same parents.Immunofluorescence results are consistent (such as Fig. 5 C institute with Western blot result Show). The above described is only a preferred embodiment of the present invention, be not intended to limit the present invention in any form, therefore Without departing from the technical solutions of the present invention, to the above embodiments according to the technical essence of the invention any simply to repair Change, equivalent variations and modification, all of which are still within the scope of the technical scheme of the invention. Claims (5) 1. application of the qinghaosu in the hepatoma Hep G 2 cells drug candidate of preparation treatment EMT activation, it is characterised in that: contain The qinghaosu for the treatment of effective dose pharmaceutically, the qinghaosu can be by inhibiting Beta- in hepatocellular carcinoma H22 Conversion of the catenin albuminous cell matter to cytoplasm, and then inhibit the generation of EMT, to inhibit the proliferation of HepG2. 2. application according to claim 1, it is characterised in that: the qinghaosu is from compound inflorescence plant Artemisia annua cauline leaf A kind of colourless acicular crystal of the sesquiterpene lactone for having peroxy-radical of middle extraction, molecular formula C15H22O5, belong to sesquiterpene lactone, Preparing fusing point is 156-157 DEG C, [a]D17=+66.3 ° (C=1.64 chloroform). 3. application according to claim 1, it is characterised in that: concentration >=100 μM of the qinghaosu. 4. application according to claim 1-3, it is characterised in that: the drug candidate can be made into tablet, system Preparation Method are as follows: 1) qinghaosu and starch are crossed into 80 meshes； 2) preparation of 10% starch slurry: 0.3g citric acid is dissolved in 20ml distilled water, and it is uniform to add 2g starch dispersion, is added About 80 DEG C of heat makes starch gelatinization, uses after being cooled to temperature slurry； 3) fine powder of 30g qinghaosu is weighed in mortar, and 2g starch is added by several times and is ground for equivalent, is uniformly mixed, and is added suitable Amount starch slurry prepares softwood； 4) 20 mesh nylon mesh are prepared into wet granular, wet granular and 50~60 DEG C of oven drying 30min is carried out whole with 20 meshes , particle is uniformly mixed with 1.5g talcum powder and 1g starch after whole grain, carries out punch die tabletting with 8mm punch die；Up to Artemisinin Tablets Agent. 5. application according to any one of claim 1-3, it is characterised in that: the drug can be made into suspension injection, Preparation method are as follows: 1) it takes oil for injection to be heated to 115~125 DEG C, keeps the temperature 1~2 hour, suspending agent is added, stirring and dissolving cools to 50 DEG C Hereinafter, spare； 2) substance of step 1) is placed in colloid mills, 0.5~l0.0g of qinghaosu is added, with the speed of 4000r/min, Suspension is made in high speed shear 30min, spare； 3) by the liquid of step 2), sequentially add 0.1~5.0g of suspending agent, 0.05~0.5g of antioxidant, wetting agent 1.0~ 3.0g, flocculant 0.2~2.0g, it is stirring while adding, until substantially uniformity, then continuously grinding 10min, it is spare； 4) it by the liquid after the grinding of step 3), is placed in high pressure homogenizer, with pressure 50-55 megapascal, progress is high-pressure homogeneous, so Afterwards, filling and sealing is packed to get 100mL sweet wormwood suspension injection. Patent Citations (1) Publication numberPriority datePublication dateAssigneeTitle CN101856352A *2009-04-102010-10-13中国科学院上海生命科学研究院Synergistic effect of arteannuim and derivative thereof on chemotherapeutic agent Family To Family Citations * Cited by examiner, † Cited by third party Non-Patent Citations (1) Title TAN WEIFENG等.: "Artemisinin inhibits in vitro and in vivo invasion and metastasis of human hepatocellular carcinomacells.", 《PHYTOMEDICINE》 * * Cited by examiner, † Cited by third party Similar Documents PublicationPublication DateTitle Abdel-Salam et al.2019Cytotoxicity of Luffa cylindrica (L.) M. 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And Related Applications Priority Applications (1) ApplicationPriority dateFiling dateTitle CN201910349857.7A2019-04-282019-04-28Application of the qinghaosu in the hepatoma Hep G 2 cells drug candidate of preparation treatment EMT activation Applications Claiming Priority (1) ApplicationFiling dateTitle CN201910349857.7A2019-04-28Application of the qinghaosu in the hepatoma Hep G 2 cells drug candidate of preparation treatment EMT activation https://patents.google.com/patent/CN110354118A/en 青蒿素在制备治疗EMT激活的肝癌HepG2细胞候选药物中的 应用 技术领域 本发明涉及一种肝癌治疗药物，属于生物制药技术领域，具体涉及一种青蒿素在制备治疗EMT激活的肝癌HepG2细胞候选药物中的应用。 背景技术 肝癌(HCC)是全球癌症相关死亡的主要原因之一，超过80％的肝癌病例发生在中国和非洲等发展中国家。HCC具有长潜伏期，但发展迅速通常到晚期时才被诊断出来。这些特征加上其高度入侵的可能性，导致患有该疾病的患者不能得到有效的治疗。非手术方法是必要的，因为患有大肿瘤(直径>5cm)或多个病灶(>3)的患者通常不适合肝切除术。不幸的是，单一化学治疗剂的活性是有限的，具有非常低的治疗率。 青蒿素(ART)是一种从植物青蒿(Artemesiaannua L)中分离出来的天然产物，被广泛用作抗疟疾药物。近年来，ART及其衍生物也已经显示出具有抗癌作用，其抗癌活性的主要机制是诱导细胞凋亡。青蒿素及其衍生物的选择性抗癌潜力与c-MYC， cdc25A，EGFR，γ-谷氨酰胺合成酶(GLCLR)等不同分子的表达有关。ART还在多种癌症类型及体内发挥抗癌作用。 ART还调节u-PA，MMP2，MMP7和MMP9的水平，所有这些都与转移相关。但青蒿素在肝癌细胞中的应用和作用机制研究尚少，虽然详细的机制仍有待阐明。 发明内容 为了解决现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种生物治疗肿瘤候选药物青蒿素在制备抗肿瘤中的应用。 本发明是通过如下技术方案实现的： 本发明公开一种青蒿素在制备治疗EMT激活的肝癌HepG2细胞候选药物中的应用，含有药学上的治疗有效剂量的青蒿素，所述青蒿素能够通过抑制肝癌细胞HepG2 中Beta-catenin蛋白细胞质向细胞浆的转换，进而抑制EMT的发生，从而抑制HepG2 的增殖。 本发明所述的应用，所述青蒿素是从复合花序植物黄花蒿茎叶中提取的有过氧基团的倍半萜内酯的一种无色针状晶体，分子式为C15H22O5，属倍半萜内酯，制备熔点为 156-157℃，[a]D17＝+66.3°(C＝1.64氯仿)。 本发明所述的应用，所述青蒿素的浓度≥100μM，所述候选药物可制成片剂，其制备方法为： 1)将青蒿素和淀粉过80目筛； 2)10％淀粉浆的制备：将0.3g枸橼酸溶解于20ml蒸馏水中，再加入2g淀粉分散均匀，加热约80℃使淀粉糊化，冷却至温浆后使用； 3)称取30g青蒿素的细粉于乳钵中，等量分次加入2g淀粉进行研磨，混合均匀，加入适量淀粉浆制备软材； 4)将20目尼龙筛制备湿颗粒，将湿颗粒与50～60℃烘箱干燥30min，用20目筛进行整粒，整粒后颗粒与1.5g滑石粉和1g淀粉混合均匀，以8mm冲模进行冲模压片；即得青蒿素片剂。 本发明所述的应用，所述药物可制成混悬注射液，其制备方法为： 1)取注射用油加热至115～125℃，保温1～2小时，加入助悬剂，搅拌溶解，降温到50℃以下，备用； 2)将步骤1)的物质置于高速胶体磨中，加入青蒿素0.5～10.0g，以4000r/min的速度，高速剪切30min，制成混悬液，备用； 3)将步骤2)的液体，依次加入助悬剂0.1～5.0g、抗氧化剂0.05～0.5g、湿润剂1.0～3.0g、絮凝剂0.2～2.0g，边加边搅拌，直至完全均匀，再连续研磨10min，备用； 4)将步骤3)的研磨后的液体，置于高压均质机中，以压力50-55兆帕，进行高压均质，然后，灌装封口，包装，即得100mL青蒿混悬注射液。 本发明具有如下优点和有益技术效果： 1)发现青蒿素对人肝癌HepG2细胞具有抑制作用，并呈现良好的时间和浓度依赖性； 2)青蒿素可诱导人肝癌HepG2细胞的凋亡； 3)青蒿素可抑制Beta-catenin从细胞质向细胞核的转运，进而抑制EMT的发生，从而抑制肿瘤细胞的侵袭和转移； 本发明为研制新的抗肿瘤候选药物提供了科学依据，对开发中药新药具有重要意义。 附图说明 图1为本发明实施列1中细胞活力实验检测青蒿素对人肝癌HepG2细胞的增殖抑制作用。 图2为本发明实施列1中细胞克隆形成实验检测青蒿素对人肝癌HepG2细胞的增殖抑制作用。 图3为本发明实施列2中细胞流式实验检测青蒿素诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的作用。 图4为本发明实施列3中Western blot检测青蒿素对HepG2细胞内PARP蛋白的表达量。 图5为本发明实施列4中Western blot检测青蒿素对HepG2细胞质内Beta-catenin蛋白的影响。 具体实施方式 下面结合具体实施列和图表详细说明本发明的技术方案，但本发明并不仅限于以下的实施例。 本发明提供一种生物治疗肿瘤候选药物青蒿素在制备抗肿瘤中的应用。具体涉及一种青蒿素抑制细胞质内Beta-catenin蛋白向细胞核的转换进而诱导肝癌HepG2细胞凋亡；所述的体外实验所用的细胞株为人源肝癌细胞(HepG2)。 青蒿素的低宿主毒性，是开发青蒿素作为抗癌剂的主要动力。故本发明人发现青蒿素在人肝癌HepG2细胞中具有抗肝癌作用，可以作为抗肝癌候选药物开发的潜在价值。 本发明通过细胞活力测试、细胞克隆形成实验、细胞流式实验、Western blot实验、免疫荧光实验等研究证实了青蒿素具有诱导肝癌细胞HepG2凋亡的作用机制。 以下实验所用的青蒿素是购买于美国sigma公司。 各种试验仪器与试剂均为市售商品，均为可通过商业途径购买获得。其中，青蒿素由传统中草药黄花蒿中提取有效成分制得，购买于美国sigma公司，产品型号为361593，青蒿素含量为98％，体外实验所用的细胞株为人源肝癌细胞(HepG2)，来源于美国ATCC 细胞库。 实施例1： 将青蒿素药物制成片剂，其制备方法为： 1)将青蒿素和淀粉过80目筛； 2)10％淀粉浆的制备：将0.3g枸橼酸溶解于20ml蒸馏水中，再加入2g淀粉分散均匀，加热约80℃使淀粉糊化，冷却至温浆后使用； 3)称取30g青蒿素的细粉于乳钵中，等量分次加入2g淀粉进行研磨，混合均匀，加入适量淀粉浆制备软材； 4)将20目尼龙筛制备湿颗粒，将湿颗粒与50～60℃烘箱干燥30min，用20目筛进行整粒，整粒后颗粒与1.5g滑石粉和1g淀粉混合均匀，以8mm冲模进行冲模压片；即得青蒿素片剂。 给药方法： 成人常用量：口服给药，先服1g，6～8小时再服0.5g，第2、3日各服0.5g，疗程3日，总量为2.5g。小儿15mg/kg，按上述方法3日内服完。 注意事项：妊娠早期慎用。 实施例2： 将青蒿素药物制成混悬注射液，其制备方法为： 1)取注射用油加热至115～125℃，保温1～2小时，加入助悬剂，搅拌溶解，降温到50℃以下，备用； 2)将步骤1)的物质置于高速胶体磨中，加入青蒿素0.5～10.0g，以4000r/min的速度，高速剪切30min，制成混悬液，备用； 3)将步骤2)的液体，依次加入助悬剂0.1～5.0g、抗氧化剂0.05～0.5g、湿润剂1.0～3.0g、絮凝剂0.2～2.0g，边加边搅拌，直至完全均匀，再连续研磨10min，备用； 4)将步骤3)的研磨后的液体，置于高压均质机中，以压力50-55兆帕，进行高压均质，然后，灌装封口，包装，即得100mL青蒿混悬注射液。 给药方法：深部肌注：第1次200mg，6～8小时后再给100mg，第2、3日各肌注100mg，总剂量500mg(别重症第4天再给100mg)。连用3日，每日肌注300mg，总量900mg。小儿15mg/kg，按上述方法3日内注完。 注意事项：妊娠早期慎用。 效果验证试验例 试验例1-1(青蒿素对人肝癌HepG2细胞的增殖抑制作用) 1、Cell Viability Assay法测定细胞增殖 1)取处于对数生长期，生长状态良好的HepG2细胞，用DMEM(含有10％FBS 和1％青霉素、1％链霉素)培养基调整细胞密度到3*104个/ml，接种到96孔板，每孔 100μL细胞悬液，同时设置空白组，37℃，5％CO2培养过夜。 2)待细胞贴壁生长良好24h后，弃旧的培养液，加入用DMEM培养基稀释过的青蒿素，浓度依次为0μM、50μM、100μM、150μM、200μM，每种浓度设置6个重复。阴性对照组加等量的DMEM。放入培养箱分别培养24h、48h和72h。 3)待药物作用到相应时间点后，从培养箱中取出96孔板，分别加入 20μLCellTiter-Luminescent Cell Viability Assay，注意避光，放入培养箱孵育10分钟后，使用Bio-Rad细胞城乡检测仪测量Luminescent的吸光度。 4)细胞存活率(cell viability％)＝(加药组/阴性对照组)×100％。 实验重复三次，分别计算不同时间下青蒿素对人肝癌HepG2细胞的抑制情况。 试验例1-2(细胞克隆形成实验) 1)制备细胞悬液：弃旧培养基，PBS洗一遍后加1mL 0.25％的胰酶消化3min，显微镜下观察大部分细胞变圆时，弃胰酶，加2倍所加胰酶量的完全培养基终止消化，将瓶内细胞轻轻吹下，并转移到15mL离心管中，1000rpm离心5min。 2)弃上清，加入新鲜培养基，1/3的细胞悬液留种，其余备用。 3)细胞计数和铺板：细胞悬液吹打混匀后，吸取10μL加入血球计数板在显微镜下计数。向12孔板的每孔加入2ml浓度调整过的细胞悬液，细胞数为2000个/孔，置于 37℃，5％CO2培养箱中培养，使其过夜贴壁。 4)加药：弃去旧培养基，加入用DMEM培养基稀释过的青蒿素，浓度依次为0μM、 50μM、100μM、150μM，每种浓度设置3个重复。 5)将平板在37℃，5％CO2下孵育7天以允许菌落生长。在长期孵育期间，每三天更换含有不同浓度的青蒿素(0μM、50μM、100μM、150μM)的新鲜完全培养基。用 1X PBS洗涤细胞两次，0.01％结晶紫溶液染色。Gel Doc TM XR+Imager(Bio-Rad)捕获图像。为了量化集落形成的速率，将集落形式的染色细胞溶解在10％(v/v)乙酸中，在540nm处定量吸光度。 6)数据统计：细胞克隆形成率＝(加药组/阴性对照组)×100％。 细胞活力结果显示：分别作用24h、48h、72h后，青蒿素能剂量依赖和时间依赖性抑制HepG2细胞的增殖。 由图1A可见，在同一作用时间的药物浓度越高，与空白对照相比细胞增殖抑制率也随着增高。 由图1B可见，在青蒿素浓度为100μM时，对人肝癌HepG2细胞的抑制有差异统计学意义。 细胞克隆形成实验结果显示：与空白对照组相比较，青蒿素对人肝癌HepG2细胞增殖具有明显的抑制作用。且在青蒿素浓度为100μM时，肝癌细胞的集落形成抑制在 50％以下，且随着青蒿素浓度增大，抑制效果越好。故后续实验我们选取青蒿素浓度为 100μM。如图2所示。 试验例2 细胞流式实验检测青蒿素诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的影响。 1)取处于对数生长期，生长状态良好的HepG2细胞，用DMEM(含有10％FBS 和1％青霉素、1％链霉素)培养基调整细胞密度到5*106个/ml，接种到6孔板，每孔100μL 细胞悬液，同时设置空白组，37℃，5％CO2培养过夜。 2)待细胞贴壁生长良好24h后，弃旧的培养液，加入用DMEM培养基稀释过的青蒿素，浓度依次为0μM、100μM，每种浓度设置3个重复。阴性对照组加等量的DMEM。放入培养箱培养24h。 3)将细胞培养液吸出至一合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶细胞消化液(可含有EDTA)消化细胞。室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液。需避免胰酶的过度消化。 4)加入步骤2a中收集的细胞培养液，稍混匀，转移到离心管内，1000g离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。注意：加入步骤1中的细胞培养液一方面可以收集已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞，另一方面细胞培养液中的血清可以有效抑制或中和残留的胰酶；残留的胰酶会消化并降解后续加入的Annexin V-PE导致染色失败。 5)取5-10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195μl Annexin V-PE 结合液轻轻重悬细胞。 6)加入5μl Annexin V-PE，轻轻混匀。注：由于细胞样品的差异、凋亡和坏死程度的差异，可根据预实验结果优化Annexin V-PE的使用量。 7)室温(20-25℃)避光孵育10-20分钟，随后置于冰浴中。可以使用铝箔进行避光。孵育过程中可以重悬细胞2-3次以改善标记效果。 8)随即进行流式细胞仪检测。 9)数据统计。 以上实验重复三次。 实验结果显示：Annexin V-FITC/PI双染结果显示，在青蒿素药物浓度为100μM作用24h时，与空白对照相比较，实验组的细胞凋亡率增加。对照组HepG2细胞的凋亡率分别为13.36％，经100μM青蒿素处理24h后，实验组HepG2细胞的凋亡率为24.16％，其凋亡率明显升高(图3)。 试验例3 Western blot检测青蒿素对HepG2细胞内PARP蛋白表达的变化。 考察的相关蛋白有：PARP。 1)取处于对数生长期，生长状态良好的HepG2细胞，用DMEM(含有10％FBS 和1％青霉素、1％链霉素)培养基调整细胞密度到5*106个/ml，接种到6孔板，每孔100μL 细胞悬液，同时设置空白组，37℃，5％CO2培养过夜。 2)待细胞贴壁生长良好24h后，弃旧的培养液，加入用DMEM培养基稀释过的青蒿素，浓度依次为0μM、100μM、200μM每种浓度设置3个重复。阴性对照组加等量的 DMEM。放入培养箱培养24h。 3)从培养箱中取出细胞，吸掉培养基，轻轻加入冰的PBS清洗一遍，弃掉残留液体。 4)用PBS洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。 5)使用BCA试剂盒测蛋白浓度：用BSA作为标样做标准曲线，在96孔板中加入 2μl蛋白溶液和200ul BCA工作液(A：B＝50：1)37℃反应30min，用酶标仪在450nm 检测吸光度，利用吸光度浓度计算公式计算样本浓度。按其中浓度最低的样品为参照，将所有样品浓度调节一致。 6)加入v/2蛋白变性loading Buffer在金属浴中95℃变性10min，离心后可直接上样，或长期保存在-80℃冰箱。 7)上样：westernblotting上样，每孔上样20ul，根据样品数量选择孔数，电压200V，时间30min左右(预制胶)。 8)转膜：切一块长9cm、宽6cm的PVDF膜和两张相同大小的滤纸，将膜放在甲醇中浸泡，滤纸、膜、凝胶和滤纸“三明治”式放置湿转250mA、90min，胶面向黑的一测即负极，切勿放错位置，做好方向标记。 9)封闭：将膜放在TBST配制5％的牛奶中封闭1h后，TBST清洗4次，每次5min。 10)孵育一抗：一抗用5％的BSA+0.02％的叠氮钠1：1000稀释。4℃摇床孵育过夜，一抗稀释液可有放在-20℃保存多次使用。 11)清洗：用TBST清洗4次，放在摇床，低速摇晃，每次10min。 12)孵育二抗：二抗用TBST配制的5％牛奶按1：5000稀释，放置在摇床，室温孵育2h。二抗稀释液最好不要反复使用。 13)清洗：使用TBST摇晃清洗4次，每次5min。 14)曝光：显影液试剂盒A与B液按1：1配用，使用时，覆盖住膜反应1min左右放入蛋白成像系统中曝光。 以上实验重复三次。 结果显示：与空白对照相比较，加入青蒿素后，HepG2细胞内PARP蛋白表达上调，差异有统计学意义(P<0.05)，青蒿素能过诱导HepG2细胞凋亡。如图4所示。 试验例4 4-1青蒿素对HepG2细胞质内Beta-catenin蛋白表达的变化影响。 1.Western Blot实验检测HepG2细胞质内Beta-catenin蛋白表达 1)取处于对数生长期，生长状态良好的HepG2细胞，用DMEM(含有10％FBS 和1％青霉素、1％链霉素)培养基调整细胞密度到5*106个/ml，接种到6孔板，每孔100μL 细胞悬液，同时设置空白组，37℃，5％CO2培养过夜。 2)待细胞贴壁生长良好24h后，弃旧的培养液，加入用DMEM培养基稀释过的青蒿素，浓度依次为0μM、100μM、200μM每种浓度设置3个重复。阴性对照组加等量的 DMEM。放入培养箱培养24h。 3)从培养箱中取出细胞，吸掉培养基，轻轻加入冰的PBS清洗一遍，弃掉残留液体。 4)每20微升细胞沉淀加入200微升添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A。 5)最高速剧烈Vortex 5秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。(如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开，可以适当延长vortex时间。) 6)冰浴10-15分钟。 7)加入细胞浆蛋白抽提试剂B10微升。最高速剧烈Vortex 5秒，冰浴1分钟。 8)最高速剧烈Vortex 5秒，4℃12,000-16,000g离心5分钟。 9)立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白。可以立即使用，也可以冻存。(千万不要触及沉淀，可以在沉淀上方保留极小体积的上清，以免触及沉淀。每200万细胞用200微升本产品中的细胞浆蛋白抽提试剂A裂解后可获得的上清，其细胞浆蛋白浓度约为2-5mg/ml，不同细胞有所不同。) 10)对于沉淀，完全吸尽残余的上清，加入50微升添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂。(不吸尽上清会带来细胞浆蛋白的污染。) 11)最高速剧烈Vortex 15-30秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中，每隔1-2分钟再高速剧烈Vortex 15-30秒，共30分钟。 12)4℃12,000-16,000g离心10分钟。 13)立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞核蛋白。可以立即使用，也可以-70℃冻存。 14)加入100μl的RIPA细胞裂解液(含有蛋白酶抑制剂)，用细胞刮铲刮下细胞，吸到EP管中，插入冰里裂解1h，期间颠倒几次使细胞裂解充分。 15)将EP管放在4℃离心机中14000rpm离心20min，取上清。 16)使用BCA试剂盒测蛋白浓度：用BSA作为标样做标准曲线，在96孔板中加入2μl蛋白溶液和200ul BCA工作液(A:B＝50：1)37℃反应30min，用酶标仪在450nm 检测吸光度，利用吸光度浓度计算公式计算样本浓度。按其中浓度最低的样品为参照，将所有样品浓度调节一致。 17)加入v/2蛋白变性loading Buffer在金属浴中95℃变性10min，离心后可直接上样，或长期保存在-80℃冰箱。 18)上样：western blotting上样，每孔上样20ul，根据样品数量选择孔数，电压200V，时间30min左右(预制胶)。 19)转膜：切一块长9cm、宽6cm的PVDF膜和两张相同大小的滤纸，将膜放在甲醇中浸泡，滤纸、膜、凝胶和滤纸“三明治”式放置湿转250mA、90min，胶面向黑的一测即负极，切勿放错位置，做好方向标记。 20)封闭：将膜放在TBST配制5％的牛奶中封闭1h后，TBST清洗4次，每次5min。 21)孵育一抗：一抗用5％的BSA+0.02％的叠氮钠1：1000稀释。4℃摇床孵育过夜，一抗稀释液可有放在-20℃保存多次使用。 22)清洗：用TBST清洗4次，放在摇床，低速摇晃，每次10min。 23)孵育二抗：二抗用TBST配制的5％牛奶按1：5000稀释，放置在摇床，室温孵育2h。二抗稀释液最好不要反复使用。 24)清洗：使用TBST摇晃清洗4次，每次5min。 25)曝光：显影液试剂盒A与B液按1：1配用，使用时，覆盖住膜反应1min左右放入蛋白成像系统中曝光。 以上实验重复三次。 4-2免疫荧光实验检测HepG2细胞质内Beta-catenin蛋白表达 1)取处于对数生长期，生长状态良好的HepG2细胞，用DMEM(含有10％FBS 和1％青霉素、1％链霉素)培养基调整细胞密度到5*106个/ml，接种到6孔板，每孔100μL 细胞悬液，同时设置空白组，37℃，5％CO2培养过夜。 2)24h后，换新鲜的DMEM培养基，实验组加入浓度为100μM的青蒿素，对照组加入等量的DMSO，培养24h。 3)吸干液体，随后在细胞上覆盖一层2-3mm用PBS稀释的4％甲醛。 4)室温下固定细胞15分钟。 5)吸干固定液，用PBS漂洗三次，每次5分钟。 6)在封闭缓冲液中封闭标本60分钟。 7)封闭标本时，按照说明书中推荐的稀释比例，在抗体稀释缓冲液中配制一抗。 8)吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。 9)4℃温度下孵育过夜。 10)用PBS漂洗三次，每次5分钟。 11)用抗体稀释缓冲液将偶联荧光素的二抗稀释后，室温下避光孵育标本1-2小时。 12)二抗Hoechst避光孵育1-2小时，PBS洗3遍,每次5分钟，5％甘油封片，在共聚焦显微镜下观察。实验重复三次。 结果显示： Western blot实验结果显示，与空白对照相比较，加入青蒿素后，HepG2细胞质内Beta-catenin蛋白表达上调，差异有统计学意义(P<0.05)，而细胞核内无趋势变化，青蒿素能过够抑制Beta-catenin从细胞质向细胞核的转运，进而抑制EMT的发生，从而抑制肿瘤细胞的侵袭和转移(如图5A-5B所示)。免疫荧光结果与Western blot结果相符合(如图5C所示)。 以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。 Claims (5) 1.青蒿素在制备治疗EMT激活的肝癌HepG2细胞候选药物中的应用，其特征在于：含有药学上的治疗有效剂量的青蒿素，所述青蒿素能够通过抑制肝癌细胞HepG2中Beta-catenin蛋白细胞质向细胞浆的转换，进而抑制EMT的发生，从而抑制HepG2的增殖。 2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述青蒿素是从复合花序植物黄花蒿茎叶中提取的有过氧基团的倍半萜内酯的一种无色针状晶体，分子式为C15H22O5，属倍半萜内酯，制备熔点为156-157℃，[a]D17＝+66.3°(C＝1.64氯仿)。 3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述青蒿素的浓度≥100μM。 4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于：所述候选药物可制成片剂，其制备方法为： 1)将青蒿素和淀粉过80目筛； 2)10％淀粉浆的制备：将0.3g枸橼酸溶解于20ml蒸馏水中，再加入2g淀粉分散均匀，加热约80℃使淀粉糊化，冷却至温浆后使用； 3)称取30g青蒿素的细粉于乳钵中，等量分次加入2g淀粉进行研磨，混合均匀，加入适量淀粉浆制备软材； 4)将20目尼龙筛制备湿颗粒，将湿颗粒与50～60℃烘箱干燥30min，用20目筛进行整粒，整粒后颗粒与1.5g滑石粉和1g淀粉混合均匀，以8mm冲模进行冲模压片；即得青蒿素片剂。 5.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于：所述药物可制成混悬注射液，其制备方法为： 1)取注射用油加热至115～125℃，保温1～2小时，加入助悬剂，搅拌溶解，降温到50℃以下，备用； 2)将步骤1)的物质置于高速胶体磨中，加入青蒿素0.5～l0.0g，以4000r/min的速度，高速剪切30min，制成混悬液，备用； 3)将步骤2)的液体，依次加入助悬剂0.1～5.0g、抗氧化剂0.05～0.5g、湿润剂1.0～3.0g、絮凝剂0.2～2.0g，边加边搅拌，直至完全均匀，再连续研磨10min，备用； 4)将步骤3)的研磨后的液体，置于高压均质机中，以压力50-55兆帕，进行高压均质，然后，灌装封口，包装，即得100mL青蒿混悬注射液。 Patent Citations (1) Publication numberPriority datePublication dateAssigneeTitle CN101856352A *2009-04-102010-10-13中国科学院上海生命科学研究院青蒿素及其衍生物对化疗剂的协同作用 Family To Family Citations * Cited by examiner, † Cited by third party Non-Patent Citations (1) Title TAN WEIFENG等.: "Artemisinin inhibits in vitro and in vivo invasion and metastasis of human hepatocellular carcinomacells.", 《PHYTOMEDICINE》 * * Cited by examiner, † Cited by third party Similar Documents 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