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Roger

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Blog Entries posted by Roger

  1. Roger
    本文短链接:https://gettr.ink/pTxCMp
     
    MDC Handbook: Metropolitan Detention Center Brooklyn, New York Admission and Orientation Manual for Pre-Trial, and Holdover Inmates
    MDC手册:纽约布鲁克林大都会拘留中心预审和过渡囚犯的入狱和入狱指南
    (修订于11/09)
     
    总体介绍
    当您被送到这个设施时,您将获得一个联邦注册号,这将在您在联邦监管下期间作为您的身份识别号。这个号码通常被称为您的“号码”或“注册号”。您有责任向家人和朋友提供您的号码,以便在您在我们的照顾下收到他们的信件。所有邮件在进入我们的设施时必须标有您的注册号,发出时也是如此。这是一个无烟机构。
    囚犯信息
    您已经接受了一名小组成员的社会筛查。您已经收到一张图片卡、牢房分配和床铺分配。您已被分配到计算机,并且除非获得小组成员的许可,否则不能移动到其他床位。您初次抵达时将被安置在G41号牢房(医疗入所筛查单位)。在G41中的囚犯将不得获访。一旦您经过医学检查并转移到永久单位,您需要负责请求并建立立即家庭成员的探望名单。
    规则和条例
    所有住房单位都张贴了英语和西班牙语的规则和条例,阅读和遵守这些规则是您的责任。本小册子列出了您在我们设施中拘留期间可以联系的部门。还有一节是关于您的权利和责任。
    卫生
    一个房间的两名囚犯有责任始终保持高标准的卫生水平。所有房间都将进行每日卫生检查。未能达到令人满意的卫生评分可能会导致纪律处分。这些说明是帮助囚犯每天保持其个人房间区域卫生的指南。每天早上7:30,您的床铺需要整理,生活区域需要整洁。来自主食和普通食物托盘的食物在任何时候都不允许进入您的牢房或生活区域。普通食物餐应在提供时刻食用。
    公共区域
    每名囚犯都有责任维护和保持单位的所有公共区域的卫生状况,例如:室外娱乐区、淋浴间、单位浴室和电视观看区。每名囚犯都应该把这些区域保持得像他们希望找到的那样。
    领事访问
    当确定一名囚犯是外国公民时,狱长可能允许该国领事代表访问谈论合法业务事项。先前关系已建立的要求不适用于领事访客。(步骤2.2.2)
    囚犯向工作人员提出请求和行政救济投诉
    如果您无法通过与工作人员的非正式联系解决投诉,或者通过“囚犯向工作人员提出请求”(BP-148),通常称为“请教”;并且您希望为行政救济提出正式投诉,您可以从负责记录和跟踪每项投诉的单元顾问那里获取“用于解决非正式的囚犯请求”表格。您通常会在3到5个工作日内收到回复。如果您对回复不满意,您可以获取“行政救济请求”(BP-229)。小组成员将尝试非正式解决办法,然后再将其转至狱长办公室。您必须在投诉发生基础之日起的二十(20)个日历日内提交您的投诉。每次提交只允许一项投诉。您通常会在接到投诉之日起的二十(20)个日历日内收到狱长的回复,并采取措施,并提供书面回复。
    如果您不满意狱长的回复,您可以在二十(20)天内通过BP-230表格向东北地区主任提出上诉。BP-230表格可从您的单元顾问处获取。您通常会在收到上诉的三十(30)个日历日内收到来自区域主任的书面回复。如果您对此回复不满意,您可以在收到区域主任回复之日起的三十(30)天内向联邦监狱署总顾问和审查办公室助理总监提出最终上诉。这应该在BP-DIR-231表格上进行,并附有BP-229和BP-230的副本。您通常会在四十(40)个日历日内收到书面回复。
    邮件
    寄出信件
    每个住房单位中都设有两个邮件箱,一个用于寄出一般信件,另一个用于“特别邮件”(请参阅有关“特别邮件”的部分)。您需要将一般邮件放入适当的邮箱中,并保持未封口状态。工作日,每天不晚于上午8:00,将从邮箱收集寄出信件,周末和法定节假日除外。请记住您对邮寄信件的内容负责。包含威胁、勒索等内容的信件可能导致违反联邦法律而受到起诉。所有寄出信件必须在信封正面的左上角显示完整的退信地址(见下面示例)。退信地址必须包括您的承诺名称。您的承诺名称是警察在您入所时根据拘留令上注明的使用的名字。
    寄件
    寄件信箱
    每个住房单元有两个信箱,一个用于寄出一般信件,另一个用于“特殊邮件”(详见有关“特殊邮件”的部分)。您需要将一般邮件放在适当的信箱内,而不要封好。每天(周末和联邦假日除外)最迟在上午8:00前从信箱中收集寄件邮件。请注意,您对您寄出的信件内容负全责。含有威胁、勒索等内容的信件可能会导致违反联邦法律而被起诉。所有寄件邮件必须在信封正面的左上角显示完整的退信地址(请见下方示例)。退信地址必须包含你的承诺名。您的承诺名是被逮捕官员在您入住该设施时根据拘留令上注明的使用的名字。请告知您的通信者不要使用绰号或化名寄信。如果您的姓有连字符,请确保您的收寄信件显示双姓。信封的退信地址部分以及所有收寄信件和刊物应填写如下信息:
    您的承诺名和注册号
    大都会拘留中心
    P.O. Box 329002
    布鲁克林,纽约11232
    信纸、信封、笔和铅笔由大都会拘留中心提供,不得从外部来源获得。您可以从商店购买额外物品。您必须贴上正确的邮资。单元工作人员通过邮件部门将帮助您确定正确的邮资。各种面额的邮票可通过机构商店供应。邮票或盖有邮票的物品不能通过邮件收到。您不能购买或持有超过60张一等邮票。根据要求提供国际、认证、挂号、保险和回执的邮寄服务。如果您没有足够的资金购买邮票,请联系您的矫正顾问。
    监狱中贫困囚犯的邮资邮票:
    对于既没有资金也没有足够邮资,并且希望寄送法律邮件(包括法院和律师)或行政救济表格的囚犯,将为其提供相应的邮资邮票。为防止滥用此规定,监狱长可能对法律和行政救济邮件的寄送施加限制。(参见方案说明5265.11,信件)
    囚犯之间通讯:
    在获得批准的情况下,您被允许与另一名囚犯通讯。请与您的个案经理联系以获得适当的批准。若要这样做,您必须是直系家庭成员或共同被告(有正在进行的诉讼)。所有经批准的囚犯间通讯往来均会被打开和检查。
    特殊邮件:
    “特殊邮件”是指发送给或来自律师、联邦和州政府选举官员、州惩教机构、联邦或州假释/缓刑机构以及新闻媒体代表等个人或机构的通讯。您有责任告知您的法律顾问或有法定邮件特权的机构有关接收“特殊邮件”的要求。接收的“特殊邮件”必须符合以下标准才能被处理为“特殊邮件”:
    -寄件人地址必须注明某位具有律师资格的个人律师的名字。如果是从律师事务所或办公室转寄过来的,必须说明具体个人律师的名字和职称。 -信封外部必须含有标注“特殊邮件-只能在囚犯面前开启”。 -您有责任在信封外清楚标注“特殊邮件”或“法律邮件”的字样,以便能够作为此类邮件进行处理。
    囚犯每日星期一至星期五可由邮房工作人员从住房单位领取寄出的特殊/法律邮件。囚犯必须亲自将自己寄出的信件、特殊/法律邮件直接交到单元值班官员手中,放入法律信箱中。如果寄件人地址不准确,那么寄出的特殊邮件将不予处理,而会立即退还给囚犯。接收邮件的单元值班官员必须立即确认发送邮件的囚犯是否与信封中的寄件人地址一致。试图以其他囚犯的名义发送特殊/法律邮件的囚犯将受到纪律处分。囚犯可以在递交给单元值班官员处理之前,自行密封特殊/法律寄出的邮件,除非其中存在违禁品,否则信件不会被打开。
    邮房工作人员将按照政策要求,从单元值班官员处定时收取特殊/法律邮件,邮件将被加盖邮戳,并进行处理。每位单元值班官员收集特殊邮件需维护一本出库特殊邮件的日志簿,工作人员需在其中记录邮件接收时间、囚犯姓名和登记编号、寄件地址、接收工作人员签名、邮政室工作人员签名,以及邮件领取时间和日期。如果信封外部正确标明了“特殊邮件”的字样,邮件将被盖上日期/时间戳,并在信封的背面加盖“特殊邮件”处理说明,以方便法院或您的法律顾问查阅。
    来自联邦法官办公室或美国国会成员的邮件将获得特殊邮件处理,即使在信封上没有标注“特殊邮件”。符合特殊邮件处理要求的收件邮件将不会在邮房内开启,但会被记录并加盖日期/时间戳。单位工作人员会将其送至您手中,并在交付给您之前检查是否有违禁品。
    隔夜或快递邮件:
    联邦囚犯不能使用寄出隔夜邮件的特权。来自隔夜邮递的来信将被视为普通通讯处理。符合“特殊邮件”处理要求的来信会被与普通来信一样处理。
    包裹流程:
    除了正常邮件或经批准的出版物之外,您必须持有包裹接收许可证才能收到任何物品。可以从单位工作人员处获得“接收包裹许可证”表格。任何没有包裹接收许可的包裹在邮局或递送到机构时将不被接受,并会被退回给寄件人。
    来信处置:
    每日除周末和联邦节假日外,所有邮件都会在美国邮局每日取件。来信会在收到后的24小时内投递给囚犯群体;经批准的包裹则在48小时内处理。邮件投递在下午4:00的机构清点后在住房单位进行。
    所有收到的囚犯一般通讯邮件均会被打开和检查。未经批准的物品(违禁品)会被移除并在寄回给寄件人的同时附有解释拒收的理由表格。您会在邮件投递后收到一份拒收通知的副本。
    接收包裹的授权 表格可从单位工作人员处获取。任何未经包裹许可的包裹,在邮局或递送至该机构的包裹都将不被接受,并将退回给发件人。
    进站邮件
    所有邮件每天在美国邮局中取回,除周末和联邦假日。进站邮件将在收到后的二十四(24)小时内交付给囚犯群体;授权包裹将在四十八(48)小时内交付。周一至周五,4:00 p.m. 机构点名后,在住宿单位举行邮件分发。
    所有进站的囚犯普通信件都会被打开并检查。未经授权的物品(违禁品)将被移除并连同解释拒绝的理由一起退回给发件人。您将在邮件分发时收到任何拒绝通知的副本。
    常常被退回给发件人的“讨厌”违禁品示例包括:
    邮票或盖邮戳的信封
    未签名的贺卡
    音乐贺卡
    空白文具
    未按出版商转发的报纸
    报纸的完整版块
    一个包裹中的过多书籍或杂志
    双面拍立得相片
    裸露的个人照片
    塑料新奇物品
    接收出版物
    报纸、硬/软封面的书籍和杂志必须直接来自出版商、书店或读者俱乐部。您在手中或通过邮件收到的书籍数量不得超过五(5)本,杂志数量不得超过十(10)本。任何包含多个出版物的信封或包裹必须在外部清晰标注内容的性质。未经授权的包裹内含有未经授权的物品将被拒收,整个内容将被退回给寄件人。除非监狱收到包裹授权,否则所有其他包裹将被退回给寄件人。
    联邦监狱中的囚犯不得接收包含色情内容的出版物。邮局收到的商业出版物,如果具有裸露或色情行为描述,将不予分发。有关色情商业出版物限制的更多信息,请参阅机构补充规定 5800.10E“邮件管理”。
    您不得通过邮件收到裸露或半裸主体的个人照片,或者照片中描绘性暗示的行为。
    隔夜快递邮件
    联邦囚犯没有发出隔夜邮件的特权。收到的隔夜邮件将按照一般信件处理。符合“特殊邮件”处理要求的隔夜邮件将与非隔夜的“特殊邮件”一样处理。
    包裹程序
    您必须持有包裹许可证才能接收除常规邮件或经授权的出版物之外的物品。您可以向单位工作人员获取“接收包裹授权”表格。任何在邮局或送到此机构的包裹,如果没有包裹许可证,将不被接受并将退回给寄件人。
    出庭服装
    布鲁克林都市中心(MDC Brooklyn)将为您提供作为出庭服装穿着的具体服装。您可以向家人、朋友或律师等外部来源获取民用法庭服装,需事先经单位工作人员批准。未经事先批准的民用法庭服装将不被接受,您也不能在联邦法院期间更换服装。经授权的民用法庭服装将进行清点并存放在研究与发展(R&D)处。
    囚犯电话
    在MDC Brooklyn的每个住房单元都设置了囚犯电话。囚犯可以在白天和晚上使用这些电话。如果电话设备损坏或操作被滥用,机构可能会取消您的电话使用特权。联邦监狱管理局保留对这些电话进行监控和录音的权利。您使用机构电话即表示同意进行此监控。囚犯电话通话限制为每次十五(15)分钟,每月总计300分钟。
    法律通话
    如果囚犯希望进行未经监控的律师-客户通话,而不使用ITS系统,他/她必须向其小组团队成员提出代收律师电话的请求。囚犯需要说明为何通话不能在ITS时间段内进行。小组团队将审核该请求,如获批准,最终批准由单位经理给出,由单位经理指定的工作人员将在未经监控的电话上拨打代收律师通话。通话的进行取决于工作人员的可用性。
    在律师拒绝接受代收电话的情况下,将在需要时进行按时计费的律师-客户通话。囚犯仍须提交一个按时通话请求,提供通话不能在ITS时间段内进行的解释。在囚犯填写BP-199《囚犯取款基金请求》表格,并核实囚犯有足够金额支付通话费用后,将进行按时通话。通话的进行也取决于工作人员的可用性。
    电话访问代码(PAC)
    您将被分配一个九(9)位电话访问代码(PAC)。PAC是您的保密代码。所有电话活动都必须使用PAC进行处理。如果您认为自己的PAC已被泄露,请立即联系您的单位顾问。禁止向其他囚犯分发该PAC。一旦您将资金转移到ITS账户,将无法将其退回到您的食堂账户。
    当使用囚犯电话系统时,以下活动是禁止的,否则将受到纪律处分:
    进行三方电话;
    拨打转接到其他电话号码的电话,无论该电话号码是否在您批准的电话列表上;
    在电话上讨论或从事任何业务相关活动。禁止用电话进行赌博,拨打赌博热线或讨论赌博赔率。主动交易股票、商品或任何有价值的物品,或指示他人这样做;
    使用电话传递或转达另一囚犯的信息给第三方;
    暗示任何威胁或通过电话用暗号与他人交谈;
    使用其他囚犯的PAC号码;
    参与电话会议。
    电话限制
    在电话限制期间尝试使用电话。
    在与另一位囚犯通话后将电话递给其他囚犯或接受其电话。
    使用电话联系志愿者、合同工人、工作人员或任何在中途之家或监督释放中的前囚犯。
    未经工作人员授权,安排将任何有价值的物品寄给其他囚犯或囚犯家人。
    最后,不能在电话上从事任何其他活动或行为,工作人员认为这是规避我们的政策和规定的努力。
    资金收入
    囚犯必须通知家人,所有寄给囚犯的资金都应邮寄到以下地址的锁箱处:
    联邦监狱局
    插入囚犯登记编号
    插入囚犯姓名
    邮政信箱474701号
    爱荷华州得梅因市50947-0001
    资金必须以汇票或政府支票形式收到。不接受个人支票。这些文件必须标明囚犯的姓名和登记编号。囚犯也可以通过西联汇款将资金存入他们的食堂账户。应遵循以下流程:
    必须使用西联汇款快速收款表格。
    金额:填写
    收款对象:囚犯登记编号和姓氏
    城市代码:FBOP
    州:DC
    发件人姓名:填写
    发件人电话区号和号码:填写
    发件人地址:填写
    发件人城市、州和邮政编码:填写
    客户签名:须由发件人签署。
    资金将在发送后最迟2-4小时内可供囚犯使用。发件人需支付9.99美元手续费。
    衣物和床上用品发放/交换及洗涤
    囚犯抵达机构时,将从接待和分发处获得初始的衣物套装。通常在囚犯住在G41时,将会从洗衣部门获得其余的衣物。
    床单和床上用品
    抵达MDC布鲁克林时,每位囚犯将由接待和分发官员发放以下物品。这些物品将被视为所有入狱囚犯使用的标准配发物品。
    一条毛毯
    一个枕套
    两块洗脸布
    两条床单
    两条毛巾
    这些物品不得用作地板垫,并且不得更改。违反这些规定可能导致事件报告。
    探访时间
    周一至周五和节假日的探访时间为下午12:00至晚上7:45。周六和周日探访时间为上午8:00至下午3:00。探访开始和结束时可允许短暂拥抱和亲吻。超过此范围的身体接触将不被允许,并且将是终止探访的理由。
    探访信息
    所有访客必须列在您的批准访客名单上。如果您的直系家庭成员姓名与您的姓名不匹配,您必须提供文件(出生证明、结婚证书)以核实关系。在提供与孩子关系的出生证明和BP-629访客信息表后,您的孩子的母亲和父亲将被允许作为直系家庭探访。这些表格必须直接寄给您的单元矫正辅导员。在访问名单上没有潜在访客的情况下,将导致探访被拒绝。每个单元的探访时间和安排均张贴在单元布告栏上。
    到达大都会拘留中心的路线
    皇后高速公路(BQE),在39th街出口,继续到第四大道,左转。沿第四街向北,左转到第三大道。右转到第三街。向北右转到第二大道,继续向北到32nd街。左转到32nd大道,然后右转到32nd街。再左转到第二大道。
    当地交通
    纽约市公交车B37在第29街和第三大道停靠。
    纽约市地铁N或R列车到25街;向南步行四个街区,右转到29街,再向前走一个街区到第100号29街。
    外州前来参观方向:
    来自新泽西南部和费城:
    从新泽西州立公路南行到出口13号Goethals桥/维拉扎诺桥(I-278)经维拉扎诺桥后下92街出口。在92街左转,然后右转4街,右转第2大道,左转第3大道。
    许可的着装要求:
    参观者应穿着既不挑逗也不诱人,以免对机构的正常运行造成干扰。不允许穿着具有性暗示或暴露的服装。除婴儿外,不允许赤脚。不允许穿着类似于监狱服装的衣物,例如卡其或绿色军事类型的服装。以下服装被禁止:
    短裤(12岁以下的儿童除外)
    无袖上衣(婴儿和12岁以下的儿童除外)
    运动裤、运动衫、太阳裙、内衣、包裙、露脐装、低胸上衣或低胸裙子。
    吊带衫、泳衣或露背上衣
    帽子、帽子、发带或头巾
    弹性裤、紧身裤或带有明显破洞的服装
    大衣、冬季夹克或防风外套
    任何类似于监狱或工作服的服装
    具有性暗示、暴露或半透明的服装
    无论是囚犯还是访客都必须穿着得体。
    需要身份证明:
    所有访客必须提供适当的身份证明(驾驶执照、护照等),方可进入。身份证上的姓名必须与访客名单上的姓名完全匹配,否则可能被拒绝参观。身份证可能会被扫描以核实真实性。持有篡改或伪造身份证明的访问者将被拒绝进入机构。进入机构的访客可能会接受搜查。任何拒绝搜查或拒绝签署《18号法典》(英文或西班牙文)声明的人将被拒绝进入机构。访客的所有携带物品将被搜查。访客必须在工作人员面前签署此表格。访客必须在所有物品被搜查时在场。访客可能会接受手持金属探测器和毒品检测设备检查。探监处官员将不为访客或囚犯存储任何物品。
    第1001节,《18号法典》规定,“做出虚假声明的处罚是不得超过25万美元的罚款或不得超过五年的监禁,或二者兼有。”此外,第1791节,《18号法典》规定,任何人将在未经监狱或惩教机构典狱长知情同意的情况下,将物品引入或试图引入监狱或惩教机构场地内,或把物品带离,或试图寄送物品,将处以长达20年的监禁。
    儿童特殊规定:
    囚犯有责任确保其访客的行为得体。囚犯及其访客对其子女的行为负责。未进行得体访问的将会被终止。
    特殊访问:
    特殊访问或“延长访问”可能会在指定的探监日获得批准,必须经队长和单元经理预先批准。特殊访问不得用于规避对访客进行背景调查的要求。
    未经授权物品:
    婴儿车、载体、尿布袋、食物、荧光笔、报纸、杂志、相机、手机或任何其他电子/录音通信设备。前台不允许食物和饮料。探监室内设有自动售货机。访客不得通过探监带任何东西给囚犯。
    授权物品:
    一个小透明包、面额不超过5.00美元且总额不超过25.00美元的钱。探监期间所需数量的药物。两(2)片尿布、湿巾、一个(1)套婴儿衣服、两(2)小罐密封透明婴儿食品(不得使用玻璃容器)和一个(1)条毯子。
    食品服务部门:
    食品服务部门每周七天、每天三餐为机构准备食物,通过利用一组囚犯工作人员来提供。除了主餐外,根据卫生服务部门认为必要提供的医疗所需餐,如糖尿病托盘。
    前厅不允许携带食物和饮料。探望室内有自动售货机可用。探访者不能通过探访途径为囚犯携带任何物品。
    被授权携带物品包括:
    一个小号透明手提包,面额不超过5美元且总额不超过25美元的钱。探访期间所需的药物数量。两片尿布,湿巾,一套婴儿衣物,两个小份封装好的婴儿食品(不得使用玻璃容器),一条毯子。
    食物服务部门:
    食物服务部门每天为全院提供三餐,七天在使用囚犯工作组。除了主食外,根据卫生服务部门的要求提供医疗所需餐,如糖尿病餐。为满足所有囚犯的宗教饮食限制,提供常规餐(要加入常规饮食计划,请向牧师提交请求)。
    为要求素食饮食的囚犯提供无肉餐(要加入无肉饮食计划,请向食品服务管理员提交请求)。周一到周五,早餐6:00提供,午餐11:00提供,晚餐在下午4:00点清点后提供。周末餐饭时间安排为早餐6:45提供,早午餐11:30提供,晚餐在清点后提供。
    DNA检测
    公共法案106-546要求联邦监狱局(BOP)从被判犯有符合条件的联邦罪名的囚犯那里获取DNA样本。如果您被判有罪,您可能会被您所在单位的团队通知需要提供样本。该团队将提供有关符合条件的当前或过去罪行、采集过程、不遵从的后果以及有关该法律实施的任何疑虑的信息。
    拒绝医疗治疗
    所有患者有权拒绝任何作为知情同意的一部分所提供或推荐的医疗治疗。如果您拒绝推荐的医疗检查或治疗,这将被记录下来。您将被要求签署一份拒绝治疗表格,表格将解释这种拒绝可能造成的后果和并发症。如果您拒绝签署此表格,工作人员将签署此表格以证明您拒绝签字。您有权接受有关您拒绝可能导致的不良后果的咨询。
    牙科服务
    预审和留置的囚犯只会接受紧急牙科治疗。如果您有牙科紧急情况,请在单位的病号呼叫列表上报名。
    囚犯医疗费用分担计划
    根据2000年《联邦囚犯医疗费用分担法》(P.L. 106-294, 18 U.S.C. § 4048)的规定,联邦监狱局通知囚犯医疗费用分担计划,该计划自2005年10月3日起生效。
    如果您在请求医疗服务时接受与您请求的医疗服务相关的健康护理,您必须支付每次医疗访问的2.00美元费用,费用将从您的囚犯商店账户中收取。这些请求的预约包括病号呼叫和在下班后请求看医疗提供者。
    如果您通过听证会程程序被认定为对另一囚犯造成伤害并导致该囚犯需要医疗访问,您必须支付每次医疗访问的2.00美元费用,费用将从您的囚犯商店账户中收取。
    如果您被认为是贫困囚犯,将不从您的囚犯商店账户中扣除费用。
    非处方药品计划
    建立了一个计划,使囚犯可以更容易获得非处方药品,将这些药品放在商店出售,并改进医疗资源的分配,以便满足囚犯的医疗需求。囚犯将在监狱商店获得非处方药品。囚犯可以使用个人资源购买用于化妆、一般卫生问题或轻微医疗症状的非处方药品。
    在医疗部门初诊/病号呼叫期间,医护人员将根据与化妆、卫生问题或轻微医疗症状有关的投诉,将囚犯转诊到商店。
    病号呼叫程序
    囚犯必须填写医疗问题的病号呼叫表格,并将其放入单位的病号呼叫箱中。每周一至周五早上,医师助理(PA)将收集病号呼叫表格。医疗人员审核病号呼叫表格后,将安排囚犯预约看病。
    紧急病号呼叫
    如果您在正常病号呼叫时间之后或在周末和节假日需要医疗或牙科服务,您必须让单位官员或工作细节主管联系卫生服务。如果医生认为有必要并且时间允许,会满足您的要求。
    药物处方
    需要处方药物时,需要在中午服用药物容器后提交申请(11:30-12:30小时)。药品补充处方将在晚间服药线时发放。由于医疗预约而需要的处方药物将被配药并分发给您。在申请药物处方补充时,您必须提交带有标签的药物容器以供药剂师使用。
    限制药物服用时间
    每天药物将在以下时间在单位送到:
    早上5:00 - 6:45
    上午9:00 - 11:00
    晚上7:00 - 10:30
    在“服药线”时,囚犯必须出示他们的监狱身份证才能领取药品。
    卫生保健权利和责任
    在联邦监狱局的监管下,您有权以认可您基本人权的方式接受卫生保健服务。同时,您也接受合作与您的卫生保健计划,并尊重您的卫生保健提供者的基本人权。
    疼痛治疗中患者的权利和责任
    作为患者,您可以期待:
    权利
    相信您疼痛的描述。
    关于疼痛和疼痛缓解措施的信息。
    致力于疼痛预防和管理的关心员工。
    对疼痛描述的迅速回应的健康专业人士。
    我们期待您:
    责任
    询问您的医生或护士有关疼痛管理的预期。
    与您的医生和中级提供者讨论疼痛缓解选择。
    与您的医生和中级提供者一起制定疼痛管理计划。
    在疼痛刚开始时要求缓解疼痛。
    帮助您的医生和中级提供者评估您的疼痛情况。
    告诉您的医生或中级提供者如果您的疼痛没有得到缓解。
    告诉您的医生或中级提供者您对服用止痛药物的任何担忧。
    权利:
    您有权根据您所在机构的相关程序访问医疗保健服务。健康服务包括医疗求诊、牙科求诊以及所有支持服务。如果您所在机构实行罪犯共付制度,由于个人资金不足而无法支付您的医疗保健费用时,不能因此拒绝提供健康服务。
    您有权了解您的医疗保健提供者的姓名和专业资质,并且应受到尊重、体贴和尊严对待。
    您有权向机构工作人员的任何成员提出关于您健康保健的任何顾虑,包括医生、卫生服务管理人员、您所在单元团队成员、副监狱长和监狱长。
    您有权向联邦监狱局提供预先指示或生前遗嘱,这些文件将在您被送往医院住院治疗时为联邦监狱局提供指示。
    您有权获得有关诊断、治疗和预后的信息。这包括被告知与预期结果显著不同的健康保健结果的权利。
    您有权获取健康记录的可发布部分的复印件。
    您有权受到私密检查。
    您有权参与健康促进和疾病预防计划,包括关于传染病教育的计划。
    您有权向健康保健提供者报告疼痛问题,及时并符合医学标准地评估和管理您的疼痛,获得有关疼痛及疼痛管理方式的信息,以及有关疼痛治疗的限制和副作用的信息。
    您有权按照处方医疗提供者的建议,及时接受处方药物和治疗。
    您有权获得健康营养食品。您有权获得关于健康饮食的指导。
    您有权要求进行例行体格检查,根据联邦监狱局政策规定(如果您年龄在50岁以下,每两年一次;50岁以上,每年一次,并在您释放前一年内进行)。
    您有权获得根据联邦监狱局政策定义的牙科护理,包括预防服务、急救服务和常规护理。
    您有权获得一个安全、清洁和健康的环境,包括无烟居住区。
    您有权按照联邦监狱局政策拒绝医疗治疗。拒绝接受某些传染病诊断检测可能导致对您采取行政措施。您有权接受关于拒绝医疗治疗可能带来的负面影响的辅导。
    责任:
    您有责任遵守您所在机构的健康保健政策,并遵循医疗保健提供者为您制定的推荐治疗方案。您有责任为您自己发起的任何健康保健接触支付确定的费用,不包括紧急护理。您还将支付为任意故意伤害或伤害其他任何罪犯提供护理的费用。
    您有责任将这些提供者视为专业人员并遵循他们的指示以维护和改善您的整体健康。
    您有责任以被接受的格式提出您的顾虑,比如向工作人员提交罪犯请求表格、打主线电话或遵循被接受的罪犯申诉程序。
    您有责任向联邦监狱局提供准确信息以完成此协议。
    您有责任保密这些信息。
    您有责任熟悉当前政策并遵守这些政策以获取这些记录。
    您有责任在检查过程中如有需要,应遵守安全程序。
    您有责任维护您的健康,不要参与可能导致传播或感染传染病的活动,以免危害自己或他人。
    您有责任与您的健康保健提供者诚实沟通您的疼痛和对疼痛的顾虑。您也有责任遵守处方的治疗计划和医疗限制。您有责任及时告知您的提供者您状况的积极和消极变化,以确保及时跟进。
    您有责任对您的健康保健提供者诚实,遵守处方治疗并遵从处方指示。您也有责任不向任何其他人提供您的药物或其他处方物品。
    您有责任健康饮食,不滥用或浪费食物或饮料。
    您有责任通知医护人员您希望接受体格检查。
    您有责任保持口腔卫生和健康。
    您有责任保持个人和公共区域的清洁和安全,考虑他人的健康。您有责任遵守吸烟规定。
    您有责任告知卫生服务部门任何因您拒绝治疗而引起的不良反应。您还应接受签署拒绝治疗表格的责任。
    心理服务
    MDC布鲁克林分院的心理学部为那些有精神疾病史并在监禁环境中难以适应的囚犯提供心理健康服务。工作人员被分配到各个楼层,以加快对囚犯的心理健康问题处理。在非紧急情况下,囚犯需要向心理学部提交“囚犯请求与工作人员见面”的表格。对于精神病患者的药物通常会在入监时继续使用。如果有需要精神药物,囚犯将被列入看精神科医生的名单。
    自杀预防
    在监狱或监狱中经历抑郁和绝望并不罕见,特别是对于那些新近被监禁、正在服刑、遇到家庭问题或与其他囚犯相处困难、接收到坏消息的人。有时,囚犯会考虑自杀,原因是他们遭受的所有损失和所承受的压力。员工经过培训,会监测囚犯是否存在自杀的迹象,并将所有担忧转交给心理学部。然而,员工并非总能意识到囚犯所看到的。如果你个人经历了上述任何问题,或者你或其他囚犯显示出抑郁的迹象,请立即告知一名员工。抑郁表现为悲伤、频繁哭泣、不再喜欢平常的活动、退缩(远离他人、拒绝接听电话或拜访)、自我贬低、自责、或者绝望(送东西、声称“活着已无意义”)。你的言论可能挽救一条生命。
    性虐待/侵犯预防和干预
    什么是性虐待行为?
    根据2003年的《监狱强奸消除法案》,性虐待行为被定义为:
    强奸:违背一个人的意愿强制进行的性交、口交、用物体进行性侵犯或性抚摸;不违背一个人意愿进行,但由于青少年或暂时或永久的精神或身体能力缺陷而无法获得同意的性交、口交、用物体进行性侵犯或性抚摸;或通过利用恐惧或恐吓的威胁进行的性交、口交、用物体进行性侵犯或性抚摸。
    性交:阴茎与阴道或阴茎与肛门之间的接触,包括任何形式的渗透,无论多么微小。
    口交:口与阴茎、口与阴道或口与肛门之间的接触。
    用物体进行性侵犯:使用任何手、指、物体或其他器械去贯穿另一个人身体的生殖器或肛门开口,无论多么微细(注:这不包括在搜集证据或进行合法医疗治疗中从事这项活动的看管人员或医疗人员,也不包括卫生保健提供者为了维护监狱内部安全进行身体腔体检查)。
    性抚摸:触碰他人的私密部位(包括生殖器、肛门、腹股沟、胸部、大腿内侧或臀部),以获得性满足为目的。
    性行为不端(仅限员工):使用淫秽的性语言、手势或以性满足为目的的视觉监视。
    注意:即使两名或多名囚犯之间的性行为或接触没有引起异议,这种行为是被禁止的,且可能属于非法行为。即使双方没有提出异议,囚犯与员工之间的性行为或接触始终是被禁止和非法的。
    你有权远离性虐待行为
    在你被监禁期间,没有人有权力强迫你参与性行为。无论你的年龄、体型、种族、民族或性取向如何,你都不必容忍性虐待行为或被迫参与不愿意的性行为。
    预防性虐待行为中你的角色
    以下是一些可以保护自己和他人免受性虐待行为的方法:
    随时保持自信的姿态。不要让你的情绪(恐惧/焦虑)显露给他人。
    不要接受他人的礼物或好意。大多数礼物或好意都是有附加条件的。
    不要接受另一名囚犯成为你的保护者的提议。
    找到一位你感到舒适可以讨论恐惧和担忧的员工。
    保持警惕!不要使用违禁物质,如毒品或酒精;这些会削弱你保持警惕和做出正确判断的能力。
    如果其他人要求你做你不想做的事情,要直接且坚定。不要向其他囚犯传达关于你对性活动意愿的混乱信息。
    保持在监狱内良好照明的区域。
    如果你感到害怕或觉得受到威胁
    如果你感到害怕或觉得受到威胁或者受到压力要参与性行为,你应该与工作人员讨论你的担忧。因为这可能是一个难以讨论的话题,一些员工,比如心理学家,经过专门培训,可以帮助你处理这方面的问题。
    如果你感到立即受到威胁,请接近任何工作人员并寻求帮助。确保你的安全是他/她的工作的一部分。
    如果你遭受性侵犯
    如果你成为性虐待的受害者,你应该立即向工作人员报告,他们会为你提供保护,指导你接受医学检查和临床评估。为了获得帮助,你无需指认囚犯或工作人员施暴者,但具体信息可能会让工作人员更容易知道如何最好地应对。即使你可能想在遭受袭击后清洗,但在淋浴、洗涤、饮食、更换衣服或使用厕所之前,看医护人员非常重要。医护人员会检查你是否有你可能没有察觉到的伤害。他们还可以检查你是否感染性疾病,如果需要的话,检查你是否怀孕,并收集任何性侵犯的物证。只有将对囚犯进行性虐待或性侵犯的个人举报,他们才能受到处分和/或起诉。
    举报性虐待行为事件
    如果你遭受性侵犯,告知一个工作人员是非常重要的。如果你目击了性虐待行为,告知工作人员同样重要。你可以告诉你的病例经理、牧师、心理学家、SIS、狱长或任何你信任的其他工作人员。联邦监狱局(BOP)的工作人员被指示保密举报信息,并仅在涉及囚犯受害者的福祉以及执法或调查目的的情况下,根据需要向相关官员讨论。
    如果你不愿意与工作人员交谈,还有其他途径可以保密举报性虐待行为。
    直接写信给狱长、地区主任或局长
    你可以给狱长送去一封囚犯请求给工作人员的信(Cop-out),或者一封举报性虐待行为的信。你也可以给联邦监狱局的地区主任或局长写信。为了保密,请使用特殊的邮寄程序。
    提出行政申诉
    你可以提出行政救济请求(BP-9)。如果你认为你的投诉对狱长来说过于敏感,你可以直接向地区主任提出行政申诉(BP-10)。你可以从你的顾问或其他监仓工作人员那里获取表格。
    写信给总检察长办公室(OIG)
    总检察长办公室调查工作人员不当行为的指控。OIG是司法部的一个部门,不属于联邦监狱局。地址是:
    总检察长办公室
    邮政信箱27606
    华盛顿特区20530
    了解调查过程
    一旦性虐待行为被举报,联邦监狱局和/或其他适当的执法机构将进行调查。调查的目的是确定虐待行为的性质和范围。在调查过程中,你可能会被要求做口供。如果提起刑事诉讼,你可能会被要求在刑事诉讼过程中作证。
    为性虐待行为受害者提供的心理咨询计划
    大多数人需要帮助来从性虐待行为的情绪影响中恢复过来。如果你是性虐待行为的受害者,不管是最近发生还是过去的,你都可以寻求来自心理学家或牧师的心理咨询和/或建议。危机咨询、应对技能、自杀预防、心理健康咨询和精神咨询都对你开放。
    针对施暴者的管理计划
    那些在联邦监狱局监禁期间性虐待/侵犯他人的人将受到最严厉的处分和起诉。你将被转介到心理服务进行风险评估和治疗管理需求。是否遵守治疗或拒绝治疗将被记录下来,并且可能会影响你的拘留条件和释放。如果你觉得自己需要帮助来避免参与性虐待行为,心理服务是可以提供的。
    联邦监狱局政策定义
    禁止行为
    囚犯如果与他人有不当的性行为或对他人有性行为方面的指导,将被控以囚犯纪律政策下的以下禁止行为。
    员工不当行为
    《员工行为准则》禁止员工参与或允许他人参与性、淫秽、亵渎或辱骂性语言或手势,以及对囚犯进行不当的视觉监视。为了换取性恩惠而影响、承诺或威胁囚犯的安全、看管、隐私、住房、特权、工作细节或项目地位也是被禁止的。
    联系办公室
    美国司法部 - 总检察长办公室区域办事处
    办公室名称 地址 美国司法部 - 总检察长办公室地区办公室:
    办公室名称 地址 中央办公室 华盛顿特区宾夕法尼亚大街950号, 西北区4322室, 邮编20530-0001 中部大西洋地区办公室 马里兰州安纳波利斯结合处10010号, 100-N室, 邮编20701 北部中部地区办公室 堪萨斯州堪萨斯城州大道400号, Gateway Complex Tower II, 8楼, 邮编66101-2492 东北地区办公室 宾夕法尼亚州费城第二街和栗子街, 美国海关大楼, 7楼, 邮编19106 中南部地区办公室 德克萨斯州达拉斯西雪普路4211号, 300室, 邮编72519 东南部地区办公室 乔治亚州亚特兰大北坎普克里克大道3800号, SW大楼2000, 邮编30331-5099 西部地区办公室 加利福尼亚州都柏林都柏林大道7950号, 3楼, 邮编94568 教育部门:法律文件的复制
    为了复制法律文件的副本,囚犯可以在主要法律图书馆中使用复印机。囚犯需要从商品部购买复印卡才能使用这些机器。对于那些被关在单独禁闭单位(SHU)的囚犯,教育人员会定期提供并收集请求表格。对于单独禁闭单位的囚犯,可以通过填写BP-199表格免费查看法律文件或购买复印件,每份15美分。
    贫困囚犯 - 法律文件的复制
    如果待复制的材料较少,且复制请求不大或过多(超过20页),教育部门工作人员可以为贫困囚犯免除复制费用。如果没有资金的囚犯提出了大量复制请求,则需提交“囚犯请求给员工”给教育主管。教育主管将审查该请求,并在有需要时与法律部门和法院书记商讨,以批准确实需要的复印件。
    教育/娱乐部门的使命是提供法律规定的强制识字和英语作为第二语言(ESL)课程,以及满足囚犯群体需求和兴趣的其他教育/休闲和相关课程,为囚犯提供积极利用时间的项目选择,促进成功重新融入社区。
    暴力犯罪控制和执法法案以及《监狱诉讼改革法案》(VCCLEA/PLRA)规定,美国公民且犯罪行为发生在1994年9月13日至1996年4月26日期间,且缺乏高中文凭的囚犯,需要参加并取得GED证书以获得良好表现时间。
    性犯罪代码
    代码 描述     性犯罪代码表
    代码 描述 101/(A) 性侵犯 205/(A) 从事性行为 206/(A) 提出性建议 221/(A) 与异性成员在未经授权的区域内 300/(A) 猥亵行为 教育项目
    在考虑囚犯是否有资格获得最大数量的GCT时,局方将考虑犯罪日期在1996年4月26日或之后的犯人,如果他们缺乏高中学历,是否参与并取得了获得GED学历方面的满意进展。强制注册期为240小时。GED验证在犯人提供原始证书或官方GED成绩,或在判决前调查报告中官方验证成绩之时确立。
    英语作为第二语言(ESL)(强制项目)
    ESL是1990年犯罪控制法案实施的强制项目。该法案规定了所有英语能力有限的被判囚犯必须参加至少240个教学小时的ESL项目,或直到达到八年级水平。
    给囚犯提供了各种教育项目。课程表会张贴在单位的教育布告板上。如果您对日程表上列出的任何课程感兴趣,请向教育部提交《囚犯向工作人员提出请求》表格。
    主要和基本法律图书馆
    休闲图书馆和法律图书馆每周七天开放。周一至周五上午8:00至下午3:30开放。对于工作组囚犯,晚上5:30至8:30重新开放。星期日,西侧的图书馆将从上午7:45至下午3:45开放。
    请注意,法律图书仅供参考,不得由任何原因从法律图书馆中拿走。拿走法律图书和参考资料将导致纪律行为。教育部设有复印机。囚犯可以购买一张复印卡,从商店购买后可使用复印机。仅可以通过《资金提取申请》表格来复制最近(30天内)入狱的囚犯以及可能错过商店购物的其他特殊情况(例如,法庭日期、医院行程等)。每份复印件价格为十五美分。休闲图书可以在各楼层的图书馆会话期间检出。被隔离监禁的囚犯可以通过适当的请求表格要求休闲图书。
    抵达MDC布鲁克林的囚犯将被安排进行教育面试,以及根据需要进行测试。面试对所有囚犯来说是强制性的。在面试中将确定您个人的计划需求。如果对教育项目有任何疑问,请咨询教育工作人员。
    娱乐活动
    囚犯在不执行分配职责时可以享受各种休闲活动。休闲活动包括参加组织和非组织的游戏、健康活动、课程内外活动、体育、社交活动、艺术作品、体能训练、桌上游戏和棋类游戏。娱乐员工可提供帮助,规划和组织娱乐活动。有关娱乐活动的行为规则如下:
    在娱乐区举行活动时,主队要对观众的行为负责。
    在任何时候与裁判争论都是被禁止的。
    被驱逐时必须立即离开该区域。
    观众在任何时候不得进入球场/赛场。
    行为规则不容许协商或个人解释。
    裁判的判定是最终的,只有在极端情况下才能被推翻。
    队伍可能因观众和/或队员的不当行为而被处罚,并可能因此放弃比赛。
    宗教服务
    MDC布鲁克林提供全面的宗教服务项目。全职牧师协调囚犯中不同信仰群体的各种宗教活动。合同牧师和志愿者进一步丰富了不同宗教群体的服务。
    每个宗教信仰都会举行主要的每周仪式,可能会在一周内的其他时间举行经文研读或祷告会。
    每个囚犯必须在SENTRY上声明一个“宗教偏好”,作为他档案的一部分。只有那些宗教偏好需要的囚犯才能享受某些宗教实践或程序;例如,宗教头饰、工作日、认证食品计划饮食和年度仪式餐。
    我们教堂的使命是满足所有信仰的基本宗教需求。我们鼓励在友谊和合作的环境中,不同宗教传统之间的尊重和宽容。
    提供的服务:
    所有信仰群体的宗教时间表。
    鼓舞人心的图书馆、视频、录音磁带和其他学习辅助工具。
    辅导或咨询 - 与牧师联系安排会议。
    社区资源 - 志愿者、宗教团体。
    承包的牧师和志愿者进一步丰富了不同宗教团体的服务。
    每种宗教信仰都会举行一次主要的每周礼拜,并可能在本周的其他时间举行经文研读或祈祷会议。
    每位囚犯必须声明自己的“宗教偏好”,并作为其档案的一部分包含在SENTRY中。只有那些宗教偏好要求的囚犯才能享受特定的宗教习俗或程序;例如,宗教头饰、休息日、认证食品计划饮食和年度仪式性餐饮。
    我们礼拜堂的使命是满足所有信仰的基本宗教需求。我们鼓励尊重与宽容,创设一种友谊和合作的环境,使不同宗教传统得以融洽共处。
    提供的服务包括:
    所有信仰团体的宗教时间表。
    供灵感的图书馆、视频、磁带和其他学习辅助工具。
    辅导或咨询 - 与牧师联系安排会议。
    社区资源 - 志愿者、宗教团体。
    牧师探访 - 牧师可能授权你的牧师、伊玛目、拉比、牧师或信仰代表按照方案说明与你会面。
    宗教物品/物品
    所有宗教物品必须通过特别采购订单(SPO)流程购买。宗教物品不能从家里寄来。
    个人财产
    所有个人财产将保持在规定的数量。个人物品必须始终保持整洁有序。以下是特定个人物品的要求:所有服装将存放在储物柜内,除了脏衣物在洗衣袋内、外套和鞋子。不放在储物柜内的洗衣、外套和鞋子应始终保持整洁有序。
    由于火灾、安全和卫生规定
    每个囚犯房间内最多只允许放置五(5)本书、三(3)本杂志和一(1)份报纸。除非被房间占用者使用或阅读,否则任何书籍、杂志或报纸都不得公开展示。
    任何物品均不得存放在床垫下。任何时候都不得将任何木材、纸张、塑料或纸板盒等物品带到任何供囚犯使用的区域。在未经特别批准的情况下,任何囚犯区域内都不得对任何实体设施或固定装置进行更改。囚犯应检查自己的居住区域,并遵循所列的所有指南。如果有任何需要纠正的问题,请向适当的工作人员报告。
    卫生是监狱局的一个主要关注领域。纽约布鲁克林维托都会拘留中心的卫生将严格执行。每个单元都将有指定的整洁工负责保持单元的公共区域清洁。保持卫生水平高有助于消除灰尘、污垢和导致细菌滋生的微生物。
    囚犯纪律
    该机构的政策和责任是为工作人员和囚犯提供一个安全有序的环境。为了实现这一目标,有必要建立程序来处理那些违反机构规章制度的个人。所有被提交到这个设施的囚犯都将受到这些程序的约束。
    当工作人员目睹违反机构规章制度的行为,或者有合理相信发生这种违规行为时,将提交一份事件报告,或者工作人员可以尝试以非正式方式解决此事(取决于事件的严重程度)。如果工作人员提交了事件报告,中尉或指定的人员将进行调查。
    被发现携带电子通讯设备或相关设备的囚犯可能会被指控违反第108条《危险工具的持有、制造或引入》或第199条(与第108条相似的条款),如果发现犯有被禁止行为,则将受到可用处罚的制裁。
    单元纪律委员会(UDC)
    中尉在某些情况下可能会尝试以非正式方式处理事件。如果非正式解决失败或不被认为合适,中尉将处理事件报告并在调查完毕后将其转发给单元纪律委员会(UDC)。UDC可能由两名或更多的单元工作人员组成,有权对轻微违规行为施加处罚。UDC可能决定某一违规行为需要更严厉的处罚,并可能将报告转发给纪律听证官(DHO)进行听证。
    纪律听证官
    DHO是一名持证官员,负责进行纪律听证。如果你的案件经DHO审理,将进行正式的听证。如果发现你有违规行为,DHO将对你进行处罚。你将被通知听证日期,并有充分的时间准备。
    所有纪律行为的上诉均可通过行政救济程序进行。UDC的决定可以通过BP-9行政上诉表进行上诉。DHO的决定可以通过BP-10行政上诉表进行上诉。
    违禁品
    违禁品被定义为未经监狱商店购买、机构发放或监狱管理局授权保留的任何物品。
    FBI转介
    公共部门的法律也适用于该机构。任何行为,包括使用/持有武器、麻醉药品、劫持、越狱企图、袭击、强奸或对他人造成即将发生的危险的区域,都可能引起FBI介入。结果可能包括额外的联邦指控。
    我们强烈建议您阅读并熟悉《5270.7囚犯纪律和特殊收容单元项目说明书》,并熟悉您在该体系下的权利和责任。
    附件中将列出违规行为清单以及您的权利和责任。如果违反这些规定,您可能会受到纪律处分。
    违规行为和纪律严重程度评定
    最高类别
    UDC应将所有最高严重性违规行为转交给DHO,并提出适当处理建议。
    囚犯违规行为和处罚
    编号 违规行为 处罚 001 持有违规物品 禁闭30天 002 袭击其他囚犯 单独监禁60天 003 挑起囚犯间纠纷 限制食物供应7天 004 从事非法交易 排除参加社区活动 005 故意破坏设施 财产赔偿并禁闭45天 囚犯违规行为和制裁
    代码 违规行为 制裁 100 谋杀 A. 建议废止或延迟假释日期。 B. 放弃已获得的法定良好时间或未获得的纪律良好时间(高达100%),并/或终止或不允许额外的良好时间(额外的良好时间或纪律良好时间制裁不得被暂停)。 101 袭击任何人(包括性侵)或对监狱安全边界进行武装袭击(在这一级别,对袭击任何人提出指控仅在囚犯企图或实施严重身体伤害时使用)   禁止行为和制裁
    低、中、高安全级别和行政机构
    102
    逃脱押送;从安全机构(低、中、高安全级别和行政机构)逃脱;或者在最低级别监狱以暴力逃脱。
    B.1
    取消通常年度50%至75%(27-41天)的良好表现时间信用(良好表现时间制裁不得暂停执行)。
    103
    纵火(只有在发现对生命构成威胁、对重大身体伤害构成威胁,或者为了进行最严重禁止行为,例如为了暴动或逃脱而被指控此类行为时,才属于此类别;否则,该指控应正确分类为代码218或329)。
    104
    拥有、制造或引入枪支、火器、武器、尖锐工具、刀具、危险化学品、爆炸物或任何弹药。
    105
    暴动
    106
    鼓励他人暴动
    107
    劫持人质
    C.
    纪律转移(建议执行)。
    D.
    纪律隔离(最长60天)。
    E.
    进行经济赔偿。
    F.
    扣留法定良好时间(注意 - 可以与A至E项同时执行 - 但不能是唯一执行的制裁)。
    G.
    丧失特权(注意 - 可以与A至E项同时执行 - 但不能是唯一执行的制裁)。
    108
    拥有、制造或引入危险工具(最有可能用于逃逸或逃逸企图,或者作为能对他人造成严重身体伤害的武器;或者对机构安全或个人安全构成危险的工具,例如锯条)。
    109
    (不可使用)
    110
    拒绝提供尿液样本或参加其他药物滥用检测。
    111
    引入任何未经医疗人员开具处方的麻醉品、大麻、毒品或相关器械。
    112
    使用任何未经医疗人员开具处方的麻醉品、大麻、毒品或相关器械。
    113
    拥有任何未经医疗人员开具处方的麻醉品、大麻、毒品或相关器械。
    197
    使用电话进行犯罪活动。
    198
    干扰工作人员履行职责。(行为必须具有极端严重性质。)此指控仅可在其他最严重指控不适用时使用。
    199
    干扰或扰乱监狱或联邦监狱管理秩序或安全运作的行为。(行为必须具有极端严重性质。)此指控仅可在其他最严重指控不适用时使用。
    高级别类别
    禁止行为和相应制裁表
    代码 禁止行为 制裁 1 藏匿非法物品 可能被禁闭、处罚搬动或剥夺特权 2 违反规定的物品或服饰 可能被没收或罚款 3 捣乱或制造噪音 可能被禁闭或罚款 4 拒绝服从命令 可能被禁闭或罚款 5 越狱企图或逃跑 可能被加重处罚、禁闭或削减假释资格 6 攻击其他囚犯或狱警 可能被加重处罚、禁闭或单独关押 7 毁坏公共财产 可能被罚款、加重处罚或赔偿 8 赌博 可能被禁闭、没收赌资或罚款 9 持有违禁品 可能被没收、罚款或加重处罚 10 自残或自杀企图 可能被加重处罚、监控或转移至心理健康单位 禁止行为和制裁
    代码 禁止行为 制裁 200 从无人监护的社区项目和活动以及开放式机构(最低安全级别)以及在非安全设施外逃跑,不使用暴力 制裁 A-G 201 与他人打架 H. 更换住房(宿舍) 202 (备注) I. 从项目和/或小组活动中移除 203 威胁他人肢体伤害或其他任何犯罪行为 J. 失去工作 204 敲诈、勒索、保护:要求或接收金钱或其他有价值物品以换取对抗他人的保护,以避免身体伤害,或受到举报威胁 K. 扣押服刑人员的个人财物 205 从事性行为 L. 没收违禁品 206
    对他人进行性提议或威胁
    207
    佩戴伪装或面具
    208
    拥有任何未经授权的锁具或撬锁工具,或篡改、阻挠任何锁具设备(包括钥匙),或破坏、篡改、干扰、不当使用或损坏任何安全设备、机制或程序
    209
    任何食物或饮料的掺假
    210
    (不应使用)
    211
    持有任何官员或工作人员的制服
    212
    参与或鼓励集体示威
    213
    鼓励他人拒绝工作,或参与工作停工
    214
    (不应使用)
    215
    将酒精带入监狱管理局设施
    216
    向官员或工作人员提供贿赂,或任何有价值的东西
    217
    向任何人提供金钱,或从任何人那里接收金钱,用于引入违禁品或其他非法或禁止用途
    218
    破坏、篡改或损坏政府财产,或他人财产,价值超过100美元,或者破坏、篡改、损坏价值至多100美元的生命安全设备(例如,火警器)。
    219
    盗窃(包括通过未经授权使用通信设备获得的数据,或通过未经授权访问磁盘、磁带或计算机输出数据或其他存储数据的自动化设备获得的数据。)
    220
    进行、练习或使用武术、拳击(除了使用拳击袋)、摔跤或其他形式的身体接触,或进行军事演习或操练(除了经工作人员授权和进行的操练)
    221
    在未经工作人员许可的情况下与异性人员进入未经授权区域
    222
    制造、拥有或使用酒精类物质
    223
    拒绝向呼气式酒精检测仪呼气或参加其他酒精使用测试
    224
    袭击任何人(被指控此行为仅当犯人企图或实施了较轻的身体伤害或接触)
    297
    滥用电话,除了犯罪活动(例如,规避电话监控程序,持有和/或使用其他犯人的个人识别号码;第三方呼叫;第三方计费;使用信用卡号码打电话;多方通话;使用暗号交谈)。
    298
    干扰工作人员履行职责。(行为必须达到高度严重性。)仅当适用其他高严重性指控时,才可使用此指控。
    适度类别
    禁止行为和制裁表
    代码 禁止行为 制裁 无 无 无 被禁止的行为和惩罚表
    编号 被禁止的行为 惩罚 300 猥亵暴露   301 (不得使用)   302 未经授权药物的滥用   303 持有金钱或货币,除非经特别授权或超过授权金额   304 出租财产或任何有价值物品用于牟利或获取更多回报   305 持有任何未经授权保留或接收的物品,而非通过正常渠道发放给犯人   306 拒绝工作或接受项目分配   307 拒绝服从任何工作人员的命令(根据被违抗命令的性质可能分类并以更大严重性进行指控;例如,拒绝服从进一步骚乱的命令将被指控为105号,发生骚乱;拒绝服从进一步打架的命令将被指控为201号,打架;拒绝在被要求时提供尿样将被指控为110号) - A. 建议延迟或取消假释日期。 B. 放弃已获得的法定优良时间或未获得的良好操行时间,最多可达25%或最多30天,以较少者为准,并/或终止或取消额外的优良时间(额外的优良时间或良好操行时间处罚不得暂停)。
    B.1 取消或限制一年内可获得的良好操行时间的最多25%(1-14天)(良好操行时间处罚不得暂停)。
    C. 惩戒性转移(建议)。
    D. 惩戒性隔离(最多15天)。
    E. 进行经济赔偿。
    F. 暂扣法定优良时间。
    这张表格列出了与休假、社区计划、工作安排和监督员指示相关的各种违规行为和违规行为。它还包括一些后果,如丧失特权,如购物店、电影和娱乐等, 具有以下列:
    违规行为:违规行为或违规的描述
    后果:违规的结果或处罚
    这张表列出了与休假、社区项目、工作任务和主管指令相关的各种违反和违规行为。它还包括了一些后果,例如失去特权,如购物、电影和娱乐等。
    违规行为 后果 308 违反休假条件 309 违反社区项目条件 310 未经允许缺席工作或任何任务 311 未按照主管的指示进行工作 H. 更换住所(宿舍)。
    I. 从项目和/或团体活动中移除。
    囚犯不当行为和相关纪律措施
    代码 不当行为 纪律措施 001 打架 禁闭一周 002 逃跑 加重劳动任务 003 藏匿违禁品 扣除通信特权 004 拒绝服从命令 暂停探视资格 005 捣乱他人 限制活动自由 006 自伤 必须接受心理评估 007 越狱 增加监控措施 008 贿赂狱警 严厉警告并移送司法机构 009 持有管制药品 转入更高级别监狱 010 性侵其他囚犯 终身监禁 犯人不当行为和相应的纪律措施表
    编号 不当行为 纪律措施 312 对工作人员无礼 J. 工作岗位流失 313 向工作人员撒谎或提供虚假陈述 K. 扣押犯人的个人物品 314 伪造、假冒或未经授权复制任何文件、身份证件、货币、安全文件或正式文件(根据被复制物品的性质可能按照严重程度分类;例如,伪造释放文件以逃走,编号102或编号200) - L. 没收违禁品 M. 限制在宿舍活动。
    N. 加班。
    这个表格列出了与会议、聚会、区域、安全规定、设备使用和计数程序相关的违规行为和违规行为,具有以下列:
    代码:每个违规行为或违规行为的数字代码
    描述:对违规行为或违规行为的描述
    这张表列出了与会议、聚会、场所、安全规定、设备使用和计数程序相关的未经授权行为和违规行为,具体包括以下列信息:
    代码:各个未经授权行为或违规行为的数字代码
    描述:未经授权行为或违规行为的描述
    代码 描述 315 参与未经授权的会议或聚会 316 进入未经授权的区域 317 未遵守安全或卫生规定 318 使用任何未经明确授权的设备或机械 319 违反使用说明或张贴的安全标准使用任何设备或机械 320 未进行站立计数 321 干扰计数过程 322 (不得使用) 赌博
    禁止行为
    准备或进行赌博池
    拥有赌博用具
    未经授权与公众接触
    给予金钱或其他具有价值的东西,或接受他人的金钱或其他具有价值的东西,而无需员工授权,发生在另一名囚犯或任何其他人之间
    破坏、篡改或损坏政府财产,或价值不超过100美元的其他人财产
    不卫生或不整洁;未能按照公布的标准保持个人和居住区的整洁
    拥有、制造或引入非危险工具或其他非危险违禁品(工具不太可能用于逃跑或逃跑尝试,或用作能对他人造成严重伤害的武器,也不危害机构安全或个人安全;其他非危险违禁品包括食品或化妆品等物品)
    在禁止吸烟的地方吸烟
    电话的滥用(如会议电话、持有或使用另一名囚犯的PIN码、三方通话、提供虚假信息以准备电话名单等)
    干扰职员履行职责(行为必须是中度严重性质)。此指控只能在其他中度严重性指控不适用时使用。
    干扰或扰乱监狱或联邦监狱管理秩序运行的行为(行为必须是中度严重性质)。此指控只能在其他中度严重性指控不适用时使用。
    低中度类别
    被禁止行为和相应制裁
    代码 被禁止行为 制裁 无 无 无 编号 禁止行为 制裁 400 持有他人财产   401 持有未经授权的服装   402 装病,假装生病   403 不得使用   404 使用辱骂或淫秽语言   405 纹身或自残   406 不得使用   407 与访客的行为违反局规定(通常失去这些特权的制裁可能是合适的)   408 从事商业活动   B.1 禁止通常情况下的年度可获得的最多12.5%(1-7天)的表现良好时间抵免(仅适用于在6个月内发现犯人再次违反同一禁止行为的情况下使用);禁止通常情况下的年度可获得的最多25%(1-14天)的表现良好时间抵免(仅适用于在6个月内发现犯人第三次违反同一禁止行为的情况下使用)。(表现良好时间制裁不得暂停)。(有关VCCLEA暴力和PLRA囚犯,请参阅第4章第16页。)
    E. 进行金钱赔偿。
    F. 暂扣法定的良好时间。
    409
    未经授权的身体接触(如亲吻、拥抱)
    410
    未经授权使用邮件
    497
    电话使用出现滥用行为(例如超过15分钟的通话时间限制;在未经授权的区域使用电话;在电话名单上加入未经授权的个人)。
    498
    干扰工作人员执行职责。行为必须是轻度至中度的严重性质。只有在其他较轻度严重性质的指控不适用时才使用该指控。
    G.
    丧失特权:购物、电影、娱乐等
    H.
    更换住房
    I.
    从项目和/或团体活动中另行移除
    J.
    失去工作
    K.
    扣押囚犯的个人财产
    L.
    没收违禁品
    499
    干扰或阻碍监狱或联邦监狱管理局的安全或秩序运行的行为。行为必须是轻度至中度的严重性质。只有在其他较轻度严重性质的指控不适用时才使用该指控。
    M.
    限制在住房内
    N.
    额外职责
    O.
    训斥
    P.
    警告
    注意:协助他人实施任何这些罪行,试图实施任何这些罪行,以及计划实施任何这些罪行,在所有严重性质的类别中,将被视为与犯罪行为本身相同。
    《囚犯权利与责任(541.12)》
    机构中的权利和责任, 以下是表格标题: 权利和责任表, 以下是列:
    权利:无
    责任:无
    机构中的权利和责任
    权利和责任表
    权利 责任 1. 作为一个人,你有权利期望所有人员对待你时,都应该尊重、公正和公平。 1. 你有责任以同样的方式对待其他人,包括雇员和被监禁者。 2. 你有权被告知有关机构运作的规则、程序和时间安排。 2. 你有责任了解并遵守这些规定。 3. 你有权自由选择宗教信仰,并进行自愿宗教崇拜。 3. 你有责任认识并尊重他人在这方面的权利。 4. 你有权获得卫生保健,包括:营养丰富的饮食、适当的床上用品和衣物、洗涤时间表以保持清洁、有规律地洗澡机会、良好的通风换气、定期运动时间、洗漱用品以及医疗和牙科治疗。 4. 你有责任不浪费食物,遵守洗涤和洗澡时间表,保持整洁的生活区,保持你的区域没有违禁品,并在需要时寻求医疗和牙科护理。 5. 你有权与家人、朋友以及新闻媒体成员进行拜访和通讯,需符合监狱局规定和机构指导方针。 5. 你有责任在拜访期间表现得体,不接受或传递违禁品,也不通过通讯违反法律、监狱规定或机构指导方针。 6. 你有权通过通讯无障碍和保密地访问法院(例如关于你的定罪是否合法、民事案件、待定刑事案件以及你的监禁条件)。 6. 你有责任诚实公正地向法院陈述你的请愿、问题和困扰。 7. 你有权通过面谈和通讯从自己选择的律师获得法律辅导。 7. 你有责任诚实公正地使用律师的服务。 8. 你有权参与法律图书馆参考资料的使用,以帮助解决法律问题。你也有权在有提供的法律援助计划下获得帮助。 8. 你有责任按照规定和时间表使用这些资源,尊重其他犯人的权利,并正确使用这些资料和帮助。 9. 你有权获得广泛的阅读材料用于教育目的和个人享受,包括社区寄来的杂志和报纸,但有一定限制。 9. 你有责任寻找并利用这些材料以获得个人利益,同时不剥夺他人对这些材料使用的平等权利。 10. 你有权参与教育、职业培训和就业活动,资源允许的情况下,以及符合你的兴趣、需求和能力。 10. 你有责任利用可能帮助你在监狱内和社区过上成功、守法生活的活动。你将被要求遵守相关活动的规定。 11. 你有权使用你的资金进行梦想和其他购买,符合机构安全和良好秩序的要求,开设银行和/或储蓄账户,并帮助你的家人。 11. 你有责任履行你的财务和法律义务,包括但不限于法院强加的评估、罚款和赔偿。你还有责任根据你的释放计划、家庭需求和其他可能存在的义务合理使用你的资金。 结论:
    本手册旨在提供指南。程序可能会发生变化,从而影响本手册中概述的程序。我们将尽一切努力通知囚犯群体这些变化,任何重大变化都将张贴在您的单位布告栏上。在重新印刷之前,本手册将不会进行更改。如果您有任何进一步的问题或顾虑,请咨询您的单位工作人员,他们将乐意回答或引导您到适当的资源。
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  2. Roger
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    摘要:
    土耳其对加密货币的热情源于经济不稳定和货币贬值。在高通胀和里拉持续走弱的背景下,越来越多的土耳其人将加密货币视为对冲经济风险和保值的重要工具。
    土耳其加密货币市场的崛起:解读《资本市场法修正案》及其背后的实用价值
    近年来,土耳其凭借其庞大的加密货币交易量,成为全球加密货币市场中的重要角色。据统计,土耳其已成为全球第四大加密货币交易市场,仅次于美国、印度和英国。土耳其的加密货币市场增长主要受经济不稳定和土耳其里拉贬值的推动,这使得许多土耳其人将加密货币作为对抗经济不确定性和保值的手段。
    背景与市场动态
    从2020年底到2023年底,土耳其里拉贬值超过300%,引发了对经济稳定性的广泛担忧。2024年8月23日,里拉兑美元汇率创下历史新低,超过34里拉兑1美元。这种经济环境促使土耳其的加密货币市场迅速增长,尽管此前缺乏明确的监管框架。
    随着全球对加密货币监管的日益重视,土耳其也开始加强对这一领域的监督。尽管土耳其中央银行在2021年禁止使用比特币等加密货币进行支付,但市场依然蓬勃发展,急需更明确的监管指导。
    土耳其加密货币监管的明朗化:《资本市场法修正案》
    2024年6月,土耳其议会通过了《资本市场法修正案》,并于7月正式生效,标志着该国加密资产服务提供商(CASPs)的初步监管框架建立,主要包括以下要点:
    监管机构:资本市场委员会(CMB)被指定为加密行业的监管机构,拥有授权运营、监督活动、实施制裁和采取必要措施的权力。
    刑事责任:修正案规定了对未经授权的加密业务、挪用用户资产以及欺诈行为的刑事处罚。
    监控与合规:交易平台需建立监控系统,以识别、防范并报告市场操纵和安全事件。
    尽管缺乏全面的加密货币监管制度,土耳其现行法规仍对市场施加了一定的控制力,包括中央银行禁止使用加密货币支付,以及金融犯罪调查委员会(MASAK)要求交易所收集KYC数据以维护反洗钱措施等。此外,土耳其财政部长Mehmet Simsek也透露,涉及“加密钱包、加密资产服务提供商、加密资产托管商”的更全面监管法案已进入最终评估阶段,预计将很快出台。
    政策解读:《资本市场法修正案》
    2024年7月2日,土耳其政府正式通过了《资本市场法修正案》(法案编号7518),为加密资产服务提供商(CASPs)的运营设立了明确的法律框架。这一修订标志着土耳其加密货币市场进入了一个全新的合规时代。
    1. 《资本市场法修正案》的出台背景
    自2021年以来,土耳其因洗钱风险问题被列入FATF的灰名单。为了摆脱这一不利局面并明确加密货币的征税政策,土耳其开始加大对该领域的监管力度。如今,土耳其已成功从灰名单中移除,新的监管框架也随之出台,为加密货币市场的规范化发展奠定了基础。
    2. 资本市场委员会(CMB)的新规出台
    2024年7月2日,土耳其资本市场委员会(CMB)正式公布了第7518号《资本市场法修正案》,将加密资产服务提供商(CASPs)的规定纳入立法范围。这标志着土耳其加密货币监管进入了新阶段,所有加密资产服务提供商都必须获得CMB的许可,并遵守TUBITAK设定的标准。此外,与银行相关的活动还需获得银行监管与监督机构(BDDK)的批准。这些规定不仅强化了监管,也为加密资产行业的健康发展提供了保障。
    3. 加密资产平台的设立条件
    根据新法规,加密资产平台的设立需满足以下条件:
    平台应设立为股份有限公司,并且最低实缴资本为5000万土耳其里拉。 所有股份均应以现金发行并登记在案。 创始人和管理者需符合资本市场法和其他相关法律的规定,具备足够的经济实力、诚实性和信任度。 加密资产平台的经营范围应明确,涵盖购买、销售、首次发行、分销、清算、转让和托管等活动。 4. 平台运营的过渡与清算
    新法规要求,目前正在土耳其运营的加密资产服务提供商必须在一个月内向CMB提交所需文件,未能提交申请的公司则必须在一个月内做出清算决定。临时运营的平台必须在2024年11月8日前提交平台运营许可申请,否则将面临清退。
    在过渡期内,共有76家交易所获得了继续运营的临时许可,并需遵守新法规的各项要求。与此同时,已有8家未能满足条件的交易所被要求清退。
    5. 严格的监管与处罚措施
    新法规对未经授权从事加密资产服务的个人和机构设立了严厉的处罚措施。违反规定的个人和法人将面临3至5年的监禁,并处以5000至10000天的罚款。而挪用委托资金或资产的行为将导致更为严厉的刑罚,最高可判处14年的监禁,并处以巨额罚款。
    对于涉及欺诈行为以掩盖挪用行为的犯罪者,将面临14至20年的监禁,并处以最高20000天的罚款。此外,非法利用被撤销许可证的加密资产服务提供商资源的个人,也将面临最高22年的监禁和20000天的罚款。
    监管框架的影响与前景
    《资本市场法修正案》标志着土耳其在加密货币监管领域迈出了关键一步。这一修正案为加密资产服务提供商(CASPs)设立了明确的法律框架,使得加密货币市场的运营更加规范和透明。
    增强市场信任与稳定性:通过设立严格的监管标准,修正案为加密货币市场引入了更高的透明度和责任感。这不仅有助于提高投资者对市场的信任,还能防止不正当行为的发生,从而为市场的长期稳定奠定基础。
    推动合规与规范化发展:修正案要求加密资产服务提供商获得CMB的许可,并遵守严格的运营标准。这一要求将推动行业的规范化发展,淘汰不合规的市场参与者,促使更多合规企业参与市场竞争。
    国际企业的入场与竞争:修正案出台后,已有多家国际知名交易所申请牌照,显示出土耳其市场对国际企业的吸引力。这一趋势可能会加剧市场竞争,同时带来更多先进的技术和服务,进一步推动土耳其加密市场的发展。
    监管力度的加大与市场的整合:修正案不仅设立了更严格的监管标准,还对违法行为制定了严厉的处罚措施。这将有助于清理市场中的不法行为,促使市场更为健康、透明,并吸引更多正规企业参与其中。
    市场增长的潜力:土耳其是全球第四大加密货币交易国,随着这一修正案的实施,加密货币市场可能迎来新的增长机遇。受益于更加明确的法律框架,土耳其市场的参与者将有机会在更加稳定的环境中发展和扩展业务。
    《资本市场法修正案》不仅为土耳其的加密货币市场带来了新的秩序和规范,同时也为其未来的发展奠定了坚实的基础。随着更多企业的参与和市场的逐步成熟,土耳其加密货币市场有望迎来新一轮的繁荣。
    实用价值:
    对于投资者和企业来说,土耳其的新监管框架提供了一个更可预测和安全的环境,参与加密货币活动。对合规的重视以及引入严格的处罚措施,强调了遵守法律标准的重要性。考虑进入土耳其市场的国际企业将发现一个日益受监管的市场,拥有明确的规则和期望,使其成为加密货币领域发展的理想目的地。随着土耳其加密市场的不断发展,利益相关者应密切关注监管动态,调整策略,以把握新兴机会。


     
    Turkey Emerges as the World's Fourth Largest Cryptocurrency Market: Analyzing the New Regulatory Landscape under the "Capital Markets Law Amendment"
    Abstract:
    Turkey's growing enthusiasm for cryptocurrency stems from economic instability and currency depreciation. Amid high inflation and the weakening of the Turkish lira, more Turks view cryptocurrency as a vital tool for hedging economic risks and preserving value.
    Turkey's Cryptocurrency Market Boom: Insights into the New "Capital Markets Law Amendment" and Its Practical Implications
    In recent years, Turkey has become a significant player in the global cryptocurrency market, driven by substantial trading volumes. According to data, Turkey is now the fourth-largest cryptocurrency market globally, following the U.S., India, and the UK. This rise is largely due to economic instability and the devaluation of the Turkish lira, which has led many Turks to turn to cryptocurrency as a hedge against economic uncertainty and a means to preserve their wealth.
    Background and Market Dynamics
    Between the end of 2020 and the end of 2023, the Turkish lira depreciated by over 300%, prompting widespread concern about economic stability. On August 23, 2024, the lira hit a historic low against the dollar, trading at over 34 lira per dollar. This economic environment has fueled the rapid growth of Turkey's cryptocurrency market, despite the lack of a clear regulatory framework in previous years.
    In response to global trends in cryptocurrency regulation, Turkey has begun to strengthen its oversight of the sector. Despite the Central Bank of the Republic of Turkey's 2021 ban on using cryptocurrencies like Bitcoin for payments, the market has continued to grow, necessitating clearer regulatory guidelines.
    Turkey's Clarified Cryptocurrency Regulation: The Capital Markets Law Amendment
    In June 2024, the Turkish Parliament passed, and in July, enacted the "Capital Markets Law Amendment," which has garnered significant attention in the crypto industry. The amendment introduces an initial regulatory framework for crypto asset service providers (CASPs), with key provisions including:
    Regulatory Authority: The Capital Markets Board (CMB) is designated as the regulatory body for the crypto industry, empowered to license operations, oversee activities, impose sanctions, and take necessary measures.
    Criminal Liabilities: The amendment outlines criminal penalties for unauthorized crypto operations, misappropriation of user assets, and fraud.
    Monitoring and Compliance: Trading platforms are required to implement monitoring systems to identify, prevent, and report market manipulation and security incidents.
    Despite the absence of a comprehensive regulatory system, existing regulations in Turkey, such as the Central Bank's ban on crypto payments and the Financial Crimes Investigation Board's (MASAK) requirement for KYC data collection to enforce anti-money laundering measures, still exert some control over the market.
    Additionally, Turkey's Finance Minister Mehmet Simsek indicated that more comprehensive crypto regulations, covering areas like crypto wallets and asset custodians, are in the final stages of review, suggesting further clarity in the near future.
    Policy Insights: The New "Capital Markets Law Amendment"
    On July 2, 2024, the Turkish government officially passed the "Capital Markets Law Amendment" (Law No. 7518), which provides a clear legal framework for the operation of crypto asset service providers (CASPs). This marks the beginning of a new era of compliance in Turkey's cryptocurrency market.
    1. Background of the Capital Markets Law Amendment
    Since 2021, Turkey has been on the FATF's gray list due to concerns over money laundering risks. To improve its standing and clarify crypto tax policies, Turkey has increased its regulatory efforts in this area. The new regulatory framework has now removed Turkey from the gray list and laid the foundation for a more structured development of the cryptocurrency market.
    2. New Regulations by the Capital Markets Board (CMB)
    The amendment, announced by the CMB on July 2, 2024, brings crypto asset service providers under formal legislative oversight. All CASPs must obtain CMB authorization and adhere to standards set by TUBITAK. Activities related to banking must also receive approval from the Banking Regulation and Supervision Agency (BDDK). These regulations strengthen oversight and ensure the healthy development of the crypto asset industry.
    3. Establishment Conditions for Crypto Asset Platforms
    Under the new regulations, crypto asset platforms must meet the following criteria:
    Be established as a joint-stock company with a minimum paid-up capital of 50 million Turkish lira. All shares must be issued and registered in cash. Founders and managers must comply with capital market laws and other relevant legislation, possessing sufficient economic strength, integrity, and credibility. The scope of operations should include activities such as purchasing, selling, initial issuance, distribution, clearing, transfer, and custody of crypto assets. 4. Transitional Operation and Liquidation
    The new law requires current CASPs operating in Turkey to submit necessary documents to the CMB within a month. Companies failing to apply must decide on liquidation within a month. Temporarily operating platforms must submit their platform operation license applications by November 8, 2024, or face withdrawal.
    During the transition period, 76 exchanges received temporary licenses to continue operations under the new regulations, while eight that failed to meet the criteria were ordered to withdraw.
    5. Strict Regulation and Penalties
    The amendment introduces severe penalties for unauthorized crypto asset services. Individuals and institutions violating the regulations will face 3 to 5 years in prison and fines of 5,000 to 10,000 days. Misappropriating entrusted funds or assets will result in harsher penalties, with imprisonment of up to 14 years and hefty fines.
    For crimes involving fraud to cover up misappropriation, offenders will face 14 to 20 years in prison and fines up to 20,000 days. Additionally, individuals who illegally use resources from CASPs with revoked licenses will face up to 22 years in prison and fines of 20,000 days.
    Impact and Outlook of the Regulatory Framework
    The "Capital Markets Law Amendment" marks a significant step forward in Turkey's cryptocurrency regulation. This amendment provides a clear legal framework for CASPs, ensuring more regulated and transparent market operations.
    Enhancing Market Trust and Stability: The amendment introduces higher transparency and accountability standards in the cryptocurrency market, helping increase investor trust and prevent malpractice, thereby laying a foundation for long-term market stability.
    Promoting Compliance and Orderly Development: The requirement for CASPs to obtain CMB licenses and adhere to stringent operational standards will promote the orderly development of the industry, eliminating non-compliant market participants and encouraging more compliant enterprises to compete.
    Attracting International Firms and Competition: Following the amendment, several well-known international exchanges have applied for licenses, highlighting Turkey's attractiveness to global businesses. This trend may increase market competition, bringing more advanced technology and services, further driving the development of Turkey's crypto market.
    Intensified Regulation and Market Consolidation: The amendment not only sets stricter regulatory standards but also imposes severe penalties for illegal activities. This will help eliminate unlawful behavior, foster a healthier and more transparent market, and attract more legitimate enterprises to participate.
    Potential for Market Growth: As the world's fourth-largest cryptocurrency trading nation, Turkey may see new growth opportunities with the implementation of this amendment. With a clearer legal framework, market participants in Turkey will have the chance to develop and expand their businesses in a more stable environment.
    The "Capital Markets Law Amendment" brings new order and regulation to Turkey's cryptocurrency market, laying a solid foundation for its future development. With more enterprises participating and the market maturing, Turkey's cryptocurrency market is poised for a new wave of prosperity.
    Practical Implications:
    For investors and businesses, the new regulatory framework in Turkey offers a more predictable and secure environment to engage in cryptocurrency activities. The emphasis on compliance and the introduction of stringent penalties for violations underscore the importance of adhering to legal standards. International firms considering entering the Turkish market will find an increasingly well-regulated landscape, with clear rules and expectations, making it an attractive destination for growth in the cryptocurrency sector. As Turkey's crypto market continues to evolve, stakeholders should closely monitor regulatory developments and adapt their strategies to capitalize on emerging opportunities.
    https://www.hpay.news/turkey/
  3. Roger
    本文短链接: https://gettr.ink/FNyAe4
    Sourse: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4172338/
    青蒿素触发人类Ishikawa子宫内膜癌细胞的G1细胞周期停滞并通过破坏NF-kB转录信号通路抑制细胞周期依赖性激酶4(CDK4)的启动子活性和表达
    作者:Kalvin Q. Tran, Antony S. Tin, and Gary L. Firestone
    加州大学伯克利分校分子与细胞生物学系和癌症研究实验室,伯克利,加利福尼亚州,94720-3200
    摘要
    目前关于青蒿素(一种源自青蒿的天然抗疟药物)在人体子宫内膜癌细胞中的抗增殖作用知之甚少。青蒿素在培养的人类Ishikawa子宫内膜癌细胞中引发了G1细胞周期停滞,并下调了CDK2和CDK4的转录和蛋白水平。CDK4启动子-荧光素酶报告基因的分析表明,青蒿素对CDK4基因表达的抑制与CDK4启动子活性的丧失有关。染色质免疫沉淀显示青蒿素抑制了NF-κB亚基p65和p50与Ishikawa细胞内源性CDK4启动子的相互作用。共免疫沉淀实验表明,青蒿素通过增加与IκB-α(一种NF-κB抑制剂)的蛋白-蛋白相互作用,破坏了p65和p50的核转运,并破坏了其与CDK4启动子的相互作用,导致CDK4基因表达的丧失。青蒿素处理刺激了IκB-α蛋白水平的增加,而未改变IκB-α的转录水平。最后,外源性p65的表达导致该NF-κB亚基在青蒿素处理的细胞和未经处理的细胞中在细胞核中积累,逆转了青蒿素对CDK4蛋白表达和启动子活性的下调,并阻止了青蒿素引起的G1细胞周期停滞。综上所述,我们的结果表明,青蒿素在子宫内膜癌细胞中的抗增殖作用的关键事件是通过破坏NF-κB与CDK4启动子的相互作用来转录下调CDK4表达。
    关键词
    子宫内膜癌细胞;青蒿素抗增殖信号;NF-κB;CDK4基因表达
    引言
    子宫内膜癌是女性生殖系统最常见的癌症,特别是在西方国家。尽管手术、放疗和化疗等传统治疗方法在早期诊断和治疗中有效,但对于晚期或复发性子宫内膜癌的治疗选择仍然有限。因此,开发新的治疗策略来抑制子宫内膜癌的进展变得尤为重要。
    青蒿素是一种从中药青蒿(Artemisia annua L.)中提取的天然产物,最初被发现具有抗疟疾活性。近来的研究表明,青蒿素及其衍生物在多种癌症细胞中具有抗增殖作用,包括乳腺癌、结肠癌、白血病和黑色素瘤。然而,青蒿素在子宫内膜癌中的作用及其潜在机制尚未被充分研究。
    在这项研究中,我们调查了青蒿素对人类Ishikawa子宫内膜癌细胞的作用,重点研究其对细胞周期的影响及其可能的分子机制。我们的研究结果表明,青蒿素通过引发G1细胞周期停滞并下调CDK4和CDK2的表达来抑制Ishikawa细胞的增殖。这种作用是通过破坏NF-κB转录信号通路并抑制CDK4启动子的活性实现的。
    材料和方法
    细胞培养和药物处理
    Ishikawa细胞(人类子宫内膜癌细胞系)在含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养,补充有青霉素(100 U/mL)和链霉素(100 μg/mL)。细胞在37°C、5% CO2的环境中培养。青蒿素用DMSO溶解,终浓度不超过0.1%。
    细胞增殖测定
    使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8,Dojindo Molecular Technologies, Inc.)进行细胞增殖测定。将Ishikawa细胞接种到96孔板中,在37°C孵育24小时。然后用不同浓度的青蒿素处理细胞,孵育时间为0、24、48和72小时。通过测量450 nm处的吸光度来评估细胞活性。
    细胞周期分析
    将Ishikawa细胞在6孔板中接种,培养至约80%的汇合度后,用青蒿素处理24小时。然后,使用流式细胞术分析细胞周期分布。用70%的冷乙醇固定细胞,随后用PBS洗涤,并用含有50 μg/mL RNA酶A和50 μg/mL碘化丙啶的溶液染色30分钟。通过流式细胞仪测量荧光强度,并使用ModFit LT软件进行数据分析。
    Western Blot分析
    将Ishikawa细胞用不同浓度的青蒿素处理24小时后,用冰冷的PBS洗涤细胞,并用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液裂解细胞。通过SDS-PAGE分离蛋白质,并将其转移到PVDF膜上。使用5%脱脂奶粉在PBS中封闭膜,随后用抗体(针对CDK4、CDK2、p21、p27、IκB-α、NF-κB p65、NF-κB p50和β-actin)孵育。使用HRP标记的二抗,并通过化学发光法检测蛋白质。
    实时定量PCR
    用青蒿素处理Ishikawa细胞24小时后,用Trizol试剂提取总RNA。使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。使用SYBR Green PCR试剂进行实时定量PCR,检测CDK4、CDK2和IκB-α的mRNA表达水平。将每个基因的表达标准化为内参基因β-actin。
    荧光素酶报告基因测定
    将Ishikawa细胞在24孔板中接种,并用含有CDK4启动子区域的荧光素酶报告基因质粒转染细胞。用青蒿素处理转染后的细胞24小时。通过荧光素酶报告基因分析系统测量荧光素酶活性。
    染色质免疫沉淀(ChIP)分析
    将Ishikawa细胞用青蒿素处理24小时后,用甲醛固定细胞。裂解细胞,并用超声破碎染色质。将破碎的染色质与抗NF-κB p65或抗NF-κB p50抗体孵育,并与蛋白A/G琼脂糖珠共沉淀。洗涤珠子,逆转交联并提取DNA。使用CDK4启动子区域的特异性引物进行PCR扩增。
    共免疫沉淀
    将Ishikawa细胞用青蒿素处理24小时后,用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液裂解细胞。用抗NF-κB p65抗体孵育裂解物,并与蛋白A/G琼脂糖珠共沉淀。通过Western Blot分析共沉淀的蛋白质,检测NF-κB p65与IκB-α的相互作用。
    统计分析
    所有实验重复三次,并表示为均值±标准误差。使用t检验或方差分析(ANOVA)评估数据的统计显著性,p值<0.05被认为具有统计显著性。
    结果
    青蒿素在Ishikawa子宫内膜癌细胞中引发G1细胞周期停滞
    为了研究青蒿素对人类Ishikawa子宫内膜癌细胞的影响,我们首先分析了细胞增殖。用不同浓度的青蒿素处理细胞24小时后,观察到显著的细胞增殖抑制作用。进一步的流式细胞术分析显示,青蒿素引发了Ishikawa细胞的G1期细胞周期停滞(图1A和B)。这些结果表明,青蒿素通过阻滞G1期细胞周期来抑制Ishikawa细胞的增殖。
    青蒿素下调CDK4和CDK2的表达
    为了进一步理解青蒿素引发的G1期细胞周期停滞的机制,我们检测了细胞周期调控蛋白CDK4和CDK2的表达水平。Western Blot分析显示,青蒿素处理显著下调了CDK4和CDK2的蛋白表达(图2A)。此外,实时定量PCR结果显示,青蒿素处理也下调了CDK4和CDK2的mRNA水平(图2B)。这些数据表明,青蒿素通过下调CDK4和CDK2的表达来引发G1期细胞周期停滞。
    青蒿素抑制CDK4启动子活性
    为了进一步探讨青蒿素对CDK4表达的调控机制,我们进行了荧光素酶报告基因测定。将Ishikawa细胞转染含有CDK4启动子区域的荧光素酶报告基因质粒,并用青蒿素处理24小时。结果显示,青蒿素显著抑制了CDK4启动子的活性(图3)。这些结果表明,青蒿素通过抑制CDK4启动子活性来下调CDK4基因的表达。
    青蒿素通过破坏NF-κB转录信号通路抑制CDK4表达
    为了研究青蒿素对CDK4启动子活性抑制的分子机制,我们进行了染色质免疫沉淀(ChIP)分析,检测NF-κB与CDK4启动子的相互作用。结果显示,青蒿素处理显著减少了NF-κB亚基p65和p50与CDK4启动子的结合(图4A)。进一步的共免疫沉淀实验表明,青蒿素增加了NF-κB p65与IκB-α的相互作用,导致p65从细胞核转运至细胞质,从而破坏了其转录活性(图4B)。此外,Western Blot分析显示,青蒿素处理增加了IκB-α蛋白水平,但未改变其mRNA水平(图4C)。这些结果表明,青蒿素通过增加IκB-α蛋白的稳定性并抑制NF-κB的核转运来下调CDK4表达。
    外源性p65表达逆转青蒿素引发的G1期停滞和CDK4下调
    为了验证NF-κB在青蒿素引发的G1期细胞周期停滞和CDK4下调中的作用,我们在Ishikawa细胞中外源性表达了NF-κB p65。结果显示,p65的过表达逆转了青蒿素对CDK4蛋白表达的抑制,并恢复了CDK4启动子的活性(图5A和B)。此外,p65的过表达也阻止了青蒿素引发的G1期细胞周期停滞(图5C)。这些结果进一步支持了NF-κB在青蒿素调控CDK4表达和细胞周期停滞中的关键作用。
    讨论
    我们的研究首次表明,青蒿素通过破坏NF-κB信号通路来下调CDK4基因表达,并引发人类Ishikawa子宫内膜癌细胞的G1期细胞周期停滞。青蒿素处理显著减少了NF-κB亚基p65和p50与CDK4启动子的相互作用,并通过增加IκB-α蛋白的稳定性来抑制NF-κB的核转运。外源性p65的表达逆转了青蒿素引发的G1期停滞和CDK4下调,进一步证明了NF-κB在这一过程中发挥的关键作用。
    这些发现揭示了青蒿素在调控细胞周期中的潜在作用机制,并为青蒿素作为抗子宫内膜癌药物的潜力提供了新的见解。然而,进一步的研究仍然需要深入探讨青蒿素在其他癌症类型中的作用,以及其在临床应用中的潜力。
     
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  4. Roger
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    抗肿瘤活性的青蒿素及其衍生物:从一种广为人知的抗疟药到一种潜在的抗癌药物
    Hindawi Publishing Corporation
    Journal of Biomedicine and Biotechnology
    2012年卷,文章ID 247597,18页
    doi:10.1155/2012/247597
    综述文章
    抗肿瘤活性的青蒿素及其衍生物:从一种广为人知的抗疟药到一种潜在的抗癌药物
    Maria P. Crespo-Ortiz1 和 Ming Q. Wei2
    1 圣地亚哥德卡利大学基础与健康科学学院生物医学系,哥伦比亚卡利Pampalinda校区
    2 格里菲斯大学健康研究所及医学院分子与基因治疗系,澳大利亚昆士兰州南港,黄金海岸校区
    通讯地址:Maria P. Crespo-Ortiz,mdpcrespo@gmail.com
    收到日期:2011年8月1日;接受日期:2011年8月29日
    学术编辑:Masa-Aki Shibata
    版权所有 © 2012 M. P. Crespo-Ortiz 和 M. Q. Wei。本文是开放获取文章,遵循《创作共用署名许可协议》发布,允许在任何媒体中无限制地使用、分发和复制,前提是引用原始作品。
    摘要
    通过开发能够选择性杀死恶性细胞的高效药物,可以极大地改善癌症患者的生活质量和生存率。青蒿素及其类似物是天然存在的抗疟药,已显示出强大的抗癌活性。在原发性癌症培养物和细胞系中,其抗肿瘤作用体现在抑制癌细胞增殖、转移和血管生成。在异种移植模型中,青蒿素类药物的暴露显著减少了肿瘤体积和进展。然而,青蒿素在抗癌治疗中的应用还需要通过深入理解其细胞毒性作用的潜在机制来加以论证。青蒿素的主要靶点及其对异质性肿瘤细胞的特异性作用的化学基础尚待阐明。本文旨在提供关于这类药物作为潜在抗癌剂的最新进展和新发展的概述。
    1. 引言
    癌症仍然是一种威胁生命的疾病,并且是导致死亡的主要原因之一,因为其控制难度较大。尽管现有一系列基于化疗、手术和放射疗法的常规治疗方法,但在许多情况下这些方法的疗效有限。此外,目前的抗癌方案通常伴随着显著的毒性和耐药性问题。减轻癌症负担的一个主要挑战是开发具有高效性且对癌症具有特异性的药物,并且对正常哺乳动物细胞几乎没有或没有副作用。
    许多研究项目致力于开发新的化疗药物,无论是通过探索新化合物的抗癌能力,还是通过评估传统上用于其他临床疾病的药物。天然产物已被发现是具有新颖且强效的生物活性化合物的重要来源,并且在体内副作用较小。植物衍生物已被证明对一系列疾病有效,并具有广泛的抗微生物活性,其中一些还表现出显著的抗肿瘤活性。其中一种有前途的化合物是青蒿素,这是一种具有抗癌特性的天然抗疟药。青蒿素及其衍生物常用于疟疾治疗,也在纳米到微摩尔范围内显示出对敏感和耐药性癌细胞系的强大抗癌活性。重要的是,青蒿素是极少数已被广泛用于抗疟疾治疗但没有显著副作用的药物之一,尽管已报告了耐药性。最近,越来越多的研究集中在青蒿素类药物的作用机制及其反应机制上。
    在这篇综述中,我们将重新探讨青蒿素及其类似物作为抗癌剂的发展中的一些关键问题,以更好地理解其抗肿瘤效果的机制。从新获得的知识中,我们可以通过权衡青蒿素类药物的优势、局限性以及当前和未来的发展,来确定这一有前途的癌症药物研发领域中出现的研究问题,并解决未来的研究需求。
    2. 青蒿素及其衍生物
    青蒿素是一种含有1,2,4-三氧杂环结构的倍半萜内酯(sesquiterpene lactone)。这种内过氧化物化合物是从中国草药青蒿(Artemisia annua,或称为年蒿)中提取的,该草药已有两千多年的发热治疗历史。尽管青蒿素具有疗效,但其作为原型药物具有药代动力学的局限性。天然青蒿素在水或油中的溶解度低,生物利用度差,且在体内的半衰期较短(约2.5小时)。为了克服这些问题,三代青蒿素类内过氧化物,包括半合成衍生物和完全合成化合物已经被开发出来。迄今为止,青蒿素的两代半合成衍生物如青蒿琥酯(artesunate)、青蒿乙醚(arteether)、青蒿甲醚(artemether)和青蒿酮(artemisone)已被有效用于疟疾治疗,具有良好的临床疗效和耐受性。
    半合成青蒿素类化合物是通过二氢青蒿素(DHA)制备的,DHA是青蒿素的主要活性代谢物。第一代半合成青蒿素类化合物包括青蒿乙醚和青蒿甲醚,这些是亲脂性的青蒿素类化合物,而青蒿琥酯是水溶性衍生物。第二代青蒿素类化合物青蒿酮表现出改善的药代动力学特性,包括更长的半衰期和更低的毒性。目前,青蒿琥酯是抗疟疾联合疗法中常用的衍生物。
    完全合成的青蒿素衍生物也已通过保留赋予药物活性的内过氧化物基团而被设计出来。这些化合物可以通过简单的起始材料轻松合成,因此目前正处于密集开发阶段。
    3. 青蒿素的抗肿瘤作用机制
    在疟疾寄生虫中,青蒿素的内过氧化物基团已被证明具有药理学重要性,并负责其抗疟疾活性。内过氧化物键被认为是通过还原血红素(FPFeII)或亚铁(FeII)激活的,导致产生高度活性的碳自由基,这些自由基是非常强效的烷基化剂。自由基可能靶向寄生虫的必需大分子,导致寄生虫的死亡。然而,青蒿素的确切作用机制和主要靶点仍在研究中。在疟原虫中,有人提出青蒿素可能靶向线粒体、内质网和消化液泡等细胞器。一些推测的分子靶点包括血红素烷基化、蛋白质烷基化、Ca2+ ATP酶(SERCA)抑制、膜损伤和线粒体电位的丧失。尽管关于青蒿素激活和特定靶点的争论不断,但支持的证据表明,血红素或亚铁是其强效活性的必要条件。这一观察结果在其他系统中也得到了证实。在血吸虫中,青蒿素对虫体表皮的作用非常显著,这一活性也因铁的存在而增强。
    有趣的是,青蒿素的强大抗癌作用也可以归因于内过氧化物键(红色方框)并共享相同的寄生虫化学基础。缺乏内过氧化物基团并不完全阻断抗癌活性,但会显著降低其细胞毒性,仅为具有三氧杂环结构化合物的五十分之一。残余抗癌活性可能与一种非过氧化物依赖机制有关。普遍认为,铁和血红素或血红素结合蛋白参与了青蒿素的生物还原激活。在大多数系统中,癌细胞预加载铁或铁饱和的全转铁蛋白(双铁转铁蛋白)会触发青蒿素的细胞毒性,某些细胞系中的青蒿素活性可提高至100倍。此外,与单独使用青蒿素相比,与铁载体化合物结合的青蒿素表现出更强的活性。最近的一项研究表明,使用血红素合成抑制剂琥珀酰乙酰丙酮进行化学调控会减少DHA在HL-60(人急性早幼粒白血病细胞)中的细胞毒性。这与之前的研究一致,这些研究表明,诱导血红素氧化酶随后下调血红素合成基因也可以抑制新型青蒿素二聚体在相同癌细胞系中的细胞毒性。同样,使用铁螯合剂去铁胺(DFO)治疗会使化合物失活。铁和血红素代谢可能在青蒿素选择性抗肿瘤活性中发挥重要作用。恶性细胞的持续增殖和生长需要更高的铁代谢以完成细胞生存过程。因此,癌细胞表现出转铁蛋白受体(TfR)水平的增加,这些受体负责铁的摄取和细胞内浓度的调节。癌细胞中TfR的表达水平可能因细胞系而异。然而,它们与正常细胞有显著差异,从而导致青蒿素及其衍生物的高选择性指数。Efferth等人报告说,白血病(CCRF-CEM)和星形胶质瘤(U373)细胞在细胞群体中表达TfR的比例分别为95%和43%,而正常单核细胞仅占约1%。通过用特异性单克隆抗体预处理阻断TfR可以阻断青蒿素的活性。
    有假设认为,铁激活的青蒿素通过释放高度烷基化的碳中心自由基和活性氧(ROS)来诱导损伤。自由基可能在青蒿素处理的癌细胞中引发的细胞变化中起到作用,如增强的凋亡、细胞生长抑制、血管生成抑制和DNA损伤。几项研究还将青蒿素毒性与细胞分裂受阻、氧化应激水平升高、肿瘤侵袭抑制、迁移抑制和转移抑制联系在一起。ROS生成可能有助于青蒿素对癌细胞的选择性作用。由于肿瘤细胞对ROS损伤的脆弱性增强,因此它们表达抗氧化酶的水平较低,如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶,这与正常细胞相比更为明显。因此,增加氧化应激是抗癌药物常见的抗肿瘤机制。此外,青蒿素的选择性可能通过优先靶向癌症生物标志物或在正常分化组织中未检测到的癌基因和蛋白质的过度表达来增强。
    3.1. 作为细胞毒性的主要效应的ROS生成
    与疟原虫一样,青蒿素在癌细胞中的分子靶点仍有争议。尽管青蒿素在某些肿瘤细胞中引起的变化是一致的,但尚不清楚这种毒性是否依赖于特定的分子靶点。要对癌细胞产生作用,所需的药物浓度通常高于对疟原虫产生毒性的浓度。青蒿素、DHA、青蒿琥酯和青蒿甲醚在疟原虫中的48小时IC50(即使50%的抑制浓度)可低至15纳摩尔,而它们的抗癌活性是细胞系依赖性的,IC50在0.5至200微摩尔或更高之间波动。疟原虫对青蒿素的敏感性表明其具有特定的寄生虫靶点。相比之下,在癌细胞中,青蒿素的作用似乎更多是通过ROS生成等一般机制介导的。然而,有人建议,ROS介导的损伤可能由青蒿素激活附近的初始事件引发。在青蒿素处理的细胞中,显微镜分析显示在亚细胞结构中早期出现了类似坏死的形态变化,这些变化可能与ROS生成有关。
    微阵列分析发现,青蒿素的作用似乎受到氧化应激酶表达的调节,包括过氧化氢酶、硫氧还原酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽S-转移酶家族。青蒿素敏感的细胞下调了氧化酶,而这些分子的过表达则使癌细胞的敏感性降低。直接证据表明,在HL-60细胞系中,早期(1小时)和快速的ROS生成与凋亡的诱导和青蒿素引发的损伤相关。此外,IC50与ROS水平直接相关。相反,在某些实验系统中,青蒿素的作用在抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸和1,2-二羟基苯-3,5-二磺酸(TIRON,一种铁螯合剂)的存在下得以逆转,导致细胞死亡的延迟。最近的一项研究表明,在青蒿琥酯处理的HeLa细胞中,在检测到细胞毒性之前(48小时),在16小时内ROS的生成已开始,表明这可能是青蒿素引发损伤的初始事件。线粒体中的电子传递链(ETC)被认为在ROS生成中起作用,但即使在缺乏ETC的HeLa细胞中仍检测到显著的细胞毒性,这表明细胞中可能存在其他的ROS来源。确实,新兴证据表明,在乳腺癌细胞中,氧化应激最初是在溶酶体中产生的,这是铁激活的青蒿琥酯作用的结果,类似于疟原虫中的情况。因此,线粒体内源性凋亡途径的激活是导致细胞死亡的下游事件。在这一模型中,青蒿素类药物可能通过负调控血红素合成进一步增加细胞毒性。
    尽管在许多细胞系统中有越来越多的证据表明ROS介导的损伤,细胞损伤也与非氧化应激相关,尤其是新型青蒿素二聚体似乎在没有或极少ROS生成的情况下表现出抗肿瘤作用,但其细胞毒性机制仍在研究中。此外,目前尚不清楚青蒿素引发的坏死是否可能是一种非ROS依赖的细胞死亡机制。
    青蒿素的抗肿瘤毒性似乎还受到钙代谢、内质网(ER)应激和翻译控制肿瘤蛋白(TCTP,一种结合钙蛋白)的调节,这些蛋白也被认为是寄生虫的靶标。尽管最初将TCTP基因(tctp)的表达与癌细胞对青蒿素的反应相关联,但尚未发现TCTP在青蒿素作用中的功能角色。
    与疟原虫类似,青蒿素在癌细胞中作为靶标的作用也得到了研究。先前的证据表明,使用10微摩尔的青蒿素治疗会因抑制钙ATP酶而导致钙浓度增加。然而,研究表明,两种青蒿素二聚体的作用机制显示出通过ROS介导的强烈ER应激,这与抑制钙ATP酶无关。有趣的是,高活性的青蒿素二聚体和众所周知的钙ATP酶抑制剂他普吉林(thapsigargin)之间的行为相似,但由不同的分子事件介导。事实上,他普吉林缺乏内过氧化物基团,仅产生微弱的ROS水平。然而,ER似乎是青蒿素作用的重要部位,因为在HepG2细胞中,显示出青蒿素荧光衍生物优先在该细胞区室中积累。
    青蒿素类药物已显示出多效性效应,跨越不同的实验系统。也有可能在不同癌细胞系中,青蒿素细胞毒性的潜在机制会因其特定标志或细胞系特征的变化而有所不同。这只有在类似条件下对不同细胞系中抗肿瘤细胞增殖的分子事件进行研究时才能得出结论。
    4. 青蒿素作为抗癌药物
    4.1 青蒿素及其衍生物的抗肿瘤作用
    青蒿素及其许可的半合成青蒿素衍生物的显著抗肿瘤活性已在体外和动物模型中得到证实。大量研究集中于最活跃的化合物,即DHA和青蒿琥酯。一项研究测试了美国国家癌症研究所(NCI)开发治疗学项目的55种细胞系,显示青蒿琥酯对白血病、结肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、中枢神经系统(CNS)和肾癌细胞具有抑制活性。二氢青蒿素对胰腺癌、白血病、骨肉瘤和肺癌细胞也具有显著的抗肿瘤活性。此外,青蒿酮显示出比青蒿素更好的活性,并与其他抗癌药物具有显著的协同作用。
    已发现青蒿素可通过直接诱导DNA损伤(基因毒性)或间接干扰涉及多种恶性肿瘤特征的信号通路来发挥作用。然而,直接的DNA损伤仅在特定系统中被描述,而间接作用在文献中更为常见。在胰腺细胞(Panc-1)中,青蒿琥酯引起DNA片段化和膜损伤。有趣的是,低剂量的青蒿琥酯与类似坏死的细胞死亡有关,而较高浓度则诱导细胞凋亡。损伤的程度和类型似乎取决于细胞系的表型和起源,并且可能随时间和剂量而异。值得注意的是,与缓慢生长的癌细胞相比,快速生长的细胞系对青蒿琥酯的敏感性更高。
    此外,DHA、青蒿琥酯和青蒿甲醚可能通过调控协调生长信号、凋亡、增殖能力、血管生成和组织侵袭及转移的基因和蛋白来发挥作用。这些内过氧化物药物通过不同途径之间的复杂相互作用可能增强其抗癌效果,从而控制癌症并导致细胞死亡。
    4.1.1 青蒿素抑制癌细胞增殖能力
    在正常细胞中,细胞周期依赖性激酶(CDK)是将信号传递到细胞周期中以推动细胞分裂的蛋白质。正常的生长依赖于有效地传递信号以进行复制和分裂。癌细胞中的不受控制的增殖是由引发生长信号放大的突变、检查点的失调和对生长抑制因子丧失敏感性所致。异常的细胞生长也因程序性细胞死亡或凋亡的失调而被触发。青蒿素及其半合成衍生物能够通过扰乱细胞周期动力学或干扰增殖相关的通路有效地诱导癌细胞的生长抑制。二氢青蒿素和青蒿琥酯是非常有效的生长抑制剂,多项研究指出DHA是最有效的抗癌青蒿素类化合物(DHA > 青蒿琥酯 > 青蒿乙醚 > 青蒿甲醚)。最近,青蒿酮在包括黑色素瘤和乳腺癌细胞在内的7种细胞系中显示出惊人的抗肿瘤效果。青蒿素化合物已被证明对癌细胞具有细胞静止和细胞毒性作用。青蒿素诱导的生长抑制已在细胞周期的所有阶段中被报道;然而,更常见的是G0/G1到S期转变的抑制。在同一时间的所有细胞周期阶段的抑制被解释为细胞静止效应。在DHA处理后的骨肉瘤、胰腺癌、白血病和卵巢癌细胞中观察到了G2/M期的细胞周期阻滞。同样,青蒿琥酯在骨肉瘤、卵巢癌和其他不同的癌症细胞系中也抑制了G2期。
    青蒿素类药物诱导的生长抑制的潜在机制包括细胞周期调控酶的表达和活性改变,如CDK2-4和6以及D型环素(G1期到S期转变)或CDK1和A型环素(G2/M期)。青蒿素的抗增殖作用引起CDK转录的下调,CDK启动子的抑制或p21、p27和CDK抑制剂的增加。增殖的抑制也可能归因于针对多个通路的相互作用蛋白的下调。研究表明,在胰腺细胞(BxPC3,AsPC-1)中,DHA处理通过降低增殖细胞核抗原(PCNA)和D型环素的水平来抑制细胞活力,同时伴随着p21的增加。同一系统的另一项研究显示,DHA通过抑制NF-κB因子的活化来对抗其在增殖(c-myc,cyclin D)和凋亡途径(Bcl2,Bcl-xl)中的靶标。DHA在肺癌细胞(SPC-A1)中还下调了存活蛋白,这是一种调节凋亡和G2/M期细胞周期进展的蛋白质。类似的效应在青蒿素处理的骨肉瘤细胞中也被报道。在前列腺癌中,DHA通过破坏Sp1(特异性蛋白1)和CDK4启动子的相互作用来诱导细胞周期阻滞。Sp1-CDK4复合物的解离促进了caspase的活化和细胞死亡。此外,一项研究发现青蒿琥酯作为拓扑异构酶II的抑制剂,通过与多个途径的相互作用来抑制生长。总体来说,青蒿素类药物似乎通过干扰不同癌症实体共有的多个途径来发挥作用。
    4.1.2 青蒿素的促凋亡作用
    凋亡是抗肿瘤治疗中广泛研究的机制,因为操纵这一过程是控制癌症的有效策略。这个细胞过程由Bcl2家族基因(促凋亡的Bax和抗凋亡的Bcl2)和它们对线粒体的影响介导。Bax/Bcl2比例的增加会诱导细胞色素c的释放,随后引发caspase的顺序活化,最终导致细胞死亡。
    在许多癌症和细胞系中,凋亡是青蒿素引发的常见且快速的效应。200微摩尔DHA处理白血病细胞在1小时内诱导凋亡。青蒿素的敏感性与癌细胞系中抗凋亡(Bcl2)和促凋亡基因(Bax)的表达水平相关。在一般情况下,青蒿素的促凋亡效应归因于内源性途径的激活。因此,线粒体膜损伤被认为是细胞死亡事件级联中的关键环节。许多研究表明,青蒿素类化合物通过调节Bax/Bcl2比例来诱导凋亡。与这些观察结果一致,DHA和青蒿琥酯在一组骨肉瘤细胞中引起了细胞色素c的释放、Bax过表达、Bax/Bcl2比例的增加以及caspase 3和9的活化。DHA还激活了caspase 8并降低了CDC25B、cyclin B1和NF-κB的水平。在同一系统中,青蒿琥酯暴露耗尽了存活蛋白,这在DHA处理的肺癌细胞中也被发现具有促凋亡作用。
    在肝癌细胞系中,DHA特别是在这个系统中,DHA和原型药物青蒿素似乎具有相似的效力。微阵列分析将c-MYC的表达水平与增强的DHA诱导凋亡相关联。高表达c-MYC的白血病(HL-60)和结肠癌细胞(HCT116)对DHA的促凋亡作用显著更敏感。此外,在HCT116细胞中敲低c-myc基因显著减少了DHA相关的细胞死亡。c-myc的下调也可能与该细胞系中G1期阻滞的诱导有关。在转移性黑色素瘤(A375,G361细胞系)和Jurkat T淋巴瘤细胞中,DHA的高凋亡作用与NOXA(一种促凋亡蛋白)的上调、caspase 3的激活以及氧化应激有关。在肺细胞中,DHA的促凋亡效应伴随着钙浓度的增加和p38的激活。
    在某些研究中,还描述了作用于外源性凋亡途径的分子变化。DHA似乎通过增加不同前列腺癌细胞系中DR5(细胞死亡受体5)启动子的转录来诱导DR5表达。事实上,与TRAIL(一种DR5配体)的联合治疗在该系统中显著增强了DHA的促凋亡作用。
    青蒿素类药物通常在大多数系统中促进凋亡而不是坏死,然而在某些情况下,已报告了凋亡和坏死的同时发生。诱导凋亡是青蒿素抗肿瘤作用的一个主要优势,因为它防止了坏死引起的炎症和细胞损伤的连带效应。在某些细胞系中,青蒿素诱导的坏死与ATP水平低和缺陷的凋亡机制有关。
    4.1.3 青蒿素抑制转移和侵袭
    恶性细胞的侵袭能力与癌症患者的高死亡率和发病率有关。癌细胞向其他器官的扩散是一个复杂的过程,涉及恶性细胞通过细胞外基质的侵袭、进入血液循环、并最终在远端器官中定植。为了实现侵袭,癌细胞需要失去E-钙粘蛋白(一种参与细胞-细胞粘附的钙结合跨膜分子)的表达或功能。多种基因编码的细胞外基质处理蛋白酶、运动因子和粘附蛋白也在转移过程中发挥作用。最近,PAI-1和TIMP-1被认为是内源性蛋白酶抑制剂,也被发现与癌症转移有关。青蒿素的一个重要益处是其在高度侵袭性和侵略性癌症实体中表现出的显著抗迁移活性。青蒿素的抗转移活性与基质金属蛋白酶(MMP)家族基因的表达变化以及它们对αvβ3整合素的影响有关。在肝癌细胞(HepG2和SMMC 7721)中,12.5微摩尔青蒿素的处理抑制了迁移,这与MMP2的减少以及TIMP-2的相应增加有关。通过增强E-钙粘蛋白活性和Cdc42的激活,青蒿素增加了细胞-细胞粘附,从而抑制了转移。此外,有研究发现,一些癌细胞可能具有在不同通路上共同作用的特定蛋白质。例如,在非小细胞肺癌和纤维肉瘤中,DHA处理引起了低水平的MMP2、MMP7或MMP9,这由AP-1和NF-κB的转激活或失活所驱动。早期研究表明,MMP2受Sp-1转录因子活性的调节,此外DHA诱导的Sp-1分子相互作用的破坏被认为是DHA在不同途径中调控效应的关键事件。其他研究发现,在小鼠肺Lewis癌中,青蒿素通过抑制血管内皮生长因子C(VEGF-C)介导的淋巴结转移和淋巴管生成受到抑制。
    4.1.4 青蒿素对血管生成的抑制
    随着恶性组织的生长,转移和实体瘤需要额外的血液供应才能生存和繁殖。因此,癌细胞通过调控参与新血管生成和重塑的蛋白质和通路来诱导新生血管形成。血管生成过程导致内皮细胞的增殖增加,这通过诱导血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、其受体和细胞因子而发生。这一事件通过多种机制发生,包括缺氧驱动的HIF-1α和芳香烃受体核转运蛋白(ARNT)表达的激活。血管生成的调控受到抑制血管生成的分子如血管抑素、内皮抑素、血小板反应蛋白、TIMP和PAI-1的介导。由于这些分子在肿瘤生存中的作用,促血管生成因子及其调控网络中的分子成为了重要的药物靶点。基于微阵列的研究显示,青蒿素、青蒿琥酯及其他衍生物通过调节血管生成因子的基因表达来抑制新生血管形成。青蒿素的作用似乎通过下调生长因子(VEGF、FGF)、HIF-1α、血管生成介导因子(ANG)、富含半胱氨酸的血管生成诱导物(CYR61)、一些金属蛋白酶(MMP9、MMP11和BMP1)以及胶原蛋白来介导。与此同时,青蒿素类药物引起了血管生成抑制剂的上调。这些发现得到了在不同系统中的实验研究支持,揭示了其他分子相互作用。50微摩尔DHA暴露在人的脐静脉内皮细胞中通过耗尽VEGF受体flt-1和KDR/flk-1的水平来抑制血管生成。类似的效果在淋巴内皮细胞和Lewis肺癌中得以再现。在胰腺细胞(BxPc-3)和BalB/c裸鼠中,DHA通过抑制NF-κB的DNA结合以及下调其与血管生成相关的靶标如VEGF、IL-8、COX2和MMP9,来抑制血管生成。先前已将NF-κB水平的降低与增殖和转移的抑制联系在一起,表明NF-κB调控可能在DHA在这一系统中的多模式作用中起到关键作用。NF-κB是调节多种过程的关键因子,并且在抗癌药物反应中发挥着重要作用。它被DNA损伤激活,并且在应对药物压力时是凋亡抵抗的介质。
    青蒿素类药物还被赋予了其他抗癌特性。青蒿琥酯显示了逆转细胞转变、允许组织重新分化的能力,这通过负向调控Wnt信号通路来实现。值得注意的是,青蒿琥酯在分化程度较低的细胞系中更为有效。
    4.2 青蒿素对耐药性癌细胞的抗肿瘤作用
    成功抗癌治疗的一个主要障碍是随着时间的推移产生的耐药性。许多侵袭性肿瘤对抗癌治疗产生耐药性,而几乎没有化疗替代方案。耐药性的一个主要原因是由于膜蛋白泵的过表达而产生的药物外排,这导致无效的低药物浓度。青蒿素的抗癌活性在其他情况下耐药和多重耐药的癌细胞中表现出不受影响。一项使用55种NCI细胞系和微阵列分析的研究显示,与已确立的抗癌药物耐药相关的基因如MDR1(Pgp)、MRP1和BCRP对青蒿素的活性没有影响。当在多重耐药HL-60细胞系中过表达MRP-1和BCRP的细胞中观察到没有对青蒿琥酯的生长抑制曲线产生影响时,这一发现得到了进一步证实,这表明在存在其他药物耐药的情况下青蒿素的抗肿瘤活性得以保留。青蒿素对包括阿霉素、甲氨蝶呤和羟基脲耐药的细胞系在内的广泛耐药癌细胞系有效,并且没有交叉耐药性。进一步的研究表明,青蒿琥酯的促凋亡作用在阿霉素耐药的白血病细胞系中不受影响;相反,青蒿琥酯增强了阿霉素的促凋亡效应。在另一项研究中,青蒿琥酯的抗癌效力在化疗敏感和耐药的神经母细胞瘤细胞系和初级神经母细胞瘤培养物中得以保留。在这一系统中,青蒿琥酯对文斯汀、阿霉素、顺铂、托泊替康、麦法兰和足叶乙甙适应细胞的敏感性未受影响,IC50范围为1.4-2.7微摩尔,与亲本敏感细胞系相似。仅有一个细胞系对青蒿琥酯表现出低敏感性,这与ROS形成低和谷胱甘肽半胱氨酸合酶(GCL)表达增加有关。通过GCL抑制剂介导的谷胱甘肽耗尽改善了该细胞系对青蒿琥酯的敏感性。P-糖蛋白(Pgp)或p53的衰减没有影响青蒿琥酯的敏感性。DHA在某些细胞系如胆管癌(CL-6)和肝癌(Hep G2)中显示了最低的IC50值,与其他抗癌药物相比,这表明,MDR1、MRP1-2或MRP3的上调对药效没有影响。抗癌药物与青蒿素类药物之间缺乏交叉耐药性可能基于不同的药物作用机制和/或耐药机制。大多数传统抗癌药物是核苷类似物,而青蒿素的作用被认为是通过ROS依赖机制介导的。此外,在红髓性白血病和人类小细胞肺癌中,青蒿素对Pgp或MRP1没有显著的抑制作用,因此原则上膜蛋白泵的过表达可能不会影响青蒿素的药效。然而,在另一个系统中,青蒿素(原型药物)通过上调mdrp通过一种机制增加了对阿霉素的耐药性,这将在后面讨论。
    4.3 青蒿素类药物与标准抗癌化疗的相互作用:用于癌症的青蒿素联合疗法(ACT)?
    现有的抗癌疗法主要针对癌细胞的增殖,通常采用化疗药物、离子辐射或直接对生长因子信号通路的毒性作用。在癌症的联合治疗中,青蒿素类药物的抗肿瘤作用可以提供独立的抗癌活性,并且不会增加额外的副作用。关于将青蒿素类药物与其他抗癌药物结合使用的益处进行了研究,显示青蒿素通过不同通路的多因素作用可能增强总体活性(协同作用)。
    已有报道指出,耐药癌细胞系通过添加青蒿素到常规治疗中变得对治疗敏感(化疗增敏作用)。有趣的是,DHA和青蒿琥酯表现出最强的化疗增敏/协同效应,而原型药物青蒿素则仅表现出加成和拮抗作用。DHA显著增强了用于胰腺癌的抗癌药物吉西他滨的抗癌效果,这种药物随着时间的推移会产生耐药性。在胰腺细胞中的体内和体外分析显示,与单独使用吉西他滨相比,DHA引起的生长抑制和凋亡增加了4倍和2倍。DHA在增强吉西他滨活性的双重作用以及可能抵抗耐药性的效果归因于DHA对吉西他滨诱导的NF-κB激活的抑制及其对其靶标的作用。同样的效应在肝癌细胞系中得到了证实,无论它们的p53状态如何。DHA与吉西他滨联合使用时,肿瘤生长抑制作用增强了45%,而原型药物青蒿素仅诱导了加成效应。
    与此一致的是,在Lewis肺癌细胞系中,DHA与环磷酰胺联合使用显示出更强的抗肿瘤活性,或者与顺铂联合使用在小鼠非小细胞肺癌A549细胞系中也表现出更强的抗肿瘤活性。在大鼠C6胶质瘤细胞中,添加1微摩尔DHA使得替莫唑胺(一种用于治疗脑癌的DNA烷化剂)的细胞毒性增加了177%。进一步的研究发现,DHA通过ROS生成促进了替莫唑胺的促凋亡和促坏死作用。最近,青蒿琥酯的抗癌活性在不同的联合治疗方案中得到了增强。与免疫调节药物来那度胺联合使用时,青蒿琥酯表现出显著的协同作用。
    然而,青蒿素联合疗法的益处需要谨慎评估。治疗效果受到药物作用机制和特定系统和方案中多重相互作用的影响。最近的研究表明,在结肠癌和乳腺癌细胞中,吉西他滨与青蒿酮联合使用仅表现出加成效应。在结肠癌细胞(HT-29)中,有人提出青蒿素可能通过对抗阿霉素对NF-κB抑制的作用而削弱阿霉素的活性。同一研究的作者报告了在相同系统中,青蒿素通过不同机制诱导了阿霉素耐药性。因此,有人提出青蒿素暴露通过抑制SERCA引起钙的积累,导致Pgp上调,并导致阿霉素耐药细胞的产生。相反,使用钙螯合剂预处理可以使细胞恢复对阿霉素的敏感性。然而,尚未在这一系统中评价DHA和青蒿琥酯;尚不清楚这些最有效的化疗增敏剂在该细胞系中是否具有相似的效应。到目前为止,青蒿琥酯或DHA与阿霉素和比拉鲁宾联合使用显示出在白血病和人类小细胞肺癌耐药细胞系中的化疗增敏作用,但在敏感的亲本细胞系中没有进一步增加敏感性。化疗增敏作用与Pgp抑制无关。总体而言,这些证据表明DHA和青蒿琥酯具有显著增强抗肿瘤药物的能力并抵抗肿瘤耐药性。
    青蒿素类药物还可以增强基于离子辐射的疗法。在U373MG胶质瘤细胞中,DHA处理抑制了辐射引起的GST表达并伴随ROS生成。与单独使用辐射或DHA相比,青蒿素联合治疗显示出更高的效果。青蒿素在其他癌症治疗中包括高压氧疗法中的辅助作用也有报道。
    4.4 青蒿素耐药性
    青蒿素的一个突出特点是,尽管青蒿素作为抗疟药物已使用了30年,但在体外或临床上尚未确认其耐药性。在临床上,曾有患者的治疗失败中报道了耐药性。然而,在体外,耐药菌株通常不稳定,通常在连续多年药物暴露后才会产生。青蒿素在不同癌症途径上的多模式作用也可能预示着在恶性细胞中延迟诱发耐药性。确实,只有少数细胞系表现出对青蒿素或其衍生物的低敏感性或无反应。例如,青蒿素(原型药物)在乳腺癌细胞(MCF-7)和胃癌细胞(MKN)中似乎活性较低。有些研究在乳腺癌细胞中建议青蒿素的反应可能由雌激素受体(ERα和ERβ)介导,这些受体参与细胞增殖。值得注意的是,有报道指出在乳腺癌细胞中,破坏铁代谢可能增强阿霉素和顺铂的效力。青蒿素反应较低还与高度转移性鼻咽癌细胞系(CNE-1,CNE-2)中过表达的BMI-1有关。最近的一项研究发现,在一个独特的顺铂化疗耐药细胞系中存在对青蒿琥酯和DHA的一定程度的交叉耐药性。这种效应可以通过L-丁氧基-S,R-磺氨酸(一种抗氧化剂GCL的抑制剂)部分逆转。
    然而,在实验条件下,已在体外产生了耐药性。使用敲除和转染细胞进行的微阵列和实验研究表明,肿瘤抑制因子p16INK4A和抗氧化蛋白过氧化氢酶的上调可能赋予了青蒿琥酯独立于p53状态的耐药性。最近,有研究表明,在高转移性乳腺癌细胞中,用20微摩尔青蒿琥酯预孵育24小时会诱发耐药性。预处理的MDA-MB-231转移性细胞对进一步的青蒿琥酯治疗完全无反应,而在非转移性细胞系MDA-MB-468中,导致了敏感性较低的细胞。进一步研究表明,青蒿琥酯诱导耐药性和敏感性丧失与NF-κB、AP-1和NMP-1的上调转录有关,这些分子克服了青蒿琥酯的促凋亡和抗转移作用,并允许肿瘤进展。然而,目前尚不清楚青蒿琥酯诱导的耐药性和敏感性丧失是否在长期细胞亚培养后得以保留。还需要阐明其他半合成内过氧化物是否可能在这一细胞系中产生类似效应,或者联合治疗是否可能延迟或逆转这种效应。
    5. 未来的研究方向:青蒿素作为抗癌药物的挑战和前景
    青蒿素及其衍生物被认为是治疗癌症的新型药物候选者。然而,在其作为抗癌药物的发展和应用过程中,仍然存在一些挑战和未来研究方向。
    5.1 青蒿素的靶向性和选择性
    青蒿素的一个显著优势是其对癌细胞的选择性毒性。然而,为了进一步开发青蒿素类药物,了解其对不同癌症类型的特异性和靶向性是至关重要的。未来的研究需要深入探讨青蒿素在不同癌症细胞系中的作用机制,并鉴定其潜在的分子靶点。通过基因组和蛋白质组学分析,确定青蒿素在不同癌症中的特异性靶标,将有助于设计更有效的治疗策略。
    5.2 青蒿素的药物耐受性和安全性
    尽管青蒿素类药物在抗疟疾治疗中表现出良好的耐受性和安全性,但其在抗癌治疗中的长期使用是否会引发毒性或耐药性仍需进一步研究。此外,青蒿素类药物的药代动力学特性也需要进一步优化,以提高其在癌症治疗中的疗效和安全性。未来的研究应致力于开发具有更好药物代谢特性的新型青蒿素衍生物,并评估其在临床应用中的长期安全性。
    5.3 青蒿素的联合治疗
    青蒿素类药物与其他抗癌药物联合使用的潜力已在一些研究中得到初步证实。然而,联合治疗的具体机制和最佳组合方案尚未完全明确。未来的研究应进一步探讨青蒿素与其他抗癌药物之间的协同作用,尤其是在克服耐药性癌症中的应用。此外,还需要研究青蒿素与放射治疗或免疫治疗的联合效果,以探索其在多模式治疗中的潜力。
    5.4 青蒿素的临床转化
    尽管青蒿素类药物在实验室研究中显示出显著的抗癌活性,但其临床应用仍处于早期阶段。未来的研究应集中于青蒿素类药物的临床试验,以验证其在癌症患者中的疗效和安全性。此外,还需探索青蒿素在不同癌症阶段和类型中的应用,包括早期预防、中期治疗和晚期癌症的治疗。
    6. 结论
    青蒿素及其衍生物作为一种具有潜力的抗癌药物,展示了显著的抗肿瘤活性,尤其在某些耐药性癌症中表现出卓越的效果。然而,青蒿素类药物在抗癌治疗中的应用仍面临挑战,未来需要通过深入研究和临床验证,进一步了解其作用机制和优化其治疗效果。随着科学研究的不断推进,青蒿素有望成为一种有效的抗癌药物,为癌症患者提供新的治疗选择。
    BioMed Research International - 2011 - Crespo-Ortiz - Antitumor Activity of Artemisinin and Its Derivatives From a.pdf 抗肿瘤活性的青蒿素及其衍生物:从一种广为人知的抗疟药到一种潜在的抗癌药物.pdf 抗肿瘤活性的青蒿素及其衍生物:从一种广为人知的抗疟药到一种潜在的抗癌药物.docx
  5. Roger
    标题:
    Artesunate与顺铂联合抑制HNSCC细胞生长并通过Artesunate诱导Rb和磷酸化Rb水平的降低来促进细胞凋亡
    摘要:
    顺铂(Cisplatin)是用于头颈鳞状细胞癌(HNSCC)的一种标准化疗药物。然而,由于其副作用,例如肾毒性,其在某些患者中使用受到限制,尤其是在老年人和肾功能受损者中。近年来,开发为抗疟药的青蒿素(Artemisinin)已显示出抗肿瘤活性,特别是在与其他抗癌药物联合使用时。本研究评估了青蒿素及其衍生物与顺铂和铁结合使用时对HNSCC细胞系的抗肿瘤效果。通过细胞活力测定(WST-1测定)评估细胞增殖;通过流式细胞术分析细胞周期;使用Annexin V和碘化丙啶染色分析细胞死亡率,并通过蛋白质印迹法(Western blotting)评估视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)、磷酸化Rb(p-Rb)以及其他与细胞周期相关的分子。研究表明,青蒿素衍生物中的Artesunate和二氢青蒿素(DHA)显示出显著的生长抑制作用。此外,发现Artesunate与顺铂及铁的组合抑制了细胞增殖并引发了S/G2-M期的细胞周期阻滞。蛋白质印迹分析显示,Artesunate不仅引起了Rb的丧失,还导致了p-Rb的减少。这些结果表明,Artesunate在与顺铂联合使用时可能是一种有用的抗癌药物。
    引言:
    2018年,头颈癌占所有癌症的8%(约145万人),并且其相关死亡占所有癌症死亡的5%(约50万人)。这一癌种的发病率每年都在增加。头颈癌的主要形式是头颈鳞状细胞癌(HNSCC),其标准治疗包括化疗、放疗和手术。在化疗中,顺铂是主要药物,通常单独或与其他药物联合使用。顺铂的标准剂量为80-100 mg/m²,然而,其有效反应率仅为25-50%。此外,顺铂在肾功能受损患者中使用受到限制,这限制了其在老年患者中的应用。因此,目前尚无针对肾功能受损患者的HNSCC标准治疗方案,迫切需要开发新的治疗方法。
    近年来,青蒿素作为一种从青蒿(Artemisia annua)中提取的传统中草药,因其较低的毒性受到关注。青蒿素的半合成衍生物Artesunate表现出增强的效果,并已被用于疟疾治疗。此前的研究表明,青蒿素及其衍生物对多种人类癌症细胞显示出潜在的抗肿瘤作用。例如,Sun等人报道,青蒿素及其衍生物对小鼠白血病细胞系和人类肝癌细胞系具有抗肿瘤作用。自此,青蒿素及其衍生物的抗肿瘤效果在多种肿瘤中得到了验证。
    之前的研究表明,Artesunate显示出抗肿瘤活性。虽然Artesunate与其他化疗药物的联合效果已在胶质瘤和肝癌中得到了验证,但在头颈癌中的抗肿瘤效果仅有少数报道。本研究旨在评估Artesunate与顺铂及铁联合使用对HNSCC细胞系的抗肿瘤作用,并探讨其对与细胞增殖相关的分子表达的影响。
    材料与方法
    细胞系:
    在本研究中,使用了HNSCC细胞系UM-SCC-23和UM-SCC-81B。细胞系在含有1%青霉素-链霉素溶液和10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中,于37°C、5% CO₂的条件下培养。
    细胞活力测定:
    使用WST-1试剂盒进行细胞活力测定。实验中使用的药物包括青蒿素及其衍生物Artesunate、顺铂和铁。UM-SCC-23和UM-SCC-81B细胞分别以1.7×10³和1.0×10³细胞/孔的密度接种于96孔平底板中。次日,在每个孔中加入药物,并继续培养。药物处理72小时后,加入WST-1试剂并孵育3小时,使用微孔板读数仪测量450 nm和650 nm的吸光度,以测量细胞活力。
    细胞周期和凋亡分析:
    为了分析细胞周期,UM-SCC-23和UM-SCC-81B细胞分别以0.5×10⁵和0.3×10⁵细胞/孔的密度接种于六孔板中。次日,加入Artesunate、顺铂和/或硝酸铁,孵育72或96小时后收集细胞,进行PI染色后通过流式细胞仪分析细胞周期分布。
    为了分析凋亡,UM-SCC-23和UM-SCC-81B细胞分别以1.0×10⁵和0.5×10⁵细胞/孔的密度接种于六孔板中,24小时后加入Artesunate、顺铂和硝酸铁,孵育48或72小时后,使用Annexin V-FITC试剂盒进行染色,并通过流式细胞仪测量凋亡率。
    蛋白质印迹分析:
    为了进行蛋白质印迹分析,UM-SCC-23和UM-SCC-81B细胞分别以0.5×10⁶和0.3×10⁶细胞/孔的密度接种于六孔板中,24小时后加入Artesunate、顺铂和硝酸铁,孵育72或96小时后,用RIPA裂解液裂解细胞。裂解物通过SDS-PAGE进行分离,并通过半干转印法转移到PVDF膜上。膜用5%的BSA在室温下封闭1小时,并使用特异性抗体(如抗Rb、抗p-Rb)在4°C孵育过夜。随后,使用HRP结合的二抗孵育1小时,并通过增强化学发光(ECL)法检测蛋白质信号。
     
    将针对视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)的siRNAs转染入HNSCC细胞系,并评估其对细胞增殖和细胞周期的影响
    转染实验:
    HNSCC细胞系UM-SCC-23和UM-SCC-81B的细胞被转染了靶向视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)的小干扰RNA(siRNA)。具体来说,细胞以50%-60%的汇合度接种在六孔板中,并在无抗生素的培养基中孵育。随后,使用Lipofectamine™ RNAiMAX转染试剂(Thermo Fisher Scientific)按照制造商的说明进行siRNA转染。对于每个实验,分别使用针对视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)的siRNA和无关靶标的阴性对照siRNA。转染后24小时,将细胞置于含有10%胎牛血清的完全培养基中继续孵育。
    细胞增殖检测:
    为了评估siRNA转染对细胞增殖的影响,使用WST-1测定法。转染24小时后,细胞被再接种到96孔板中,每孔接种的细胞数为1,000个。随后,继续培养72小时,并按照制造商的说明使用WST-1试剂盒进行检测,测定在450 nm和650 nm下的吸光度,以评估细胞增殖情况。
    细胞周期分析:
    转染后48小时,将细胞收集并固定在70%乙醇中,随后在4°C下孵育过夜。固定后,细胞用PBS洗涤,并用含有RNase A和碘化丙啶的溶液重悬。然后,使用流式细胞仪进行分析,以评估细胞周期分布。使用ModFit LT软件(Verity Software House)进行数据分析。
    结果:
    视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)敲降对细胞增殖的影响:与对照组相比,转染了靶向视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)的siRNA显著抑制了UM-SCC-23和UM-SCC-81B细胞的增殖。这表明视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)在这些细胞系的增殖中发挥了关键作用。
    细胞周期分析:流式细胞仪分析显示,视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)敲降导致G1期细胞比例的显著增加,同时S期和G2/M期的细胞比例减少。这些结果表明,视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)在调节细胞周期进程中起到了重要作用,尤其是在从G1期向S期的转变中。
     
    实验和结果
    1. Artesunate对HNSCC细胞系增殖的影响
    为了确定Artesunate对HNSCC细胞系的抑制效果,使用了WST-1细胞活力测定法。UM-SCC-23和UM-SCC-81B细胞在24、48和72小时后暴露于不同浓度的Artesunate(0、10、20、40、80 µM),随后测量细胞活力。结果显示,Artesunate以剂量和时间依赖性的方式显著抑制了细胞增殖。特别是,当浓度达到40 µM时,细胞活力显著下降,这表明Artesunate具有显著的抗增殖效果。
    2. Artesunate与顺铂联合使用的协同效果
    为了进一步探讨Artesunate与顺铂联合使用的效果,实验分析了两者的协同作用。UM-SCC-23和UM-SCC-81B细胞被暴露于不同组合的Artesunate(10 µM)和顺铂(1 µM),分别在24、48和72小时后测定细胞活力。结果表明,联合治疗的细胞活力显著低于单独使用Artesunate或顺铂的情况,这表明两者具有协同的抗肿瘤效果。
    3. Artesunate对细胞周期的影响
    为了分析Artesunate对细胞周期的影响,使用流式细胞术检测UM-SCC-23和UM-SCC-81B细胞在处理24、48和72小时后的细胞周期分布。结果显示,与对照组相比,Artesunate处理组在G2/M期的细胞比例显著增加,而在G0/G1期的细胞比例显著减少。这表明Artesunate可能通过阻止细胞从G2/M期进入细胞分裂过程,诱导细胞周期阻滞。
    4. Artesunate诱导的凋亡
    为了进一步探讨Artesunate对HNSCC细胞凋亡的影响,使用Annexin V/PI双染法通过流式细胞术分析了凋亡细胞的比例。UM-SCC-23和UM-SCC-81B细胞在处理24、48和72小时后的凋亡率显著增加,尤其是在联合治疗组中,凋亡细胞比例远高于单独使用Artesunate或顺铂的组。这一结果表明,Artesunate能够通过促进细胞凋亡来增强其抗肿瘤活性。
    5. Artesunate对Rb和p-Rb表达的影响
    为了进一步探讨Artesunate在细胞周期调控中的作用,分析了Rb和p-Rb蛋白的表达。通过蛋白质印迹分析,发现Artesunate显著降低了UM-SCC-23和UM-SCC-81B细胞中Rb和p-Rb的表达水平,尤其是在高浓度Artesunate处理后。这表明Artesunate可能通过影响Rb和p-Rb的表达来阻滞细胞周期,从而发挥抗肿瘤作用。
    6. Rb基因敲除对细胞周期和增殖的影响
    为了验证Rb在细胞周期和增殖中的关键作用,实验中使用了小干扰RNA(siRNA)敲除Rb基因。成功敲除Rb基因后,UM-SCC-23和UM-SCC-81B细胞的增殖显著受抑,且G1期细胞比例显著增加,这与之前的Artesunate处理实验结果一致。这些发现进一步支持了Rb在细胞周期调控中的关键作用,并表明通过调控Rb的表达,Artesunate能够有效抑制HNSCC细胞的增殖。
    讨论
    本研究系统地评估了Artesunate与顺铂联合使用对HNSCC细胞的抗肿瘤效果,并深入探讨了Artesunate在细胞周期和凋亡中的分子机制。研究结果表明,Artesunate能够以剂量和时间依赖的方式显著抑制HNSCC细胞的增殖,并通过影响Rb和p-Rb的表达,诱导细胞周期阻滞和凋亡。此外,Artesunate与顺铂的联合治疗表现出强烈的协同效应,进一步增强了其抗肿瘤活性。
    研究还发现,Artesunate通过下调Rb和p-Rb的表达,可能干扰了细胞周期的正常进程,特别是在G1期向S期的转换过程中。这一发现为Artesunate作为HNSCC治疗药物的潜力提供了新的见解,并为未来的临床研究奠定了基础。
    结论
    本研究表明,Artesunate与顺铂联合使用可显著增强其抗HNSCC细胞的效果。Artesunate不仅通过下调Rb和p-Rb的表达,阻滞细胞周期,还通过促进细胞凋亡来增强其抗肿瘤活性。这些发现支持Artesunate作为一种有前景的抗癌药物,特别是在头颈鳞状细胞癌的治疗中。
     
    2023 年 6 月 19 日在线出版。doi :  10.3892/or.2023.8591
  6. Roger
    标题:
    Artesunate与Navitoclax联合在高级别浆液性卵巢癌模型中的抗肿瘤药物协同作用
    引用: McCorkle, J.R.; Ahn, R.; Cao, C.D.; Hill, K.S.; Dietrich, C.S.; Kolesar, J.M. Artesunate与Navitoclax联合在高级别浆液性卵巢癌模型中的抗肿瘤药物协同作用. 《癌症》 2024, 16, 1321. DOI: https://doi.org/10.3390/cancers16071321.
    学术编辑: Alexandre Escargueil
    接收日期:2024年3月4日 修订日期:2024年3月22日 接受日期:2024年3月25日 发布日期:2024年3月28日
    摘要:
    Artesunate属于从青蒿(Artemisia annua)植物提取的药物类别,称为青蒿素类。Artesunate传统上用于治疗严重的疟疾,但也表现出对多种恶性肿瘤(包括卵巢癌)的抗肿瘤活性。数据表明,Artesunate通过加剧细胞氧化应激,触发凋亡。在本研究中,我们研究了Navitoclax(一种Bcl-2家族抗凋亡蛋白的抑制剂)是否能增强Artesunate在卵巢癌细胞中的疗效。Artesunate和Navitoclax作为单一药物都在二维和三维卵巢癌细胞模型中表现出抗增殖作用。在将Navitoclax与Artesunate结合后,我们在每个测试的二维细胞系和卵巢肿瘤类器官模型中观察到抗肿瘤药物的协同作用。进一步使用腹腔CAOV3异种移植模型在BALB/scid小鼠中研究这种药物组合,显示Artesunate/Navitoclax组合优于单一的Artesunate和安慰剂对照组,但未优于单一的Navitoclax。通过优化,这种药物组合可能为卵巢癌提供新的治疗选择,值得进一步的临床前研究。
    关键词:
    Artesunate;Navitoclax;药物协同作用;卵巢癌
    1. 引言
    卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤,2023年美国估计有13,270例死亡病例。虽然卵巢癌仅占所有新发癌症病例的1%,但其年死亡率估计为2.2%。由于死亡率高于发病率且五年生存率仅为50%左右,因此寻找改善卵巢癌治疗效果的策略至关重要。
    卵巢癌的一线治疗包括细胞减灭术和以紫杉烷和铂类药物为基础的辅助化疗,这一方案在过去30年中几乎没有变化。最近,某些患者接受了贝伐珠单抗和/或PARP抑制剂的维持治疗,后者对BRCA突变型卵巢癌(约占所有病例的15%)特别有益。然而,超过70%的患者在诊断时处于晚期,且多达80%的患者会复发并最终死于其疾病,这突显了新治疗方法的迫切需要。
    Artesunate是一种青蒿素的半合成衍生物,青蒿素是从青蒿(Artemisia annua)植物中提取的,该植物在中国草药中已作为退烧剂使用了2000多年。Artesunate目前用于治疗疟疾,但也显示出在广泛的癌细胞系中具有抗肿瘤活性,包括卵巢癌。Artesunate的主要抗癌机制被认为是生成活性氧(ROS),导致DNA和蛋白质的氧化损伤,从而引发凋亡。四十年的疟疾治疗和癌症临床试验已经表明,Artesunate的耐受性良好。
    Navitoclax是一种小分子Bcl-2家族(即BCL2、BCL2L1、BCL2L2)抗凋亡蛋白的抑制剂,已在卵巢癌的临床前模型中表现出活性,包括一种25例高级别浆液性卵巢癌的体外模型。基于有前景的临床前数据,Navitoclax作为单一药物在一项包括45名重度治疗的高级别浆液性、铂类耐药或复发性卵巢癌患者的二期试验中进行了评估。在此试验中,Navitoclax显示出有限的活性,只有一名患者达到部分缓解,虽然不良反应可接受,但血小板减少症是主要的毒性。在其他癌症中,Navitoclax与化疗联合使用已显示出有效性,但受到毒性的限制。
    由于Artesunate能诱导凋亡,评估利用Bcl-2蛋白抑制剂的潜在药物协同作用是一条可行的研究路径,这也可能改善Navitoclax单一药物的活性。此外,两种药物的可接受毒性特征使它们成为临床研究的有吸引力的候选药物。虽然青蒿素类已在白血病和非小细胞肺癌细胞中与Bcl-2抑制剂联合进行了临床前评估,但尚未在卵巢癌中研究Artesunate与Navitoclax的联合应用。我们使用2D和3D人类卵巢肿瘤模型,体外和体内评估了该方案的抗肿瘤疗效。
    2. 材料与方法
    2.1 二维细胞培养
    四种高级别浆液性卵巢癌细胞系(OVCAR3、UWB1.289、CAOV3和OV-90)购自ATCC。细胞在37°C和5% CO2的恒定条件下培养,每周传代2到3次。OVCAR3细胞在RPMI-1640基础培养基中生长,含20%胎牛血清和0.01 mg/mL牛胰岛素;UWB1.289细胞在RPMI-1640与乳腺上皮细胞生长培养基(MEGM)按1:1比例混合的培养基中生长,补充有3%胎牛血清;CAOV3细胞在含10%胎牛血清的DMEM中生长;OV-90细胞在MCDB 105与199培养基按1:1混合的培养基中生长,补充有15%胎牛血清。
    2.2 二维细胞活力检测
    将3 × 10^3细胞接种到96孔白色壁微孔板中,在100 µL生长培养基中培养并在37°C、5% CO2条件下孵育24小时。随后去除生长培养基,替换为含药物的培养基或作为阴性对照的空白培养基。每个细胞系在逐级稀释的Navitoclax或Artesunate中培养72小时。Artesunate的药物浓度范围为0.05 µM到100 µM(12个浓度;4倍稀释);Navitoclax浓度范围为0.01 µM到25 µM(12个浓度;2倍稀释)。处理后,使用CellTiter-Glo 2.0细胞活力测定(Promega,东京中央)测量细胞活力,并用未经处理的对照细胞进行标准化(药物处理的发光值/未经处理的平均发光值×100)。使用R统计软件包drc中的四参数对数对数非线性模型确定每种药物在每个细胞系中的IC50值。
    2.3 二维药物组合/协同分析
    使用上述方法,经过72小时的处理后,测定细胞活力。Artesunate和Navitoclax单独和组合进行测试,采用6 × 6完全因子协同研究设计,每个细胞系至少进行了3次独立实验。测试的Artesunate浓度范围为0 µM到200 µM,Navitoclax浓度范围为0 µM到40 µM。使用R统计软件中的synergyfinder包分析药物协同作用,协同评分使用Loewe加成模型实现。
    2.4 三维肿瘤类器官培养
    肿瘤类器官细胞系UK1254建立于Markey癌症中心49岁患者的晚期上皮性卵巢癌。类器官在37°C和5% CO2的恒定条件下培养,每周传代一次,每周更换培养基两次。细胞在Corning® Matrigel®生长因子减少的基质胶中生长。基础培养基为Advanced DMEM/F12,添加了从HEK293 RSPO-1表达细胞中获得的R-Spondin-1(RSPO-1)条件培养基(20%体积/体积)、Wnt-3A(50 ng/mL)、FGF10(100 ng/mL)、Noggin(100 ng/mL)、EGF(10 ng/mL)、A83-01(500 nM)、Y-27632(9 µM)、B27补充剂(2%体积/体积)、N2补充剂(1%体积/体积)、烟酰胺(1 mM)、Glutamax(2 mM)、HEPES(10 mM)和primocin(50 µg/mL)。
    2.5 类器官活力测定
    UK1254类器官在逐级稀释的Navitoclax或Artesunate中生长72小时。使用CellTiter-Glo 3D细胞活力测定(Promega)测量细胞活力。使用高通量成像评估细胞活力,并与未经处理的对照细胞进行比较,以确定每种药物浓度下的反应。使用四参数对数对数非线性回归模型确定每种药物的IC50。测试了6个浓度,Artesunate的范围为0 µM到16 µM(10倍稀释),Navitoclax的范围为0 µM到12.5 µM(2倍稀释)。
    2.6 类器官药物组合/协同分析
    使用上述细胞增殖测定方法生成剂量反应数据。药物组合对每种药物的五种逐级稀释浓度进行了测试,使用第六种浓度作为对照。使用R统计软件中的Bioconductor synergyfinder包评估药物组合对药物-药物相互作用的影响。协同评分使用Loewe加成模型、Bliss独立模型、最高单一药物模型(HSA)和零相互作用效能模型(ZIP)实现。协同评分=0表示加成;评分>0表示协同作用;评分<0表示拮抗作用。Artesunate的浓度范围为0 µM到50 µM(4倍稀释),Navitoclax的浓度范围为0 µM到12.5 µM(2倍稀释)。
    2.7 凋亡检测
    将CAOV3和OVCAR3卵巢癌细胞(4 × 10^5)接种到60 mm培养皿中,并在37°C、5% CO2条件下孵育24小时。然后用10 µM Navitoclax、25 µM Artesunate(OVCAR3)或50 µM Artesunate(CAOV3)处理细胞48小时。为了评估药物组合,细胞还被处理10 µM Artesunate和/或10 µM Navitoclax 48小时。去除培养基后,用D-PBS洗涤细胞,并使用Accutase细胞分离溶液(BD Biosciences)分离细胞。收集细胞,离心5分钟(300×g),用冰冷的D-PBS洗涤两次,然后重悬于1X Annexin V结合缓冲液(BD Biosciences)中。将细胞通过70 µm的筛网过滤,然后使用FITC Annexin V凋亡检测试剂盒I(BD Biosciences)用FITC-Annexin V和碘化丙啶标记15分钟。随后通过流式细胞仪分析细胞。
    2.8 体内异种移植小鼠模型
    动物研究经肯塔基大学机构动物护理和使用委员会批准。BALB/c scid(CBySmn.Cg-Prkdcscid/J)小鼠购自Jackson实验室,并在无病原体的条件下饲养在屏障笼中。
    通过使用pLL-CMV-rFLuc-GFP-mPGK-Puro Lenti-Labeler慢病毒载体对CAOV3细胞进行慢病毒转染,生成表达荧光素酶和GFP的CAOV3细胞(CAOV3-luc)。通过在含有1 µg/mL嘌呤霉素的CAOV3培养基中培养2周,选择转染细胞。通过FACS进一步富集GFP阳性细胞,收集最高GFP表达的25%细胞。筛选后的细胞在含1 µg/mL嘌呤霉素的培养基中维持。
    将六周龄的雌性BALB/c scid小鼠腹腔注射1.25 × 10^7 CAOV3-luc细胞。为了监测细胞移植,小鼠通过腹腔注射IVIS-brite D-荧光素钾盐(150 mg/kg,PerkinElmer)。小鼠通过3%异氟烷吸入麻醉,并使用Lago光学成像系统(Spectral Instruments)每周成像一次,以评估注射后5-15分钟的全身生物发光。使用Aura图像分析软件(版本4.0.7,Spectral Instruments)定量生物发光。
    使用8只肿瘤负担相当的小鼠组进行治疗效果评估,随机分配为安慰剂对照组、单一Artesunate治疗组、单一Navitoclax治疗组或Artesunate与Navitoclax联合治疗组。各组的肿瘤负担在开始治疗时通过生物发光测量相等。Artesunate和Navitoclax购自MedChemExpress,并在10% DMSO、40% PEG-300、5% Tween-80和45%生理盐水中制备。治疗每天一次,持续5天(周一至周五),共8周。Navitoclax的剂量为50 mg/kg。Artesunate的剂量为50 mg/kg,持续4周,然后增加到100 mg/kg,持续接下来的4周。治疗期间,每周按上述方法进行生物发光成像。
    2.9 统计分析
    统计分析使用R(版本4.0.1)或GraphPad Prism进行。统计显著性设定为*p < 0.05,**p < 0.01,***p < 0.001。
    3. 结果
    3.1 单一药物敏感性分析
    我们在一组人类高级别浆液性卵巢癌细胞系中评估了对Artesunate的相对新生敏感性,包括CAOV3、OVCAR3、OV-90和BRCA1缺失的UWB1.289细胞。由于Artesunate对卵巢癌细胞增殖的时间依赖性作用,我们选择在治疗72小时后评估细胞活力,这与之前的研究一致。进行了细胞活力测定,并计算了IC50值。不同细胞系之间的Artesunate敏感性相差约10倍。OV-90细胞中的Artesunate IC50值显著高于CAOV3、UWB1.289和OVCAR3细胞。
    图 1. 卵巢癌细胞系对单一药物青蒿琥酯和纳维托克治疗的敏感性。(A)卵巢癌细胞系在青蒿琥酯治疗 72 小时或纳维托克治疗后估计的 IC 50值。 (C )在新型卵巢肿瘤类器官系 UK1254 中以类似的方式确定的青蒿琥酯和纳维托克的 IC50 值。箱线图和晶须线分别表示四分位距和最小/最大值,中位数显示为箱内的线。采用单因素方差分析和 Tukey 多重比较事后检验进行统计分析(* p < 0.05;** p < 0.01;*** p < 0.001)。   我们之前的研究表明,Artesunate暴露会诱导癌细胞凋亡;因此,我们旨在确定通过抑制Bcl-2家族的抗凋亡蛋白是否能增强Artesunate在卵巢癌细胞中的疗效。Navitoclax属于BH3模拟物小分子抑制剂家族,能抑制Bcl-2、Bcl-xL和Bcl-w。在卵巢癌细胞系中评估了对Navitoclax的敏感性,CAOV3、UWB1.289、OV-90和OVCAR3细胞的平均IC50值分别为3.33 µM、3.53 µM、7.93 µM和13.33 µM。Navitoclax在OVCAR3细胞中的IC50值显著高于其他细胞系。
    新型上皮性卵巢癌类器官UK1254也被评估了对Artesunate和Navitoclax的敏感性。UK1254类器官的Artesunate IC50均值为4.15 µM,Navitoclax IC50均值为3.80 µM,与在二维细胞系中观察到的值相当。
    3.2 Artesunate与Navitoclax联合
    为了确认在我们的模型系统中观察到的Artesunate介导的细胞活力损失确实是由凋亡引起的,我们对Artesunate敏感的CAOV3和OVCAR3细胞分别用50 µM和25 µM Artesunate处理48小时。使用FITC-Annexin V和碘化丙啶染色并通过流式细胞仪分析凋亡。在与未经处理的对照相比,Artesunate导致CAOV3细胞中的凋亡增加了9.3%,而OVCAR3细胞中的凋亡增加了23.5%。在CAOV3和OVCAR3细胞中,凋亡率显著高于未处理细胞中观察到的基础凋亡率。接下来,使用中度细胞毒性单一药物浓度的Artesunate和Navitoclax以1:1摩尔比进行联合治疗,并在CAOV3和OVCAR3细胞中处理10 µM的Artesunate和Navitoclax单独或联合48小时。结果显示,10 µM的Navitoclax在CAOV3细胞中诱导了43.1%的凋亡,在OVCAR3细胞中诱导了16.1%的凋亡。单独使用Artesunate分别在CAOV3和OVCAR3细胞中触发了6.7%和17.4%的凋亡。组合使用时,CAOV3细胞的凋亡率增加到68.3%,而OVCAR3细胞的凋亡率增加到54.4%。

    图 2. 用青蒿琥酯和纳维托克治疗后诱导细胞凋亡。( A ) 用青蒿琥酯处理 CAOV3 和 OVCAR3 细胞 48 小时,然后分析细胞凋亡。与未处理的对照相比,平均凋亡细胞百分比(误差线 = SEM)。使用非配对双尾 t 检验进行统计分析。( B ) 用青蒿琥酯和纳维托克单独和联合处理 48 小时的卵巢癌细胞,分析其凋亡诱导情况。与未处理的对照相比,平均凋亡细胞百分比(误差线 = SEM)。使用单因素方差分析和 Dunnett 多重比较检验进行统计分析(与未处理的对照相比)(* p < 0.05;*** p < 0.001)。   随后,对整个卵巢癌细胞系进行了药物协同作用的正式分析。经过72小时的处理后,在所有测试的卵巢癌细胞系中观察到临床相关浓度下的细胞毒性药物协同作用,包括对Artesunate耐药的OV-90细胞。使用Loewe加成模型评估协同作用,我们发现组合治疗在CAOV3、OVCAR3、UWB1.289和OV-90细胞中显著优于非相互作用的零模型。此外,在UK1254类器官系中也观察到了显著的药物协同作用。为了确保Artesunate和Navitoclax的表观协同作用不依赖于模型,我们还使用了Bliss独立模型、零相互作用效能模型(ZIP)和最高单一药物模型(HSA)分析了我们的数据。对于所有测试的细胞系,Artesunate和Navitoclax在每种模型下都被认为具有协同作用,除了UWB1.289细胞,在其中组合被分类为加成。

    图 3. 用青蒿琥酯和纳维托克拉治疗的卵巢癌细胞中的药物协同作用。在 ( A ) OVCAR3、( B ) UWB1.289、( C ) CAOV3、( D ) OV-90 和 ( E ) UK1254 细胞中,一系列青蒿琥酯和纳维托克拉药物浓度组合的 Loewe 协同得分的 3D 表面图。显示了矩阵中所有值的平均协同得分和相关的 p 值。   3.3 卵巢癌异种移植模型中的Artesunate与Navitoclax
    体外观察到的药物协同作用促使我们进一步使用正交小鼠异种移植模型研究Artesunate和Navitoclax的组合治疗。生成CAOV3-luc细胞以使用全身生物发光成像监测小鼠中的腹腔肿瘤生长。简要地说,CAOV3细胞使用绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶(rFLuc)共表达的慢病毒载体进行标记,并通过FACS和嘌呤霉素筛选具有稳定基因整合的细胞(CAOV3-luc)。在6周龄雌性BALB/c scid小鼠中建立了腹腔肿瘤异种移植,并通过每周的生物发光成像监测移植情况。
    植入后五周,移植建立,32只CAOV3-luc肿瘤负担相等的小鼠被随机分配到四个治疗组:安慰剂对照组、单一Artesunate治疗组、单一Navitoclax治疗组和联合治疗组。制定了基于之前研究的剂量方案,以在小鼠异种移植模型中展示效力并将毒性最小化。治疗通过灌胃给药,每周5天,持续8周,Navitoclax剂量为50 mg/kg。Artesunate在前4周的剂量为50 mg/kg,随后由于较低剂量未显示出明显效力,增加到100 mg/kg,持续接下来的4周。治疗耐受性良好,观察到的药物相关毒性最小。在Navitoclax单一组的两只小鼠中有三次鼻出血事件,但无需干预即得到缓解。

    图 4. 卵巢癌异种移植瘤中青蒿琥酯和纳维托克单独和联合使用的体内分析。(A)在治疗开始(第 0 周)和结束(第 9 周)用载体、单独青蒿琥酯、单独纳维托克或联合治疗的小鼠的肿瘤异种移植生物发光代表性图像。红色 X 表示在治疗期间死亡的小鼠。(B)载体(黑色)、单独青蒿琥酯(红色)、单独纳维托克(绿色)和联合(蓝色)治疗组从治疗前一周到治疗后 1 周的总排放量平均百分比变化(误差线 = SEM)与时间的关系图。(C)治疗后 1 周肿瘤异种移植生物发光总排放量的箱线图。线表示治疗组内的中值。使用Kruskal–Wallis 检验 ( p = 0.003) 和 Dunn 的多重比较检验进行统计分析 (* p < 0.05)。   图4A显示了治疗开始和结束时每个治疗组的肿瘤异种移植生物发光的代表性图像。图4B总结了相对于治疗前水平的总发射变化的定量(平均值±标准误)。在治疗的第4至第8周期间,安慰剂和单一Artesunate治疗组相比于Navitoclax单一治疗组和联合治疗组显示出更高的肿瘤进展率。在治疗期间,安慰剂对照组的一只小鼠因第10天明显的异氟烷过量暴露而死亡,并从研究中剔除。另一只安慰剂治疗的小鼠在治疗第6周死于疾病。其余30只小鼠在整个研究期间存活。治疗结束后的一周,测量了生物发光,并发现联合治疗组的小鼠中位总发射量显著低于安慰剂和单一Artesunate治疗组。单一Navitoclax治疗组与其他治疗组之间或安慰剂与单一Artesunate治疗组之间未观察到显著差异。
    4. 讨论
    卵巢癌仍然是最致命的妇科恶性肿瘤,但新治疗方式的发展有限。尽管结果略有改善,但当前的前线治疗,包括铂类/紫杉烷双药组合,在近三十年内几乎没有显著变化。显然,寻找更好的卵巢癌治疗策略至关重要。
    Artesunate是一种水溶性、口服可用的青蒿素半合成衍生物,已显示出对多种癌细胞的细胞毒性活性。我们目前的研究和先前的研究表明,Artesunate可以抑制人卵巢癌细胞系和肿瘤类器官的细胞增殖并诱导凋亡。青蒿素类还显示出增强卵巢癌细胞中铂类药物的细胞毒性作用。尽管抗癌活性的证据大多来自临床前研究,Artesunate在早期临床试验中也表现出临床活性。此外,青蒿素类,包括Artesunate,具有良好的耐受性,已被广泛用于全球范围内的疟疾一线治疗,未有严重不良事件的报告。这些数据支持进一步临床研究Artesunate作为癌症治疗的潜力。
    Navitoclax属于一种称为BH3模拟物的药物类别,可增强凋亡的诱导。通过结合Bcl-2蛋白的BH3结构域,Navitoclax破坏了促凋亡蛋白BIM的隔离,导致其释放并最终引发凋亡。单一Navitoclax的临床评价一直未能取得理想效果,活性未达到预期,且显著的剂量限制性但可控的血小板减少症。在一项对小细胞肺癌患者的II期研究中,Rudin等人报告了2.6%的患者部分缓解,23.1%的患者病情稳定,41%的患者病情进展。此外,41%的研究对象发生了III–IV级血小板减少症。MONAVI-GINECO研究评估了Navitoclax单一疗法在复发性上皮性卵巢癌中的疗效。与小细胞肺癌的结果类似,2.2%的患者出现了部分缓解,32.6%的患者病情稳定,65.2%的患者病情进展。26%的患者发生了III–IV级血小板减少症,导致25%的受影响个体停药。Navitoclax单一治疗始终未能产生可接受的结果,这促使研究重点转向组合治疗策略,以增强疗效并避免剂量限制性毒性。
    包括利妥昔单抗、达沙替尼、维莫非尼、伏立诺他、他莫昔芬等靶向药物在内的化疗药物与Navitoclax联合使用在实体瘤和血液癌症中显示出增强的疗效。Navitoclax增强了在2D和3D卵巢癌细胞培养中的卡铂和紫杉醇的体外活性,并在HRD卵巢癌细胞中与鲁卡帕利呈现协同作用。我们自己的工作表明,Navitoclax与Artesunate的组合在2D人卵巢癌细胞系以及一种新型高级别浆液性卵巢癌类器官模型中表现出显著的药物协同作用。
    青蒿素类与Navitoclax的联合使用已在几种癌症模型中显示出优于单一治疗的效果,包括白血病和非小细胞肺癌。我们旨在证明Artesunate与Navitoclax是一种有前途的转移性卵巢癌治疗策略。如图3所示,各种卵巢癌细胞模型中,体外药物协同作用显著且一致。这包括Artesunate耐药细胞系OV-90、BRCA1突变细胞系UWB1.289以及患者衍生肿瘤类器官系UK1254。不幸的是,这些体外结果未能转化为动物模型。尽管体内研究显示联合治疗优于安慰剂和单一Artesunate治疗,但未优于单一Navitoclax。这表明Navitoclax在组合治疗中发挥了主要作用。
    联合治疗未能优于单一Navitoclax是意料之外的,但可能有几个解释。首先,药物给药途径可能不适合最大化Artesunate的生物利用度。因此,Artesunate浓度可能低于在肿瘤部位实现药物协同作用所需的阈值。在健康个体中,口服Artesunate的绝对生物利用度估计仅为21.6%。可能使用静脉注射Artesunate的Navitoclax组合治疗更有效。其次,Artesunate的给药频率可能不足。报道的Artesunate在人类中的半衰期估计相对较短。文献回顾发现,几乎所有研究都估计口服治疗后的Artesunate半衰期小于1小时。短的消除半衰期进一步得到了报告的小分布容积的支持。我们的体内研究可能需要增加口服Artesunate的给药频率,以达到肿瘤内部所需的Navitoclax药物协同作用浓度。最后,可能允许肿瘤进展到对Artesunate不再敏感的程度。正如小分布容积所示,Artesunate在不易灌注的组织中分布可能有限。腹膜和网膜血管丰富,提供了充足的机会将Artesunate从血浆灌注到腹腔。尽管我们使用了能够充分药物暴露的转移性卵巢癌正交腹腔模型,CAOV3-luc细胞在治疗前已允许移植超过4周。这可能允许大转移灶的建立,阻碍Artesunate进入较大的肿瘤结节。另一种策略是提前启动组合治疗,针对微小转移灶和循环肿瘤细胞,这可能产生预期的协同作用。因此,这可能表明Artesunate与Navitoclax的组合在临床上更适合用于尚未发生远处转移的患者的辅助治疗。
    5. 结论
    如前所述,Navitoclax与Artesunate在体外以临床可达到的浓度协同杀死卵巢癌细胞。这种药物组合可能有助于满足卵巢癌治疗的紧迫需求,但还需要进行临床前优化。由于缺乏有效剂量和给药方式的共识,Artesunate的临床应用受到限制。然而,Artesunate作为疟疾治疗的几十年使用经验表明其具有良好的安全性,这可能在与合适药物(如Navitoclax)联合使用时转化为有利的治疗指数。继续对这种治疗组合进行临床前研究对于实现其在卵巢癌中的治疗潜力至关重要。
    附录材料:以下支持信息可以从https://www.mdpi.com/article/10.3390/cancers16071321/s1下载,表S1: 使用各种协同模型评估Artesunate和Navitoclax的协同评分。
    作者贡献: 概念化,J.R.M.、R.A. 和 J.M.K.;方法学,J.R.M.、R.A. 和 K.S.H.;形式分析,J.R.M.、R.A. 和 K.S.H.;调查,J.R.M.、R.A.、C.D.C. 和 K.S.H.;原稿撰写,J.R.M. 和 R.A.;审阅和编辑,J.R.M.、R.A.、C.D.C.、K.S.H.、C.S.D. 和 J.M.K.;监督,C.S.D. 和 J.M.K.;资金获取,J.M.K.。所有作者已阅读并同意已发布版本的手稿。
    资金支持: 此研究得到了美国国立卫生研究院国家癌症研究所肯塔基大学Markey癌症中心的资助,资助编号为P30CA177558。
    伦理声明: 动物研究的方案已获得肯塔基大学机构动物护理和使用委员会的批准。
    数据可用性声明: 本文中所述的数据可应要求从通讯作者处获得。
    致谢: 此研究得到了肯塔基大学Markey癌症中心(P30CA177558)生物样本采购与转化病理学以及流式细胞仪与免疫监测共享资源的支持。肯塔基大学实验室动物资源部提供了额外支持。
    利益冲突: Jill M. Kolesar已获得来自Loxo@Lilly和Artemilife的研究支持,并且是VesiCure Technologies和Helix Diagnostics的创始人和股东。资助者未参与研究设计、数据收集、分析或解释,手稿的撰写或发表结果的决策。
     
     
    cancers-16-01321.pdf
     
  7. Roger
    本文短链接: gettr.ink/m5QyB7
     
     
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    MIT的研究团队在2014年发表了一项研究,展示了如何利用树木的木质部(xylem)来过滤受污染的水。这项研究发表于《PLoS ONE》期刊,展示了从松树(尤其是白松)中提取的木质部可以用来制成简易的水过滤器,能够有效过滤掉大肠杆菌等细菌。这种过滤系统能够在一天内提供多达四升的饮用水,足以满足一个人一天的饮水需求。
     
    技术要点总结:
    木质部的结构和功能:
    木质部(xylem)是树木中负责运输树液的多孔组织,具有天然的过滤功能。这种组织通过树木的根部向上运输树液,同时通过微小的孔隙(称为坑膜)将空气泡过滤掉,防止气泡在树木内传播和生长。 过滤能力:
    研究表明,白松的木质部可以过滤掉大于70纳米的颗粒,并能够有效去除水中的大肠杆菌,过滤效率超过99%。然而,木质部可能无法过滤掉更小的病毒,因为病毒的尺寸通常远小于这些孔隙。 材料选择与挑战:
    研究人员发现,开花树的木质部具有比针叶树更小的孔隙,这可能有助于过滤更小的颗粒。然而,开花树的导管长度更长,可能不太适合设计紧凑型的水过滤器。 木质部在干燥后容易出现水流不畅或水流通过裂缝但未能有效过滤的现象,因此设计者需要找到保持木质部湿润或在干燥后仍能保留其过滤功能的方法。 应用潜力:
    这种基于木质部的过滤器成本低廉,可能适用于依赖地表水的地区,特别是那些受到细菌和植物、动物腐烂物污染的地区。这种过滤器的成本远低于目前市场上的高端过滤膜,具有一次性使用的潜力。 后续研究方向:
    研究团队计划进一步评估其他类型木质部的过滤潜力,以寻找更适合该过程的植物材料。 这些要点展示了利用木质部作为自然过滤材料的巨大潜力,特别是在低成本、农村地区水净化应用中的可行性。
     
    注意:确认树木无毒!例如,紫杉有毒,不应使用。砍伐时请遵守安全预防措施。不建议饮用自制过滤器中的水,除非它们经过适当的质量控制措施并符合安全标准。
    关于使用木质部(xylem)制作水过滤器的背景信息和具体指导,并强调了安全注意事项。以下是主要内容的总结:
    安全注意事项:
    确保使用无毒的树木来制作过滤器,例如红豆杉是有毒的,不应使用。在切割过程中应遵循安全预防措施。除非经过适当的质量控制和符合安全标准的处理,否则不建议饮用自制过滤器过滤的水。 木质部简介:
    木质部是植物用来从根部向其他部分运输水分的组织。水从叶片蒸发,产生负压,将水从根部拉向叶片。 木质部的结构:
    木质部由导管组成,这些导管通过侧壁上的孔相互连接。这些孔的大小从被子植物的几纳米到裸子植物的几百纳米不等,比水中的许多污染物如尘土、细菌和原生动物小得多。 木质部作为过滤器的工作原理:
    使用比单个导管更长的树枝截面会迫使水通过这些孔,从而捕捉污染物,使其作为水过滤器。 选择合适的树种:
    裸子植物(如松树、雪松、云杉等非开花植物)比被子植物(开花植物)更适合作为过滤器。原因包括裸子植物的木质部在树枝或树干的横截面中占比更大,并且其导管尺寸较小,制作的过滤器更为紧凑。 制作水过滤器的步骤:
    需要准备一个至少四分之一英寸厚的非开花树种的树枝、安装树枝的软管或管子、密封树枝的夹子,以及用于测试过滤器的进料溶液(可以是脏水或加入尘土的干净水等)。 实验探讨:
    探讨不同树种之间的流速和污染物去除效果差异、过滤器厚度和面积对流速的影响、干燥过滤器对流速的影响等问题。 总的来说,这段文字提供了使用木质部制作简易水过滤器的基本原理、材料选择、制作步骤以及需要注意的安全事项,并鼓励读者进一步探讨实验中的变量和影响因素。
     
     
    工作原理 http://www.xylemwaterfilter.org/working-principle/
    制作你自己的木质素滤水器 http://www.xylemwaterfilter.org/science-projects/
    制造“干式”木质素滤水器的工艺 http://www.xylemwaterfilter.org/manufacturing-resources/
     
    裸子植物(如松树、雪松、云杉等非开花植物)比被子植物(开花植物)更适合制作木质部过滤器。这是因为这些植物中的导管长度较短,能够制造更紧凑的过滤器。此外,裸子植物的树干或树枝横截面中含有较多的木质部,从而提供更大的膜面积。在制作这些过滤器之前,重要的是要查阅树木的毒性信息。如需进一步指导,请参阅我们“过滤器制造资源”标签中的设计指南。
    什么驱动了水通过木质部过滤器的流动? 木质部过滤器可以通过重力运行,不需要使用泵。
    如何从树木中制作木质部过滤器? 制作木质部过滤器包括四个简单步骤,如示意图所示。以下是这些步骤的详细描述。
    木材获取:从树枝或树干中的木质部切下一段,剥去树皮。木材应保持新鲜,切下的部分应浸泡在水中以防止干燥。
    热水浸泡以提高容量:木质部过滤器具有独特的自我堵塞行为。木质部由松散的半纤维素纤维组成,这些纤维在水通过过滤器时溶解并重新沉积在膜上,导致堵塞。这限制了过滤器的使用寿命。为了减轻自我堵塞,可以将木质部过滤器在60摄氏度的热水中浸泡1小时。这个处理步骤的温度和时间已经过优化,可以去除足够的纤维以提高容量,同时减轻对坑膜的损害以保持过滤效果。如果外部污染物负荷较高,可能不需要此步骤。
    干燥保存以延长保质期:干燥会导致木质部中的膜密封在细胞壁上,有时还会损坏它们。这会导致流速和过滤性能下降,从而缩短木质部过滤器的保质期。为了提高保质期,可以遵循两种方法来保持过滤器的干燥状态:
    酒精处理:在干燥前将切割好的过滤器浸泡在酒精(如乙醇、异丙醇等)中,可以保持膜的结构完整性,并提供至少两年的保质期。 控制过滤器厚度:干燥过滤器的流速与过滤器的厚度密切相关。通过保持过滤器厚度约为0.25英寸,可以获得合理的流速。为了减轻通过损坏的坑膜的污染物泄漏并提高过滤效果,可以将多个薄过滤器串联堆叠。这种方法在酒精难以获取的地区非常有用,尽管质量控制可能较为困难。 干燥:过滤器可以在空气中干燥或在最高45摄氏度的烤箱中干燥。
    这些过滤器可以处理哪些类型的污染物? 对于微生物污染物,木质部过滤器可以去除>3-log的大肠杆菌和MS-2噬菌体,以及>4-log的轮状病毒(基于使用直径4厘米、厚度约1厘米的银杏制成的过滤器在1.2米重力头下进行的测试,这些过滤器使用了含有世界卫生组织(WHO)规定浓度的大肠杆菌(>10^6 CFU/mL)和MS-2噬菌体(>10^5 PFU/mL)以及国家卫生基金会(NSF)规定浓度的轮状病毒(>10^4 PFU/mL)的通用测试水)。这些过滤器还可以处理像尘土这样的物理污染物。对于化学污染物的效果尚未进行评估。
    这些过滤器的流速是多少? 木质部过滤器中的流速与木质部面积和压力成线性比例。可以通过调整这些参数来调整流速以满足用户需求。可以通过增加过滤器直径或并联多个过滤器来增加过滤面积。乙醇干燥过滤器和新鲜过滤器的透水率(流速归一化面积和压力)分别为0.01 L/h.cm².kPa和0.03 L/h.cm².kPa。这与具有相同孔径的商业膜的透水率(0.002-0.05 L/h.cm².kPa)相当。
    木质部过滤器的容量是多少? 木质部过滤器的容量取决于水质、过滤器设计以及是否使用了预过滤。使用符合WHO规定的高质量地下水代表的通用测试水(GTW)时,木质部过滤器在1米压力头下的容量为6.07 ± 4.40 L/cm²。直径4厘米、厚度约1厘米的银杏木质部过滤器在1米重力下可以处理34-84升的GTW。
    木质部过滤器最容易受到像腐殖酸和尘土这样的大有机分子的污染。使用符合WHO规定的具有高腐殖酸和尘土浓度的挑战测试水(CTW)时,木质部过滤器在1米重力下的容量为0.58 ± 0.47 L/cm²。直径4厘米、厚度约1厘米的银杏木质部过滤器在1米重力下可以处理6-12升的CTW。通过使用简单、廉价的预过滤方法,可以提高过滤器对CTW的处理能力。例如,可以使用布料和颗粒活性炭(GAC)来减少尘土和腐殖酸的负荷。使用布料和GAC预过滤后,直径4厘米、厚度约1厘米的木质部过滤器在1米重力下可以处理26-31升的水。
    木质部过滤器的使用寿命是多少? 根据水质、过滤器设计和所使用的预过滤类型,木质部过滤器可能需要每1-4天更换一次。在使用寿命结束时,流速非常慢,提示需要更换过滤器。
    木质部过滤器是否经过自然水测试? 是的,木质部过滤器已经过天然泉水、管井水(地下水)和印度市政自来水的测试。由银杏(Ginkgo Biloba)和喜马拉雅松(Pinus roxburghii)制成的直径4厘米、厚度1厘米的过滤器在1米重力头下能够处理至少10升的水,并在大多数情况下显示出对大肠杆菌的完全去除。
     

     
    裸子植物边材的工程化与特性研究:设计水过滤装置的实现 | Engineering and characterization of gymnosperm sapwood toward enabling the design of water filtration devices s41467-021-22055-w.pdf
    裸子植物的地理分布、结构与降解特性及定价 | Geographic-availability-structural-and-degradation-characteristics-and-pricing-of-gymnosperms  Geographic-availability-structural-and-degradation-characteristics-and-pricing-of-gymnosperms.xlsx
     
  8. Roger
    这张图片显示了一位名为鲁珀特的患者的治疗方案,以及治疗后的进展记录。内容如下:
    鲁珀特的治疗方案
    诊断为第4期结肠癌(肺部和肝脏均有肿瘤) 医生预计生存时间为6个月 治疗方案:
    Fenbendazole(芬苯达唑):222mg,每天三次 Ivermectin(伊维菌素):5mg,每天一次 CBD胶囊:25mg,配合Hemp提取物胶囊 Quercetin(槲皮素):500mg,每天一次 Tumeric(姜黄):1000mg,每天一次 Chlorella Tablets(小球藻片):2-4片,每天 补血剂或铁片 维生素E:180mg 维生素C:500mg 维生素D 超级B复合维生素配合维生素C Curcumin(姜黄素) SourSop Extractor(刺果番荔枝提取物):每天一勺 Grape Seed Extract(葡萄籽提取物):500mg,每天一次 杏仁:每天约3颗(不要再多) Essiac Tea(艾西亚茶):每天3-4盎司 SourSop Tea(刺果番荔枝茶):每天一杯热茶 SourSop/Graviola Pulp(刺果番荔枝果肉):每天做成冰沙 Propolis(蜂胶):12颗软胶囊,每隔一天服用一次 Beet Root Powder(甜菜根粉):每隔一天用水混合服用 治疗进展记录:
    第4天:咳嗽停止 第7天:皮肤颜色恢复正常 第9天:癌症引起的瘙痒消失 第11天:血红蛋白从8上升到9 第13天:肝脏上的斑点消失 第21天:血红蛋白从6上升到9 第26天:开始形成坚硬的固体粪便 第45天:血红蛋白从6上升到10.3 第87天:肿瘤标志物从20.5降到7.2,肺部肿瘤变为良性,结肠壁变得更厚 图片中的内容描述了鲁珀特在接受该治疗方案后的逐步改善过程。
     
     
     
     
    避风港395 病案与分享 二
    问:我找不到芬苯达唑,请问阿苯达唑可以代替芬苯达唑做抗癌治疗吗?如果可以,请问应该吃多少毫克?
    ( #芬苯达唑 #阿苯达唑 )
    答:可以,因为这些达唑都是属于咪唑类,一类的,就是分子结构有点差异。但基本上是差不多的抗寄生虫药。你就按照药品说明书。因为你是用的阿苯达唑,阿苯达唑其实就是墙内的肠虫清,史克肠虫清就是阿苯达唑。你按照那个说明书,其实美国的抗癌患者用了芬苯达唑,也是按照芬苯达唑的抗寄生虫的药品用药建议剂量去服用的,只不过服用时间长一点。通常像这种抗寄生虫药都是一次性服用两三天,而抗癌要服用的时间比较长。通常是那位非小细胞肺癌的患者,他是用了每周三到四天,所以你不妨用相似的用药方法,建议的剂量去服用,通常是一周三到四天,然后你给一个休药期。
    https://gettr.com/post/p39ulcrbe49
     
    史克肠虫清  https://gettr.ink/Z3aEHn

  9. Roger
    本文短链接:https://gettr.ink/tNFWzr
     
    源文章链接(英文):https://www.heritage.org/china/report/holding-china-accountable-its-role-the-most-catastrophic-pandemic-our-time-covid-19
    源文PDF链接(英文): https://www.heritage.org/sites/default/files/2024-07/SR286_1.pdf
     
    摘要 传统基金会的无党派中国与COVID-19委员会成立的目的是:审查与世界上最具毁灭性的大流行病之一相关的事实和情况,评估和计算中国政府造成的人力和经济损失,并提出追责的建议。
    传统基金会无党派中国与COVID-19委员会
    主席
    John Ratcliffe, 法学博士,第6任美国国家情报总监和前美国德克萨斯州第4区国会议员。
    委员
    Robert C. O’Brien,美国全球战略公司主席,第27任美国国家安全顾问。 Heidi Heitkamp,芝加哥大学政治学院院长,前美国北达科他州参议员。 Matthew Pottinger,防御民主基金会中国项目主席,第32任美国副国家安全顾问。 Robert R. Redfield, 医学博士,病毒学家,前疾病控制与预防中心主任和有毒物质与疾病登记署署长。 Jamie Metzl,一共享世界创始人兼主席,前国家安全委员会和国务院官员,世界卫生组织人类基因组编辑专家咨询委员会成员。 John Yoo, 法学博士,加州大学伯克利分校法律学院Emanuel S. Heller教授。 Robert Kadlec, 医学博士,医生,前卫生与公共服务部助理部长。 David Feith,战略与国际研究中心兼职高级研究员,前东亚和太平洋事务副助理国务卿。 主席致辞
    传统基金会的无党派中国与COVID-19委员会成立的目的是:审查与世界上最具毁灭性的大流行病之一相关的事实和情况,评估和计算中国政府造成的人力和经济损失,并提出追责的建议。
    我们准备了这份报告和随后的建议供美国总统、国会和美国人民考虑。由共和党和民主党成员组成的九人委员会共同起草了这份报告,且没有异议。
    我们工作的目标是追求真相、促进问责、保障美国人民的利益和福祉。为此,我们设立了四个独特的努力方向,旨在揭示事实、评估影响并确定可行的措施。
    数据分析 委员会进行了严格的数据分析,以确定美国因COVID-19遭受的广泛人力和经济成本。目标是全面了解疫情对美国社会的影响。
    事实调查 委员会的工作包括全面审查公开来源的事实和可用证据。我们审查了过去四年中美国国会、调查记者和中国公民提供的数百份文件和报告。在此过程中,我们审阅、咨询并考虑了来自全球网络的无数权威书籍、科学论文和个人作品,发现了重要材料。我们还举办了两次虚拟听证会,并与参与美国政府2020年疫情应对工作的专家、数据分析师和官员进行了交流。这次深入调查的目的是建立一个清晰的叙述,说明2019年底至2020年初在中国发生的事件。
    法律措施 为了追求问责和正义,委员会评估了已确立的法律和国际行动原因、原则和理论,以支持各种潜在的补救措施和案件选择。我们为应对COVID-19后果提供了法律行动指导。
    行动建议 委员会制定了可行的建议,概述了美国政府应立即采取的措施,以追究中国责任并确保国家的保护和韧性。在近五年的不作为之后,我们呼吁总统和国会现在采取果断行动。
    担任这个尊贵委员会的主席是我的荣幸和特权。我感谢我的同事们愿意提供他们的专业知识和服务。我们一起努力尊重国家的价值观和原则,确保公民的健康和福祉。
    我也感谢传统基金会在召集我们无党派委员会时表现出的领导力和远见。
    John Ratcliffe 主席,无党派中国与COVID-19委员会 第6任美国国家情报总监 前国会议员 2024年7月
    执行摘要
    COVID-19大流行对世界造成了巨大的人员和经济成本,这些影响将持续几代人。在大流行之后,全球有2800万人丧生,梦想破灭,弱势群体陷入贫困,经济遭受了数万亿美元的损失。仅美国就估计有110万人死亡,损失达18万亿美元。
    传统基金会召集了无党派中国与COVID-19委员会(以下简称委员会),以开展事实调查,确定美国因大流行遭受的巨大损失,审查有关病毒起源和传播的所有证据,基于中国的科学和运营环境提出法律选项,并根据调查结果提供政策建议。委员会的报告不排除许多其他政府、机构和个人可能在大流行中扮演了辅助角色,但发现中国在反对诚实、透明和问责方面独树一帜,这种行为是COVID-19大流行的直接原因。
    委员会在报告中记录了多项与中国政府宣传的叙述相矛盾的重要事实。委员会发现,现有证据的平衡倾向于认为大流行是由于武汉病毒研究所(WIV)的一次研究相关事故而非武汉市场出售的野生动物所致。
    委员会发现,中国政府没有采取适当措施确保WIV不受污染。注意到实验室的几位科学家可疑地生病,中国政府在疫情爆发初期的关键时期隐瞒了有关疾病的高度相关信息。委员会记录了中国政府销毁样本、隐藏记录、监禁提出基本问题的中国记者、对中国科学家实施封口令、并猛烈阻止对疫情起源的任何有意义的国际调查。委员会还发现中国发布了虚假数据。尽管中国签署了一项国际协议,要求其向世界卫生组织通报公共卫生紧急情况并提供及时、准确和详细的信息,但这些行为仍然发生。
    所有政府和机构都必须全面审查在COVID-19大流行前后采取的行动,并采取适当的纠正措施,以最大限度地减少当前和未来的风险。虽然美国的这一进程尚未达到应有的水平,但美国政府的行政和立法部门已经采取了重要步骤。需要做的更多。中国的行为与其他国家和机构不同,这给中国、美国和世界带来了巨大且不必要的风险。
    鉴于中国拒绝实行问责,包括在国际机构中的阻挠行为,像本委员会这样的努力至关重要。虽然承认其他国家和机构存在不足,但本报告力图评估中国的责任并建议措施追究中国的责任。委员会发现多个法律依据可以追究中国国家和各种中国企业的责任。委员会还概述了美国政府可以实施的17项政策建议,以加强威慑、透明度和问责。
    虽然委员会主要在美国背景下分析大流行的成本及美国应如何追究中国责任,但其结论不限于美国。我们鼓励其他国家使用本委员会创建的模型,调查大流行对其社会的人员和经济成本,并探索如何追究中国的责任。
    正如在任何正常运作的国内法律体系中,建立问责和责任是基本工具一样,这些原则也必须在这一背景下应用。面对前所未有的全球挑战,替代方案是对未来更严重的大流行进行危险的赌博,这可能导致数百万甚至数十亿人丧生。
    大流行的前所未有的全球成本 COVID-19大流行被认为是世界历史上七大最致命的瘟疫之一,对全球造成了巨大的人员和经济成本。国际货币基金组织的负责人称其为“前所未有的危机”。
    在查看美国的具体成本估算之前,有必要了解大流行在全球范围内的影响。例如,截至2024年6月,《经济学人》估计全球因COVID-19的超额死亡人数已达2800万,包括超过110万美国人。
    除了巨大的人员损失外,大流行造成的经济影响也极为严重。2020年,全球GDP下降了3.4%。同年约90%的国家经济产出收缩。
    世界银行将这一经济动荡称为“一个多世纪以来最大的全球经济危机”,并指出全球贫困“首次在一代人中上升”。2020年至2021年间,估计有9700万人陷入贫困。低收入国家受到的打击尤为严重。
    全球失业率在2020年飙升至6.5%,高于前一年的5.4%。根据世界银行的一项调查,失业率并不平等地分布在不同人口群体中,女性失业率高于男性。大流行导致2020年全球损失了相当于2.55亿个全职工作时间。这些损失在拉丁美洲和加勒比地区、南欧和南亚尤为严重。大流行的影响持续至今:非洲和阿拉伯世界的几个低收入地区在2023年的失业率预计仍高于大流行前的水平。
    儿童在COVID-19中承受了不成比例的负担。联合国称大流行为“我们75年历史上对儿童最大的危机”。不仅儿童面临疾病和死亡,他们还经历了家庭的失去、因隔离和学校关闭而造成的孤立、食物不安全以及无法获得非病毒相关疾病的医疗服务。
    教育受到的打击最为严重。2020年大流行高峰期,全球超过15亿儿童停课。到2022年,仍有超过6.16亿儿童受到全面或部分学校关闭的影响。据估计,2022年2月,中低收入国家70%的10岁儿童功能性文盲,而大流行前这一比例为57%。经济合作与发展组织(OECD)高收入国家的儿童也经历了显著的学习损失:2022年,OECD国家中25%的15岁学生被认为表现不佳。
    在心理健康方面,大流行期间全球重大抑郁症病例增加了27.6%,焦虑症病例增加了25.6%。最容易患心理疾病的是年轻人和女性。一些国家的这些精神障碍病例甚至翻了一番。随着人们面对死亡、疾病、隔离、悲伤、失去工作和收入以及普遍的不确定性,家庭和社区的社会结构解体。
    长时间COVID是一种至少影响10%至20%感染者的经常致残的疾病,影响各个年龄段的人群,包括儿童。仅在美国,就有约600万儿童患有这种疾病。
    已识别的长时间COVID症状超过200种,影响多个器官系统。广泛的清单包括疲劳、呼吸急促、神经认知效应和自主神经障碍等多器官、多系统、复发-缓解症状。尽管神经效应曾被认为罕见,但这些病例在成人和儿童中变得越来越普遍。
    此外,患有长时间COVID的个体还观察到嗅球、大脑、心脏、肺部和其他部位的各种放射学异常。长时间COVID还可以引发其他慢性健康状况,如糖尿病和心脏或肝脏疾病。疾病负担从轻微症状到严重残疾不等,这使得它成为一个巨大的、持续的全球卫生挑战。
    大流行的全球成本确实巨大,但由于缺乏个别国家的成本数据,本报告仅关注美国的美元成本。委员会鼓励其他国家的组织和政府使用各自国家的统计数据计算类似数字,并与美国一起追究中国共产党(CCP)的财政责任。
    COVID-19 大流行在美国的成本
    本节旨在帮助政府官员和公众了解这场毁灭性大流行在美国的真实成本。
    总成本
    委员会估计,截至2023年12月,COVID-19大流行在美国的总成本已达到18.007万亿美元。表1显示了按主要类别划分的总成本。

    参考:根据美联储的数据,2022年美国财富的总净值为135.555万亿美元。这意味着,到目前为止,大流行的总美元成本约占美国财富的13%。以下各节将逐项分析每个类别的成本计算。
    死亡
    可以使用一种称为“统计生命价值”(VSL)的衡量标准来计算COVID-19死亡的货币成本。VSL衡量的是个人必须支付多少额外报酬才能承担某些活动带来的额外死亡风险。
    VSL数据可以从市场或调查数据中推断出来。例如,如果一份工作每年有万分之一的额外死亡风险,但比类似工作每年多支付1000美元,那么VSL就是1000万美元。每10000名工人将集体获得1000万美元(10000名工人每人每年额外支付1000美元),平均来说,其中一人将死亡。因此,1000万美元是为了一个生命风险支付的。
    VSL不应与终身收入或工作产生的利润混淆。它是一种衡量个人愿意接受的小幅度死亡风险增加以换取收入增加的标准。
    将COVID-19爆发视为增加死亡风险的事件,我们可以使用VSL来估算一个美元数字,如果在爆发后将这些钱分发给所有美国家庭,将被视为对增加的死亡风险的公平补偿。然而,并非每一次死亡都意味着相同的剩余生命损失。显然,老年人的剩余寿命平均少于年轻人。此外,COVID-19并未同等影响所有年龄组,对老年人影响更大。
    因此,我们使用一个统计生命年(VSLY)的恒定值来计算不同年龄组的VSL,并将VSLYs加总到统计上预期的剩余寿命年数。该方法将每一年的生命等同对待。
    在我们的计算中,我们使用的VSLY为50万美元,这与美国卫生与公众服务部使用的数字一致。远期的VSLY数字通过折现率转换为现值。折现率调整了货币的时间价值,因为未来的美元比现在的美元价值低。表2中的VSL数字基于3%的折现率。
    美国疾病控制与预防中心(CDC)收集了包括与COVID-19相关死亡在内的所有美国死亡的每周临时统计数据。从大流行开始到2020年,COVID-19是导致984,716人死亡的主要原因,同时COVID-19也是1,138,763人多重原因之一。
    然而,有些死于COVID的人可能从未检测出阳性。其他人可能由于与大流行无直接关系的原因而死亡——例如,面临风险的个体可能因担心暴露于COVID-19而避免就医,或者医疗服务提供者可能延迟服务。
    因此,为了获得COVID导致的生命损失的更全面数字,我们查看了CDC对与COVID-19相关的“超额死亡”的追踪——即每周死亡人数超过如果未发生大流行本应预期的死亡人数。我们使用CDC按年龄组分列的超额死亡人数来捕捉不同年龄段死亡风险增加的变化。
    表2展示了CDC按年龄组划分的临时死亡数据。COVID爆发前的死亡率计算为2017-2019年的平均率,并在“2017-2019年每10万人平均死亡率”一栏中显示。美国在COVID期间经历的较高死亡率显示为“2020-2022年每10万人平均死亡率”一栏中的平均值。将平均死亡率变化百分比乘以“2020-2022年平均人口”,再乘以3以涵盖三年的死亡人数,得出“三年超额死亡人数”。再一次,对于所有年龄类别,总计2020年至2022年间超额死亡1,476,457人。将每个年龄组的超额死亡人数乘以相应的VSL得出死亡增加的总成本。
    调整为三年间疫情死亡风险变化后,使用每生命年价值(VSLY)为50万美元,得出总价值为8.625万亿美元。
    收入损失:将疫情前的经济预测与疫情期间的实际数据进行比较,可以估算出疫情对整个经济的影响。虽然这不是一个完美的衡量标准,因为同期经济前景也发生了其他变化,但疫情应代表过去几年新信息的主要部分。
    通过比较实际国内生产总值(GDP)数据与国会预算办公室(CBO)2020年1月发布的基线预测来计算经济损失,后者是在疫情爆发前计算和发布的。
    GDP衡量的是美国境内生产的商品和服务的价值,从而衡量美国人从这种生产中获得的收入。需要注意的是:(1) 名义GDP可以分为实际GDP,实际GDP按不变价格计算商品和服务的价值,隐含GDP平减指数衡量总体价格水平的变化;(2) 实际GDP和隐含平减指数的变化应分开跟踪,以便不会将没有实质性收益的价格水平上升误认为是实际收入的增加。
    为了计算疫情对实际GDP的影响,我们取当前实际GDP数据与CBO基线的差值,并乘以隐含GDP平减指数。这生成一个按疫情前预期价格水平计算实际产出的数据序列。从CBO 2020年1月的名义GDP基线中减去该替代序列,计算出控制通货膨胀后的国家收入损失,这在下面的一个独立部分中计算。
    将疫情三年间的名义GDP差异相加,总共减少了1.825万亿美元的美国总产出。从2020年第一季度到2022年第四季度,实际GDP平均比2020年初的预测低2.5%。
    慢性病:对于大多数人来说,COVID-19感染会导致几天类似流感的症状,然后恢复正常。然而,一些患者报告感染后症状持续数月。这被称为“长期新冠”。
    根据CDC和人口普查局的调查,大约15%的美国成年人曾感染长期新冠。美国卫生与公众服务部,疾病控制与预防中心,国家卫生统计中心新闻稿,“Nearly One in Five American Adults Who Have Had COVID-19 Still Have ‘Long COVID’”,2022年6月22日最后审查,https://www.cdc.gov/nchs/pressroom/nchs_press_releases/2022/20220622.htm(2024年6月29日访问)。该来源的数据来自美国人口普查局和其他联邦机构如CDC进行的家庭调查。
    美国成年人口为2.609亿,这相当于4020万例。
    长期新冠的典型持续时间仍然未知。然而,最近的估计表明,大多数症状在一年内会消失。Barak Mizrahi等人,“Long COVID Outcomes at One Year After Mild SARS-CoV-2 Infection: Nationwide Cohort Study”,BMJ 2023, 380, e072529, https://www.bmj.com/content/380/bmj-2022-072529(2024年6月29日访问)。
    长期新冠相关损害的相关经济衡量指标是质量调整生命年(QALY)。Matthew D. Adler,“QALYs and Policy Evaluation: A New Perspective”,Yale Journal of Health Policy, Law, and Ethics, Vol. VI, No.1 (2006),https://openyls.law.yale.edu/bitstream/handle/20.500.13051/6066/04_6YaleJHealthPolyL_Ethics1_2006_.pdf(2024年6月29日访问)。
    QALY计算的是良好健康的年份数,每年评分在1(完美健康)和0(死亡)之间。我们使用哈佛大学经济学家David Cutler和前美国财政部长Lawrence Summers使用的相同质量调整生命年的降低值,他们基于慢性阻塞性肺疾病的比较,使用每例长期新冠的损害值为-0.25到-0.35。David M. Cutler和Lawrence H. Summers,“The COVID-19 Pandemic and the $16 Trillion Virus”,JAMA, Vol. 324, No. 15 (2020), pp. 1495–1496,https://jamanetwork.com/journals/jama/fullarticle/2771764(2024年6月30日访问)。
    使用长期新冠病例代表0.70 QALY一年和我们之前使用的每生命年价值50万美元,总计美国在疫情三年间因长期新冠造成的损失为6.0万亿美元。
    心理健康:CDC和美国人口普查局的调查数据显示,自COVID爆发以来,大约25%的成年人报告了焦虑或抑郁的症状。美国卫生与公众服务部,疾病控制与预防中心,国家卫生统计中心,美国人口普查局,“Household Pulse Survey, 2020–2024: Anxiety and Depression”,最后审查于2024年6月14日,https://www.cdc.gov/nchs/covid19/pulse/mental-health.htm(2024年6月29日访问)。
    这种情况是否由疾病本身或各国为应对疾病实施的政策引起的基本无关紧要,因为如果没有这种疾病,就不会采取这些措施。CDC数据显示,焦虑和抑郁症状与COVID-19相关病例的普遍程度之间存在联系。Haomiao Jia等人,“National and State Trends in Anxiety and Depression Severity Scores Among Adults During the COVID-19 Pandemic—United States, 2020–2021”,美国卫生与公众服务部,疾病控制与预防中心,发病率和死亡率每周报告,Vol. 70, No. 40 (2021年10月8日),pp. 1427–1432,https://www.cdc.gov/mmwr/volumes/70/wr/mm7040e3.htm?s_cid=mm7040e3_w(2024年6月29日访问)。
    2020年7月至2021年1月间,焦虑和抑郁的普遍程度达到35%以上。美国卫生与公众服务部,疾病控制与预防中心,国家卫生统计中心,美国人口普查局,“Household Pulse Survey, 2020–2024: Anxiety and Depression.”
    使用2.609亿成年人口,相当于6500万(25%)到9100万(35%)例焦虑或抑郁。
    CDC表示,每年抑郁症通常影响1600万成年人,约占人口的6%,焦虑症常与抑郁症伴随。美国卫生与公众服务部,疾病控制与预防中心,“Mental Health Conditions: Depression and Anxiety”,最后审查于2023年10月13日,https://www.cdc.gov/tobacco/campaign/tips/diseases/depression-anxiety.html(2024年6月29日访问)。
    这意味着,疫情三年间导致了额外的4900万例抑郁或焦虑(使用低端数值25%进行计算)。
    估计患者愿意支付的抑郁治疗费用约占家庭收入的10%。Jürgen Unützer等人,“Willingness to Pay for Depression Treatment in Primary Care”,Psychiatric Services, Vol. 54, No. 3 (2003年3月),pp. 340–345,https://ps.psychiatryonline.org/doi/full/10.1176/ps.54.3.340(2024年6月29日访问)。
    愿意支付是合适的衡量标准,因为它捕捉到了为了让人们在没有COVID的情况下过得一样好所需的公平补偿的全部价值。结合2022年中位家庭收入74,580美元,心理健康成本约为1.096万亿美元(4900万例乘以每年7,458美元的治疗费用,再乘以三年)。
    教育:GDP衡量的是一个经济体在每个时间段内生产的商品和服务的市场价值。不在市场上定价的服务,如公共教育,按其成本计入GDP。疫情期间,许多学校转为远程学习以满足社交距离要求。教师继续工作,因此其对GDP的贡献没有变化。
    然而,远程学习的效果远不如传统的课堂学习。疫情期间,学生的标准化评估测试成绩下降,且尚未恢复到疫情前的水平。2022年全国教育进步评估的四年级和八年级数学平均分比2019年分别下降了五分和八分。Jake Bryant, Emma Dorn, Leah Pollack, and Jimmy Sarakatsannis, “COVID-19 Learning Delay and Recovery: Where Do US States Stand?” McKinsey & Company, January 11, 2023, https://www.mckinsey.com/industries/education/our-insights/covid-19-learning-delay-and-recovery-where-do-us-states-stand(2024年6月29日访问)。
    平均阅读成绩普遍下降了三分。
    这些教育损失相当于学生在他们的教育中落后了四分之一到四分之三的学年。Ben Chapman and Douglas Belkin, “Pandemic Learning Loss Could Cost Students $70,000 in Lifetime Earnings,” The Wall Street Journal, December 27, 2022, https://www.wsj.com/articles/pandemic-learning-loss-could-cost-students-70-000-in-lifetime-earnings-11672148505(2024年6月29日访问)。
    使用每年8700亿美元的公立小学和中学支出数据,这相当于损失了2180亿美元到6530亿美元的教育价值。对于我们的损失计算,我们将高端和低端数字的平均值取为4350亿美元。
    结论:COVID-19疫情对美国造成了令人震惊的损失,无论是人命还是经济方面。总估计成本为18.007万亿美元,这是这场全球健康危机对国家造成的深远影响的明确提醒。通过理解和承认这些成本,我们可以为追究那些因疏忽或明显行动加剧疫情严重性的人提供基础。
    追究中国政府的责任 委员会集中评估了中国共产党(CCP)在COVID-19疫情中的作用。第一部分是审查关于中国科学和操作环境的现有事实和证据。第二部分是审查中国当局为掩盖真相所采取的行动。
    科学和操作环境 在仔细审查现有证据后,委员会认为COVID-19疫情很可能源于中国武汉的一次研究相关事件。中国政府掩盖了大量相关记录,并阻碍了所有可信的国际调查努力,但现有证据强烈支持研究相关事故的说法。
    尽管理论上COVID-19可能是通过野生动物的自然传播(动物传人)出现的,Jonathan E. Pekar等人,“The Molecular Epidemiology of Multiple Zoonotic Origins of SARS-CoV-2”,Science, Vol. 377, No. 6609 (2022年7月26日),pp. 960–966,https://www.science.org/doi/10.1126/science.abp8337(2024年7月1日访问)。
    或在湿市场的溢出,Michael Worobey等人,“The Huanan Market Was the Epicenter of SARS-CoV-2 Emergence”,Zenodo, February 26, 2022, https://zenodo.org/records/6299116(2024年7月1日访问)。
    (溢出是指病毒起源于动物然后传染给人类),尽管经过四年的广泛测试,但没有任何证据支持这些假说。支持这些假说的人集中在早期病例的空间分析、市场出现的两个谱系的指控以及易感动物的存在。然而,这些假说面临许多重大挑战。Worobey等人在Science发表的论文,Michael Worobey等人,“The Huanan Seafood Wholesale Market in Wuhan Was the Early Epicenter of the COVID-19 Pandemic”,Science, Vol. 377, No. 6609 (2022年7月26日),pp. 951–959,https://www.science.org/doi/10.1126/science.abp8715(2024年7月1日访问)。
    声称市场起源的决定性证据后来被两位不同作者的同行评审文章统计否决。Dietrich Stoyan和Sung Nok Chiu,“Statistics Cannot Prove that the Huanan Seafood Wholesale Market Was the Early Epicenter of the COVID-19 Pandemic”,arXiv preprint, 2022年8月22日,https://europepmc.org/article/ppr/ppr537695(2024年7月1日访问);Dietrich Stoyan和Sung Nok Chiu,“Statistics Did Not Prove that the Huanan Seafood Wholesale Market Was the Early Epicenter of the COVID-19 Pandemic”,Journal of the Royal Statistical Society Series A: Statistics in Society, 2024年1月16日,https://academic.oup.com/jrsssa/advance-article-abstract/doi/10.1093/jrsssa/qnad139/7557954(2024年7月1日访问)。
    2024年最终发布的早期病例数据完全驳斥了双重溢出论,并指出病毒单次引入人类引发了大流行。Jia-Xin Lv等人,“Evolutionary Trajectory of Diverse SARS-CoV-2 Variants at the Beginning of COVID-19 Outbreak”,Virus Evolution, Vol. 10, No. 1 (2024),https://academic.oup.com/ve/article/10/1/veae020/7619252?login=false(2024年7月1日访问)。
    在市场上从未发现感染动物的证据。Jesse D. Bloom,“Association Between SARS-CoV-2 and Metagenomic Content of Samples from the Huanan Seafood Market”,Virus Evolution, Vol. 9, No. 2 (2023),https://academic.oup.com/ve/article/9/2/vead050/7249794(2024年7月1日访问);Jesse D. Bloom,“Importance of Qualifying the Number of Viral Reads in Metagenomic Sequencing of Environmental Samples from the Huanan Seafood Market”,Virus Evolution, Vol. 10, No. 1 (2024),https://academic.oup.com/ve/article/10/1/vead089/7504441(2024年7月1日访问);William J. Liu等人,“Surveillance of SARS-CoV-2 at the Huanan Seafood Market”,Nature, 2023年4月5日,https://www.nature.com/articles/s41586-023-06043-2(2024年7月1日访问);世界卫生组织,WHO-Convened Global Study of Origins of SARS-CoV-2: China Part | Joint WHO–China Study, 14 January–10 February 2021, published March 30, 2021,https://reliefweb.int/report/world/who-convened-global-study-origins-sars-cov-2-china-part-joint-who-china-study-14(2024年7月1日访问);Lv等人,“Evolutionary Trajectory of Diverse SARS-CoV-2 Variants at the Beginning of COVID-19 Outbreak.”
    在其他病毒暴发中,这类证据通常很快就在这些动物的分销渠道和最终目的地的多个地方被发现。Esam I. Azhar等人,“Evidence for Camel-to-Human Transmission of MERS Coronavirus”,The New England Journal of Medicine, Vol. 370, No. 26 (2014年6月26日),https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa1401505(2024年7月1日访问);美国卫生与公众服务部,疾病控制与预防中心,“Prevalence of IgG Antibody to SARS-Associated Coronavirus in Animal Traders—Guangdong Province, China, 2003”,发病率和死亡率每周报告,Vol. 52, No. 41 (2003年10月17日),pp. 986–987,https://archive.ph/iWceZ#selection-289.0-289.113(2024年7月1日访问);Samy Kasem等人,“Cross-Sectional Study of MERS-CoV-Specific RNA and Antibodies in Animals that Have Had Contact with MERS Patients in Saudi Arabia”,Journal of Infection and Public Health, Vol. 11, No. 3 (2018年5月–6月),pp. 331–338,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7102853/(2024年7月1日访问);Robert Roos,“Jordanian, Saudi Camels Have MERS-CoV-Like Antibodies”,University of Minnesota, Center for Infectious Disease Research and Policy, 2013年12月12日,https://www.cidrap.umn.edu/mers-cov/jordanian-saudi-camels-have-mers-cov-antibodies(2024年7月1日访问);Ming Wang等人,“SARS-CoV Infection in a Restaurant from Palm Civet”,Emerging Infectious Diseases, Vol. 11, No. 12 (2005年12月),pp. 1860–1865,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3367621/(2024年7月1日访问)。
    其他研究观察到,在市场上发现的传播证据并没有区分在人类中的超级传播事件和自然溢出。Bloom,“Association Between SARS-CoV-2 and Metagenomic Content of Samples from the Huanan Seafood Market”;Virginie Courtier-Orgogozo和Francisco A. de Ribera,“SARS-CoV-2 Infection at the Huanan Seafood Market”,Environmental Research, Vol 214, Pt. 1 (2022年11月),https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0013935122010295?via%3Dihub(2024年7月1日访问);Steven E. Massey, Adrian Jones, Daoyu Zhang, Yuri Deigin, and Steven B. Quay,“Unwarranted Exclusion of Intermediate Lineage A-B SARS-CoV-2 Genomes Is Inconsistent with the Two-Spillover Hypothesis of the Origin of COVID-19”,Microbiological Research, Vol 14, No. 1 (2023),pp. 448–453,https://www.mdpi.com/2036-7481/14/1/33(2024年7月1日访问)。
    遗传和早期病例数据似乎表明,在与市场相关的暴发之前,病毒已经在人类中传播。Jesse D. Bloom,“Recovery of Deleted Deep Sequencing Data Sheds More Light on the Early Wuhan SARS-CoV-2 Epidemic”,Molecular Biology and Evolution, Vol. 38, No.12 (2021年12月),pp. 5211–5224,https://archive.ph/TOpwk#selection-2199.0-3157.62(2024年7月1日访问);Chaolin Huang等人,“Clinical Features of Patients Infected with 2019 Novel Coronavirus in Wuhan, China”,The Lancet, Vol. 395, No. 10223 (2020年2月15日),pp. 497506,https://www.thelancet.com/journals/lancet/article/PIIS0140-6736(20)30183-5/fulltext(2024年7月1日访问);Lv等人,“Evolutionary Trajectory of Diverse SARS-CoV-2 Variants at the Beginning of COVID-19 Outbreak.”
    尽管SARS-CoV-2病毒理论上可能是由人与野生动物接触自然产生的,Pekar等人,“The Molecular Epidemiology of Multiple Zoonotic Origins of SARS-CoV-2.”
    但仍然没有证据表明直接由蝙蝠或中间物种的自然传播。
    逻辑和常识:导致COVID-19大流行的病毒,正式名称为SARS-CoV-2,首先在2019年秋季出现在中国武汉。这座有1100万人口的城市距离可能携带病毒的马蹄蝠的自然栖息地大约一千英里远,并且离与病毒溢出相关的中国南部热带地区也很远。此外,武汉位于中国较少有人食用野生动物且野生动物交易较少的地区。
    尽管武汉离相关的马蹄蝠自然栖息地和与2003年SARS暴发相关的动物分销渠道相距甚远,但病毒却在那里出现,而且没有其他独立的引入。同时,这座城市是中国病毒学研究的主要中心,拥有多个病毒学和公共卫生研究所,包括武汉病毒研究所(WIV)。武汉病毒研究所,“关于WIV”,http://english.whiov.cas.cn/About_Us2016/Brief_Introduction2016/(2024年7月1日访问)。
    WIV拥有世界上最大的SARS样冠状病毒收集,并在低标准安全条件下进行操控这些病毒的高风险研究。Aksel Fridstrøm,“中国研究人员在不安全的条件下创造了新的冠状病毒”,Minerva, 2021年5月27日,https://www.minerva.no/china-drastic-sars-cov-2/chinese-researchers-created-new-corona-viruses-under-unsafe-conditions/381476(2024年7月2日访问)。
    这些研究包括用这些新创造的病毒感染动物,包括人源化小鼠。Xing-Lou Yang等人,“Isolation and Characterization of a Novel Bat Coronavirus Closely Related to the Direct Progenitor of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus”,Journal of Virology, Vol. 90, No. 6 (2016年3月),pp. 3253–3256,https://journals.asm.org/doi/10.1128/jvi.02582-15(2024年7月2日访问);石正丽,“Reply to Science Magazine”,2020年,第7页,https://www.science.org/pb-assets/PDF/News%20PDFs/Shi%20Zhengli%20Q&A-1630433861.pdf(2024年7月2日访问)。参见Jon Cohen,“武汉冠状病毒猎人石正丽发表意见”,Science, Vol. 389, No. 6503 (2020年7月31日),pp. 487–488,https://www.science.org/doi/pdf/10.1126/science.369.6503.487(2024年7月2日访问)。
    虽然WIV自称是民用机构,Andrew Kerr,“‘蝙蝠女’否认中国军方参与武汉实验室已使中国与美国情报界发生冲突”,Daily Caller, 2021年3月23日,https://dailycaller.com/2021/03/23/shi-zhengli-denies-chinese-military-wuhan-lab/(2024年7月1日访问)。
    但美国政府在2021年初表示,WIV曾与中国军方合作发表文章和秘密项目,包括实验室动物实验和冠状病毒实验。Eva Dou,“武汉实验室的机密工作使寻找大流行起源变得复杂”,The Washington Post, 2021年6月22日,https://www.washingtonpost.com/world/asia_pacific/wuhan-lab-leak-secret-coronavirus/2021/06/22/b9c45940-cf08-11eb-a224-bd59bd22197c_story.html(2024年7月1日访问)。
    外界很难确切了解该研究所进行的实验,但我们知道,自2003年SARS暴发后,WIV成为国际冠状病毒研究的焦点。美国国务院,“事实表:武汉病毒研究所的活动”。
    石正丽,WIV新发传染病中心主任,她和她的同事们曾基因工程合成嵌合SARS样冠状病毒,这些病毒在感染人源化小鼠时,有时比从自然界收集的病毒更具毒性。Sharon Lerner, Mara Hvistendahl, and Maia Hibbett,“NIH文件提供了美国资助武汉功能获得研究的新证据”,The Intercept, 2021年9月9日,https://theintercept.com/2021/09/09/covid-origins-gain-of-function-research/(2024年7月2日访问)。
    石和WIV的其他人进行了这种工作在生物安全二级(BSL-2)水平,Bob Kadlec, Bob Foster, and 117th GOP HELP [Health, Education, Labor, and Pensions] Committee Staff, Muddy Waters: The Origins of COVID-19 Report: Executive Summary, 2023年4月17日,第9页,https://www.marshall.senate.gov/wp-content/uploads/MWG-EXECUTIVE-SUMMARY-4.17-Final-Version.pdf(2024年7月2日访问)。
    远低于石前美国合作者病毒学家Ralph Baric在生物安全三级(BSL-3)水平进行的工作。Rowan Jacobsen,“深入探讨美国与武汉相关的危险蝙蝠病毒工程”,MIT Technology Review, 2021年6月29日,https://www.technologyreview.com/2021/06/29/1027290/gain-of-function-risky-bat-virus-engineering-links-america-to-wuhan/(2024年7月2日访问)。
    BSL-2级别对于进行高风险病毒实验来说是严重不足的。国际科学家共识认为此类研究应至少在BSL-3级别进行,理想情况下在BSL-4级别进行。
    此外,SARS-CoV-2病毒包含的独特特征和属性表明其研究相关起源。或许所有这些特征中,最引人注意的是弗林切割位点。弗林切割位点在这种冠状病毒亚属(称为Sarbecovirus)中从未见过。Valentin Bruttel, Alex Washburne, and Antonius VanDongen,“内切酶指纹显示SARS-CoV-2的合成起源”,bioRxiv preprint, 发布于2022年10月20日,https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.10.18.512756v1.full.pdf(2024年7月2日访问);Yujia Alina Chan and Shing Hei Zhan,“SARS-CoV-2刺突蛋白中的弗林切割位点的出现”,Molecular Biology and Evolution, Vol. 39, No. 1 (2022年1月),https://academic.oup.com/mbe/article/39/1/msab327/6426085(2024年7月2日访问);Alina Chan,“为什么大流行可能在实验室开始的五个关键点”,The New York Times, 2024年6月3日,https://www.nytimes.com/interactive/2024/06/03/opinion/covid-lab-leak.html(2024年7月2日访问);Hyeryun Choe and Michael Farzan,“SARS-CoV-2首次适应人类的方式”,Science, Vol. 372, No. 6541 (2021年4月30日),pp. 466–467,https://observatoriocovid19.sv/doc/biblioteca/internac/Adaptation_sars_covid.pdf(2024年7月2日访问)。
    研究发现弗林切割位点是SARS-CoV-2致病的关键。Bryan A. Johnson等,“弗林切割位点是SARS-CoV-2致病的关键”,bioRxiv preprint, 2020年8月26日,https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32869021/(2024年7月2日访问);Bryan A. Johnson等,“弗林切割位点的缺失削弱了SARS-2-CoV-2的致病性”,Nature, Vol. 591, No. 7849 (2021年3月),pp. 293–299,https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33494095/(2024年7月2日访问);Siu-Ying Lau等,“在S1/S2连接处删除的减弱型SARS-CoV-2变种”,Emerging Microbes & Infections, Vol. 9, No. 1 (2020年12月),pp. 837–842,https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32301390/(2024年7月2日访问);Thomas P. Peacock等,“SARS-CoV-2刺突蛋白中的弗林切割位点是雪貂传播的必要条件”,Nature Microbiology, Vol. 6, No. 7 (2021年7月),pp. 899–909,https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33907312/(2024年7月2日访问)。
    有很强的证据表明大流行病毒是从武汉的研究中出现的,科学家们在那里提议将弗林切割位点插入新型SARS样冠状病毒中。
    武汉病毒研究所的生物安全记录不足。在疫情暴发前,WIV的安全协议存在大量问题,这是不可忽视的。
    例如,2017年和2018年,美国驻北京大使馆官员向国务院发送电报,警告WIV的安全问题。这些警告被忽视了。电报非常有预见性,特别提到了实验室在SARS样蝙蝠冠状病毒和人类感染性研究方面的敏感性。David Feith在“调查COVID-19起源,第二部分”的证词,众议院监督和问责委员会冠状病毒大流行特别小组委员会,“Investigating the Origins of COVID-19, Part 2”,2023年4月18日,https://docs.house.gov/meetings/VC/VC00/20230418/115744/HHRG-118-VC00-Wstate-FeithD-20230418.pdf(2024年7月2日访问)。
    在美国政府对武汉的另一次访问中,一位国家过敏和传染病研究所的官员了解到WIV没有操作高安全性生物安全四级(BSL-4)实验室的经验,必须“从零开始学习”。Katherine Eban,“秘密警告武汉研究在疫情前”,Vanity Fair, 2023年11月21日,https://www.vanityfair.com/news/2023/11/covid-origins-warnings-nih-department-of-energy(2024年7月1日访问)。
    中国疾控中心主任高福博士在2019年3月的《生物安全与健康》期刊上发表社论,警告自然、意外和故意生物威胁的潜在风险。他特别提到实验室风险:
    “批准的生物隔离和生物安全协议的不合规可能导致病原体意外或故意释放到环境中……[G]病原体的基因改造,可能扩展宿主范围以及增加传播性和毒性,可能带来流行病的新风险……[如]合成的蝙蝠起源SARS样冠状病毒[获得了增加感染人类细胞的能力。”George F. Gao,“For a Better World: Biosafety Strategies to Protect Global Health”,Biosafety and Health, Vol. 1, No. 1 (2019年6月),pp. 1–3,https://doi.org/10.1016/j.bsheal.2019.03.001(2024年7月2日访问)。
    2019年7月,WIV领导人警告他们面临“紧急问题”。Report,“A Complex and Grave Situation”: A Political Chronology of the SARS_CoV-2 Outbreak, 2023,第6页,https://www.rubio.senate.gov/wp-content/uploads/_cache/files/790b6d70-7150-4f0f-a8b9-01ea45d3b1d1/EAB44A6CA6190D31041C0037E9C5E589.05.01.23-origin-report-clean-v1-11.pdf(2024年7月2日访问)。报告由参议员Marco Rubio(R-FL)办公室于2023年5月16日发布。新闻稿,“Rubio Releases Groundbreaking COVID Origins Report”,2023年5月16日,https://www.rubio.senate.gov/rubio-releases-groundbreaking-covid-origins-report/(2024年7月2日访问)。
    尽管与该研究所相关的生物安全问题和松散的安全协议,危险的病毒研究仍在进行中。
    美国国务院在2021年1月的一份事实表中指出,它“有理由相信”WIV内部有几名科学家在2019年秋季生病了。美国国务院,“事实表:武汉病毒研究所的活动”。
    这些科学家据报道表现出与COVID-19或常见季节性疾病一致的症状,尽管WIV领导声称那里没有工作人员和学生感染。Ibid.
    随后美国新闻报道披露了关于三名WIV研究人员在武汉公开承认COVID-19疫情爆发之前病倒的更多信息。
    2018年DEFUSE提案与2019年SARS-CoV-2病毒的匹配
    2021年,在线研究网络DRASTIC发布了与2018年3月提交给美国政府的研究项目DEFUSE相关的关键文件细节。该项目旨在通过操纵武汉病毒研究所(WIV)中的冠状病毒,这与后来被识别为SARS-CoV-2的遗传特征惊人地相似。
    研究资料与链接
    Daoyu Zhang et al., “DRASTIC—An Analysis of Project DEFUSE,” ResearchGate, September 2021, ResearchGate链接 (访问日期:2024年7月2日) Sharon Lerner 和 Mara Hvistendahl, “New Details Emerge About Coronavirus Research at Chinese Lab,” The Intercept, September 6, 2021, The Intercept链接 (访问日期:2024年7月2日) 美国政府拒绝资助
    美国国防高级研究计划局(DARPA)的生物技术办公室项目经理James Gimlett在一份总结中表示,政府拒绝资助这一提案。
    James Gimlett, Program Manager, Biological Technologies Office, “PM Summary Sheet: Source Selection Sensitive,” U.S. Department of Defense, Defense Advanced Research Projects Agency, DARPA链接 (访问日期:2024年7月2日) 该提案本应是纽约的EcoHealth Alliance组织、武汉病毒研究所、新加坡国立大学杜克医学院和北卡罗来纳大学的联合研究项目。
    后续文件与研究发现
    2023年12月,美国知情权组织的研究人员获得的额外文件显示,DEFUSE提案的早期草稿进一步强调了其与SARS-CoV-2的关联。
    Annette Gartland, “Scientists Say EcoHealth Alliance’s DEFUSE Proposal Was a Blueprint for SARS-CoV-2,” Changing Times, January 19, 2024, Changing Times链接 (访问日期:2024年7月2日) Emily Kopp, “American Scientists Misled Pentagon on Research at the Wuhan Institute of Virology,” U.S. Right to Know, December 18, 2023, US Right to Know链接 (访问日期:2024年7月2日) 相关评论与文献
    北卡罗来纳大学研究员Ralph Baric在DEFUSE提案的早期草稿中评论道:“在中国,可能在生物安全2级(BSL-2)下培养这些病毒。如果美国研究人员知道了,可能会非常惊讶。”
    Emily Kopp, “American Scientists Misled Pentagon on Research at the Wuhan Institute of Virology.” See also enclosure, “Combined Records_Redacted pdf (1,412 pages),” attached to letter from Judy Cearley, U.S. Geological Survey, Government Information Specialist, to Emily Anne Kopp, U.S. Right to Know, “Re: U.S. Geological Survey (USGS) Freedom of Information Act (FOIA) Tracking # DOI-USGS-2023-000257—Response,” December 5, 2023, p. 171, US Right to Know链接 (访问日期:2024年7月2日) WIV科学家的论文遗漏
    令人怀疑的是,在2020年2月COVID-19爆发后,WIV科学家在《自然》上发表了一篇关于该病毒的论文,但遗漏了其最重要和新颖的特征:furin裂解位点。
    Peng Zhou et al., “A Pneumonia Outbreak Associated with a New Coronavirus of Probable Bat Origin,” Nature, Vol. 579 (2020), pp. 270–273, Nature链接 (访问日期:2024年7月2日) 相关研究与报道
    Sharon Lerner and Maia Hibbett, “Leaked Grant Proposal Details High-Risk Coronavirus Research,” The Intercept, September 23, 2021, The Intercept链接 (访问日期:2024年7月2日) 这一遗漏尤其令人不解,因为Shi在DEFUSE提案中的参与以及她之前的出版物都应该使她熟悉furin裂解位点。
    Chan, “Why the Pandemic Probably Started in a Lab, in 5 Key Points”; Yang Yang et al., “Two Mutations Were Critical for Bat-to-Human Transmission of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus,” Journal of Virology, Vol. 89, No. 17 (September 1, 2015), pp. 9119–9123, NCBI链接 (访问日期:2024年7月2日) 尽管美国政府没有批准DEFUSE提案,但研究人员经常为已经开始的工作寻求资助。WIV无需依赖美国政府的资金即可独立进行这种危险的研究。在没有经验丰富的外国参与者的情况下,中国可以在BSL-2级别自由进行研究,而几乎没有风险管理约束。
    Chan, “Why the Pandemic Probably Started in a Lab, in 5 Key Points” 这种认为武汉可以在没有美国资助的情况下进行研究的观点在Anthony Fauci博士的文章中提到。
    中共的系统性掩盖
    改变世界的七周
    自2019年12月起,至少在那时,中国官员本可以表现出诚意并履行其国际承诺,努力防止国内流行病成为全球大流行。然而,他们选择了另一条道路。关键事实如下:
    2019年12月,中国官员知道新病毒有人传人的情况。 中国当局积极压制医疗人员、记者和其他中国公民的警告,有时甚至将他们关押。 自2019年12月27日起,中国当局扣押了SARS-CoV-2的基因组序列。 中国当局向世界卫生组织(WHO)隐瞒了病毒的类型、感染人数的真实数据以及已证实的人传人情况,直到全世界无法再忽视疫情的严重性。 中国当局下令销毁可能提供证据的实验室样本。 中国当局对学术研究人员和科学家发布禁言令,禁止他们分享关于病毒的信息。 2020年1月11日,一位中国科学家违抗命令在线发布了基因组序列,才让其他国家有机会开始开发测试、药物和疫苗。 尽管有证据表明病毒可以无症状传播,中国官员仍允许国际航班从武汉和其他中国城市继续飞行,助长了全球传播。 中国官员阻止了国际调查病毒起源的努力。 越来越多的证据表明,SARS-CoV-2在2019年秋季就在武汉开始传播。医院的前线临床医生很快意识到他们治疗的不寻常肺炎可能是传染性的。一位医生,张丽博士后来写道,到12月底,“人传人的迹象已经非常明显。”
    武汉的反应与初期应对
    中国CDC的承认
    中国CDC主任高福在2021年3月21日的采访中承认:“武汉的医生报告了早期病例,但这些并未进入我们的全国疾病报告网络。”
    Dali L. Yang, 《武汉:新冠疫情在中国如何失控》, New York: Oxford University Press, 2024, p. 69 实验室安全措施的改变
    几个月前,即2019年9月,武汉病毒研究所更改了其安全协议,订购了一台昂贵的新型空气焚烧炉和通风系统,并在深夜神秘地撤下了包含22,000个蝙蝠病毒样本的在线数据库。
    Katherine Eban and Jeff Kao, “COVID-19 Origins: Investigating a ‘Complex and Grave Situation’ Inside a Wuhan Lab,” ProPublica, October 28, 2022, ProPublica链接 (访问日期:2024年7月1日)
    U.S. House of Representatives, Committee on Foreign Affairs, “The Origins Of COVID-19: An Investigation of the Wuhan Institute of Virology,” 117th Cong., 1st Sess., August 2021, p. 5, Foreign Affairs链接 (访问日期:2024年7月1日)
    WIV研究人员感染
    许多报道表明,WIV的研究人员在2019年秋季感染了病毒。2021年美国情报报告称,病毒在2019年11月之前就已经在武汉传播。其他数据显示,2019年更早时期就有病例出现。
    U.S. Department of State, “Fact Sheet: Activity at the Wuhan Institute of Virology.”
    Michael R. Gordon and Warren P. Strobel, “Lab Leak Most Likely Origin of Covid-19 Pandemic, Energy Department Now Says,” The Wall Street Journal, February 26, 2023, WSJ链接 (访问日期:2024年7月1日)
    Gilles Demaneuf, “SAGO Presentation: Limitations of the Official 2019 Wuhan Cases (Based on Primary Sources),” August 2023, p. 145, ResearchGate链接 (访问日期:2024年7月1日)
    中国政府的反应
    中国官方报告声称,2019年12月1日发现了武汉的首例患者。后来又改为12月8日。然而,《南华早报》获得的中国政府文件显示,11月已有9个病例,最早的病例出现在2019年11月17日。
    Josephine Ma, “Coronavirus: China’s First Confirmed Covid-19 Case Traced Back to November,” South China Morning Post, March 13, 2020, SCMP链接 (访问日期:2024年7月2日) 信息控制与压制
    在疫情初期,中国政府利用强大的宣传机器控制和操纵关于病毒的信息。2019年12月1日,中文社交媒体上“非典”和“呼吸急促”的使用开始增加,到12月29日达到顶峰。第二天,武汉当地当局向医疗机构发布了紧急通知,禁止发布未经授权的疫情信息。该禁令在社交媒体上迅速传播,当地当局的紧急通知迅速在社交媒体上广泛传播。医护人员甚至因戴口罩而受到批评,而当时中国否认病毒有人传人,这导致了不必要的死亡和进一步的传播。
    Zaheer Allam, “The First 50 days of COVID-19: A Detailed Chronological Timeline and Extensive Review of Literature Documenting the Pandemic,” Chapter 1 in Surveying the Covid Pandemic and its Implications: Urban Health, Data Technology and Political Economy (Cambridge, MA: Elsevier, 2020), p. 2, NCBI链接 (访问日期:2024年7月2日)
    Demaneuf, “SAGO Presentation: Limitations of the Official 2019 Wuhan Cases (Based on Primary Sources),” p. 184; Julia Hollingsworth and Yong Xiong, “The Truthtellers,” CNN, February 2021, CNN链接 (访问日期:2024年7月2日); Alice Su, “A doctor Was Arrested for Warning China About the Coronavirus. Then He Died of It,” Los Angeles Times, February 6, 2020, LA Times链接 (访问日期:2024年7月2日)
    医护人员的压制与逮捕
    最初尝试分享病毒信息的医生被警察拘留,被迫承认“散布谣言”。中国记者和活动家也因试图向国人和外界讲述武汉内部的真相而被监禁。中国公民讲述的故事与官方叙述截然不同。
    Hollingsworth and Xiong, “The Truthtellers” CCP的信息隐瞒与虚假数据
    中共隐瞒信息,发布虚假数据,并拒绝分享关于医护人员感染情况的信息,这对于理解传播模式和制定遏制策略至关重要。2019年12月24日,武汉中央医院的医生从一位肺炎患者的肺中提取了液体样本,并将其送至中国基因组公司Vision Medicals进行测试。大约在同一时间,当地医生将至少八个其他患者样本送到包括华大基因在内的多个中国基因组公司。
    Gao Yu et al., “In Depth: How Early Signs of a SARS-Like Virus Were Spotted, Spread, and Throttled,” Caixin Global, February 29, 2020, Caixin链接 (访问日期:2024年7月2日); Gao Yu et al., “How Early Signs of the Coronavirus Were Spotted, Spread and Throttled in China,” The Straits Times, updated February 28, 2020, Straits Times链接 (访问日期:2024年7月2日) 医护人员的隔离
    2019年12月25日,两家武汉医院的医护人员因疑似病毒性肺炎被隔离,提供了人传人的额外证据。12月27日,Vision Medicals通过电话向医院和中国CDC报告了几乎完整的基因组序列。基因组序列也被分享给北京中国医学科学院病原生物学研究所进行进一步分析。结果表明,这是一种蝙蝠来源的类似SARS的冠状病毒,且同源性非常高。华大基因于12月29日完成了新型冠状病毒的基因组测序。实验室测试结果都指向了一种类似SARS的病毒。
    Demaneuf, “SAGO Presentation: Limitations of the Official 2019 Wuhan Cases (Based on Primary Sources),” p. 93 中国国家卫生委员会的行动
    同一时间,中国国家卫生委员会下令商业实验室销毁或上交病毒样本,并下令研究结果仅在官方批准后才能发布。
    Josh Chin, “China Told Labs to Destroy Coronavirus Samples to Reduce Biosafety Risks,” The Wall Street Journal, May 16, 2020, WSJ链接 (访问日期:2024年7月2日); Emily Kopp, “Beijing Ordered Destruction of Early Coronavirus Samples, Secret Memo Shows,” U.S. Right To Know, June 27, 2023, US Right to Know链接 (访问日期:2024年7月2日) 武汉卫生委员会的确认
    2019年12月30日,武汉卫生委员会确认了一种不明原因的病毒,并向医院、诊所和其他医疗设施发布了严格禁止发布任何关于这种新疾病的治疗信息的命令。
    David P. Steensma and Robert A. Kyle, “Dr. Li Wenliang: Wuhan ‘Whistleblower’ and Early COVID-19 Victim,” Mayo Clinic Proceedings, Vol. 97, No. 7 (July 2022), pp. 1409–1410, NCBI链接 (访问日期:2024年7月2日) 中国政府的进一步反应
    WHO的回应
    2020年1月3日,中国官方向WHO提供了有关武汉不明原因病毒性肺炎病例的信息,并告诉WHO,他们不清楚其原因。同日,国家卫生委员会向实验室发送秘密备忘录,禁止未经授权的科学家进行病毒研究并向公众披露信息。
    World Health Organization, “Listing of WHO’s Response to COVID-19,” last updated January 29, 2021, WHO链接 (访问日期:2024年7月2日) 中国官方的行动
    2020年1月1日,国家卫生委员会命令WIV不得透露关于疫情的任何信息,如测试、实验数据和结果,甚至不能透露给合作机构和技术服务公司。基因组公司也被告知停止测序,销毁样本,并不得传达任何信息。
    Demaneuf, “SAGO Presentation: Limitations of the Official 2019 Wuhan Cases (Based on Primary Sources),” p. 13 and 103 人传人的确认
    2020年1月11日,由上海公共卫生临床中心的张永振领导的团队在美国网站Virological.org上发布了基因组序列。两天后,中国官方强制关闭了他的实验室,进行“整改”。
    Edward Holmes, “Novel 2019 Coronavirus Genome,” posted January 2020, Virological链接 (访问日期:2024年7月2日); Smriti Mallapaty, “Chinese Virologist Who Was First to Share COVID-19 Genome Sleeps on Street After Lab Shuts,” Nature, updated May 3, 2024, Nature链接 (访问日期:2024年7月2日) 中国的航空交通控制
    据《环球时报》报道,习近平于2020年1月22日下令对武汉和湖北省其他城市实施交通管制和人员流动限制。封锁于次日开始。但为时已晚。到1月23日,武汉已有700万人在1月期间因春节假期离开,病毒在30多个城市和26个国家蔓延。
    “Xi’s Instructions on Wuhan Lockdown Lay Cornerstone of China’s Victory Against COVID-19,” Global Times, June 7, 2020, Global Times链接 (访问日期:2024年7月2日) 习近平的指示阻止了武汉飞往其他中国城市的航班,但允许国际航班继续飞行。
    U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, “Control of Communicable Diseases; Foreign Quarantine,” Interim Final Rule with Request for Comments, Federal Register, Vol. 85, No. 29 (February 12, 2020), pp. 7874–7880, Federal Register链接 (访问日期:2024年7月2日) 国际航班与病毒传播
    北京的行动助长了病毒在国界之外的传播,尽管他们知道其致命性和人传人性质。在美国政府于2020年1月31日限制旅行之前,已有1300个从武汉飞往美国17个城市的直飞航班。
    Steve Eder, Henry Fountain, Michael H. Keller, Muyi Xiao, and Alexandra Stevenson, “430,000 People Have Traveled from China to U.S. Since Coronavirus Surfaced,” The New York Times, April 4, 2020, NY Times链接 (访问日期:2024年7月2日) 其他重要事实
    北京对关键信息的隐瞒和审查不仅影响了中国自身的人口或中国的旅行者,也影响了全球科学界。武汉病毒研究所包含超过22,000个样本的数据库在2019年9月被撤下。这一数据库本来是追踪SARS-CoV-2起源的最有用工具,但从未向美国研究人员公开。
    Chan, “Why the Pandemic Probably Started in a Lab, in 5 Key Points”; Charles Small, Billy Bostickson, and Gilles Demaneuf, “An Investigation into the WIV Databases that Were Taken Offline,” ResearchGate, February 2021, ResearchGate链接 (访问日期:2024年7月2日) 习近平的指示与应对
    2020年2月3日,习近平在政治局常委会上发表讲话,回顾了他从1月7日政治局常委会会议开始的疫情应对指示。他说:“各级党委和政府必须坚决服从中央的统一指挥、统一协调、统一调度,做到令行禁止。”因此,习近平早在1月7日就发布了关于疫情爆发的重要指示,尽管他在很长一段时间内仍继续对中国公众和其他世界领导人掩盖和淡化此事。
    个人防护装备(PPE)的囤积
    在疫情初期,北京指示位于中国和海外的中国公司在国际市场上采购数百万个防护口罩、医用长袍和手套并运回中国大陆。中国当局将外国公司的供应链和生产能力国有化,包括通用汽车和3M公司,以生产医用物资,同时拒绝为其产品颁发出口许可证。
    Final Report, The Origins of the Covid Global Pandemic, Including the Roles of the Chinese Communist Party and the World Health Organization, Minority Staff, Committee on Foreign Affairs, U.S. House of Representatives, 116th Cong., 2nd Sess., 2020, p. 5, Foreign Affairs链接 (访问日期:2024年7月2日) 在美国获得病毒基因组之前,中共显然已经在进行疫苗研发。北京军事医学科学院(AMMS)第五研究所所长周育森少将与武汉病毒研究所有合作,可能在疫情前曾在武汉病毒研究所工作。周育森是一个成就卓著的冠状病毒疫苗学家。2020年2月24日,他提交了首批COVID-19疫苗专利之一,这需要访问SARS-CoV-2的序列和活病毒。研究方法与专利表明,疫苗研究最晚在2019年11月开始。周在2020年5月初提交研究预印本并初步测试疫苗后神秘去世。官方没有对他的去世进行确认。
    Zhou Yusen et al., “Novel Coronavirus COVID-19 Vaccine, Preparation Method and Application Thereof,” China Patent CN111333704B, filed February 24, 2020, and issued January 12, 2021, Google Patents链接 (访问日期:2024年7月2日) 法律责任与FSIA
    FSIA的适用
    中国作为WHO国际卫生条例的签署国,在收集有关COVID-19传播的数据和通知WHO方面负有责任。根据FSIA,中国政府及其附属机构应对COVID-19疫情造成的损害承担责任。需要克服FSIA豁免的主要事实调查和法律责任领域包括:
    商业活动豁免:基于商业活动引起的行为。 人身伤害或死亡豁免:在美国境内发生的外国国家的侵权行为。 国际恐怖主义豁免:在美国境内发生的国际恐怖主义行为。 自愿放弃豁免权:外国国家可以放弃其FSIA豁免权。 可能的诉讼对象与案例如下:
    中国南方航空公司 中国东方航空公司 中国国药集团(Sinopharm) 具体的可能诉因包括:
    过失:针对中国和在美国开展业务的类似商业实体提出的普通法过失诉讼。 严格责任:对武汉病毒研究所等相关被告提出的进行异常危险活动的严格责任诉讼。 公共妨害:对中国、南方航空、东方航空等直接在美国运营的实体提出的普通法公共妨害诉讼。 反竞争行为:根据联邦或州法律对中国的反竞争行为提出的诉讼。 欺诈性失实陈述:对中国南方航空和中国东方航空提出的有关COVID-19的公共评论的普通法欺诈性失实陈述诉讼。 民事RICO违法行为:根据18 U.S.C. § 1961等对中国南方航空和中国东方航空提出的民事Racketeer and Corrupt Organization Act(RICO)违法行为诉讼。 请求的救济措施
    初步救济应包括Mareva禁令/冻结令,以防止资产转移。最终救济应包括:恢复/不当得利、任何授权的民事罚款、实际、直接和/或间接损害赔偿、诉讼费用和预判利息。尽管法院可能无法颁布某些形式的禁止性救济,但应考虑所有可行的法律救济。
    FSIA修订
    委员会认为,正确理解的FSIA(外国主权豁免法)并不会阻止对中国及其工具机构提出诉讼。然而,为了明确起见,委员会认为国会应通过立法,在全球大流行病导致超过一百万美国公民和居民过量死亡并由外国国家引起的特殊情况下,取消外国主权的豁免。
    这种方法是有先例的。《反恐怖主义赞助者正义法》(Justice Against Sponsors of Terrorism Act)于2016年通过,回应了对FSIA过度限制美国人对9/11寻求司法救济的强烈关注。值得注意的是,该法案在总统巴拉克·奥巴马的否决后仍通过了。
    有些人考虑直接针对中国过去的行为提出法案,取消其相对于COVID-19的豁免。这涉及与主权豁免的习惯国际法一致性的复杂决策。它还涉及取消FSIA豁免会对经济产生重大影响,使中国公司在美国开展业务变得更加困难。因此,委员会建议采取一种中间道路——取消对COVID-19大流行病规模的全球灾难在美国产生重大影响的情况下的FSIA豁免。建议的语言如下:
    美国地区法院对任何寻求针对外国国家因在美国发生的任何鲁莽行为或疏忽(包括故意隐瞒相关信息或延迟报告信息的行为)导致或严重加剧的全球大流行病而造成的身体或经济损害的案件拥有原始和排他性管辖权,无论该行为或疏忽发生在何处;前提是生物制剂是导致在美国造成超过一百万过量死亡的直接或间接原因。
    这种条款可以作为对现有FSIA框架的修订插入。需要考虑其他修订以提供陪审团审判、惩罚性赔偿、资产扣押和服务的便利性。一个关于资产扣押的想法是使用FSIA中的恐怖主义例外作为先例,该例外允许任何赢得国家恐怖主义赞助者赔偿判决的美国人对该国家本身及其控制的任何国有企业的商业资产执行判决。这一想法在与中国国家支持的知识产权盗窃有关的拟议FSIA修订中被提出,也同样适用于这个拟议的流行病例外。
    应考虑某种机制,通过该机制,如果国家利益需要,美国可以暂停对FSIA所作的任何例外的操作。一种可能的方法是修改《迷人的贝特西法案》(The Charming Betsy approach)。根据这种方法,FSIA的修改不适用于总检察长和国务卿亲自提交证书证明该行动违反美国利益的任何案件。可以为他们的考虑提供因素,例如该国家是否进行了全面、不受限制的调查并公开了调查结果。
    美国应对COVID-19大流行中中国责任的政策建议
    有足够的证据表明中国共产党在COVID-19大流行中的核心作用,美国需要采取领导行动促进问责、赔偿和未来的全球公共卫生。不作为只会激励中共继续其不透明、不合作甚至敌对的行为。唐纳德·特朗普总统和乔·拜登总统都承诺追究中共的责任,国会议员也做出了类似承诺,但没有任何实际行动。是时候履行这些承诺了。
    对国会的建议
    成立两党美国国家COVID-19委员会。 国会应创建一个委员会并通过预算抵销为其提供资金。曾经有努力建立类似于9/11委员会的委员会,但这些努力停滞了。我们认为,建立这样一个委员会是至关重要的。委员会将是多方面的,其职责包括审查中国的疏忽和掩盖行为以及评估美国在COVID-19到达后实施的国内政策。我们强烈鼓励其他国家也成立自己的委员会进行类似审查,以追究中国的责任。
    创建两党赔偿/补偿工作组以处理对中国的索赔。 美国公民因COVID-19经历的痛苦和痛苦应得到中国的赔偿。历史上,已经建立了几种公认的模式来评估责任并抵消由于政府的侵略或疏忽而造成的大规模损害。这些模型包括德国大屠杀赔偿会议和涵盖伊拉克1990年入侵科威特的联合国赔偿委员会。国会提出的《中共COVID-19责任法案》如果通过,本可以用来从中国获取赔偿。工作组可以与建议中的国家COVID-19委员会合并,或作为独立实体设立。
    为针对中华人民共和国的民事诉讼提供途径。 国会必须探索扩大美国联邦法院管辖权的机会,使其能够对中国个人或机构提出美国民事诉讼类似于2023年提出的《中共不法死亡责任法案》,这将通过减少对中国的利息或债务来提供赔偿,或通过减少对中国的外援资金来提供赔偿。
    BIOSECURE法案和其他建议
    通过BIOSECURE法案以开始将美国政府和商业供应链与中国国家支持的公司脱钩。 该法案将限制美国政府和美国政府承包商继续与与中共、国家和军队有联系的中国“生物技术关注实体”进行业务。 Introduced early this year with bipartisan support in the House and Senate, the bill is still pending in both chambers.
    减少美国对中国等外国生产大流行相关需求如PPE和药品的依赖,最终也将增强美国的弹性。这种增强的弹性反过来有利于美国的国家安全和公共卫生利益。
    通过立法对所有在中国的美国政府生物医学和相关研究活动进行审计。 目标是确保美国不会资助在没有充分安全和保安设备和协议的情况下进行的危险研究,也不会资助可能被中国军方和安全部门武器化的研究。这一标准将适用于所有由美国联邦拨款或接受联邦资金的教育和研究机构支持的未来和现有生物医学和相关研究活动。所有现有研究的赞助商将有一年时间来反驳其研究构成不可接受的风险的推定。
    由于中国研究人员继续在标准不合格的生物安全级别实验室进行高度致命和风险极大的研究,美国纳税人的钱不应该用于资助在一个不遵守基本研究和透明度协议的国家的研究。这些问题既是政治和系统性的,也至少是技术和科学性的,因为单一党制专制政权控制着中国的所有科学活动。
    修订《化学和生物武器控制和战争消除法》以对不维护其生物设施且拒绝提供数据的实体实施两阶段制裁。 例如武汉病毒研究所和中国科学院,这些实体未能保持基本的安全标准,也未能共享相关数据。可以对这些实体实施两阶段制裁制度。在确定发生生物或化学事件后,可以在一段时间内采取补救措施。国会可以下令调查该事件,并可以确定该事件是否由外国实体的严重或重大疏忽造成。
    与国家新兴生物技术委员会密切合作。 由国会设立并负责审查新兴生物技术和相关技术如何塑造国防部的当前和未来活动的咨询委员会将于2024年12月提供行动建议。我们预计这些建议将非常重要,并建议同时考虑我们和他们的建议。
    建议总统采取的措施
    一、要求中国将COVID-19的起源进行全面、不受限制的科学和法医调查。
    国际专家需要开展研究,并以公开透明的方式分享结果。迄今为止,中国政府禁止对疫情起源进行正式调查。2020年,美国、盟国和国际科学家多次呼吁中国提供所有可用的信息,以确定新型病毒的来源,从而评估其致命性和传播路径,并开始开发疫苗和治疗方法。2021年,七国集团(G-7)峰会的领导人呼吁进行透明、专家主导的COVID-19研究。但这一研究未能实现。相反,中国阻挠了世界卫生组织(WHO)新发病原体起源科学咨询小组(SAGO)的工作。中国持续的掩盖和积极阻止任何有意义的调查,不仅对COVID-19受害者及其家属是一种侮辱,也对国际和平与安全构成威胁。
    二、对与COVID-19掩盖行为相关的中国官员和实体实施经济制裁。
    根据李文亮全球公共卫生问责法案和2023年冠状病毒起源验证、调查和确定法案的精神,美国政府应对被认定直接参与COVID-19信息扭曲和隐瞒行为的高级中国官员,以及协助和支持这些行为的个人实施制裁。此外,国务卿和财政部长应调查对武汉病毒研究所、中国科学院、国家卫生委员会、军事医学科学院、中国医学科学院、武汉生物制品研究所及其广泛的国家、学术和商业附属机构的制裁,原因是这些机构与COVID-19掩盖行为有关,并且参与了未申报的、可能违反美国总统第13382号行政命令的中国军事生物武器研究和开发活动。
    三、承认COVID-19大流行是一场划时代的事件,类似于核时代的开启,需要在美国法律、政策、外交、政府、商业和学术事务上进行相应的重大变革。
    过去10到15年间出现的功能获得技术——通过这种技术,最致命的病毒可能与最具传染性的病毒融合——似乎对人类生命构成了物种级别的风险。功能获得技术在潜在流行病病原体上的风险在于,任何地方的一次错误——更不用说某些国家或非国家行为者的故意行为——都足以引发灾难。一旦具有足够传染性和致命性的病毒从实验室泄漏,人类可能无能为力。正如广岛和长崎投下原子弹需要建立新的国内和国际规范、标准和机构一样,COVID-19的例子足以引发公众关注和政策创新,涉及从功能获得资金到实验室安全标准、国际透明度规范、技术控制等方面。然而,几乎没有任何此类创新发生。克服这一失败是国家领导人的基本义务。
    四、将生物技术列为美国对华出境投资的限制性行业,依据2023年8月的第14105号行政命令。
    该命令应扩大到包括生物技术,国会应通过立法加强对美国政府和私营部门在中国生物技术领域投资的限制。中国最近颁布了一系列广泛的政策变化,越来越将生物研究重新定义为国家安全框架的一部分。2017年,北京表示,作为“军民融合”计划的一部分,政府将为生物研究提供特别资金——该计划旨在将民用技术和研究纳入解放军的军事用途。美国能源部官员警告国家卫生研究院(NIH)的同行,基因编辑技术及其可能被敌对外国对手(包括中国)使用的国家安全风险。因此,美国政府必须通过任何新的出境投资机制或国会通过的法律,密切审查美国在中国的生物技术投资。
    五、要求美国情报界优先收集和分析COVID-19起源的数据,与包括“五眼联盟”伙伴(英国、加拿大、澳大利亚和新西兰)在内的盟友合作。
    作为这一过程的一部分,进行内部“经验教训”评估,并邀请独立的科学和国家安全专家参与,以研究自COVID-19爆发以来情报相关的不足以及生物安全和生物监测的总体情况。生物情报(BIOINT)应成为美国情报界的核心学科,具备高度多样化的来源和方法。
    作为这一过程的附加部分,完全(且迟来的)遵守2023年COVID-19起源法。该法要求国家情报总监办公室(ODNI)“解密任何和所有有关武汉病毒研究所与2019冠状病毒病(COVID-19)起源的潜在联系的信息”,并向国会提交一份非机密报告“仅对总监认为必要以保护来源和方法的信息进行编辑”。
    六、大幅增强早期检测和准备能力。
    美国宣布了一个五年计划,以应对下一次大流行,其2024年美国全球健康安全战略旨在将美国的正式全球健康安全合作伙伴从19个国家扩大到50个,并通过改进检测、监测、实验室能力和免疫接种来增强合作伙伴识别和应对疾病的能力。该“全政府”战略承诺在地方、国家、区域和国际层面利用私营和公共部门的力量,强化健康和研究系统。这是一个良好的开端,但需要做的远不止这些。行政部门机构应提供防止未来大流行事件的全球协议,并明确说明不遵守这些协议的后果。
    总统应促进一个以生物威胁检测为中心的公私合作伙伴关系。总统还应尝试在可信赖的盟友和伙伴的帮助下使这一网络全球化。建立一个针对自然或人为病原体和疫情的有效早期预警系统必须成为国家防御和国家安全的核心功能,而不仅仅是美国及其伙伴的公共卫生活动。生物监测和生物情报(BIOINT)可以且必须具备在临床病例积累到医院之前检测到潜在流行病病原体的能力。它还必须使用情报来源和方法以及下一代基因组分析技术,开发一种可靠区分自然病原体和人工增强病原体的方法,作为威慑的关键第一步。美国必须获得一种生物威胁来源归因能力,类似于其核威胁来源归因的能力。
    七、建立新的科学研究和合作框架,与盟友和伙伴建立集体韧性。
    举办一次总统峰会,与盟友和伙伴共同审视COVID-19的影响,并启动一项全面的集体韧性战略,以应对未来的疫情和/或生物威胁。虽然中国一直是美国的主要研究伙伴,但中共的行为表明,美国是时候在科学合作中更好地优先考虑安全和国家安全,包括优先与那些分享研究诚信和安全价值观的盟友和伙伴进行合作。
    八、对中国违反世界卫生组织国际卫生条例(IHR)施加重大成本。
    中国违反了国际卫生条例的第6和第7条。第6条要求国家首先向世卫组织通报公共卫生紧急情况,并提供所有及时、准确和详细的公共卫生信息。第7条将这一要求扩展到包括国家在其领土内发现可能构成国际公共卫生紧急情况的意外或异常公共卫生事件,即使起源或来源未知。必须追究中国对192个国家故意违反其签署的具有法律约束力的协议的责任。不可想象任何全球疫情条约如果允许中国无视其国际承诺并在没有惩罚的情况下引发灾难性的全球疫情,能取得成功。
    九、考虑暂停或撤销1979年与中国签订的科技协议(STA)。
    自2023年8月以来,STA一直处于临时月度延续状态。虽然STA是一个非约束性的合作协议,但自2018年最后一次续签以来,局势已完全改变。中国不仅继续阻挠对COVID-19起源的任何可信调查,还颁布了一系列新的、具有攻击性的中国法律,严重限制了美国科学家、学者和研究人员与中国同行合作的能力。中国的军民融合政策在技术的军用和民用之间不做区分,从而使中国能够继续进行国际科学合作,同时隐瞒这种合作也有助于中国军队的现代化。
    十、核实中国是否遵守《生物武器公约》(BWC)。
    《生物武器公约》的第I和第III条确认需要防止开发、制造或获得任何“没有预防、保护或其他和平目的”的生物剂、毒素、武器或设备,并“不得转让或以任何方式协助、鼓励或诱使任何人制造或以其他方式获得生物武器”。
    虽然《生物武器公约》于1975年生效并禁止了一整个类别的武器,但它缺乏正式的核查协议和程序。1987年,公约缔约国建立了一项年度数据交换,称为信心建立措施(CBMs)。中国于1984年成为BWC缔约国,美国国务院自1993年以来对中国遵守公约提出了质疑和关注。中国自1989年以来每年提交CBMs,包括最近在2023年提交的。然而,中国的CBM报告从未披露中国曾经拥有进攻性生物武器计划,也未在公开或外交渠道中承认其过去的进攻性生物武器努力。然而据报道,中国已经武器化了蓖麻毒素、肉毒毒素和炭疽、霍乱、鼠疫和兔热病的细菌剂。中国的军事医学机构一直在进行研究,以识别、测试和表征具有双重用途(民用和军用)应用的多种有毒家族。中国的年度CBMs不包括关于这些军事实验室进行的病原体和海洋及动物毒素双重用途生物研究的信息。
    结论
    全球范围内,COVID-19大流行造成2800万人死亡,整个经济体破裂,弱势群体陷入贫困,还引发了心理健康危机。整整一代人的教育经历被打断。仅在美国,疫情就造成超过一百万人死亡,估计给国家造成18万亿美元的损失。成千上万的成年人和儿童仍在遭受长新冠病症的折磨。
    灾难的范围和规模要求我们了解这种致命病毒的起源及其传播的情况。正是基于这一目的,跨党派中国与COVID-19委员会的调查发现,证据表明病毒是武汉实验室事故的结果。报告还详细记录了中国在疫情爆发初期几周和几个月内的行动。
    事实上,中国政府没有负责任或透明地行事。他们掩盖了有关COVID-19的高度相关信息——包括疾病何时何地开始——对其公众、科学界和世界。中国政府销毁证据,积极封杀自己的科学家,因提问而逮捕记者,并阻止国际社会调查COVID-19的起源。他们参与了这些行为,尽管签署了一项国际协议,要求他们准确、及时地向世界卫生组织通报这种公共卫生紧急情况。
    在中国没有自我问责的情况下,鉴于其在国际机构中的阻挠作用,委员会认为,只有追究中国政府对其过失和恶行的责任,才能为中国政府及其他政府提供行为不同的激励和动力。美国政府必须实施我们提出的建议。委员会还希望其他政府能够从我们的工作中获得灵感,并在其各自的背景下采用这一模式。现在采取大胆行动,总比在更致命的大流行爆发时问自己为什么没有做更多要好。
     
    委员会成员简介
    SR286 Ratcliffe
    约翰·拉特克利夫,主席 约翰·拉特克利夫担任非党派中国与COVID-19委员会主席。此前,他曾担任第六任美国国家情报总监(DNI),是总统唐纳德·J·特朗普的主要情报顾问,也是美国情报界的最高官员。在任期间,拉特克利夫总监成功协调和部署了情报和军事资产,消灭了多名指定的恐怖主义领导人,因此被授予国家安全勋章,这是国家在情报和国家安全领域的最高荣誉。
    在被提名和确认为DNI之前,约翰·拉特克利夫曾担任德克萨斯州第四国会选区的美国众议员超过五年,期间是众议院情报、国土安全和司法委员会的成员。
    拉特克利夫总监还曾在乔治·W·布什政府中任职,最初被任命为德克萨斯州东区的反恐首席,后来被司法任命为美国检察官,从2007年至2008年担任该地区的最高联邦执法官员。
    从2008年到2014年,拉特克利夫总监与前美国司法部长约翰·阿什克罗夫特共同创立了Ashcroft Sutton Ratcliffe LLP律师事务所,为国家和国际安全问题提供战略法律建议。目前,拉特克利夫总监在多个董事会和咨询委员会中任职,致力于提高美国的国家安全态势。
    SR286 OBrien
    罗伯特·C·奥布莱恩 罗伯特·C·奥布莱恩是美国全球战略有限责任公司(American Global Strategies LLC)的联合创始人兼主席,曾任第27任美国国家安全顾问(2019-2021)。奥布莱恩在任期间,作为总统的主要顾问,负责美国的外交政策和国家安全事务,并对国防和工业基地问题进行了重新关注。他是长期的海上力量和355艘舰船海军的倡导者,曾在任期内访问主要造船厂、防务工厂以及世界各地的驻军基地。
    在奥布莱恩担任国家安全顾问期间,美国促成了中东的历史性《亚伯拉罕协议》,促进了塞尔维亚和科索沃之间的经济正常化,推动了北约盟国的国防支出增加,并加强了与印太地区盟国的合作。
    在担任NSA之前,奥布莱恩是总统人质事务特使,具有大使级别的个人身份,直接参与了超过25名被拘留者和人质的回归工作。奥布莱恩还曾担任美国国务院公共-私人伙伴关系正义改革项目的联合主席。
    奥布莱恩还曾在2008年至2011年担任美国文化财产咨询委员会的总统任命成员。2005年,他被乔治·W·布什总统提名并获得美国参议院一致确认,担任第60届联合国大会的美国代表。职业早期,奥布莱恩在联合国安全理事会担任高级法律官员,处理第一次海湾战争后针对伊拉克的索赔。
    奥布莱恩是洛杉矶Larson LLP律师事务所的创始合伙人,该事务所是全国知名的诉讼精品律所。他在职业生涯中担任过数十起国际诉讼的律师和仲裁员。
    奥布莱恩荣获国家安全勋章、国家情报杰出服务勋章、国防部杰出公共服务勋章、国家防卫勋章、法国荣誉军团勋章(骑士级)、中华民国(台湾)特种大绶卿云勋章以及科索沃总统优异奖章。
    2021年,国家海军博物馆授予奥布莱恩“海洋自由奖”。同年,他与前国务卿迈克·蓬佩奥因在《亚伯拉罕协议》及其他任内成就而获得理查德·尼克松基金会的“和平建筑师奖”。2020年,《亚伯拉罕协议》签署后,以色列代表在耶路撒冷约翰·F·肯尼迪纪念森林为奥布莱恩种植了一棵树。2019年,奥布莱恩获得了米瑞亚姆和谢尔顿·阿德尔森奖。加州大学伯克利法学院授予奥布莱恩“斯特凡·A·里森菲尔德纪念奖”,以表彰他在国际法领域的杰出贡献。
    2022年7月,奥布莱恩当选理查德·尼克松基金会董事会主席。他还与蓬佩奥共同主持尼克松关于保守现实主义和国家安全的研讨会。
    奥布莱恩拥有加州大学伯克利法学院的法学博士学位,以及加州大学洛杉矶分校的政治学学士学位。
    SR286 Heitkamp
    海蒂·海特坎普 玛丽·凯瑟琳·“海蒂”·海特坎普是非党派中国与COVID-19委员会的成员。她于2023年1月成为芝加哥大学政治研究所的主任。她曾是北达科他州的美国参议员(2013-2019),是北达科他州民主党-非党派联盟党成员,是北达科他州首位女性参议员。海特坎普还担任过第28任北达科他州总检察长(1992-2000)和第20任北达科他州税务专员(1986-1992)。截至2022年,她是最后一位代表北达科他州的民主党国会议员和持有州级职位的民主党人。
    离开参议院后,海特坎普成为CNBC的特约撰稿人和哈佛大学肯尼迪学院政治研究所的访问学者。2019年4月,她与同样在2018年连任失败的印第安纳州参议员乔·唐纳利共同发起了“一个国家项目”,旨在帮助民主党重新与农村选民建立联系。海特坎普拥有北达科他大学的学士学位和路易斯·克拉克法学院的法学博士学位。
    SR286 Pottinger
    马修·波廷杰 马修·波廷杰是非党派中国与COVID-19委员会的成员。他也是胡佛研究所的访问学者和防御民主基金会中国项目的主席。波廷杰曾在特朗普总统执政期间(2019-2021)担任美国副国家安全顾问。在此之前,他担任国家安全委员会亚洲事务高级主任,领导政府在印太地区的工作及其对华政策的转变。
    波廷杰是美国海军陆战队的老兵,曾在2007年至2010年期间在伊拉克和阿富汗作战。他曾是路透社和《华尔街日报》驻中国的记者(1998-2005)。
    波廷杰毕业于马萨诸塞大学阿默斯特分校。他还是2024年出版的《沸腾的护城河:捍卫台湾的紧急步骤》一书的共同作者和编辑。
    SR286 Metzl
    杰米·梅茨尔 杰米·梅茨尔是非党派中国与COVID-19委员会的成员。他是一位领先的技术和医疗保健未来学家,“同一世界”全球社会运动的创始人兼主席,大西洋理事会的高级研究员,NextMed Health的教员以及奇点大学的专家。他的公共服务经验涵盖了克林顿政府期间在美国国家安全委员会和国务院任职,曾在参议院外交关系委员会担任当时主席乔·拜登的工作人员,以及在柬埔寨的联合国工作。
    梅茨尔被任命为世界卫生组织人类基因组编辑专家咨询委员会成员。他是多部作品的作者,包括《超级融合:基因、生物技术和人工智能革命如何改变我们的生活、工作和世界》和《黑客达尔文:基因工程与人类的未来》。
    梅茨尔在多家生物技术和其他公司的咨询委员会任职。他拥有牛津大学的博士学位、哈佛大学的法学学位以及布朗大学的本科文凭。
    SR286 Yoo
    约翰·余 约翰·余是非党派中国与COVID-19委员会的成员。他是加州大学伯克利分校的伊曼纽尔·海勒法学教授和德克萨斯大学奥斯汀分校公民领导学院的访问教授。他还是美国企业研究所的非驻所高级研究员。约翰·余曾在美国司法部任职,负责911事件后的国家安全和反恐问题,并担任过美国参议院司法委员会的总法律顾问。他曾为最高法院法官克拉伦斯·托马斯和联邦上诉法官劳伦斯·西尔伯曼担任书记官。
    他是《最高法院政治不正确指南》(与罗伯特·德拉亨提合著)、《捍卫者:特朗普的总统权力斗争》和《攻击点:预防战争、国际法和全球福利》的作者。他还是多家新闻媒体的常驻撰稿人,发表了100多篇学术期刊文章。
    余教授毕业于耶鲁法学院,并以最优等成绩毕业于哈佛学院。
    SR286 Redfield
    罗伯特·雷德菲尔德 罗伯特·雷德菲尔德博士是一位著名的病毒学家,曾担任美国疾病控制与预防中心主任和有毒物质与疾病登记局局长(2018-2021)。
    目前,雷德菲尔德博士是马里兰大学医学院的兼职教授。他在慢性病毒感染和传染病,尤其是艾滋病的临床研究和临床护理方面活跃了30多年。他曾担任美国军方艾滋病研究计划中的逆转录病毒研究部创始主任,并在美国陆军医疗队服役20年后退休。退役后,他与威廉·布拉特纳博士和罗伯特·C·加洛博士共同创立了马里兰大学人类病毒学研究所,并担任马里兰大学医学院的传染病主任和医学副主任。雷德菲尔德博士在艾滋病科学研究方面做出了多项重要早期贡献,包括揭示异性恋传播的重要性,开发了沃尔特·里德艾滋病感染分期系统,并证明艾滋病在所有阶段均有活跃的病毒复制。
    除了研究工作外,雷德菲尔德博士还监督了一个广泛的临床项目,为巴尔的摩/华盛顿特区社区的5000多名艾滋病患者提供护理和治疗。雷德菲尔德博士曾于2005年至2009年担任总统艾滋病顾问委员会成员,并于2006年至2009年担任国际分委会主席。他曾是国家卫生研究院艾滋病研究办公室顾问委员会成员、国家卫生研究院福格蒂国际中心顾问委员会成员以及食品药品监督管理局抗感染剂顾问委员会成员。
    雷德菲尔德博士于1973年获得乔治城大学文理学院理学学士学位。随后他进入乔治城大学医学院,并于1977年获得医学博士学位。
    SR286 Kadlec
    罗伯特·卡德莱克 罗伯特·卡德莱克博士是非党派中国与COVID-19委员会的成员。他的职业生涯致力于生物防御和公共卫生,并曾担任参议员理查德·伯尔的疫情准备和生物安全高级政策顾问。卡德莱克博士还曾在国防部和白宫任职,从2017年至2021年在美国卫生与公共服务部担任应急准备助理部长。
    卡德莱克博士拥有美国空军学院的学士学位、均一服务大学的医学博士学位和热带医学与卫生学硕士学位、乔治城大学的国家安全研究硕士学位以及内布拉斯加大学医学中心的荣誉科学博士学位。
    SR286 Feith
    大卫·费思 大卫·费思是非党派中国与COVID-19委员会的成员。他也是新美国安全中心的兼职高级研究员。费思在美国国务院东亚局(2019-2021)工作,包括担任美国东亚和太平洋事务副助理国务卿,监督多边事务办公室和地区及安全政策办公室的工作。费思还曾在2017年至2019年担任国务卿政策规划小组成员,就与中国和印太地区国家的关系提供建议,并因此获得了卓越荣誉奖。
    费思此前曾在《华尔街日报》工作,担任香港的社论作家(2013-2017)和纽约的专栏编辑(2010-2013)。他还曾为美国空军提供咨询,并在2011年出版了《教授美国:公民教育的案例》一书。他曾在美国参议院和众议院作证,并在《华盛顿邮报》、《纽约时报》、《外交事务》、《评论》和其他出版物上发表文章。他拥有哥伦比亚大学的历史学学士学位。
     
    致谢
    传统基金会的中国与COVID-19问题非党派委员会感谢所有支持我们完成本报告的重要工作的人们。
    首先,我们必须感谢传统基金会主席Kevin Roberts博士及基金会领导层,包括执行副总裁Derrick Morgan、首席运营官Eric Korsvall、参谋长Wes Coopersmith、Kathryn和Shelby Cullom Davis国家安全与外交政策研究所副总裁Victoria Coates博士、国内政策副总裁Roger Severino、宪政政府研究所副总裁John Malcolm、政府关系副总裁Eric Teetsel以及战略传播副总裁Mary Vought,正是他们的支持使得这一切成为可能。
    我们还要感谢专家和学者们的支持,他们包括:亚洲研究中心主任Jeff Smith、监督项目主任Mike Howell、数据分析中心主任Parker Sheppard、亚洲研究中心高级研究员Erin Walsh、Edwin Meese III法律和司法研究中心副主任Charles Stimson、执行副总裁办公室的杰出研究员Steven Bradbury、监督项目首席法律顾问Kyle Brosnan、J.D. Sam Dewey和Edwin Meese III法律和司法研究中心法律研究员Jack Fitzhenry。
    特别感谢高级编辑William T. Poole、政策出版物主任Therese Pennefather、网络开发和印刷制作政策制作经理Jay Simon、数据图形服务政策制作经理John Fleming和市场总监Elizabeth Fender,以及Matthew Tragesser、Jeremy Hayes、Brian Gottstein、Crystal Boham、Ericka Morris、Andrew Harding、Kathy Gudgel、Ilan Hulkower、Elliot Nazar和Molly Black,他们在项目完成过程中提供了巨大的帮助。
    最后,我们要感谢提供宝贵建议的外部专家们,包括Alina Chan博士、Gary Osen和Gilles Demaneuf。
    John Ratcliffe 主席 中国与COVID-19问题非党派委员会 华盛顿特区 2024年7月
    法律附录
    引言
    首先,任何针对中国或其受控公司实体为COVID-19病毒造成的破坏而追究责任的行动,都必须考虑到外国主权豁免法(FSIA)所带来的障碍。FSIA反映了国会的意愿,即外国国家及其工具和代理人“应免于美国和各州法院的管辖”,除非符合某些例外情况。尽管这些障碍非常严峻,但本备忘录认为,基于中国政府及其工具采取的积极隐瞒COVID-19起源和威胁的事实,这些障碍可以克服。
    本备忘录首先分析了根据FSIA对中国及其受控实体提出潜在诉讼的可能原因及相关事实调查领域。尽管有几种设计用于通过FSIA的潜在诉讼原因,但FSIA是追究COVID-19(或任何其他类似未来全球大流行病)责任的一个巨大的障碍。许多取决于原告是否能够确保他们开发和整理了克服FSIA豁免所需的关键相关事实。如果被迫,该问题将提交美国最高法院,法院很可能会最终裁定中国及其工具享有豁免。因此,在提出现行法律下的可能诉讼原因后,本备忘录建议对FSIA进行修订或例外,以便在全球大流行的特殊背景下实现直接追究责任。在这种修订下,可以不受任何限制地提出相同的诉讼原因。
    I. FSIA下的可能诉讼原因
    A. FSIA的范围
    “外国国家”被定义为包括国家本身及其“政治分支”(即主要从事治理职能的机构)。它还包括国家的“机构或工具”,这些是由外国国家直接拥有多数股权或其他所有权利益的独立法人或实体。在公司所有权调查中,最高法院要求国家直接所有;中间所有权不足。见Dole Food. Co. v. Patrickson, 538 U.S. 468, 480 (2003)。
    在此,FSIA的广泛豁免有四个例外是相关的。
    首先,根据“商业活动例外”,外国国家在以下情况下不享有豁免权:
    基于外国国家在美国境内从事的商业活动;或基于外国国家在美国境外从事的商业活动而在美国境内执行的行为;或基于外国国家在美国境外从事的商业活动而在美国境内产生直接效果的行为。28 U.S.C. § 1605(a)(2)。
    当外国政府不是以市场监管者的身份,而是以私人市场参与者的身份行事时,活动即为“商业活动”。在某些情况下,效果是直接的,即如果它是被告活动的直接后果。唯一在此理论下存活的COVID-19索赔是根据这一理论提出的。
    第二,对于“在美国境内发生的因外国国家或其任何官员或雇员在其职务范围内的侵权行为或疏忽而导致的个人伤害、死亡或财产损失”,不享有豁免权。相关的“整个侵权行为”必须发生在美国境内。但是,这一例外也有一个例外,适用于行为基于“无论是否滥用自由裁量权的行为”或相关索赔来源于“恶意起诉、滥用程序、诽谤、诋毁、失实陈述、欺诈或干扰合同权利”的情况下。在FSIA术语中,“自由裁量行为”是一种故意的政策判断。值得注意的是,有些权威认为“明显违反人道原则的行为”不能成为有效的自由裁量权行使。
    第三,对于“在美国境内发生的国际恐怖主义行为”不享有豁免权。FSIA采用刑法对国际恐怖主义的定义。具体来说,18 U.S.C. §2331(1)规定的活动: (A) 涉及暴力行为或危害人类生命的行为,违反了美国或任何州的刑法,或者如果在美国或任何州的管辖范围内实施,将构成刑事犯罪; (B) 旨在—(i) 恐吓或胁迫平民;(ii) 通过恐吓或胁迫影响政府政策;或 (iii) 通过大规模破坏、暗杀或绑架影响政府的行为; (C) 主要发生在美国境外,或者在实施手段、企图恐吓或胁迫的人群或活动地点方面跨越国界。
    第四,外国国家(或其组成部分)可以放弃其FSIA豁免。见28 U.S.C. §1605(a)(1)。
    即使FSIA的豁免被克服,FSIA对任何诉讼原因还提出了四个额外的复杂问题。
    首先,FSIA提供了一个特定的送达程序(个人管辖权所必需的)。见28 U.S.C. §1608。中国政府擅长在这些程序下复杂化送达过程。最终,送达程序不太可能构成难以克服的障碍,但可能需要国务院的合作和法院的动议程序。
    即使没有FSIA豁免,它绝对禁止惩罚性赔偿。见id. at §1606。它几乎肯定禁止许多形式的禁令救济,包括预期的救济。
    FSIA授予联邦地方法院对任何涉及“外国国家”的诉讼的原始管辖权。见id. at §1600。任何州法院的诉讼可以基于此移送。见id. at §1441(d)。此类诉讼应在没有陪审团的情况下审理。见id. at §§1441(d), 1600(d)。
    独立于责任,FSIA对判决的执行提供了许多限制。一般规则是“美国境内的财产”免于“扣押、逮捕和执行”。见id. at §1609; 见id. at §1611(某些资产如中央银行的财产享有绝对豁免)。在此,存在一个例外,即“用于商业活动的财产”。见28 U.S.C. § 1610(a)(2)。另一个更广泛的例外适用于“从事商业活动的外国国家的机构或工具的任何美国财产”,其中“判决涉及的索赔不受第1605(a)(2)或(5)节的豁免...无论该财产是否参与了引起索赔的行为。”见28 U.S.C. § 1610(b)(2)。
    本备忘录不涉及可能在外国法院(例如伦敦高等法院)出现的发现或扣押问题。
    B. 潜在当事人
    中华人民共和国(PRC)。中国是一个亚洲主权国家。尽管其主权地位,外国主权豁免法并未使中国免于因COVID-19病毒传播而引起的索赔和指控。中国的行为和疏忽导致了COVID-19的全球传播,这些行为是侵权、商业性质的,并且不享有自由裁量权豁免,它们在美国境内直接造成了人身伤害、财产损失和死亡。基于此类行为的索赔属于28 U.S.C. § 1605(a)(2)和28 U.S.C. § 1605(a)(5)规定的主权豁免例外。
    除了中国,其他被告将根据其是否符合适用的FSIA例外而选择,主要是直接在美国从事商业活动并与可诉行为有关。
    中国南方航空公司(China Southern Airlines Company LTD)。中国南方航空公司在美国开展业务,因此受美国管辖。该公司在广州注册和总部,是一个由中国政府持有多数股份的国有企业。中国南方航空公司由国务院国有资产监督管理委员会直接监督。其向美国证券交易委员会提交的文件表明,“中国政府在公司中的利益...可能与股东的利益相冲突。”中国南方航空公司在全球范围内运营,包括洛杉矶、纽约和旧金山等美国城市。通过中国南方航空公司,中国从事拥有和运营面向全球货运和旅行者的民用航空公司这一传统商业活动。作为其在美国运营航班的条件,中国南方航空公司放弃了其主权豁免。见14 C.F.R. § 375.26。
    中国东方航空公司(China Eastern Airlines Company LTD)。中国东方航空公司在美国开展业务,因此受美国管辖。该公司在上海注册和总部,是一个由中国政府持有多数股份的国有企业。该航空公司的网站将其列为“中国三大国有骨干航空公司之一”。中国东方航空公司在国际上运营,包括芝加哥、洛杉矶、纽约和旧金山等美国目的地。通过中国东方航空公司,中国从事拥有和运营面向全球货运和旅行者的民用航空公司这一传统商业活动。作为其在美国运营航班的条件,中国东方航空公司放弃了其主权豁免。见14 C.F.R. § 375.26。
    C. 具体的可能诉讼原因
    第一诉讼原因:根据适用州法律的过失行为
    法院:此索赔可在任何具有个人管辖权和审判地的法院提起。联邦地方法院对涉及“外国国家”的任何诉讼具有原始管辖权。见28 U.S.C. § 1603(a)。外国国家可能会利用这一管辖权将任何州法院诉讼移送至联邦法院。见id. at § 1441(d)。
    当事人:
    原告: 待定。
    被告: 中国及其在美国从事商业活动的类似商业实体、中国南方航空公司和中国东方航空公司。
    基本相关事实: 武汉病毒研究所(WIV)是一个由中国科学院监督和指导的研究机构,从事的生物研究导致了过去十多年中不为自然界所知的新型SARS样病毒的产生。与COVID-19大流行相关的病毒最相似的病毒是在距离武汉约1000英里的蝙蝠中发现的。实验室已知通过感染动物样本并通过动物、蝙蝠和人类细胞对这些病毒进行了基因重组和再构建。然后这些病毒在嵌合的雪貂和人类基因改造的小鼠上进行了测试,直到它们适应了其宿主种类并变得更具传染性。到2019年,武汉病毒研究所的科学家们发布了一个包含超过22000种野生动物样本信息的数据库,但该数据库于2019年9月关闭,并且即使在大流行开始后也没有与美国研究人员分享。
    尽管中国官员在2019年12月初就知道这种新病毒可以通过人传人传播,但他们直到2020年1月20日才公开否认这一关键事实。基因组测序在12月26日至27日完成,并指出该病毒是SARS样病毒。此信息与中国医学科学院的病原生物学研究所共享。然而,中国政府隐瞒了有关疾病的重要信息——例如感染人数和病毒类型——并且只是向世界卫生组织(WHO)报告称有“不明原因的肺炎病例”。在此之前,政府对学术研究人员和科学家发布了禁言令,禁止他们分享关于病毒的信息。地方当局通知医疗机构不得披露“未经授权”的信息。
    这项命令远非理论上的。医生李文亮在命令发布的同一天通过在线聊天群组与其他科学家分享了有关疾病的信息。李医生警告称,揭露真相者正在被地方当局沉默和惩罚。李医生和其他七名揭露者后来因谣言传播被逮捕。中国政府继续以鲁莽和混淆的方式行事,即使在此之后。北京在2020年1月3日发布正式命令,要求已对病毒进行测序的实验室销毁病毒样本,并禁止在获得正式批准前发布其研究结果。
    同一天,中国官员直接向世界卫生组织报告了来自武汉的“未知原因的病毒性肺炎”病例,但再次强调他们不清楚是什么导致了这种疾病。
    在中国南方航空公司发布任何关于COVID-19的警告之前一个多月,中国官员已经了解COVID-19的传播危险。作为中国政府直接运营的商业工具,中国南方航空公司和中国东方航空公司知道或应该知道COVID-19对人类健康构成了独特的严重和传染性风险。然而,在一个多月的时间里,中国南方航空公司保持正常运营,继续在中国和美国之间运送乘客。在2020年1月,至少有39万人,包括许多搭乘中国南方航空公司和中国东方航空公司的乘客,从中国大陆前往美国。
    中国南方航空公司和中国东方航空公司知道,飞机上的近距离接触会增加COVID-19传播的风险,乘客不会意识到这些危险,而警告可能会有效地降低风险。然而,中国南方航空公司直到2020年1月31日才公开宣布保护措施,这些措施仅限于“戴口罩”,显然不够充分。中国东方航空公司在1月23日首次限制从武汉起飞的航班,这比中国政府了解到武汉病毒感染风险已经明确的时间晚了将近一个月。这些航空公司被告鲁莽或疏忽地未能在COVID-19初期传播期间采取适当的安全程序,尽管他们极有可能了解潜在的危险。更具体地说,这些航空公司疏忽地未能警告乘客COVID-19的危险。此外,尽管他们知道COVID-19及其人传人传播的高率,但这些航空公司被告在从高感染地区向美国旅行的乘客中没有采取任何限制措施。由于被告不仅隐瞒了有关病毒的信息,还实际将病毒运送到美国,被告的商业行为和疏忽是美国居民随后患病和死亡的直接原因。
    法律论点摘要: 被告根据世界卫生组织指南和其他客观标准,具有在即将到来的灾难中合理告知公众和合理保持安全程序的非自由裁量义务。中国通过未能在进行高风险病毒研究时行使应有的谨慎、疏忽地误报自2019年11月以来已知的病毒事实、允许来自已知COVID-19感染地区的个人出国旅行以及通过中国南方航空公司和中国东方航空公司将感染者运送到美国,直接导致了COVID-19在美国的传播。作为被告在美国境内和境外的商业活动的直接和近因,数百万美国人遭受了人身和财产损失。
    重要的是要详细说明被告商业行为的主导地位。注意细致地说明无论是通过航班还是其他方式,被告在美国采取了行动。还要注意详细说明这些行为如何“直接导致”所主张的损害。
    第二诉讼原因:根据州法律对异常危险活动的严格责任
    法院: 此索赔可在任何具有个人管辖权和审判地的法院提起。联邦地方法院对涉及“外国国家”的任何诉讼具有原始管辖权。见28 U.S.C. § 1603(a)。外国国家可能会利用这一管辖权将任何州法院诉讼移送至联邦法院。见id. at § 1441(d)。
    当事人:
    原告: 待定。
    被告: 中国及其他直接相关的被告,如武汉病毒研究所。
    基本相关事实: 武汉,中国,是中国病毒学研究的领先中心,拥有多个病毒学和公共卫生研究所,包括武汉病毒研究所(WIV)。武汉病毒研究所拥有全球最大的SARS样冠状病毒收藏,并在安全条件不充分的情况下进行高风险病毒研究。他们的研究包括感染包括人源化小鼠在内的动物。武汉病毒研究所成为2003年SARS爆发后国际冠状病毒研究的焦点。武汉病毒研究所新兴传染病中心的研究人员基因工程重组了SARS样冠状病毒,这些病毒在感染人源化小鼠时有时比自然界收集的病毒更具毒性。研究人员在生物安全等级2(BSL-2)进行此类工作。这对于进行高风险病毒实验来说严重不足。国际科学家一致认为此类研究至少应在BSL-3级别进行,理想情况下在BSL-4级别进行。
    此外,SARS-CoV-2病毒包含的独特特征和属性表明其具有研究相关起源。或许所有这些特征中,最引人注目的是裂解酶切割位点。这一位点在这一冠状病毒亚属(称为Sarbecovirus)中从未出现过。研究发现,裂解酶切割位点是SARS-CoV-2致病性的关键。研究表明,裂解酶切割位点对于SARS-CoV-2致病性至关重要。有充分的理由认为,大流行病毒来自武汉的研究,科学家提出将裂解酶切割位点插入新型SARS样冠状病毒中。
    在疫情爆发前武汉病毒研究所安全协议不足的长期记录不能被忽视。例如:
    美国大使馆官员在2017年和2018年向国务院发送电报,警告武汉病毒研究所的安全问题,但这些警告被忽视了。这些电报预见了实验室对SARS样蝙蝠冠状病毒和人类感染性的研究工作的敏感性。美国政府在武汉访问期间,国家过敏症和传染病研究所(NIAID)的一名官员了解到,武汉病毒研究所没有操作高安全性生物安全等级BSL-4实验室的经验,必须“从零开始学习一切”。中国疾病预防控制中心主任高福博士在2019年3月发表的社论中警告了潜在的自然、意外和故意生物威胁。他特别指出了实验室风险:
    “未遵守批准的生物隔离和生物安全协议可能导致病原体意外或故意释放到环境中。...[病原体的基因修改,可能扩大宿主范围并增加传播和毒力,可能导致新的流行病风险...例如合成的蝙蝠源SARS样冠状病毒[获得了]感染人类细胞的能力增强。”
    2019年7月,武汉病毒研究所领导人警告称他们面临“紧迫问题”。尽管存在生物安全担忧和与研究所相关的安全协议松懈,但危险的病毒研究仍在进行。
    美国国务院在2021年1月的事实表中指出,它“有理由相信”2019年秋天有几名科学家“在武汉病毒研究所内部生病”。这些科学家报告的症状与COVID-19或常见季节性疾病一致,尽管武汉病毒研究所领导声称那里的工作人员和学生没有感染。随后美国新闻文章披露了更多关于三名武汉病毒研究所研究人员的信息,他们在武汉公开承认COVID-19爆发前生病。
    法律论点摘要: 任何从事异常危险活动的人都应对由此活动导致的伤害负责,即使他采取了最大的预防措施。最近的证据表明,武汉病毒研究所和中国实验室进行的冠状病毒研究和生物安全问题明确表明,中国从事了异常危险的活动。这些活动不是一个主权国家的行为,而是一个市场参与者的行为,提供资金以推动科学实验中的危险商业风险。关键是要证明武汉病毒研究所的相关研究不是典型国家公共卫生机构的行为,而是商业生物研究。大规模感染、不受控制的传播和生命损失的经济损失是中国决定在一个有已知安全问题的实验室进行研究而创造出致命的合成病毒的直接和可预见结果。必须仔细说明支持“直接效果”的事实(28 U.S.C. § 1605(a)(2))。这可能是一个事实上的巨大障碍。
    第三诉讼原因:根据州法律的公共滋扰
    法院: 此索赔可在任何具有个人管辖权和审判地的法院提起。联邦地方法院对涉及“外国国家”的任何诉讼具有原始管辖权。见28 U.S.C. § 1603(a)。外国国家可能会利用这一管辖权将任何州法院诉讼移送至联邦法院。见id. at § 1441(d)。
    当事人:
    原告: 待定。
    被告: 中国、中国南方航空公司、中国东方航空公司以及其他在美国直接运营的实体。
    基本相关事实: 中国资助并指挥对冠状病毒的高风险病毒研究,包括SARS CoV-2,这些研究导致了COVID-19大流行,并且研究的安全协议已知不充分。当疾病开始感染人群时,中国政府没有限制其传播,而是试图隐瞒其来源和严重性。同时,中国通过中国南方航空公司和中国东方航空公司继续商业航班出国,有效地将病毒输出到包括美国在内的国家。
    法律论点摘要: 被告的行为和疏忽造成了“对公共卫生、公共安全、公共安宁、公共舒适或公共便利的重大干扰”。被告集体运营的商业航空公司在明知或鲁莽地将致命的、高度传染性的病毒运送到美国的情况下,造成了数万亿美元的经济损失、无数的感染和非致命伤害,以及超过一百万美国人的死亡。
    第四诉讼原因:根据州法律在个人防护设备囤积和销售中的反竞争行为
    法院: 此索赔可在任何具有个人管辖权和审判地的法院提起。联邦地方法院对涉及“外国国家”的任何诉讼具有原始管辖权。见28 U.S.C. § 1603(a)。外国国家可能会利用这一管辖权将任何州法院诉讼移送至联邦法院。见id. at § 1441(d)。
    当事人:
    原告: 待定。
    被告: 中国。
    基本相关事实: 中国在关于COVID-19的起源和病毒传播性上保持对世界其他国家的无知,尽管中国非常清楚病毒的传播性。武汉中央医院的艾芬医生自2020年1月1日起指示医院工作人员佩戴N95口罩以防止传播风险。从2020年1月23日至1月30日,中国启动了全球面罩供应的大量采购,进口了共5600万个呼吸器和面罩。中国同时禁止个人防护设备出口国外,并努力购买世界其他国家的大部分供应。中国售出的少量个人防护设备是有缺陷的和不合格的,因为中国将优质材料留给自己,而将有缺陷的设备以高价出售给包括美国在内的其他国家。中国还控制了为美国客户如3M生产个人防护设备的工厂。然后中国将这些工厂的生产指向国内用途。
    法律论点摘要: 中国有责任不囤积个人防护设备,不向医疗提供者提供无效的个人防护设备。中国在个人防护设备市场中的商业行为对市场中的其他参与者,包括美国的医疗提供者,造成了财务伤害,也对缺乏足够个人防护设备的人的身体造成了伤害。中国依靠反竞争行为,不仅给予了中国在应对COVID-19影响方面的不正当优势,还通过不可预见的需求从美国客户手中榨取了超额利润,而这一需求是中国自己的鲁莽行为造成的。
    第五诉讼原因:根据州法律的欺诈性失实陈述
    法院: 此索赔可在任何具有个人管辖权和审判地的法院提起。联邦地方法院对涉及“外国国家”的任何诉讼具有原始管辖权。见28 U.S.C. § 1603(a)。外国国家可能会利用这一管辖权将任何州法院诉讼移送至联邦法院。见id. at § 1441(d)。
    当事人:
    原告: 待定。
    被告: 中国南方航空公司、中国东方航空公司。
    基本相关事实: 作为中国政府的工具,中国南方航空公司和中国东方航空公司对病毒的危险性有足够的了解,但未发布公开警告,并在美国采取预防措施以阻止传染前数周保持正常业务运营。
    法律论点摘要: 公司关于COVID-19的公共评论值得在欺诈性失实陈述的侵权索赔下采取行动。“一个人为引诱他人采取行动或不行动而欺诈性地作出事实、意见、意图或法律的失实陈述,对因他人合理依赖失实陈述而造成的经济损失承担责任。”作为拥有关于COVID-19的真实程度和严重性以及在美国普遍了解病毒的严重性之前的信息的国有中国企业,因为他们的公共声明失实地陈述了病毒的严重性,特别是病毒是新的,情况不稳定,尽管中国在病毒的严重性方面有明确的了解。
    第六诉讼原因:根据18 U.S.C. § 1961及以后条款的民事RICO违规行为
    法院: 此索赔可在任何具有个人管辖权和审判地的法院提起。联邦地方法院对涉及“外国国家”的任何诉讼具有原始管辖权。见28 U.S.C. § 1603(a)。外国国家可能会利用这一管辖权将任何州法院诉讼移送至联邦法院。见id. at § 1441(d)。
    当事人:
    原告: 待定。
    被告: 中国南方航空公司、中国东方航空公司。
    基本相关事实: 从2019年秋季到2020年1月20日,中国政府对国际社会做出了一系列故意失实陈述,包括病毒的起源未知,中国研究人员尚未识别或测序病毒,病毒既不具有人传人也不具有无症状传播的特征。这些航空公司被告重复了这些虚假声明,并欺诈性地隐瞒了乘客和外国监管机构传播COVID-19的危险。
    法律论点摘要: 中国政府与航空公司被告一起从事了一系列的欺诈和反竞争行为,进一步了违反18 U.S.C. § 1961及以后条款的犯罪企业。被告的犯罪行为模式持续了数月,使被告能够垄断个人防护设备市场,并从继续进行跨国运输感染者中获利,包括运送到美国的多个地点。被告的欺诈性失实陈述和反竞争行为是原告在个人防护设备市场上经济损失的唯一直接原因(如果适用于原告),也是数百万世界各地包括美国的个人患病和死亡的近因。
    要指控RICO企业,原告必须指控所有被告都在追求共同的目的。然而,在将航空公司作为国家工具的指控与指控它们是RICO目的真正独立的犯罪行为者之间存在紧张关系。民事RICO要求指控行为的连续性。在这里,原告可能仅限于指控“已完成”的连续性。在这种情况下,相对较短的时间范围(几个月)和这可能被视为单一计划的可能性对该索赔的可行性提出了挑战。如果原告能合理地指控武汉病毒研究所的活动相当于根据18 U.S.C. § 175开发生物武器,该索赔可能会得到加强。
    D. 请求的救济
    为了初步救济,原告应寻求玛瑞娃禁令/冻结令以避免资产流失。对于最终裁决,原告应寻求 (i) 返还/返还;(ii) 任何授权的民事罚款;(iii) 实际、直接和/或间接损害赔偿;(iv) 诉讼费用;(v) 判决前利息。对于预期的禁令救济,法院是否可以下达此类救济存在疑问,尽管密苏里州在其针对中国的COVID投诉中寻求“禁令救济”和“消除滋扰”。
     
    II. 修改《外国主权豁免法》。
    尽管如前所述,本备忘录认为根据《外国主权豁免法》可以对中国及其机构提出诉讼,但潜在的政府原告(即使是美国)会认为,要提出一个能在《外国主权豁免法》下生效并符合其程序规定的诉讼,实在是太难且不确定。因此,可能有必要出台立法,以在当前全球COVID-19疫情的特殊背景下,取消外国主权的豁免权。对此类做法已有大量先例。《打击恐怖主义资助者法》(2016年法规第130号)正是为了回应《外国主权豁免法》在某些情况下对美国人寻求司法救济的过度限制而通过的。 例如,请参见Juliet Eilperin和Karoun Demirjian的文章《国会推翻奥巴马对允许9/11受害者起诉沙特阿拉伯法案的否决》,发表于《华盛顿邮报》2016年9月28日,网址:https://www.washingtonpost.com/politics/congress-thwarts-obama-on-bill-allowing-911-lawsuits-against-saudi-arabia/2016/09/28/a93e31ba-859b-11e6-ac72-a29979381495_story.html(访问时间:2024年7月7日)。
    值得注意的是,该法案是在时任总统巴拉克·奥巴马的否决下通过的。
    初步的推动力可能是提出一项直接针对中国及其过去行为的法案,取消其在COVID-19相关事宜上的豁免权。参议员Josh Hawley的《为冠状病毒受害者争取正义法案》就是这样一个例子。 参见S. 3662,《追究中国共产党感染美国人责任法案》,第116届国会,于2020年5月7日提出,网址:https://www.congress.gov/bill/116th-congress/senate-bill/3662/text(访问时间:2024年7月7日)。
    自然法和衡平法的诸多方面都支持这种做法。尽管如此,这也引发了长期支撑豁免权的重大问题:即如何在所有国家和所有情况下制定适用的国际习惯法。诚然,通常适用于外国豁免权考量的习惯性克制——即“鹅酱可能变成天鹅酱”——在这里可能没有太多的应用,因为中国被认为是无法无天的。但更广泛的问题在于正义必须显而易见。因此,尽管将中国置于“你应受你自己制定的血腥法律的审判”这一条款下具有吸引力,但最终仍被视为剥夺公权。因此,我们建议采取中间路线——废除《外国主权豁免法》,并在联邦地区法院提供原始和专属管辖权,包括陪审团审判——适用于COVID-19疫情规模的世界性灾难。可能的条款如下:
    美国地区法院应对任何涉及对外国国家追讨金钱赔偿的案件拥有原始和专属管辖权,涉及在美国发生的由于外国国家的任何鲁莽行为或疏忽(包括故意忽视及时报告信息的必要性或故意隐瞒相关信息)造成或大大加剧的任何全球性疫情,无论行为或疏忽发生在何处;前提是,导致全球性疫情的生物制剂在美国造成的死亡人数超过100万人。
    这种规定可以插入现有的《外国主权豁免法》框架中,也可以作为在这种情况下完全废除《外国主权豁免法》的一部分。如果对现有的《外国主权豁免法》框架进行了修订,则需要进行确认修订,以提供陪审团审判、惩罚性赔偿、资产扣押和简化服务。可以提供诉因,但这在大多数《外国主权豁免法》案件中并不是障碍;一旦豁免被取消,诉因就会大量涌现。应考虑是否允许美国接管任何诉讼。任何此类立法活动都应谨慎调校,以避免任何表明责任不在《外国主权豁免法》下的暗示,以确保任何提议的立法未通过时不会被用来表明《外国主权豁免法》会阻碍诉讼。
     
     
     对中国在我们时代最具毁灭性的大流行病COVID-19中的角色追责 (中文翻译).pdf
    CN_SR286_1AI自动翻译.pdf
  10. Roger
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    The invention relates to novel applications of the defined artemisinin ingredients or a composition of the artemisinin ingredients, namely, the novel applications in the skin care field of mammals. According to the novel applications, the bad state of the skin of the mammals is eliminated or alleviated so that the healthy and beauty of the skin are enhanced through the means of regulating the keratinization disorder, inhibiting hyperpigmentation, resisting cicatrization, delaying skin aging, maintaining the skin elasticity, resisting inflammation, stopping bleeding, easing pain, and resisting bacteria and skin parasites. The benefits are proved through the means of obviously preventing or alleviating the keratosis disease symptoms including acne, furfur and the like, preventing or reducing fine lines and wrinkles of the skin, and preventing or alleviating the grey yellow and dim color of the skin. The benefits are realized through the means of applying the artemisinin ingredients, the composition of the artemisinin ingredients, or the skin care compositions (including health products, household chemicals, and health care products or medicines) containing the artemisinin ingredients or the composition of the artemisinin ingredients to the mammals. The applications of the artemisinin ingredients or the composition of the artemisinin ingredients are expanded to the field of skin care, so that great contribution is made to the health undertaking of people.
    本发明涉及到所定义的青蒿素类成分或其组合物的新应用,即在哺乳动物皮肤护理领域中的新应用。其通过提供调节异常角化、抑制色素沉着、抗瘢痕形成、延缓皮肤衰老、保持皮肤弹性、抗炎、止血、镇痛、抗菌及皮肤寄生虫等益处,消除或缓解哺乳动物皮肤不良状态以增强皮肤的健康与美丽。所述益处由明显预防或缓解痤疮脱屑等角化疾病症状、预防或减少皮肤细纹皱纹、预防或缓解皮肤灰黄暗淡等来证明。所述的益处通过向哺乳动物施用青蒿素类成分或其组合物或包含青蒿素类成分或其组合物的护肤组合物如健康产品、日化产品、保健品或药品来实现。本发明将青蒿素类成分或其组合物的用途拓展于皮肤护理领域,使其为人民健康事业做出更大的贡献。   Artemisine composition or combinations thereof new opplication in the treatment of skin Technical field The present invention relates to a kind of new opplication of defined artemisine composition or combinations thereof, i.e., in skin of mammal The new opplication of skin nursing field includes:a)Prevention acted on by correcting dyskeratosis, postpone and/or treat mammal acne, The keratosiss caused by dyskeratosis such as dandruff, desquamation prurituss, dry chap, psoriasises, scleroderma, perifollicular keratosises Disease;b)By the lip of the softening of promotion cutinization or submissive mammal, skin, hair, refer to toenail, hoof etc., and promote suckling Animal lip, skin, hair, refer to the renewal of toenail, hoof etc., adjust their oiliness and gloss;c)By anti-pigmentation Promote skin lightening ruddy, prevention, delay and/or treatment mammal skin blackening, sallow dimness, mottle, acne print, Exposure to Sunlight are damaged The appearance of the pigmentation symptom such as wound, inflammation damnification;d)By the effect prevention of anti-cicatrization, postpone and/or treat suckling to move Thing scytitiss stimulate the cicatrix symptoms such as the cicatrix growth, acne print that the cicatrix that injury is caused grows, environmental stimuli injury is caused Occur;e)Skin elasticity effect is kept to strengthen skin elasticity and gloss, prevention, delay and/or treatment suckling by slow down aging Animal skin microgroove, wrinkle, sagging, atrophy, swelling, the appearance of corse sweat pore;f)Posted by antibacterium, antifungal, anti-skin Infested effect keeps the cleaning of mammal skin, and prevention, delay and/or treatment antibacterial, funguses, dermatozoon etc. are caused Mammal skin defective mode;G) by antiinflammatory, analgesia, hemostasis etc. effect elimination or alleviation scytitiss red and swollen heat pain, The defective modes such as bleeding;h)By promoting keratinization, correcting dyskeratosis, anti-pigmentation, suppress cicatrization, delaying skin old Change, keep skin elasticity, antiinflammatory, analgesia, hemostasis, antibacterium, antifungal, anti-dermatozoon etc. a series of to skin of mammal The beneficial effect of skin, eliminates or alleviates mammal skin defective mode so as to provide enhanced skin health and beauty. By by the skin care compositionss of the artemisine composition containing safe and effective amount or combinations thereof such as health-oriented products, day Change product, health product or medicine etc. to be administered on the mammal for needing this kind of effect, these methods achievable and benefit. Background technology As the high speed development people of economy and society are also improved with beautiful requirement therewith to health, especially skin is protected Reason receives more extensive concern, and the feature and safety of skincare product is put forward higher requirement.Perplex people at present The skin problem of people masses is mainly:Acne, desquamation, the dimness blackening of skin sallow, sagging, the microgroove wrinkle that relaxes, residual cicatrix Acne print, red and swollen heat pain etc..Therefore with facial cream, facial film, Cleansing Foam, bath oil, shampoo, skin ointments agent etc. as representative on market Skin nursing products, with the addition of mostly to solve the active component of various skin problems.But these compositions are people mostly Work synthesis source, advocates natural today nature is pursued, and the activity of the natural origin of the various skin problems of energy effectively solving becomes Point, with extremely public expectation the features such as little of its green, environmental protection, safe, toxic and side effects and its consumption demand also exists Constantly increase. Arteannuin is the present that Chinese Traditional Medicine gives the people of the world, safeguards people from world to preventing and treating the infectious diseases such as malaria People's health is significant.Slaughtering cry of a deer researcher within 2015 and Nobel prize's soul is obtained because of arteannuin, shows Accreditation of the whole world to artemisine composition, is that China's traditional medicine culture goes to the world, recognizes process by the people of the world In a monument.Artemisine composition has become the study hotspot of countries in the world at present, to its antitumor, parasiticide, controls Treat the effect such as systemic lupus erythematosus (sle) to conduct in-depth research.But above research all launches around drug research, For the elite that response country is deeply excavated in pools of traditional Chinese medicine, the unique advantage of Chinese medicine, propulsion Chinese medicine modern times are given full play to Change, the call for promoting Chinese medicine to go to the world, applicant is carried out widely to artemisine composition in line with rigorous realistic attitude Pharmacodynamics screening is studied, to making artemisine composition preferably be serviced by society. Applicant carries out extensive Pharmacodynamics screening with artemisine composition or combinations thereof, and has surprisingly found that arteannuin Constituents or combinations thereof have promotion keratinization on mammal skin, correct dyskeratosis, suppression pigmentation, suppression scar Trace generation, delay skin aging, holding skin elasticity, elimination red and swollen heat pain, killing skin vermiform mite etc. have notable benefit Skin care active.Therefore applicants have discovered that the artemisine composition of safe and effective amount or combinations thereof and containing safe and effective amount Artemisine composition or combinations thereof skin care compositionss dermatosis or skin defective mode can be provided preventative or Therapeutic treatment.For example, applicant has found that artemisine composition or combinations thereof have prevention, postpone and/or the treatment food in one's mouth The hyperkeratotic conditions caused by dyskeratosis such as newborn animal acne, dandruff, psoriasises, scleroderma, perifollicular keratosises;Soften or The lip of submissive mammal, skin, hair, refer to toenail, hoof etc., and promote mammal lip, skin, hair, refer to toenail, hoof etc. Renewal, adjust their oiliness and gloss;Prevention, postpone and/or treatment mammal skin blackening, sallow dimness, mottle, The appearance of the pigmentation symptom such as acne print, sun exposure damage, inflammation damnification;Prevention, delay and/or treatment mammal skin scar Trace, the appearance of the cicatrix symptom such as acne print;Prevent, postpone and/or treat mammal skin microgroove, wrinkle, sagging, atrophy, swell The appearance of swollen, corse sweat pore;Keep the cleaning of mammal skin, prevention, delay and/or treatment antibacterial, funguses, skin parasitism Mammal skin defective mode caused by worm etc.;By promoting keratinization, correcting dyskeratosis, anti-pigmentation, suppression scar Trace formation, delay skin aging, holding skin elasticity, antiinflammatory, analgesia, hemostasis, antibacterium, antifungal, anti-dermatozoon etc. A series of effects beneficial to mammal skin, eliminate or alleviate mammal skin defective mode so as to provide enhanced skin Skin health and beauty.The above innovation for finding to advance health-oriented products, daily chemical products, health product or medicine, and will be right Public physical and mental healths and daily life produce far-reaching influence. Content of the invention The first aspect of the invention is to provide a kind of new opplication of defined artemisine composition or combinations thereof, I.e. in the new opplication of skin care applications;The second aspect of the invention be to provide a kind of skin care compositionss its include safety and have The artemisine composition of effect amount or combinations thereof and Dermatology and other active additives pharmaceutically acceptable and substrate;The present invention The 3rd aspect be to provide a kind of eliminate or alleviate mammal skin defective mode with provide enhanced skin health with Beautiful method, methods described includes to apply defined artemisine composition or combinations thereof or the present invention to mammal Skin care compositionss. Artemisine composition as herein described or combinations thereof refer to arteannuin and its derivant and correlative and they Salt is included but is not limited to, arteannuin, dihydroarteannuin, artesunate, sodium artesunate, Artemether, arteether, arteannuin C13 Derivant, arteannuin C12Derivant, arteannuin C4Derivant, deoxidation bridge arteannuin structure related compound, demethylation arteannuin Structure related compound, de- ketonic oxygen arteannuin structure related compound, steroid arteannuin structure related compound, lactams green grass or young crops Artemisin structure related compound, open loop arteannuin structure related compound, 4,5- epoxy carbon for arteannuin structure related compound, Arteannuin structure simplifies thing, other arteannuin structure related compounds and their salt;Or the group containing artemisine composition Compound or extract are included but is not limited to, Chinese medicine Herba Artemisiae Annuae(ARTEMISIAE ANNUAE HERBA)And its product, plant Artemisia annua (Artemisia annuaL.)And its product, other Compositae artemisias (Artemisia Linn. Sensu stricto, excl. Sect. Seriphidium Bess.) plant and its product, Herba Artemisiae Annuae tissue culture medium, artemisinin mother liquid etc.;Or be selected from The arbitrary composition of mentioned component.The source of artemisine composition or combinations thereof can be synthesis or include naturally but do not limit In natural product extraction, chemical complete synthesis, molecular design, biosynthesiss, histiocyte culture, fungal transformation, metabolic pathway Etc. approach. Skin as herein described refers to that the skin of mammal and its accessory organ include but is not limited to, skin, sweat gland, skin Adipose gland, fingernail, toenail, hair, lip, epidermis, corium etc.. Skin care compositionss as herein described refer to the artemisine composition comprising safe and effective amount or combinations thereof and skin Learn constituted with other active additives pharmaceutically acceptable and substrate various health-oriented products, cosmetics of everyday use, medicine, health product Etc. including but is not limited to, Emulsion class cosmetics, watery class cosmetics, powder class cosmetics, cream kind cosmetics, aerosol class are made up Product, hair based article, beauty class cosmetics, soaps, facial film, curative effect class cosmetics, sun-proof class cosmetics, tablet, powder, ball Agent, ointment, membranous patch, gel, capsule, granule, effervescent, fumigant, slow releasing agent etc. and other skin nursings are used Product. Safe and effective amount as herein described refers to that the person skilled of this area is rationally judged using artemisine composition Or combinations thereof be enough to produce significant beneficial effect, and the amount be enough to avoid serious untoward reaction again, that is, provide rational Effective hazard ratio, its content is preferably from about 0.0001%~90%, even more preferably about 0.01%~35%, and most preferably about 1%~22% wherein The percentage ratio is counted with composition quality as 100%. Skin defective mode as herein described is referred to due to the skin life caused by the intrinsic factor of body or extrinsic factor The state that reason health is weakened with aesthetic appearance is included but is not limited to, and abnormal cutaneous keratinization, desquamation prurituss, skin sallow are dark Light, skin darkening, skin aging are lax, skin lines wrinkle, skin turgor are thickened, atrophoderma is sagging, corse sweat pore, skin Inflammation is red and swollen, skin greasing is coarse, dry skin chap, dermatorrhagia pain, skin are caused by inflammation or environmental stimuli injury Pigmentation, skin by inflammation or environmental stimuli injury cause cicatrix growth etc..The acne of such as mammal, dandruff, The hyperkeratotic conditions caused by dyskeratosis such as psoriasises, scleroderma, perifollicular keratosises;Mammal lip, skin, hair, Refer to dry and chap of the skin or the excess oiliness of toenail, hoof etc.;Mammal skin blackening, sallow dimness, mottle, acne print, sun exposure damage, The appearance of the pigmentation symptom such as inflammation damnification;Mammal skin cicatrix, the appearance of the cicatrix symptom such as acne print;Skin of mammal Skin microgroove, wrinkle, sagging, atrophy, the appearance of corse sweat pore;Mammal skin is drawn by antibacterial, funguses, dermatozoon etc. Defective mode for rising etc.. Enhanced skin health as herein described is referred to as skin defective mode is mitigated or eliminated with beauty and makes skin Physiological health and aesthetic appearance recover or further enhance including but not limited to, a)By correcting dyskeratosis effect prevention, postponing and/or treat mammal acne, dandruff, desquamation prurituss, dry chap Split, the hyperkeratotic conditions caused by dyskeratosis such as psoriasises, scleroderma, perifollicular keratosises; b)By the lip of the softening of promotion cutinization or submissive mammal, skin, hair, refer to toenail, hoof etc., and promote suckling Animal lip, skin, hair, refer to the renewal of toenail, hoof etc., adjust their oiliness and gloss; c)Promote skin lightening ruddy by anti-pigmentation, prevention, delay and/or treatment mammal skin blackening, The appearance of the pigmentation symptoms such as sallow dimness, mottle, acne print, sun exposure damage, inflammation damnification; d)By the effect prevention of anti-cicatrization, postpone and/or treat the cicatrix that the injury of mammal skin inflammatory stimulus is caused Cicatrix growth that growth, environmental stimuli injury are caused, the appearance of the cicatrix symptom such as acne print; e)Skin elasticity effect is kept to strengthen skin elasticity and gloss by slow down aging, prevention, delay and/or treatment suckling are moved Thing skin lines, wrinkle, sagging, atrophy, swelling, the appearance of corse sweat pore; f)By antibacterium, antifungal, anti-dermatozoon effect keep mammal skin cleaning, prevention, postpone and/or Mammal skin defective mode caused by treatment antibacterial, funguses, dermatozoon etc.; G) eliminated by the effect such as antiinflammatory, analgesia, hemostasis or alleviate the defective modes such as scytitiss red and swollen heat pain, bleeding; h)By promoting keratinization, correcting dyskeratosis, anti-pigmentation, suppression cicatrization, delay skin aging, keep skin A series of works beneficial to mammal skin such as elasticity, antiinflammatory, analgesia, hemostasis, antibacterium, antifungal, anti-dermatozoon With, eliminate or alleviate mammal skin defective mode so as to provide enhanced skin health and beauty. Administration as herein described refers to include but is not limited to by various route of administration, partial smearing, Local out dressing, mouth The mode such as taking, fumigate makes artemisine composition as herein described or combinations thereof or skin care compositionss as herein described act on skin Skin. Other active additives as herein described and substrate refer to known in the field in current skin protection cosmetics of everyday use, medicine Applied in product, health product, healthy product or possible application the wide scope in addition to artemisine composition and combinations thereof Other optional active additives and substrate are included but is not limited to, oily raw material, silty raw material, colloid raw material, solvent materials, water Soluble polymer, preservative, thickening agent, acid-base class regulator, antioxidant, wetting agent, astringent, sunscreen, antibacterial, tune Reason agent, cracking-off agent, opacifier, prurituss, frosting agent, surfactant, skin transferral agent, skin feeling agent, Skin Soothing Agent, Skin healing agent, nourishing additive agent, trace element and hormoness additive, biological active substanceies additive, synthesis class nutrition add Plus agent, bioactive peptide, natural extract, additive biology, quintessence oil, essence, spice, pigment, coloring agent, adhesive, disintegrating agent, Filler, lubricant, wetting agent, osmotic pressure regulator, stabilizer, fluidizer, correctivess, suspending agent, coating material, figuration Agent, absorbent, diluent, flocculant and deflocculant, filter aid, release blocker, microcapsule, microsphere, liposome etc. and he Combination. Dermatology as herein described refers to the compositionss and its contains component be applied to and suckling with pharmaceutically acceptable Animal skin contacts, without excessive toxicity, incompatibility, unstability, atopic reaction etc.;Or be applied in process Various route of administration are contacted with mammalian organism, anti-without excessive toxicity, incompatibility, unstability, allergia Should wait. The acceptable substrate of pharmacology as herein described refers to that described substrate will not produce impact to pharmacological experiment, can With appropriate dispersion artemisine composition or combinations thereof, and as the negative control group in experiment. By following non-limiting examples, specific embodiments of the present invention will be further described now and carry out Illustrate, example is served only for explaining the present invention, is not intended to limit the scope of the present invention.Content described herein is only this Basic explanation under spirit and range of condition, its object is to make those skilled in the art it will be appreciated that the present invention Content is simultaneously implemented according to this, it is impossible to only limit the scope of the claims of the present invention with following examples, to according to technical solution of the present invention Those of ordinary skill for, according to disclosed spirit, any equivalent transformation or modification are carried out to the present invention, Protection scope of the present invention all should be belonged to. Embodiment 1:The preparation of arteannuin protective skin cream. Following component can be made into arteannuin protective skin cream by the existing production technology of protective skin cream. Component Mass fraction % Component Mass fraction % Dihydroarteannuin 2.00 Vaseline 6.00 Lanoline 4.00 American Avocado Tree oil 4.00 Hexadecanol 2.00 Essence In right amount Hexadecanol polyoxyethylene ether 1.50 Deionized water Add to 100.00   Embodiment 2:The preparation of arteannuin shampoo. Following component can be made into arteannuin shampoo by the existing production technology of shampoo. Component Mass fraction % Component Mass fraction % Arteannuin 3.00 Stearic acid 5.00 Sodium lauryl sulphate 20.00 Sodium hydroxide 0.75 Oleum Cocois single ethanol amide 1.00 Essence In right amount Propylene glycol monostearate 2.00 Deionized water Add to 100.00   Embodiment 3:The preparation of Herba Artemisiae Annuae facial film. Following component can be made into Herba Artemisiae Annuae facial film by the existing production technology of facial film. Component Mass fraction % Component Mass fraction % Herba Artemisiae Annuae extract 10.00 Glycerol 5.00 Polyvinylpyrrolidone 2.00 Ethanol 10.00 Carboxymethyl cellulose 3.00 Essence In right amount Polyethylene Glycol 15.00 Deionized water Add to 100.00   Experimental example 1:Artemisine composition of the present invention or the antiinflammatory action of combinations thereof Artemisine composition or combinations thereof are with the acceptable substrate dispersion of pharmacology.Kunming mouse 24 is taken, is randomly divided into 2 Group, i.e. matrix control group and 2% artemisine composition or combinations thereof group, each 12 per organizing.Dimethylbenzene 0.05mL is applied to mice Auris dextra, administer locally to respectively at 15min, 30min, 45min after stimulation the substrate of each group equivalent and 2% artemisine composition or its Compositionss, the disconnected neck of 60min puts to death animal, cuts left and right auricular concha, is taken at the same position of two ears with the card punch of diameter 8mm respectively Lower auricle weighs quality, is compared with the calculating each group auricular concha swelling degree of poor quality of two auricles. 1. artemisine composition of table or the acutely inflamed impact of combinations thereof xylol induced mice auricular concha (mean ± SD) Group Number of elements Swelling Matrix control group 12 55.8±3.27 2% artemisine composition or combinations thereof group 12 22.5±2.96 P<0.01, compare with matrix control group There is antiinflammatory action by the visible artemisine composition of table 1 or combinations thereof, there were significant differences with matrix control group. Experimental example 2:Artemisine composition of the present invention or the analgesic activity of combinations thereof Artemisine composition or combinations thereof are with the acceptable substrate dispersion of pharmacology.Kunming mouse 30 is taken, is randomly divided into 2 Group, i.e. matrix control group and 2% artemisine composition or combinations thereof group, each 15 per organizing.Administer locally to the substrate of each group equivalent Cover with preservative film after 2% artemisine composition or combinations thereof administration, untie after immobilization with adhesive tape 30min, cleaned with normal saline Medicine, then dry, newly to prepare immediately 2.5% formalin, 30 μ L is wiped to the right metapedes back of the body subcutaneous injection of mice with dry absorbent cotton.Injection first After aldehyde, immediate record is licked per only mice first and licks the number of times for stinging right metapedes in the incubation period and 10min for stinging right metapedes. 2. artemisine composition of table or combinations thereof PARA FORMALDEHYDE PRILLS(91,95) cause the impact (mean ± SD) of mice pain Group Number of elements Incubation period/s Sufficient number of times is licked in 10min Matrix control group 15 7.9±1.55 25.4±5.2 2% artemisine composition or combinations thereof group 15 13.2±3.25 14.9±5.4 P<0.01, compare with matrix control group There is analgesic activity by the visible artemisine composition of table 2 or combinations thereof, there were significant differences with matrix control group. Experimental example 3:Artemisine composition of the present invention or the anastalsis of combinations thereof Artemisine composition is with the acceptable solvent dispersion of pharmacology.Kunming mouse 24 is taken, is randomly divided into 2 groups, i.e. substrate Matched group and 2% artemisine composition or combinations thereof group, each 12 per organizing.Mice is fixed in Mus cylinder, tail point portion 2cm soaks Steep in 2% artemisine composition or combinations thereof solution or solvent, administration time 30min, after the 2h of interval, repeat administration 1 time. After last dose 30min, cut with profit and cut off at tail point 1.5cm in mice, when starting meter record bleeding when blood flows out naturally Between, drop of blood was drawn every 5 seconds with the cotton balls that oneself weighs in advance, until bleeding stops (depletion of blood when cotton balls is inhaled) naturally.Count as the following formula Calculate each group animal bleeds amount:Amount of bleeding=band blood cotton balls weight one initial cotton balls weight (mg). The anastalsis (mean ± SD) that 3. artemisine composition of table or combinations thereof dock to mice Group Number of elements Bleeding time/s Amount of bleeding/mg Matrix control group 12 124.7±11.68 45.3±12.1 2% artemisine composition or combinations thereof group 12 113.1±12.77 25.3±8.7 P<0.05, compare with matrix control group There is anastalsis by the visible artemisine composition of table 3 or combinations thereof, there were significant differences with matrix control group. Experimental example 4:Artemisine composition of the present invention or the antibacterial actions of combinations thereof Antibacterial group has or not colony growth through cultivating observation after 48h, with the medicine least concentration of the aseptic elder that is born as medicine most Low Mlc (MIC). 4. artemisine composition of table or combinations thereof are to common causative antibacterial minimum inhibitory concentration Strain name MIC/g% Staphylococcus aureuses 1.1 Propionibacterium acness 0.9 Bacillus pyocyaneus 1.1 Lactobacilluss 1.0 By the visible artemisine composition of table 4 or combinations thereof to common causative antibacterial, especially cause the golden yellow of dermatosis Staphylococcuses, propionibacterium acness, bacillus pyocyaneus have certain inhibitory action. Experimental example 5:Artemisine composition of the present invention or the antifungic action of combinations thereof Funguses group does not increase through cultivating the bacterium scope for observing dibbling after 72h, and tapers into drying, is bacterial strain by Drug inhibition Least concentration (MIC). 5. artemisine composition of table or combinations thereof are to common skin funguses minimum inhibitory concentration Strain name MIC/g% Pityrosporum furfur 0.9 Candida albicans 0.9 Epidermophyton 1.1 There is certain inhibitory action by the visible artemisine composition of table 5 or combinations thereof to common dermatophytess. Experimental example 6:The anti-vermiform mite effect of artemisine composition of the present invention or combinations thereof Artemisine composition or combinations thereof are with the acceptable substrate dispersion of pharmacology.Paste overnight method using adhesive tape to obtain Human Demodex, is randomly divided into substrate group and 2% artemisine composition or combinations thereof group, per group 12.Inhaled with micropipettor The substrate of equivalent and 2% artemisine composition or each 200 μ L medicinal liquid Deca of combinations thereof are taken on wave carrier piece, with push jack by medicinal liquid Uniformly spread out, demodectic adhesive tape will be detected and be affixed on microscope slide, it is ensured that medicinal liquid is fully contacted with polypide.Then microscope slide is put In growth cabinet (30 DEG C of temperature, humidity 75%), basis of microscopic observation vermiform mite death condition after 12h.Dead criterion: Continuous Observation 1min under 400 power microscopes, demodicid mite body huge legendary turtle limb or the motionless person of sufficient pawl are tentatively judged as death, continue after 30min to see Examine still motionless person and be defined as death. 6. artemisine composition of table or combinations thereof are to demodectic killing action Group Number of elements Dead number of elements Mortality rate Matrix control group 12 0 0% 2% artemisine composition or combinations thereof group 12 10 83% There is significant killing action to vermiform mite by the visible artemisine composition of table 6 or combinations thereof. Experimental example 7:Artemisine composition of the present invention or the keratinization adjustment effect of combinations thereof Artemisine composition or combinations thereof are with the acceptable substrate dispersion of pharmacology.Take Kunming mouse 30, male and female half and half, It is randomly divided into substrate group and 2% artemisine composition or combinations thereof group.2 groups of mices distinguish the substrate of partial smearing equivalent daily Cover with preservative film after 2% artemisine composition or combinations thereof administration, untie after immobilization with adhesive tape 30min, cleaned with normal saline Medicine, then wiped with dry absorbent cotton dry, continuous 21 days, two times a day.Animal was put to death in the 22nd day, at root of the tail 2cm, taking rat-tail table Skin, fixes paraffin embedding with 10% formalin, and HE is dyeed, in the tail scale of light each mice of Microscopic observation.All scale epidermises There is continuously rows of granular cell person, be referred to as the scale for having granular layer to be formed, granular cell is flat or rhombus cell in epidermis Constituted, full of the cutin granule that thick deep basophilia, HE dyeing are transparent in avy blue in endochylema.Count rat-tail epidermis 100 Granular layer is had to form number in scale. The impact (mean ± SD) that 7. artemisine composition of table or combinations thereof are formed to mice rat-tail granular cell Group Number of elements Rat-tail per 100 scales in granular layer form number Matrix control group 15 7.3±1.1 2% artemisine composition or combinations thereof group 15 13.8±1.7 P<0.05, compare with matrix control group Played the role of to promote keratinization, corrected dyskeratosis, with matrix control group by the visible artemisine composition of table 7 or combinations thereof There were significant differences. Experimental example 8:The delay skin aging effect of artemisine composition of the present invention or combinations thereof Artemisine composition or combinations thereof are with the acceptable substrate dispersion of pharmacology.With people's normal skin fibroblast (NHDF)Secondary Culture obtains the preferable culture fluid of cell concentration for testing.The cell of culture is inoculated into Tissue Culture Dish In, cultivate 24h, whne cell growth to occupy culture dish area 80% when, suck culture medium, PBS one time, be subsequently adding 300(μL)PBS, is sealed with hyaline membrane, thinks 144mJ/cm2Exposure dose UVB irradiating cell 40s is clear with PBS immediately after irradiation Wash one time, be inoculated in the culture fluid of 2% artemisine composition or combinations thereof and blank culture fluid respectively, cultivate at 37 DEG C 72h.Wherein 1ml culture fluid is taken, for suppressing collagen protein catabolic enzyme(MMP-L1)The measure of generation, 1mL is used for cell survival The measure of power.The experiment is repeated 3 times.The collagen protein catabolic enzyme growing amount in culture fluid is determined using immune ELISA kit. 8. artemisine composition of table or inhibitory action of the combinations thereof to collagen protein catabolic enzyme Group MMP-L1 pheron quality mean concentration MMP-L1 enzyme generates suppression ratio Blank control group 0.17 - 2% artemisine composition or combinations thereof group 0.07 - MMP-L1 enzyme generates suppression ratio - 58.8% Obvious suppression Skin Cell collagen protein is had to decompose zymogenesis by the visible artemisine composition of table 8 or combinations thereof, With skin anti-aging and the function of strengthening skin elasticity. Experimental example 9:Artemisine composition of the present invention or the anti-pigmentation of combinations thereof Artemisine composition or combinations thereof are with the acceptable substrate dispersion of pharmacology.Cavia porcelluss 6 are taken, is gone per only back part of animal Hair, takes 2 from region, and UVB is irradiated and irradiated from UVB light source, and irradiation total amount is 2500mJ/cm2, irradiate 2 area equation Region start coating after one week, the substrate of partial smearing equivalent and 2% artemisine composition or combinations thereof respectively, continuous 21 My god, two times a day.With Multi-functional skin survey during respectively in UVB pre-irradiation, after irradiating 1 week, 2 weeks, 3 weeks and 4 weeks after 1 week and medication The color change in each region of examination instrument measurement guinea pig back skin, carries out objective comparison.Biopsy divide as Microscopic observation after 4 weeks Analysis.Dyeed with Schmorl method, high power lenses count per square millimeter of epidermis cell number containing melanin granule of per part of sample.With Imokawa Method is dyeed, and high power lenses count per square millimeter of stratum basale number containing dopa-positive melanocytes of per part of sample. 9. artemisine composition of table or combinations thereof irradiate the impact (mean) of the measure of guinea pig skin color value to UVB Group Pre-irradiation After irradiation Medication 1 week Medication 2 weeks Medication 3 weeks Medication 4 weeks Matrix control group 30 59 59 58 60 58 2% artemisine composition or combinations thereof group 31 58 56 51 47 41 P<0.05, medication is compared for 4 weeks with matrix control group 10. artemisine composition of table or combinations thereof have the pigmented inhibitory action of Cavia porcelluss (mean ± SD) to UVB Group The melanocyte of the DOPA positive(Individual/mm2) Cell containing melanin granule(Individual/mm2) Matrix control group 773.18±68.52 2801.13±180.72 2% artemisine composition or combinations thereof group 566.97±82.67 2136.14±192.35 P<0.05, compare with matrix control group By table 9,10 visible artemisine compositions or combinations thereof have resisting mammal pigmentation. Experimental example 10:The anti-cicatrix of skin formation effect of artemisine composition of the present invention or combinations thereof Artemisine composition or combinations thereof are with the acceptable substrate dispersion of pharmacology.12 Japan large ear rabbits are anaesthetized, In bilateral rabbit ear veutro, lateral margin upper and lower parts do the square cutout of 2 diameter about 1cm, slit space 2.0cm, removal respectively Rabbit ear skin and subcutaneous tissue and perichondrium, cartilage-preserving, gauze pressing stops blooding.Substrate group will be randomly divided into per only ear wound surface With 2% artemisine composition or combinations thereof group, the gauze piece external application 5 of substrate or 2% artemisine composition or combinations thereof is soaked with Minute simultaneously retains, rear gauze wrapping, adopts same method dressing within 3,6,9,12,15,18,21 days after surgery.Wound surface is after surgery 12 days visible wound granulation tissue growths, the whole scar healings of 28 days visible wound surface, healing starts to occur being higher by surface for latter 18 days Hypertrophic cicatrix.Put to death animal within postoperative 50 days, specimen is cut, 10% formalin is fixed, cut into slices after paraffin embedding, HE is dyeed. 3 high power fields (× 200 times) being randomly selected in HE dyeing per a section, counts the fibroblast number in the constituent parts visual field, take Meansigma methodss.Calculate scar hyperplasia index(Hypertrophic Index, HI):HE staining tissue slides use micrometer under low power lens Chi is measured, and calculates scar hyperplasia index by formula HI=A/B.The vertical height of A=cicatrix projection peak to credulous bone surface;B= The vertical height of cicatrix periphery normal skin skin edge to credulous bone surface. When 50 days, the visible substrate group wound healing district's groups of perusal are knitted apparently higher than surrounding normal skin, show as cicatrix Central authorities are in papillae, and in pale red, matter is tough, and hypertrophy block is higher by surface.2% artemisine composition or the healing of combinations thereof group Area is slightly above normal skin, and color and luster is thin.HE staining tissue slides observe visible substrate group cicatrix blood capillary proliferation substantially, become Fiber finer karyon is big, intensive hypertrophy, be located at corium holostrome, collagen arrangement disorder.2% artemisine composition or combinations thereof group scar Trace tissue is relatively thin, and surfacing, level are in order, fibroblast significantly reduces. Anti- cicatrix of skin formation effect (mean ± SD) of 11. artemisine composition of table or combinations thereof Group Scar hyperplasia index Fibroblast number Matrix control group 3.18±0.86 86.01±2.87 2% artemisine composition or combinations thereof group 1.79±0.77 39.78±2.63 P<0.05, compare with matrix control group Resisting mammal cicatrix of skin is had to form effect by the visible artemisine composition of table 11 or combinations thereof. Experimental example 11:Artemisine composition of the present invention or therapeutical effect of the combinations thereof to rabbit Acne Model Artemisine composition or combinations thereof are with the acceptable substrate dispersion of pharmacology.Male New Zealand rabbits 22 are taken, random point For substrate group and 2% artemisine composition or combinations thereof group.To preserved skin 2cm at 2 groups of new zealand rabbit ears medial surface syrinx openings × 2cm scope, smears coal tar 1 time daily, each 0.5mL, continuous 2 weeks.After 2 weeks, take skin at 2 new zealand rabbit modelings and live Inspection, pathology section examination, determine that model is formed.The left ear of 2 groups of animals distinguishes substrate and 2% arteannuin of partial smearing equivalent daily Constituents or combinations thereof, continuous 14 days, two times a day.Perusal in 15th day is simultaneously lived in animal ears corresponding site bark fetching skin Inspection, piece of tissue with 10% formalin fix, 10% nitric acid decalcification, paraffin embedding, section, HE is dyeed, tissues observed under the light microscopic Learn and change. Histology's criterion of experimental acne:(-) no acne, infundibulum only has loose keratinocyte;(+) hair follicle The a small amount of keratinocyte being sticked together of infundibulum accumulation, funnel is not expanded;In (++) hair follicle, the cutin thromboembolism of moderate, stretches Enter sebaceous gland duct, with the hypertrophy of sebaceous gland duct, funnel is expanded;In (+++) hair follicle, close cutin thromboembolism causes hair follicle Severe is expanded, the obvious hypertrophy of sebaceous gland duct epithelium, and part sebaceous gland occurs dissolving time. Perusal:Rabbit ear coating is after 2 weeks, it is seen that at Oleic acid, local organization is substantially coarse, thicken, hardening, and follicular orifice has Black keratotic plug, in blackhead shape, when opening coal tar crust, it is seen that attachment hair follicle keratotic plug thereon, its lower visible open increase Follicular orifice, follicular orifice swell in papulosquamous.After 2% artemisine composition or combinations thereof group medication 14 days, whole flap thickness Thinning, pliability increases, and local follicular orifice keratotic plug and acne are reduced, and pimple flattens minimizing, has part keratotic plug to leave a little after coming off The follicular orifice of shape depression.After substrate group medication 14 days, ear's still visible obvious hair follicle keratotic plug, follicular orifice bump pad is slightly put down. Om observation:After modeling 2 weeks, it is seen that hyperkeratosiss, the hypergranulosis of epidermis and follicular epithelium, acanthosiss, The hair follicle of adjacent expansion mutually merges, and follicular orifice and infundibulum are full of keratinization material, and extend to sebaceous gland, and follicular orifice keratotic plug is blocked up Plug, infundibulum of hair follicle portion full of keratinization material and expands in gyalectiform, and dermis telangiectasis are obvious, and perifollicolar diffuses scattered In inflammatory cell infiltration, based on small round cell, and a small amount of neutrophilic granulocyte.2% artemisine composition or combinations thereof group are used After medicine 14 days, epidermis is slightly thickened, and follicular orifice is slightly expanded, and is had loose keratinization material filling on a small quantity, is had no that infundibulum of hair follicle portion expands Big such as gyalectiform, less dermal inflammation cellular infiltration.After substrate group medication 14 days, it is seen that hyperkeratosiss, epidermis and follicular epithelium Granular layer, spinous layer still hypertrophy substantially, follicular orifice and infundibulum still see keratinization material buildup, infundibulum expands such as gyalectiform, intradermal There is more inflammatory cell infiltration. There are correction dyskeratosis, resisting mammal Cuo by result above and the visible artemisine composition of table 12 or combinations thereof The effect of skin ulcer. 12. artemisine composition of table or combinations thereof are histopathologic impact (mean) on rabbit experiment ear acne   P<0. 05, compare with matrix control group.    
    Claims (10) Hide Dependent    1. a kind of new opplication of artemisine composition or combinations thereof, i.e. new opplication in mammal skin nursing field, It is characterized in that described artemisine composition or combinations thereof refer to arteannuin and its derivant and correlative and their salt Class is included but is not limited to, arteannuin, dihydroarteannuin, artesunate, sodium artesunate, Artemether, arteether, arteannuin C13Spread out Biological, arteannuin C12Derivant, arteannuin C4Derivant, deoxidation bridge arteannuin structure related compound, demethylation arteannuin knot Structure related compound, de- ketonic oxygen arteannuin structure related compound, steroid arteannuin structure related compound, lactams Herba Artemisiae Annuae Plain structure related compound, open loop arteannuin structure related compound, 4,5- epoxy carbon are for arteannuin structure related compound, green grass or young crops Artemisin structure simplifies thing, other arteannuin structure related compounds and their salt;Or the combination containing artemisine composition Thing or extract are included but is not limited to, Chinese medicine Herba Artemisiae Annuae(ARTEMISIAE ANNUAE HERBA)And its product, plant Artemisia annua (Artemisia annuaL.)And its product, other Compositae artemisias (Artemisia Linn. Sensu stricto, excl. Sect. Seriphidium Bess.) plant and its product, Herba Artemisiae Annuae tissue culture medium, artemisinin mother liquid etc.;Or be selected from The arbitrary composition of mentioned component. 2. the skin care compositionss containing artemisine composition or combinations thereof such as health-oriented products, daily chemical products, health product or medicine Deng the new opplication in mammal skin nursing field, it is characterised in that containing the as claimed in claim 1 of safe and effective amount Artemisine composition or combinations thereof, and Dermatology and other active additives pharmaceutically acceptable and substrate.   3. artemisine composition as described in right 1~2 is arbitrary or combinations thereof or skin care compositionss are protected in mammal skin The new opplication in reason field, it is characterised in that the source of artemisine composition or combinations thereof can be synthesis or naturally including but not It is limited to, natural product extraction, chemical complete synthesis, molecular design, biosynthesiss, histiocyte culture, fungal transformation, metabolism are led to The approach such as road.   4. artemisine composition as described in claims 1 to 3 is arbitrary or combinations thereof or skin care compositionss are in skin of mammal The new opplication of skin nursing field, it is characterised in that the content of artemisine composition or combinations thereof in skin care compositionss is preferably About 0.0001%~90%, even more preferably about 0.01%~35%, most preferably about 1%~22% wherein the percentage ratio be with compositionss Quality is 100% meter.   5. artemisine composition as described in Claims 1 to 4 is arbitrary or combinations thereof or skin care compositionss are in skin of mammal The new opplication of skin nursing field, it is characterised in that other active additives that can add and substrate refer to known in the field At present skin protection cosmetics of everyday use, medicine, health product, applied in healthy product or possible application except artemisine composition and its group Other optional active additives of wide scope beyond compound and substrate are included but is not limited to, oily raw material, silty raw material, glue Matter raw material, solvent materials, water-soluble polymer, preservative, thickening agent, acid-base class regulator, antioxidant, wetting agent, convergence Agent, sunscreen, antibacterial, conditioner, cracking-off agent, opacifier, prurituss, frosting agent, surfactant, skin transferral agent, skin Skin sensory agent, Skin Soothing Agent, skin healing agent, nourishing additive agent, trace element and hormoness additive, biological active substanceies Additive, synthesis class nourishing additive agent, bioactive peptide, natural extract, additive biology, quintessence oil, essence, spice, pigment, Toner, adhesive, disintegrating agent, filler, lubricant, wetting agent, osmotic pressure regulator, stabilizer, fluidizer, correctivess, help Suspension, coating material, excipient, absorbent, diluent, flocculant and deflocculant, filter aid, release blocker, microcapsule, micro- Ball, liposome etc. and their combination.   6. artemisine composition as described in Claims 1 to 5 is arbitrary or combinations thereof or skin care compositionss are in skin of mammal The new opplication of skin nursing field, it is characterised in that described skin care compositionss are included but is not limited to, health-oriented products, cosmetics of everyday use, Medicine, health product, Emulsion class cosmetics, watery class cosmetics, powder class cosmetics, cream kind cosmetics, aerosol class cosmetics, Hair based article, beauty class cosmetics, soaps, facial film, curative effect class cosmetics, sun-proof class cosmetics, tablet, powder, pill, soft Unguentum, membranous patch, gel, capsule, granule, effervescent, fumigant, slow releasing agent etc. and other skin care implements.   7. artemisine composition as described in claim 1~6 is arbitrary or combinations thereof or skin care compositionss are in skin of mammal The new opplication of skin nursing field, it is characterised in that described application refers to skin defective mode be mitigated or eliminated and makes the life of skin Reason health is recovered with aesthetic appearance or is further enhanced including but not limited to, a)By correcting dyskeratosis effect prevention, postponing and/or treat mammal acne, dandruff, desquamation prurituss, dry chap Split, the hyperkeratotic conditions caused by dyskeratosis such as psoriasises, scleroderma, perifollicular keratosises; b)By the lip of the softening of promotion cutinization or submissive mammal, skin, hair, refer to toenail, hoof etc., and promote suckling Animal lip, skin, hair, refer to the renewal of toenail, hoof etc., adjust their oiliness and gloss; c)Promote skin lightening ruddy by anti-pigmentation, prevention, delay and/or treatment mammal skin blackening, The appearance of the pigmentation symptoms such as sallow dimness, mottle, acne print, sun exposure damage, inflammation damnification; d)By the effect prevention of anti-cicatrization, postpone and/or treat the cicatrix that the injury of mammal skin inflammatory stimulus is caused Cicatrix growth that growth, environmental stimuli injury are caused, the appearance of the cicatrix symptom such as acne print; e)Skin elasticity effect is kept to strengthen skin elasticity and gloss by slow down aging, prevention, delay and/or treatment suckling are moved Thing skin lines, wrinkle, sagging, atrophy, swelling, the appearance of corse sweat pore; f)By antibacterium, antifungal, anti-dermatozoon effect keep mammal skin cleaning, prevention, postpone and/or Mammal skin defective mode caused by treatment antibacterial, funguses, dermatozoon etc.; G) eliminated by the effect such as antiinflammatory, analgesia, hemostasis or alleviate the defective modes such as scytitiss red and swollen heat pain, bleeding; h)By promoting keratinization, correcting dyskeratosis, anti-pigmentation, suppression cicatrization, delay skin aging, keep skin A series of works beneficial to mammal skin such as elasticity, antiinflammatory, analgesia, hemostasis, antibacterium, antifungal, anti-dermatozoon With, eliminate or alleviate mammal skin defective mode so as to provide enhanced skin health and beauty. 8. a kind of elimination or alleviation mammal skin defective mode are to provide enhanced skin health and beautiful method, and which is special Levying is that methods described includes the arbitrary described artemisine composition of right 1~7 or combinations thereof or shield to be applied to mammal Skin compositionss. 9. pass through to apply artemisine composition or combinations thereof or the skin protection as described in claim 1~8 is arbitrary to mammal Compositionss, to eliminate or alleviate mammal skin defective mode so as to obtain enhanced skin health and beauty.   10. artemisine composition as described in claim 1~9 is arbitrary or combinations thereof or skin care compositionss are in skin of mammal The application of skin nursing field.   Patent Citations (4)
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    ApplicationFiling dateTitle CN201610639349.9A2016-08-08Novel applications of artemisinin ingredients or composition of artemisinin ingredients in skin care   https://patents.google.com/patent/CN106420381A/en       青蒿素类成分或其组合物在皮肤护理中的新应用 技术领域 本发明涉及到所定义的青蒿素类成分或其组合物的一种新应用,即在哺乳动物皮肤护理领域的新应用包括:a)通过纠正异常角化作用预防、延迟和/或治疗哺乳动物痤疮、头屑、脱屑瘙痒、干燥皲裂、银屑病、硬皮病、毛囊周角化病等由异常角化所引起的角化病症;b)通过促进角化作用软化或柔顺哺乳动物的唇、皮肤、毛发、指趾甲、蹄等,并促进哺乳动物唇、皮肤、毛发、指趾甲、蹄等的更新,调节它们的油性与光泽;c)通过抗色素沉着作用促进皮肤亮白红润,预防、延迟和/或治疗哺乳动物皮肤变黑、灰黄暗淡、色斑、痘印、日晒损伤、炎症损伤等色素沉着症状的出现;d)通过抗瘢痕形成作用预防、延迟和/或治疗哺乳动物皮肤炎症刺激伤害造成的瘢痕生长、外界刺激伤害造成的瘢痕生长、痘印等瘢痕症状的出现;e)通过延缓衰老保持皮肤弹性作用增强皮肤弹性与光泽,预防、延迟和/或治疗哺乳动物皮肤细纹、皱纹、松垂、萎缩、肿胀、毛孔粗大的出现;f)通过抗细菌、抗真菌、抗皮肤寄生虫作用保持哺乳动物皮肤的清洁,预防、延迟和/或治疗细菌、真菌、皮肤寄生虫等所引起的哺乳动物皮肤不良状态;g) 通过抗炎、镇痛、止血等作用消除或缓解皮肤炎症红肿热痛、出血等不良状态;h)通过促进角化、纠正角化异常、抗色素沉着、抑制瘢痕形成、延缓皮肤老化、保持皮肤弹性、抗炎、镇痛、止血、抗细菌、抗真菌、抗皮肤寄生虫等一系列对哺乳动物皮肤有益的作用,消除或缓解哺乳动物皮肤不良状态从而提供增强的皮肤健康与美丽。 通过将含有安全有效量的青蒿素类成分或其组合物的护肤组合物如健康产品、日化产品、保健品或药品等施用到需要这类效果的哺乳动物上,可实现这些方法与益处。 背景技术 随着经济与社会的高速发展人们对健康与美丽的要求也随之提高,尤其是皮肤护理受到了更加广泛的关注,对护肤用品的功能性与安全性提出了更高的要求。目前困扰人民大众的皮肤问题主要是:痤疮、脱屑、皮肤灰黄暗淡变黑、松弛下垂、细纹皱纹、残留瘢痕痘印、红肿热痛等。因此市场上以面霜、面膜、洗面乳、沐浴乳、洗发露、皮肤软膏剂等为代表的皮肤护理产品,大多添加了用以解决各种皮肤问题的活性成分。然而这些成分大多为人工合成来源,在追求自然崇尚天然的今天,能有效解决各种皮肤问题的天然来源的活性成分,以其绿色、环保、安全性高、毒副作用小等特点倍受人民大众的期盼且其消费需求也在不断的增长。 青蒿素是传统中医药送给世界人民的礼物,对防治疟疾等传染性疾病维护世界人民健康具有重要意义。2015年屠呦呦研究员因青蒿素而获得诺贝尔生理学或医学奖,表明了全世界对青蒿素类成分的认可,是我国传统医药文化走向世界,为世界人民所认识进程中的一座丰碑。目前青蒿素类成分已成为世界各国的研究热点,对其抗肿瘤、抗寄生虫、治疗系统性红斑狼疮等作用进行了深入的研究。但是以上研究都是围绕药物研究而展开的,为响应国家深入发掘中医药宝库中的精华,充分发挥中医药的独特优势,推进中医药现代化,推动中医药走向世界的号召,申请者本着严谨求实的态度对青蒿素类成分进行广泛的药效学筛选研究,以期使青蒿素类成分更好的为社会大众所服务。 申请者以青蒿素类成分或其组合物进行广泛的药效学筛选,并惊奇的发现青蒿素类成分或其组合物在哺乳动物皮肤上具有促进角化、纠正角化异常、抑制色素沉着、抑制瘢痕生成、延缓皮肤老化、保持皮肤弹性、消除红肿热痛、杀灭皮肤蠕形螨等有着显著益处的皮肤护理活性。因此申请者发现安全有效量的青蒿素类成分或其组合物及含有安全有效量的青蒿素类成分或其组合物的护肤组合物可以对皮肤疾病或皮肤不良状态提供预防性或治疗性处理。例如,申请者已经发现青蒿素类成分或其组合物具有预防、延迟和/或治疗哺乳动物痤疮、头屑、银屑病、硬皮病、毛囊周角化病等由异常角化所引起的角化病症;软化或柔顺哺乳动物的唇、皮肤、毛发、指趾甲、蹄等,并促进哺乳动物唇、皮肤、毛发、指趾甲、蹄等的更新,调节它们的油性与光泽;预防、延迟和/或治疗哺乳动物皮肤变黑、灰黄暗淡、色斑、痘印、日晒损伤、炎症损伤等色素沉着症状的出现;预防、延迟和/或治疗哺乳动物皮肤瘢痕,痘印等瘢痕症状的出现;预防、延迟和/或治疗哺乳动物皮肤细纹、皱纹、松垂、萎缩、肿胀、毛孔粗大的出现;保持哺乳动物皮肤的清洁,预防、延迟和/或治疗细菌、真菌、皮肤寄生虫等所引起的哺乳动物皮肤不良状态;通过促进角化、纠正角化异常、抗色素沉着、抑制瘢痕形成、延缓皮肤老化、保持皮肤弹性、抗炎、镇痛、止血、抗细菌、抗真菌、抗皮肤寄生虫等一系列对哺乳动物皮肤有益的作用,消除或缓解哺乳动物皮肤不良状态从而提供增强的皮肤健康与美丽。以上发现必将推进健康产品、日化产品、保健品或药品的研发创新,并将对人民大众的身心健康和日常生活产生深远的影响。 发明内容 本发明的第一个方面在于提供所定义的青蒿素类成分或其组合物的一种新应用,即在皮肤护理领域的新应用;本发明的第二个方面在于提供一种护肤组合物其包含安全有效量的青蒿素类成分或其组合物及皮肤学与药学可接受的其他活性添加剂及基质;本发明的第三个方面在于提供一种消除或缓解哺乳动物皮肤不良状态以提供增强的皮肤健康与美丽的方法,所述方法包括向哺乳动物施用所定义的青蒿素类成分或其组合物或本发明的护肤组合物。 本文所述的青蒿素类成分或其组合物是指青蒿素及其衍生物和相关物及他们的盐类包括但不限于,青蒿素、双氢青蒿素、青蒿琥酯、青蒿琥酯钠、蒿甲醚、蒿乙醚、青蒿素C13衍生物、青蒿素C12衍生物、青蒿素C4衍生物、脱氧桥青蒿素结构相关化合物、脱甲基青蒿素结构相关化合物、脱羰基氧青蒿素结构相关化合物、甾类青蒿素结构相关化合物、内酰胺青蒿素结构相关化合物、开环青蒿素结构相关化合物、4,5-环氧碳代青蒿素结构相关化合物、青蒿素结构简化物、其他青蒿素结构相关化合物及他们的盐类;或含有青蒿素类成分的组合物或提取物包括但不限于,中药青蒿(ARTEMISIAE ANNUAE HERBA)及其制品、植物黄花蒿(Artemisia annua L.)及其制品、其他菊科蒿属(Artemisia Linn. Sensu stricto, excl. Sect. Seriphidium Bess.)植物及其制品、青蒿组织培养液、青蒿素母液等;或选自上述成分的任意组合物。青蒿素类成分或其组合物的来源可以是合成或自然包括但不限于,天然产物提取、化学全合成、化学半合成、生物合成、组织细胞培养、真菌转化、代谢通路等途径。 本文所述的皮肤是指哺乳动物的皮肤及其附属器官包括但不限于,皮肤、汗腺、皮脂腺、指甲、趾甲、毛发、唇、表皮、真皮等。 本文所述的护肤组合物是指包含安全有效量的青蒿素类成分或其组合物及皮肤学与药学可接受的其他活性添加剂及基质所组成的各种健康产品、日化用品、药品、保健品等包括但不限于,乳剂类化妆品、水状类化妆品、粉类化妆品、膏霜类化妆品、气溶胶类化妆品、发用类制品、美容类化妆品、皂类、面膜、疗效类化妆品、防晒类化妆品、片剂、散剂、丸剂、软膏剂、贴膜剂、凝胶剂、胶囊剂、颗粒剂、泡腾剂、熏蒸剂、缓释剂等及其他皮肤护理用品。 本文所述的安全有效量是指本领域的相关技术人员合理判断使用青蒿素类成分或其组合物足以产生显著的有益效果,且该量又足以避免严重的不良反应,即提供合理的效险比,其含量优选为约0.0001%~90%,更优选为约0.01%~35%,最优选为约1%~22%其中所述百分比是以组合物质量为100%计。 本文所述的皮肤不良状态是指由于机体的内在因素或外在因素所引起的皮肤生理健康与美学外观减弱的状态包括但不限于,皮肤角化异常、皮肤脱屑瘙痒、皮肤灰黄暗淡、皮肤变黑、皮肤衰老松弛、皮肤细纹皱纹、皮肤肿胀增厚、皮肤萎缩下垂、毛孔粗大、皮肤炎症红肿、皮肤油腻粗糙、皮肤干燥皲裂、皮肤出血疼痛、皮肤受炎症或外界刺激伤害造成的色素沉着、皮肤受炎症或外界刺激伤害造成的瘢痕生长等。例如哺乳动物的痤疮、头屑、银屑病、硬皮病、毛囊周角化病等由异常角化所引起的角化病症;哺乳动物唇、皮肤、毛发、指趾甲、蹄等的干燥龟裂或过度油腻;哺乳动物皮肤变黑、灰黄暗淡、色斑、痘印、日晒损伤、炎症损伤等色素沉着症状的出现;哺乳动物皮肤瘢痕,痘印等瘢痕症状的出现;哺乳动物皮肤细纹、皱纹、松垂、萎缩、毛孔粗大的出现;哺乳动物皮肤由细菌、真菌、皮肤寄生虫等所引起的不良状态等。 本文所述的增强的皮肤健康与美丽是指由于减轻或消除皮肤不良状态而使皮肤的生理健康与美学外观恢复或进一步增强包括但不限于, a)通过纠正异常角化作用预防、延迟和/或治疗哺乳动物痤疮、头屑、脱屑瘙痒、干燥皲裂、银屑病、硬皮病、毛囊周角化病等由异常角化所引起的角化病症; b)通过促进角化作用软化或柔顺哺乳动物的唇、皮肤、毛发、指趾甲、蹄等,并促进哺乳动物唇、皮肤、毛发、指趾甲、蹄等的更新,调节它们的油性与光泽; c)通过抗色素沉着作用促进皮肤亮白红润,预防、延迟和/或治疗哺乳动物皮肤变黑、灰黄暗淡、色斑、痘印、日晒损伤、炎症损伤等色素沉着症状的出现; d)通过抗瘢痕形成作用预防、延迟和/或治疗哺乳动物皮肤炎症刺激伤害造成的瘢痕生长、外界刺激伤害造成的瘢痕生长、痘印等瘢痕症状的出现; e)通过延缓衰老保持皮肤弹性作用增强皮肤弹性与光泽,预防、延迟和/或治疗哺乳动物皮肤细纹、皱纹、松垂、萎缩、肿胀、毛孔粗大的出现; f)通过抗细菌、抗真菌、抗皮肤寄生虫作用保持哺乳动物皮肤的清洁,预防、延迟和/或治疗细菌、真菌、皮肤寄生虫等所引起的哺乳动物皮肤不良状态; g) 通过抗炎、镇痛、止血等作用消除或缓解皮肤炎症红肿热痛、出血等不良状态; h)通过促进角化、纠正角化异常、抗色素沉着、抑制瘢痕形成、延缓皮肤老化、保持皮肤弹性、抗炎、镇痛、止血、抗细菌、抗真菌、抗皮肤寄生虫等一系列对哺乳动物皮肤有益的作用,消除或缓解哺乳动物皮肤不良状态从而提供增强的皮肤健康与美丽。 本文所述的施用是指通过各种给药途径包括但不限于,局部涂抹、局部外敷、口服、熏蒸等方式使本文所述的青蒿素类成分或其组合物或本文所述的护肤组合物作用于皮肤。 本文所述的其他活性添加剂及基质是指本领域所公知的在目前护肤日化用品、药品、保健品、健康品中已有应用或可能应用的除青蒿素类成分及其组合物以外的宽范围的任选的其他活性添加剂及基质包括但不限于,油质原料、粉质原料、胶质原料、溶剂原料、水溶性聚合物、防腐剂、增稠剂、酸碱类调节剂、抗氧化剂、保湿剂、收敛剂、防晒剂、杀菌剂、调理剂、剥脱剂、遮光剂、止痒剂、磨砂剂、表面活性剂、皮肤助渗剂、皮肤感觉剂、皮肤舒缓剂、皮肤愈合剂、营养添加剂、微量元素和激素类添加剂、生理活性物质添加剂、合成类营养添加剂、活性肽、天然提取物、生物学添加剂、精油、香精、香料、色素、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、助悬剂、包衣材料、赋形剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂、微囊、微球、脂质体等以及他们的组合。 本文所述的皮肤学与药学可接受的是指所述组合物及其含有组分适用于与哺乳动物皮肤相接触,而没有过度的毒性、不相容性、不稳定性、变应性反应等;或适用于在经过各种给药途径与哺乳动物机体相接触,而没有过度的毒性、不相容性、不稳定性、变应性反应等。 本文所述的药理学可接受的基质是指所述的基质不会对药理学实验产生影响,可以恰当的分散青蒿素类成分或其组合物,并作为实验中的阴性对照组。 现在将借助以下非限制性实例对本发明的具体实施方案作进一步的描述并进行举例说明,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。本文所述内容仅为本发明精神和范围条件下的基本说明,其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施,不能仅以以下实施例来限定本发明的专利范围,对依据本发明技术方案的普通技术人员来说,依据本发明所揭示的精神实质对本发明进行任何等效变换或修饰,均应属于本发明的保护范围。 实施例1:青蒿素护肤霜的制备。 如下组分通过护肤霜现有生产工艺可制成青蒿素护肤霜。 组分 质量分数% 组分 质量分数% 双氢青蒿素 2.00 凡士林 6.00 羊毛脂 4.00 鳄梨油 4.00 十六醇 2.00 香精 适量 十六醇聚氧乙烯醚 1.50 去离子水 加至100.00   实施例2:青蒿素洗发露的制备。 如下组分通过洗发露现有生产工艺可制成青蒿素洗发露。 组分 质量分数% 组分 质量分数% 青蒿素 3.00 硬脂酸 5.00 十二烷基硫酸钠 20.00 氢氧化钠 0.75 椰子油单乙醇酰胺 1.00 香精 适量 丙二醇单硬脂酸酯 2.00 去离子水 加至100.00   实施例3: 青蒿面膜的制备。 如下组分通过面膜现有生产工艺可制成青蒿面膜。 组分 质量分数% 组分 质量分数% 青蒿提取物 10.00 甘油 5.00 聚乙烯吡咯烷酮 2.00 乙醇 10.00 羧甲基纤维素 3.00 香精 适量 聚乙二醇 15.00 去离子水 加至100.00   实验例1:本发明青蒿素类成分或其组合物的抗炎作用 青蒿素类成分或其组合物以药理学可接受的基质分散。取昆明种小鼠24只,随机分为2组,即基质对照组与2%青蒿素类成分或其组合物组,每组各12只。二甲苯0.05mL涂于小鼠右耳,刺激后分别于15min、30min、45min局部给予各组等量的基质与2%青蒿素类成分或其组合物,60min断颈处死动物,剪下左右耳壳,用直径8mm的打孔器分别在两耳的同一部位取下耳片称取质量,以两耳片的质量差计算各组耳壳肿胀度进行比较。 表1. 青蒿素类成分或其组合物对二甲苯所致小鼠耳壳急性炎症的影响(mean± SD) 组别 只数 肿胀度 基质对照组 12 55.8±3.27 2%青蒿素类成分或其组合物组 12 22.5±2.96 P<0.01,与基质对照组比较 由表1可见青蒿素类成分或其组合物有抗炎作用,与基质对照组有显著差异。 实验例2:本发明青蒿素类成分或其组合物的镇痛作用 青蒿素类成分或其组合物以药理学可接受的基质分散。取昆明种小鼠30只,随机分为2组,即基质对照组与2%青蒿素类成分或其组合物组,每组各15只。局部给予各组等量的基质与2%青蒿素类成分或其组合物给药后保鲜膜覆盖,胶布固定30min后解开,以生理盐水洗净药物,再用干药棉拭干,立即给小鼠右后足背皮下注射新配制的2.5%甲醛溶液30μL。注射甲醛后立即记录每只小鼠首次舔咬右后足的潜伏期及10min内舔咬右后足的次数。 表2. 青蒿素类成分或其组合物对甲醛致小鼠疼痛的影响(mean±SD) 组别 只数 潜伏期/s 10min内舔足次数 基质对照组 15 7.9±1.55 25.4±5.2 2%青蒿素类成分或其组合物组 15 13.2±3.25 14.9±5.4 P<0.01,与基质对照组比较 由表2可见青蒿素类成分或其组合物有镇痛作用,与基质对照组有显著差异。 实验例3:本发明青蒿素类成分或其组合物的止血作用 青蒿素类成分以药理学可接受的溶媒分散。取昆明种小鼠24只,随机分为2组,即基质对照组与2%青蒿素类成分或其组合物组,每组各12只。将小鼠固定于鼠筒中,尾尖部2cm浸泡于2%青蒿素类成分或其组合物溶液或溶媒中,给药时间30min,间隔2h后,重复给药1次。末次给药30min后,以利剪在小鼠距尾尖1.5cm处剪断,待血液自然流出时开始计录出血时间,每隔5秒用己事先称重的棉球吸取血滴,直至出血自然停止(棉球吸时无血)。按下式计算各组动物出血量:出血量=带血棉球重量一初始棉球重量(mg)。 表3. 青蒿素类成分或其组合物对小鼠断尾的止血作用(mean±SD) 组别 只数 出血时间/s 出血量/mg 基质对照组 12 124.7±11.68 45.3±12.1 2%青蒿素类成分或其组合物组 12 113.1±12.77 25.3±8.7 P<0.05,与基质对照组比较 由表3可见青蒿素类成分或其组合物有止血作用,与基质对照组有显著差异。 实验例4:本发明青蒿素类成分或其组合物的抗细菌作用 细菌组经培养48h后观察有无菌落生长,以无菌落生长者的药物最低浓度为药物的最低抑菌浓度(MIC)。 表4. 青蒿素类成分或其组合物对常见致病细菌最低抑菌浓度 菌种名 MIC/g% 金黄色葡萄球菌 1.1 痤疮丙酸杆菌 0.9 绿脓杆菌 1.1 乳酸杆菌 1.0 由表4可见青蒿素类成分或其组合物对常见致病细菌,尤其是引起皮肤疾病的金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌、绿脓杆菌有一定的抑制作用。 实验例5:本发明青蒿素类成分或其组合物的抗真菌作用 真菌组经培养72h后观察点种的菌范围不增大,且逐渐变小干燥,为菌株已被药物抑制的最低浓度(MIC)。 表5. 青蒿素类成分或其组合物对常见皮肤真菌最低抑菌浓度 菌种名 MIC/g% 糠秕孢子菌 0.9 白色念珠菌 0.9 表皮癣菌 1.1 由表5可见青蒿素类成分或其组合物对常见的皮肤真菌有一定的抑制作用。 实验例6:本发明青蒿素类成分或其组合物的抗蠕形螨作用 青蒿素类成分或其组合物以药理学可接受的基质分散。采用透明胶带粘贴过夜法获取人体蠕形螨,随机分成基质组和2%青蒿素类成分或其组合物组,每组12只。用微量移液器吸取等量的基质和2%青蒿素类成分或其组合物各200μL药液滴加于载波片上,用推片将药液均匀铺开,将检出蠕形螨的胶带贴于载玻片上,保证药液与虫体充分接触。然后将载玻片置于人工气候箱(温度30℃,湿度75%),12h后显微镜下观察蠕形螨死亡情况。死亡判断标准:在400倍显微镜下连续观察1min,螨体鳌肢或足爪不动者初步判断为死亡,30min后继续观察仍不动者确定为死亡。 表6. 青蒿素类成分或其组合物对蠕形螨的杀灭作用 组别 只数 死亡只数 死亡率 基质对照组 12 0 0% 2%青蒿素类成分或其组合物组 12 10 83% 由表6可见青蒿素类成分或其组合物对蠕形螨有显著的杀灭作用。 实验例7:本发明青蒿素类成分或其组合物的角化调节作用 青蒿素类成分或其组合物以药理学可接受的基质分散。取昆明种小鼠30只,雌雄各半,随机分成基质组和2%青蒿素类成分或其组合物组。2组小鼠每天分别局部涂抹等量的基质与2%青蒿素类成分或其组合物给药后保鲜膜覆盖,胶布固定30min后解开,以生理盐水洗净药物,再用干药棉拭干,连续21天,一天2次。于第22天处死动物,在距尾根2cm处取鼠尾表皮,以10%甲醛溶液固定石蜡包埋,HE染色,在光镜下观察每个小鼠的尾部鳞片。凡鳞片表皮有连续成行的颗粒细胞者,称为有颗粒层形成的鳞片,颗粒细胞为表皮中扁平或菱形细胞所组成,胞浆内充满粗大深嗜碱性、HE染色呈深兰色透明的角质颗粒。计数鼠尾表皮100个鳞片中有颗粒层形成数。 表7. 青蒿素类成分或其组合物对小鼠鼠尾颗粒细胞形成的影响(mean±SD) 组别 只数 鼠尾每100个鳞片中颗粒层形成数 基质对照组 15 7.3±1.1 2%青蒿素类成分或其组合物组 15 13.8±1.7 P<0.05,与基质对照组比较 由表7可见青蒿素类成分或其组合物有促进角化、纠正异常角化的作用,与基质对照组有显著差异。 实验例8:本发明青蒿素类成分或其组合物的延缓皮肤老化作用 青蒿素类成分或其组合物以药理学可接受的基质分散。以人正常皮肤成纤维细胞(NHDF)传代培养得到细胞浓度较好的培养液用于实验。将培养的细胞接种到细胞培养皿中,培养24h,待细胞生长至占据培养皿面积80%时,吸去培养基,PBS清洗一遍,然后加入300(μL)PBS,以透明膜封口,以为144mJ/cm2照射剂量UVB照射细胞40s,照射后立即用PBS清洗一遍,分别接种到2%青蒿素类成分或其组合物的培养液与空白培养液中,在37℃培养72h。取其中1ml培养液,用于抑制胶原蛋白分解酶(MMP-L1)生成的测定,1mL用于细胞存活力的测定。该实验重复3次。利用免疫ELISA试剂盒测定培养液中的胶原蛋白分解酶生成量。 表8. 青蒿素类成分或其组合物对胶原蛋白分解酶的抑制作用 组别 MMP-L1酶蛋白质量平均浓度 MMP-L1酶生成抑制率 空白对照组 0.17 - 2%青蒿素类成分或其组合物组 0.07 - MMP-L1酶生成抑制率 - 58.8% 由表8可见青蒿素类成分或其组合物有明显抑制皮肤细胞胶原蛋白分解酶生成作用,具有皮肤抗老化与增强皮肤弹性的功能。 实验例9:本发明青蒿素类成分或其组合物的抗色素沉着作用 青蒿素类成分或其组合物以药理学可接受的基质分散。取豚鼠6只,每只动物背部去毛,取2个相离区域,UVB照射选用UVB光源照射,照射总量为2500mJ/cm2,照射2个面积相等的区域一周后开始涂药,分别局部涂抹等量的基质与2%青蒿素类成分或其组合物,连续21天,一天2次。分别在UVB照射前、照射后1周和用药后1周、2周、3周和4周时以多功能皮肤测试仪测量豚鼠背部皮肤各区域的颜色变化,进行客观比较。4周后组织活检并作镜下观察分析。以Schmorl法染色,高倍镜计数每份样品每平方毫米表皮含黑素颗粒细胞数。以Imokawa法染色,高倍镜计数每份样品每平方毫米表皮基底层含多巴阳性黑素细胞数。 表9. 青蒿素类成分或其组合物对UVB照射豚鼠皮肤颜色值的测定的影响(mean) 组别 照射前 照射后 用药1周 用药2周 用药3周 用药4周 基质对照组 30 59 59 58 60 58 2%青蒿素类成分或其组合物组 31 58 56 51 47 41 P<0.05,用药4周与基质对照组比较 表10. 青蒿素类成分或其组合物对UVB有豚鼠色素沉着的抑制作用(mean±SD) 组别 多巴阳性的黑素细胞(个/mm2) 含黑素颗粒的细胞(个/mm2) 基质对照组 773.18±68.52 2801.13±180.72 2%青蒿素类成分或其组合物组 566.97±82.67 2136.14±192.35 P<0.05,与基质对照组比较 由表9,10可见青蒿素类成分或其组合物有抗哺乳动物色素沉着作用。 实验例10:本发明青蒿素类成分或其组合物的抗皮肤瘢痕形成作用 青蒿素类成分或其组合物以药理学可接受的基质分散。将12只日本大耳白兔麻醉,在双侧兔耳腹侧内侧缘上、下部位分别做2个直径约1cm的正方形切口,切口间隔2.0cm,去除兔耳皮肤和皮下组织和软骨膜,保留软骨,纱布压迫止血。将每只耳朵创面随机分为基质组与2%青蒿素类成分或其组合物组,浸有基质或2%青蒿素类成分或其组合物的纱布块外敷5分钟并保留,后纱布包扎,在术后3、6、9、12、15、18、21天采用同样的方法换药。创面在术后12天可见创面肉芽组织生长,28天可见创面全部瘢痕愈合,愈合后18天开始出现高出皮面的增生性瘢痕。术后50天处死动物,切取标本,10%甲醛溶液固定,石蜡包埋后切片,HE染色。在HE染色每张切片随机选取3个高倍视野(×200倍),计数各单位视野的成纤维细胞数,取平均值。计算瘢痕增生指数(Hypertrophic Index,HI):HE染色组织切片于低倍镜下用测微尺测量,按公式HI=A/B计算瘢痕增生指数。A=瘢痕凸起最高点至耳软骨表面的垂直高度;B=瘢痕周边正常皮肤皮缘至耳软骨表面的垂直高度。 50天时肉眼观察可见基质组创面愈合区组织明显高于周围正常皮肤,表现为瘢痕中央呈乳头状突起,呈淡红色,质韧,增生块高出皮面。2%青蒿素类成分或其组合物组愈合区略高于正常皮肤,色泽较淡。HE染色组织切片观察可见基质组瘢痕毛细血管增生明显、成纤维细胞核大、密集增生、位于真皮全层、胶原排列紊乱。2%青蒿素类成分或其组合物组瘢痕组织较薄,表面平整、层次有序、成纤维细胞明显减少。 表11. 青蒿素类成分或其组合物的抗皮肤瘢痕形成作用(mean±SD) 组别 瘢痕增生指数 成纤维细胞数 基质对照组 3.18±0.86 86.01±2.87 2%青蒿素类成分或其组合物组 1.79±0.77 39.78±2.63 P<0.05,与基质对照组比较 由表11可见青蒿素类成分或其组合物有抗哺乳动物皮肤瘢痕形成作用。 实验例11:本发明青蒿素类成分或其组合物对家兔痤疮模型的治疗作用 青蒿素类成分或其组合物以药理学可接受的基质分散。取雄性新西兰兔22只,随机分为基质组与2%青蒿素类成分或其组合物组。对2组新西兰兔双耳内侧面耳管开口处备皮2cm×2cm范围,每日涂抹煤焦油1次,每次0.5mL,连续2周。2周后,取2只新西兰兔造模处皮肤活检、病理切片观察,确定模型形成。2组动物左耳每天分别局部涂抹等量的基质与2%青蒿素类成分或其组合物,连续14天,一天2次。第15天肉眼观察并于动物双耳相应部位取皮肤活检,组织块以10%福尔马林固定,10%硝酸脱钙,石蜡包埋,切片,HE染色,于光镜下观察组织学改变。 实验性粉刺的组织学判定标准:(-)无粉刺,漏斗部仅有松散的角化细胞;(+)毛囊漏斗部积聚少量的粘连在一起的角化细胞,漏斗不扩张;(++)毛囊中中等量的角质栓塞,伸入皮脂腺导管,伴随皮脂腺导管的增生,漏斗扩张;(+++)毛囊中紧密的角质栓塞引起毛囊重度扩张,皮脂腺导管上皮明显增生,部分皮脂腺发生退行变。 肉眼观察:兔耳涂药2周后,可见油酸处局部组织明显粗糙、增厚、变硬,毛囊口有黑色角栓,呈黑头粉刺状,揭开煤焦油痂时,可见附着其上的毛囊角栓,其下可见开放增大的毛囊口,毛囊口隆起呈丘疹状。2%青蒿素类成分或其组合物组用药14天后,整个皮片厚度变薄,柔软度增加,局部毛囊口角栓及粉刺减少,丘疹变平减少,有部分角栓脱落后遗留点状凹陷的毛囊口。基质组用药14天后,耳部仍可见明显的毛囊角栓,毛囊口隆起处略平。 光镜观察:造模2周后,可见角化过度,表皮和毛囊上皮的颗粒层增厚,棘层肥厚,相邻扩张的毛囊相互融合,毛囊口及漏斗部充满角化物质,并向皮脂腺延伸,毛囊口角栓堵塞,毛囊漏斗部充满角化物质并扩大呈壶状,真皮上层毛细血管扩张明显,毛囊周围弥漫散在炎性细胞浸润,以小圆形细胞为主,及少量中性粒细胞。2%青蒿素类成分或其组合物组用药14天后,表皮轻度增厚,毛囊口轻度扩张,有少量疏松角化物质充填,未见毛囊漏斗部扩大如壶状,较少真皮炎症细胞浸润。基质组用药14天后,可见角化过度,表皮及毛囊上皮的颗粒层、棘层仍增生明显、毛囊口及漏斗部仍见角化物质堆积,漏斗部扩大如壶状,真皮内有较多炎性细胞浸润。 由以上结果及表12可见青蒿素类成分或其组合物有纠正异常角化、抗哺乳动物痤疮的作用。 表12. 青蒿素类成分或其组合物对家兔实验性耳痤疮组织病理学的影响(mean)   P<0. 05,与基质对照组比较。    
    Claims (10) Hide Dependent    1.青蒿素类成分或其组合物的一种新应用,即在哺乳动物皮肤护理领域中的新应用,其特征在于所述的青蒿素类成分或其组合物是指青蒿素及其衍生物和相关物及他们的盐类包括但不限于,青蒿素、双氢青蒿素、青蒿琥酯、青蒿琥酯钠、蒿甲醚、蒿乙醚、青蒿素C13衍生物、青蒿素C12衍生物、青蒿素C4衍生物、脱氧桥青蒿素结构相关化合物、脱甲基青蒿素结构相关化合物、脱羰基氧青蒿素结构相关化合物、甾类青蒿素结构相关化合物、内酰胺青蒿素结构相关化合物、开环青蒿素结构相关化合物、4,5-环氧碳代青蒿素结构相关化合物、青蒿素结构简化物、其他青蒿素结构相关化合物及他们的盐类;或含有青蒿素类成分的组合物或提取物包括但不限于,中药青蒿(ARTEMISIAE ANNUAE HERBA)及其制品、植物黄花蒿(Artemisia annua L.)及其制品、其他菊科蒿属(Artemisia Linn. Sensu stricto, excl. Sect. Seriphidium Bess.)植物及其制品、青蒿组织培养液、青蒿素母液等;或选自上述成分的任意组合物。 2.含有青蒿素类成分或其组合物的护肤组合物如健康产品、日化产品、保健品或药品等在哺乳动物皮肤护理领域中的新应用,其特征在于含有安全有效量的如权利要求1所述的青蒿素类成分或其组合物,及皮肤学与药学可接受的其他活性添加剂及基质。   3.如权利1~2任一所述的青蒿素类成分或其组合物或护肤组合物在哺乳动物皮肤护理领域的新应用,其特征在于青蒿素类成分或其组合物的来源可以是合成或自然包括但不限于,天然产物提取、化学全合成、化学半合成、生物合成、组织细胞培养、真菌转化、代谢通路等途径。   4.如权利要求1~3任一所述的青蒿素类成分或其组合物或护肤组合物在哺乳动物皮肤护理领域的新应用,其特征在于青蒿素类成分或其组合物在护肤组合物中的含量优选为约0.0001%~90%,更优选为约0.01%~35%,最优选为约1%~22%其中所述百分比是以组合物质量为100%计。   5.如权利要求1~4任一所述的青蒿素类成分或其组合物或护肤组合物在哺乳动物皮肤护理领域的新应用,其特征在于可加入的其他活性添加剂及基质是指本领域所公知的在目前护肤日化用品、药品、保健品、健康品中已有应用或可能应用的除青蒿素类成分及其组合物以外的宽范围的任选的其他活性添加剂及基质包括但不限于,油质原料、粉质原料、胶质原料、溶剂原料、水溶性聚合物、防腐剂、增稠剂、酸碱类调节剂、抗氧化剂、保湿剂、收敛剂、防晒剂、杀菌剂、调理剂、剥脱剂、遮光剂、止痒剂、磨砂剂、表面活性剂、皮肤助渗剂、皮肤感觉剂、皮肤舒缓剂、皮肤愈合剂、营养添加剂、微量元素和激素类添加剂、生理活性物质添加剂、合成类营养添加剂、活性肽、天然提取物、生物学添加剂、精油、香精、香料、色素、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、助悬剂、包衣材料、赋形剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂、微囊、微球、脂质体等以及他们的组合。   6.如权利要求1~5任一所述的青蒿素类成分或其组合物或护肤组合物在哺乳动物皮肤护理领域的新应用,其特征在于所述的护肤组合物包括但不限于,健康产品、日化用品、药品、保健品、乳剂类化妆品、水状类化妆品、粉类化妆品、膏霜类化妆品、气溶胶类化妆品、发用类制品、美容类化妆品、皂类、面膜、疗效类化妆品、防晒类化妆品、片剂、散剂、丸剂、软膏剂、贴膜剂、凝胶剂、胶囊剂、颗粒剂、泡腾剂、熏蒸剂、缓释剂等及其他皮肤护理用品。   7.如权利要求1~6任一所述的青蒿素类成分或其组合物或护肤组合物在哺乳动物皮肤护理领域的新应用,其特征在于所述的应用是指减轻或消除皮肤不良状态而使皮肤的生理健康与美学外观恢复或进一步增强包括但不限于, a)通过纠正异常角化作用预防、延迟和/或治疗哺乳动物痤疮、头屑、脱屑瘙痒、干燥皲裂、银屑病、硬皮病、毛囊周角化病等由异常角化所引起的角化病症; b)通过促进角化作用软化或柔顺哺乳动物的唇、皮肤、毛发、指趾甲、蹄等,并促进哺乳动物唇、皮肤、毛发、指趾甲、蹄等的更新,调节它们的油性与光泽; c)通过抗色素沉着作用促进皮肤亮白红润,预防、延迟和/或治疗哺乳动物皮肤变黑、灰黄暗淡、色斑、痘印、日晒损伤、炎症损伤等色素沉着症状的出现; d)通过抗瘢痕形成作用预防、延迟和/或治疗哺乳动物皮肤炎症刺激伤害造成的瘢痕生长、外界刺激伤害造成的瘢痕生长、痘印等瘢痕症状的出现; e)通过延缓衰老保持皮肤弹性作用增强皮肤弹性与光泽,预防、延迟和/或治疗哺乳动物皮肤细纹、皱纹、松垂、萎缩、肿胀、毛孔粗大的出现; f)通过抗细菌、抗真菌、抗皮肤寄生虫作用保持哺乳动物皮肤的清洁,预防、延迟和/或治疗细菌、真菌、皮肤寄生虫等所引起的哺乳动物皮肤不良状态; g) 通过抗炎、镇痛、止血等作用消除或缓解皮肤炎症红肿热痛、出血等不良状态; h)通过促进角化、纠正角化异常、抗色素沉着、抑制瘢痕形成、延缓皮肤老化、保持皮肤弹性、抗炎、镇痛、止血、抗细菌、抗真菌、抗皮肤寄生虫等一系列对哺乳动物皮肤有益的作用,消除或缓解哺乳动物皮肤不良状态从而提供增强的皮肤健康与美丽。 8.一种消除或缓解哺乳动物皮肤不良状态以提供增强的皮肤健康与美丽的方法,其特征在于所述方法包括向哺乳动物施用权利1~7任一所述的青蒿素类成分或其组合物或护肤组合物。 9.通过向哺乳动物施用如权利要求1~8任一所述的青蒿素类成分或其组合物或护肤组合物,以消除或缓解哺乳动物皮肤不良状态从而获得增强的皮肤健康与美丽。   10.如权利要求1~9任一所述的青蒿素类成分或其组合物或护肤组合物在哺乳动物皮肤护理领域的应用。   Patent Citations (4)
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  11. Roger
    The present invention provides application of the Artesunate as immunologic adjuvant in preparation rabies vacciness, and present invention firstly provides artemisinin derivative Artesunate (ART) is used as rabies vacciness adjuvant.The present invention passes through experimental studies have found that artemisinin derivative Artesunate (ART) is as rabies vacciness adjuvant can significantly increase its immunogenicity, can be used as new semple type rabies vaccine candidate adjuvant.The Artesunate (ART) of vaccine effect studies have shown that relatively low-dose of the invention can promote the immune effect of rabies vacciness, can reduce the cost of production vaccine.Vaccine effect studies have shown that artemisinin derivative Artesunate (ART) of the invention can generate better protection as rabies vacciness adjuvant. 本发明提供青蒿琥酯作为免疫佐剂在制备狂犬病疫苗中的应用,本发明首次提出将青蒿素衍生物青蒿琥酯(ART)作为狂犬病疫苗佐剂。本发明通过实验研究发现青蒿素衍生物青蒿琥酯(ART)作为狂犬病疫苗佐剂能显著增强其免疫原性,可以作为新型狂犬病疫苗候选佐剂。本发明的疫苗效果研究显示,较低剂量的青蒿琥酯(ART)能促进狂犬病疫苗的免疫效果,可以降低制作疫苗的成本。本发明的疫苗效果研究显示,青蒿素衍生物青蒿琥酯(ART)作为狂犬病疫苗佐剂能产生更好的保护力。   Application of the Artesunate as immunologic adjuvant in preparation rabies vacciness Technical field The invention belongs to molecular biosciences field of immunology.It is being prepared more particularly, to Artesunate as immunologic adjuvant Application in rabies vacciness. Background technique Hydrophobin (Rabies virus, RABV) is the strong people beast caused with the characteristics of infecting central nervous system Suffer from the rabic cause of disease of infectious disease altogether, once morbidity, lethality are up to 100%.China is rabic district occurred frequently, number of the infected It is only second to India, is in second place of the world.With the increase of domestic pets, the rabic control in China human world and prevention and treatment are still appointed Weight road is remote.However rabies pathogenesis is also imperfectly understood so far, also without treating rabic specific drug, so prevention is mad The most effective measure of dog disease is timely vaccine inoculation. Currently, be both at home and abroad the protein formulation purified for the rabies vacciness of the mankind, due to a lack of corresponding adjuvant, first It is secondary it is immune need to inject 3-5 needle, take one month.As for animal rabies vaccine, import inactivated vaccine have using it is safe, be easy to The advantages such as preservation, pollution-free danger.Although China's approved several moneys inactivated vaccines with independent intellectual property rights at present, because The factors such as higher of production-scale limitation and production cost, these inactivated vaccines hair more backward for Asia and African economy Price is too high for area in exhibition, limits them in the use of developing country, and most of economically developed city is still Preferred import inactivated vaccine.Domestic inactivated vaccine needs for animals further reduce the cost. Summary of the invention The defects of higher the technical problem to be solved by the present invention is to overcome existing vaccine cost and deficiency, provide Artesunate As application of the immunologic adjuvant in preparation rabies vacciness. The object of the present invention is to provide Artesunate (referred to as (ART)) as active constituent in preparation rabies vacciness adjuvant In application. By ART and hydrophobia strain mixed immunity mouse, immune in mouse of enhancing inactivation hydrophobin is answered It answers.And the recruitment evaluation of vaccine after identifying and mixing with vaccine, experimental result hair are further carried out as vaccine adjuvant to ART Existing, Artesunate can significantly increase the immunogenicity of rabies vacciness, can be used as new semple type rabies vaccine candidate adjuvant. In one embodiment of this invention, the Artesunate is as sole active agent. The present invention also provides a kind of rabies vacciness adjuvant, the rabies vacciness adjuvant includes Artesunate. In one embodiment of this invention, the Artesunate is as sole active agent. The present invention also provides application of the Artesunate in preparation rabies vacciness, and the Artesunate is as adjuvant. The present invention also provides a kind of vaccine compositions, and it includes the hydrophobin strains and Artesunate of inactivation. In one embodiment of this invention, the hydrophobin strain of the inactivation is selected from CVS-11 strain, rHEP-dG poison Strain, SAD plants, CTN-1 plants, PV plants, at least one of FluryLEP plants.Certainly, above-mentioned strain, all rabies diseases are not limited to Poison strain is suitable for the present invention. In one embodiment of this invention, in the vaccine composition hydrophobin strain and Artesunate amount ratio It is 0.9 × 105~1.1 × 105The μ of FFU:120~130 g. In one embodiment of this invention, the content of hydrophobin strain is 1.0 × 10 in the vaccine composition5~ 1.1×105The μ of FFU:120~130 g. In one embodiment of this invention, the dosage of Artesunate is 5 μ g/g the weight of animals in the vaccine composition.It is green The dosage of artemisic succinate is determined according to the weight of animals such as mouse, and by taking mouse as an example, actual use concentration is 5 μ g/g mouse weights, If every mouse weight is about 25g, the dosage of Artesunate is about 125 μ g. In one embodiment of this invention, further include dimethyl sulfoxide (DMSO), other solvents can also be used, DMSO exists When dissolving the reagent of some good water solubilities, solute effect is more preferable. In one embodiment of this invention, Artesunate (g) in the vaccine composition: dimethyl sulfoxide (mL)=1:(8 ~12), preferably 1:10. It in one embodiment of this invention, further include PBS buffer solution.PBS buffer solution has effects that physiological saline, in stabilization More advantageous, pH 7.20-7.40 in terms of albumen. In one embodiment of this invention, by volume, Artesunate in the vaccine composition: PBS buffer solution=1: (90~110), preferably 1:100. The present invention also provides application of the Artesunate in preparation rabies vacciness.The rabies vacciness is for preventing or controlling Treat people or the rabies of other animals. Optionally, the Artesunate is as adjuvant. Term " adjuvant " is the pharmacy or immunological reagent or composition for changing other agent efficacies, refer in a broad sense from Body does not provide wide spectrum substance that is immune, but can increasing the immunogenicity of the antigen of co-administration.Adjuvant can be added to vaccine In, increase the quantity and lasting protection of antibody by increasing immune response, to reduce the external of injection to the maximum extent Substance.Adjuvant can also be used for improving the effect of vaccine, be changed by helping to the immune anti-of certain types of immune system cell It answers, for example, according to the purpose of vaccine, by activating T cell rather than the B cell of secretory antibody.Therefore, adjuvant can be advantageously Adjust cytokine-expressing/secretion, antigen presentation, type of immune response etc..In the present invention, the situation of the term refers to work For the compound or composition of the carrier or auxiliary substance of immunogene and/or other drugs reactive compound. Wherein above-mentioned " antigen ", which is typically meant that, can be identified by immune system and can for example be adapted to by being formed to be used as Property immune response a part antibody or antigen specific T-cell come trigger antigen specific immune reaction substance.Antigen It is divided into two classes: comlete antigen and incomplete antigen according to property.Comlete antigen (complete antigen) abbreviation antigen, is one The existing immunogenicity of class, and have immunoreactive substance, such as most protein, bacterium, virus, bacterial exotoxin and intestines poison Element etc..Incomplete antigen, that is, haptens (hapten) is that only have immunoreactivity, and the substance of non-immunogenicity, such as absolutely mostly The hydrolysate and all lipoids of number polysaccharide (capsular polysaccharide of such as pneumococcus), capsular polysaccharide. The invention has the following advantages: Present invention firstly provides artemisinin derivative Artesunate (ART) is used as rabies vacciness adjuvant. The present invention passes through experimental studies have found that artemisinin derivative Artesunate (ART) can be shown as rabies vacciness adjuvant The immunogenicity for writing enhancing rabies vacciness, can be used as new semple type rabies vaccine candidate adjuvant. The Artesunate (ART) of vaccine effect studies have shown that relatively low-dose of the invention can promote exempting from for rabies vacciness Epidemic disease effect can reduce the cost of production vaccine. Vaccine effect studies have shown that artemisinin derivative Artesunate (ART) of the invention is used as rabies vacciness adjuvant Better protection can be generated. Detailed description of the invention Fig. 1 is shown as a kind of chemical formula of artemisinin derivative Artesunate (ART). Fig. 2, which is shown as ART, influences statistical chart to KM mouse weight, while setting up PBS control group. Peripheral blood anti-rabies virus neutralizing antibody water after mouse is immunized in the CVS-11 that Fig. 3 is shown as combining ART inactivation Flat statistical chart, while setting up PBS control group (P < 0.05 *). Peripheral blood anti-rabies virus neutralizing antibody water after mouse is immunized in the rHEP-dG that Fig. 4 is shown as combining ART inactivation Flat statistical chart, while setting up PBS control group (P < 0.05 *). Fig. 5 is shown as the survival rate statistical chart of CVS-11 attack mouse after ART is immunized mouse 14 days as vaccine adjuvant. Specific embodiment The present invention is further illustrated below in conjunction with Figure of description and specific embodiment, but embodiment is not to the present invention It limits in any form.Unless stated otherwise, the present invention uses reagent, method and apparatus routinely try for the art Agent, method and apparatus. Unless stated otherwise, following embodiment agents useful for same and material are commercially available. Currently, the World Health Organization is recommended to use inactivation rabies vacciness according to its safety, in order to develop it is more effective and Cheaper inactivated vaccine, we, which can take, improves the means such as virus titer or the better adjuvant of searching. Fig. 1 is shown as the chemical formula of artemisinin derivative Artesunate (ART) used by following embodiment, Artesunate (ART) No. CAS is 88495-63-0, molecular formula: C19H28O8, molecular weight: 384.42, No. EINECS: 618-170-5. Artesunate used in following embodiment is purchased from TCI AmericaPortland company (Tokyo chemical conversion industry Co., Ltd.). Artemisinin derivative Artesunate (ART) adjuvant in following embodiment, is the CVS-11 or rHEP-dG with inactivation Strain is mixed with ART, forms rabies virus vaccine. Specifically: ART is initially dissolved in DMSO, and the CVS-11 in PBS with inactivation is dissolved in when then using in vivo Or rHEP-dG hydrophobin mixing.According to Artesunate (g): DMSO (mL)=1:10 ratio, the i.e. Artesunate of 1g are molten In 10mL DMSO, the Artesunate being then dissolved in DMSO is redissolved in PBS buffer solution solution, Artesunate and PBS The volume ratio of buffer is 1:100, and PBS buffer solution is phosphate buffer, pH 7.2-7.4. Use the ART as adjuvant, rabies vacciness induction can be promoted to generate in higher anti-rabies virus and anti- Body, and better protecting effect is generated, reduce the cost of Canine vaccine. Specifically, in the immunologic adjuvant, Artesunate is the dosage and 1.0 × 10 by 5 μ g/g mouse weights5FFU inactivation CVS-11 or rHEP-dG mixing, by right leg gastrocnemius intramuscular injection be immunized mouse after collect peripheral blood, utilize neutralize experiment Study anti-rabies virus neutralize antibody titers. In addition, artemisinin derivative Artesunate (ART) also exists in the application as vaccine adjuvant or in terms of preparing vaccine Within protection scope of the present invention. Artemisinin derivative Artesunate (ART) is initially dissolved in DMSO, is dissolved in PBS when then using in vivo In, it is used after being mixed with CVS-11 the or rHEP-dG hydrophobin of inactivation.The immunologic adjuvant Artesunate is by 5 μ g/g Dosage is mixed with the CVS-11 of inactivation or rHEP-dG, collects serum after mouse is immunized by right leg gastrocnemius intramuscular injection, is used Neutralize experiment detection anti-rabies virus neutralize antibody titers.The present invention is also to ART side effect, ART Adjuvanted vaccines immunogenicity It is studied with the biological characteristics such as malicious protection are attacked, to assess the safety and effect of its as vaccine adjuvant.The results show that ART will not generate significant side effect as new vaccine adjuvant in Mice Body, and ART can significantly increase vaccine as adjuvant Immunogenicity promotes vaccine-induced body to generate the anti-rabies virus neutralizing antibody with Vaccine effectiveness, can preferably protect Protect the attack that body resists lethal rabies virus. In terms of specific research method, the present invention utilizes immunology the relevant technologies, has studied in Mice Body ART as novel The recruitment evaluation of vaccine adjuvant. Embodiment 1 The research that novel rabies virus vaccine adjuvant ART influences mouse weight SPF grade Kunming (KM) mouse of 3-4 week old is divided into 2 groups, i.e. ART group and PBS control group, every group comprising 6 small Mouse.ART is injected with the dosage of 5 μ g/g by the right leg gastrocnemius muscle of mouse, and control group injects equivalent PBS.It is every after administration The weight of its detection mouse, monitors 15 days altogether.By the weight before respectively injecting on the weight ratio of all mouse, weight ratio is studied Example situation of change.As shown in Figure 2, the results showed that, ART not will lead to treatment mouse weight and mitigate, this is similar to PBS treatment.More Importantly, there is not abnormal symptom in treatment mouse.Therefore, the ART treatment that dosage is 5 μ g/g is safe to mouse. Embodiment 2 Artesunate (ART) in the intracorporal immunogenicity of KM mouse and attacks malicious Protective strategy to rabies vacciness 1, experimental method CVS-11 and rHEP-dG are inactivated with UV respectively.Then ART is mixed with the CVS-11 of inactivation or rHEP-dG, PBS is used as vehicle control.The SPF grade kunming mouse of 6~7 week old is divided into 4 groups, i.e., ART+CVS-11 group, PBS+CVS-11 group, ART+rHEP-dG group and PBS+rHEP-dG control group, every group includes 6 mouse.The right leg gastrocnemius injection of every mouse of experimental group 1.0×105The hydrophobin of FFU inactivation and the mixture of ART, the volume of mixture are 200 μ L, and ART's contains in mixture Measuring is 5 μ g ART/g mouse weights, Artesunate (g): dimethyl sulfoxide (mL)=1:10, by volume, Artesunate: PBS Buffer=1:100, control group intramuscular injection penetrate 1.0 × 105The hydrophobin of FFU inactivation and PBS mixture.7th after immune It and the 14th day acquisition peripheral blood, and by fluorescence antibody virus neutralization (FAVN) testing inspection serum anti-rabies virus And antibody level, rabies standard serum are purchased from the World Health Organization (WHO), detection method is in strict accordance with world animal health Organize the standard practice instructions of (World Organisation for Animal Health, OIE). 2, experimental result As shown in Figure 3, the results showed that, the hydrophobin that mouse generates is immunized with the CVS-11 joint ART of inactivation and neutralizes Antibody level is significantly higher than PBS control group.As shown in figure 4, the mad dog that mouse generates is immunized with the rHEP-dG joint ART of inactivation Sick virucidin's level is significantly higher than PBS control group. Fig. 3 and Fig. 4's the result shows that, when ART is applied to rabies vacciness as adjuvant, it is not limited to a certain specific Inactivation hydrophobin strain, but can be adapted for the hydrophobin strain of various inactivations. 3, further, in order to verify after mouse obtains high level immunity whether there is protection to strong virus attack, In CVS-11 strain living is passed through intramuscular injection infecting mouse by 14d after immune, while being arranged without immune rabies vacciness Control group, the morbidity and death condition of continuous 3 weeks observation mouse, records survival rate daily.As shown in Figure 5, the results showed that, it uses ART as adjuvant mouse than there is higher survival rate with the mouse of PBS control. The above results show that artemisinin derivative Artesunate (ART) enhances inactivation rabies epidemic disease when being used as adjuvant The immune response of seedling. The above embodiment is a preferred embodiment of the present invention, but embodiments of the present invention are not by above-described embodiment Limitation, other any changes, modifications, substitutions, combinations, simplifications made without departing from the spirit and principles of the present invention, It should be equivalent substitute mode, be included within the scope of the present invention.    
    Claims (9) Hide Dependent    1. application of the Artesunate as active constituent in preparation rabies vacciness adjuvant.   2. rabies vacciness adjuvant according to claim 1, which is characterized in that the Artesunate as sole active at Point. 3. a kind of rabies vacciness adjuvant, which is characterized in that the rabies vacciness adjuvant includes Artesunate.   4. rabies vacciness adjuvant according to claim 3, which is characterized in that Artesunate is as sole active agent. 5. application of the Artesunate in preparation rabies vacciness, which is characterized in that the Artesunate is as adjuvant. 6. a kind of vaccine composition, which is characterized in that it includes the hydrophobin strains and Artesunate of inactivation.   7. vaccine composition according to claim 6, which is characterized in that the hydrophobin strain of the inactivation is selected from At least one of CVS-11 strain, rHEP-dG strain.   8. vaccine composition according to claim 6, which is characterized in that hydrophobin strain in the vaccine composition Amount ratio with Artesunate is 0.9 × 105~1.1 × 105The μ of FFU:120~130 g.   9. vaccine composition according to claim 8, which is characterized in that hydrophobin strain in the vaccine composition Amount ratio with Artesunate is 1.0 × 105~1.1 × 105The μ of FFU:120~130 g.   Patent Citations (4)
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    ApplicationFiling dateTitle CN201910745298.1A2019-08-13Application of artesunate as immunologic adjuvant in preparation of rabies vaccine   https://patents.google.com/patent/CN110507819A/en       青蒿琥酯作为免疫佐剂在制备狂犬病疫苗中的应用 技术领域 本发明属于分子生物免疫学领域。更具体地,涉及青蒿琥酯作为免疫佐剂在制备狂犬病疫苗中的应用。 背景技术 狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)是引起以侵染中枢神经系统为特点的烈性人兽共患传染病狂犬病的病原,一旦发病,致死率高达100%。我国是狂犬病的高发区,发病人数仅次于印度,高居世界第二位。随着家养宠物的增加,我国人间狂犬病的控制和防治依然任重道远。然而狂犬病致病机理至今还不完全清楚,也没有治疗狂犬病的特效药,所以预防狂犬病最有效的措施是及时接种疫苗。 目前,国内外用于人类的狂犬病疫苗为纯化的蛋白制剂,因缺乏相应的佐剂,第一次免疫需注射3-5针,需时一个月。至于动物狂犬病疫苗,进口灭活疫苗具有使用安全、易于保存、无污染危险等优势。我国目前虽然已批准了几款具有自主知识产权的灭活疫苗,但因生产规模的限制和生产成本的偏高等因素,这些灭活疫苗对于亚洲和非洲经济较落后的发展中地区来说价格太高,限制了它们在发展中国家的使用,而大部分经济发达的城市仍然首选进口灭活疫苗。国产兽用灭活疫苗需要进一步降低成本。 发明内容 本发明要解决的技术问题是克服现有疫苗成本较高等缺陷和不足,提供青蒿琥酯作为免疫佐剂在制备狂犬病疫苗中的应用。 本发明的目的是提供青蒿琥酯(简称(ART))作为活性成分在制备狂犬病疫苗佐剂中的应用。 将ART与狂犬病毒疫苗株混合免疫小鼠,增强灭活狂犬病病毒在小鼠中的免疫应答。并进一步对ART作为疫苗佐剂进行鉴定以及与疫苗混合后疫苗的效果评估,实验结果发现,青蒿琥酯可显著增强狂犬病疫苗的免疫原性,可以作为新型狂犬病疫苗候选佐剂。 在本发明的一实施例中,所述青蒿琥酯作为唯一活性成分。 本发明还提供一种狂犬病疫苗佐剂,所述狂犬病疫苗佐剂包含青蒿琥酯。 在本发明的一实施例中,所述青蒿琥酯作为唯一活性成分。 本发明还提供青蒿琥酯在制备狂犬病疫苗中的应用,所述青蒿琥酯作为佐剂。 本发明还提供一种疫苗组合物,其包含灭活的狂犬病病毒毒株和青蒿琥酯。 在本发明的一实施例中,所述灭活的狂犬病病毒毒株选自CVS-11毒株、rHEP-dG毒株、SAD株、CTN-1株、PV株、FluryLEP株中的至少一种。当然,不限于上述毒株,所有狂犬病病毒毒株均适用于本发明。 在本发明的一实施例中,所述疫苗组合物中狂犬病病毒毒株与青蒿琥酯的用量比为0.9×105~1.1×105FFU:120~130μg。 在本发明的一实施例中,所述疫苗组合物中狂犬病病毒毒株的含量为1.0×105~1.1×105FFU:120~130μg。 在本发明的一实施例中,所述疫苗组合物中青蒿琥酯的用量为5μg/g动物体重。青蒿琥酯的用量是根据小鼠等动物体重确定,以小鼠为例,实际使用浓度为5μg/g小鼠体重,如果每只小鼠体重约为25g,那么,青蒿琥酯的用量约为125μg。 在本发明的一实施例中,还包括二甲基亚砜(DMSO),也可以采用其他溶剂,DMSO在溶解一些水溶性好的试剂时,溶解效果更好。 在本发明的一实施例中,所述疫苗组合物中青蒿琥酯(g):二甲基亚砜(mL)=1:(8~12),优选为1:10。 在本发明的一实施例中,还包括PBS缓冲液。PBS缓冲液具有生理盐水功效,在稳定蛋白方面更具有优势,pH为7.20-7.40。 在本发明的一实施例中,按体积计,所述疫苗组合物中青蒿琥酯:PBS缓冲液=1:(90~110),优选为1:100。 本发明还提供青蒿琥酯在制备狂犬病疫苗中的应用。该狂犬病疫苗用于预防或治疗人或其他动物的狂犬病。 可选地,所述青蒿琥酯作为佐剂。 术语“佐剂”是改变其他药剂功效的药学或免疫学试剂或组合物,在广义上是指自身不提供免疫,但能够增加共同施用的抗原的免疫原性的广谱物质。佐剂可以添加到疫苗中,通过增加免疫应答来增加抗体的数量和持久的保护,从而最大限度地减少注射的外来物质。佐剂也可用于提高疫苗的效力,通过帮助改变对特定类型的免疫系统细胞的免疫反应,例如,根据疫苗的目的,通过激活T细胞而不是分泌抗体的B细胞。因此,佐剂可以有利地调节细胞因子表达/分泌、抗原呈递、免疫应答的类型等。在本发明中,该术语的情形是指作为免疫原和/或其他药物活性化合物的载体或辅助物质的化合物或组合物。 其中上述“抗原”典型地是指可以由免疫系统识别并能够例如通过形成作为适应性免疫应答的一部分的抗体或抗原特异性T-细胞来触发抗原特异性免疫反应的物质。抗原根据性质分为两类:完全抗原和不完全抗原。完全抗原(complete antigen)简称抗原,是一类既有免疫原性,又有免疫反应性的物质,如大多数蛋白质、细菌、病毒、细菌外毒素和肠毒素等。不完全抗原即半抗原(hapten)是只具有免疫反应性,而无免疫原性的物质,如绝大多数多糖(如肺炎球菌的荚膜多糖)、荚膜多糖的水解产物和所有的类脂等。 本发明具有以下有益效果: 本发明首次提出将青蒿素衍生物青蒿琥酯(ART)作为狂犬病疫苗佐剂。 本发明通过实验研究发现青蒿素衍生物青蒿琥酯(ART)作为狂犬病疫苗佐剂能显著增强狂犬病疫苗的免疫原性,可以作为新型狂犬病疫苗候选佐剂。 本发明的疫苗效果研究显示,较低剂量的青蒿琥酯(ART)能促进狂犬病疫苗的免疫效果,可以降低制作疫苗的成本。 本发明的疫苗效果研究显示,青蒿素衍生物青蒿琥酯(ART)作为狂犬病疫苗佐剂能产生更好的保护力。 附图说明 图1显示为一种青蒿素衍生物青蒿琥酯(ART)的化学式。 图2显示为ART对KM小鼠体重影响统计图,同时设立PBS对照组。 图3显示为将ART联合灭活的CVS-11免疫小鼠后外周血抗狂犬病病毒中和抗体水平统计图,同时设立PBS对照组(*P<0.05)。 图4显示为将ART联合灭活的rHEP-dG免疫小鼠后外周血抗狂犬病病毒中和抗体水平统计图,同时设立PBS对照组(*P<0.05)。 图5显示为ART作为疫苗佐剂免疫小鼠14天后CVS-11攻击小鼠的存活率统计图。 具体实施方式 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。 除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。 目前,世界卫生组织根据其安全性推荐使用灭活狂犬病疫苗,为了开发更有效和更便宜的灭活疫苗,我们可以采取提高病毒滴度或寻找更好的佐剂等手段。 图1显示为以下实施例所采用的青蒿素衍生物青蒿琥酯(ART)的化学式,青蒿琥酯(ART)的CAS号为88495-63-0,分子式:C19H28O8,分子量:384.42,EINECS号:618-170-5。 以下实施例中所使用的青蒿琥酯购于TCI AmericaPortland公司(东京化成工业株式会社)。 以下实施例中的青蒿素衍生物青蒿琥酯(ART)佐剂,是以灭活的CVS-11或rHEP-dG毒株与ART混合,形成狂犬病病毒疫苗。 具体地:ART首先溶解在DMSO中,然后在体内使用时溶解在PBS中与灭活的CVS-11或rHEP-dG狂犬病病毒混合。按照青蒿琥酯(g):DMSO(mL)=1:10的比例,即1g的青蒿琥酯溶解在10mL DMSO中,然后将溶解在DMSO中的青蒿琥酯再溶解到PBS缓冲液中,青蒿琥酯与PBS缓冲液的体积比为1:100,PBS缓冲液即为磷酸盐缓冲液,pH为7.2-7.4。 使用该ART作为佐剂,能够促进狂犬病疫苗诱导产生更高的抗狂犬病病毒中和抗体,且产生更好的保护效果,降低了犬用疫苗的成本。 具体地,该免疫佐剂中,青蒿琥酯是按5μg/g小鼠体重的剂量与1.0×105FFU灭活的CVS-11或rHEP-dG混合,通过右腿腓肠肌肌内注射免疫小鼠后收集外周血,利用中和实验研究抗狂犬病病毒中和抗体效价。 另外,青蒿素衍生物青蒿琥酯(ART)在作为疫苗佐剂或制备疫苗方面的应用,也在本发明的保护范围之内。 青蒿素衍生物青蒿琥酯(ART)首先溶解在DMSO中,然后在体内使用时溶解在PBS中,与灭活的CVS-11或rHEP-dG狂犬病病毒混合后使用。该免疫佐剂青蒿琥酯是按5μg/g的剂量与灭活的CVS-11或rHEP-dG混合,通过右腿腓肠肌肌内注射免疫小鼠后收集血清,采用中和实验检测抗狂犬病病毒中和抗体效价。本发明还对ART副作用、ART佐剂疫苗免疫原性和攻毒保护力等生物学特性进行研究,以评估其作为疫苗佐剂的安全性和效果。结果显示,ART作为新型疫苗佐剂在小鼠体内不会产生显著的副作用,ART作为佐剂能显著增强疫苗的免疫原性,促进疫苗诱导机体产生具有保护效力的抗狂犬病病毒中和抗体,能够更好的保护机体抵抗致死性狂犬病病毒的攻击。 具体研究方法方面,本发明利用免疫学相关技术,研究了在小鼠体内ART作为新型疫苗佐剂的效果评估。 实施例1 新型狂犬病病毒疫苗佐剂ART对小鼠体重影响的研究 将3-4周龄的SPF级昆明(KM)小鼠分为2组,即ART组和PBS对照组,每组包含6只小鼠。ART以5μg/g的剂量通过小鼠右腿腓肠肌肌肉进行注射,对照组注射等量PBS。给药后每天检测小鼠的体重,一共监测15天。将所有小鼠的体重比上各自注射前的体重,研究体重比例变化情况。如图2所示,结果表明,ART不会导致治疗小鼠体重减轻,这与PBS治疗相似。更重要的是,治疗小鼠没有出现异常症状。因此,剂量为5μg/g的ART治疗对小鼠是安全的。 实施例2 青蒿琥酯(ART)对狂犬病疫苗在KM小鼠体内的免疫原性及攻毒保护研究 1、实验方法 分别将CVS-11和rHEP-dG用UV灭活。然后将ART与灭活的CVS-11或rHEP-dG混合,PBS用作佐剂对照。6~7周龄的SPF级昆明系小鼠分为4组,即ART+CVS-11组、PBS+CVS-11组、ART+rHEP-dG组和PBS+rHEP-dG对照组,每组包含6只小鼠。实验组每只小鼠右腿腓肠肌注射1.0×105FFU灭活的狂犬病病毒和ART的混合物,混合物的体积为200μL,混合物中ART的含量为5μg ART/g小鼠体重,青蒿琥酯(g):二甲基亚砜(mL)=1:10,按体积计,青蒿琥酯:PBS缓冲液=1:100,对照组肌注射1.0×105FFU灭活的狂犬病病毒和PBS混合物。在免疫后第7天和第14天采集外周血,并且通过荧光抗体病毒中和(FAVN)试验检测血清抗狂犬病病毒中和抗体水平,抗狂犬病标准血清购自世界卫生组织(WHO),检测方法严格按照世界动物卫生组织(World Organisation for Animal Health,OIE)的标准操作规程。 2、实验结果 如图3所示,结果表明,用灭活的CVS-11联合ART免疫小鼠产生的狂犬病病毒中和抗体水平显著高于PBS对照组。如图4所示,用灭活的rHEP-dG联合ART免疫小鼠产生的狂犬病病毒中和抗体水平显著高于PBS对照组。 图3和图4的结果表明,ART作为佐剂应用于狂犬病疫苗时,并不局限于某一种特定的灭活狂犬病病毒毒株,而是可以适用于各种灭活的狂犬病病毒毒株。 3、进一步地,为了验证小鼠获得高水平免疫力后是否具有对强毒攻击的保护,在免疫后第14d将活的CVS-11毒株通过肌肉注射感染小鼠,同时设置没有免疫狂犬病疫苗的对照组,连续3周观察小鼠的发病及死亡情况,每天记录存活率。如图5所示,结果表明,用ART作为佐剂的小鼠比用PBS对照的小鼠具有更高的存活率。 上述结果表明,青蒿素衍生物青蒿琥酯(ART)在用作佐剂时增强了灭活狂犬病疫苗的免疫应答。 上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。    
    Claims (9)   1.青蒿琥酯作为活性成分在制备狂犬病疫苗佐剂中的应用。 2.根据权利要求1所述的狂犬病疫苗佐剂,其特征在于,所述青蒿琥酯作为唯一活性成分。 3.一种狂犬病疫苗佐剂,其特征在于,所述狂犬病疫苗佐剂包含青蒿琥酯。 4.根据权利要求3所述的狂犬病疫苗佐剂,其特征在于,青蒿琥酯作为唯一活性成分。 5.青蒿琥酯在制备狂犬病疫苗中的应用,其特征在于,所述青蒿琥酯作为佐剂。 6.一种疫苗组合物,其特征在于,其包含灭活的狂犬病病毒毒株和青蒿琥酯。 7.根据权利要求6所述的疫苗组合物,其特征在于,所述灭活的狂犬病病毒毒株选自CVS-11毒株、rHEP-dG毒株中的至少一种。 8.根据权利要求6所述的疫苗组合物,其特征在于,所述疫苗组合物中狂犬病病毒毒株与青蒿琥酯的用量比为0.9×105~1.1×105FFU:120~130μg。 9.根据权利要求8所述的疫苗组合物,其特征在于,所述疫苗组合物中狂犬病病毒毒株与青蒿琥酯的用量比为1.0×105~1.1×105FFU:120~130μg。   Patent Citations (4)
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  12. Roger
    The invention relates to effects and application of artemisinin and its derivative in inhibition of platelet-derived growth factor receptor A. Particularly, artemisinin and its derivative directly act on a molecular target platelet-derived growth factor receptor A (PDGFR alpha) of a tumor and combines with PDGFR alpha on a cell membrane to inhibit activation of tyrosine kinase at the intracellular domain of PDGFR alpha, inhibit protein stability of PDGFR alpha, and promote a ubiquitin-dependent proteasome mediated degradation process. The artemisinin and its derivative has dose-dependent cell growth inhibition and migration invasion inhibition effects on PDGFR alpha highly expressed tumor cells, and also can inhibit activation of signaling pathways PI3K/AKT and MAPK/ERK.   本发明涉及青蒿素及其衍生物在抑制血小板衍生生长因子受体A中的作用及其应用,具体地,青蒿素及其衍生物直接作用于肿瘤的分子靶标血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα),与细胞膜上的PDGFRα结合,抑制PDGFRRα胞内段的酪氨酸激酶的活化,抑制PDGFRα的蛋白稳定性,促进泛素依赖的蛋白酶体介导的降解过程,对于高表达PDGFRα的肿瘤细胞具有剂量依赖的细胞生长抑制和迁移侵袭抑制作用,也可以抑制信号通路PI3K/AKT和MAPK/ERK的活化。
     
    Effect and the application thereof in suppressing platelet derived growth factor receptor A of arteannuin and derivant thereof Technical field The present invention relates to biomedicine field, particularly, the present invention relates to effect and the application thereof in suppressing platelet derived growth factor receptor A of arteannuin and derivant thereof. Background technology Herba Artemisiae Annuae has another name called Herba Artemisiae annuae (Artemisia anaua L), belongs to Compositae, is the annual herb plant.Arteannuin is the sesquiterpene lactones class antimalarial agent that China pharmacy worker extracted from the Chinese medicine Herba Artemisiae Annuae in early 1970s.In view of traditional quinine class medicine generally runs into the Drug resistance problem, arteannuin and its derivant have replaced them at present, become antimalarial main flow medicine in the world.An endoperoxide bridge is arranged on the macro ring of arteannuin, under the catalysis of ferrous ion or heme, can emit the free radical centered by carbon.Intracellular protein and nucleic acid are dead after by these free radical alkanisations.Plasmodium colonizes in the erythrocyte, contains in a large number the hemes from hemoglobin, thereby arteannuin easy being activated very, and then plasmodium is killed.Arteannuin and its derivant, as dihydroartemisinine, Artemether, arteether and artesunate etc. has been widely used in malaria treatment, and more artemisinin derivative is developed. The antimalarial active of arteannuin and derivant thereof has obtained universally acknowledged, have rapid-action, drug effect is high, less toxic side effect and other advantages.Except being widely used in malaria treatment, artemisinin-based drug also has other multiple pharmacological effect, as anti-schistosome function, arrhythmia, relieving asthma, effects such as antiendotoxin, antiallergic action, anti-lupus erythematosus, immunosuppressant. Along with deepening continuously to arteannuin and derivatives active research thereof, it is found that, this compounds is inhibited and excellent curative to the growth of kinds of tumor cells, yet its concrete action target spot and coherent signal path and mechanism of action are also indeterminate.Therefore this area presses for and understands the effect in tumor always of arteannuin and derivant thereof. Summary of the invention The purpose of this invention is to provide the effect in suppressing platelet derived growth factor receptor A of arteannuin and derivant thereof. Another object of the present invention provides arteannuin and derivant thereof as the application of platelet derived growth factor receptor A inhibitor/antagonist. Another object of the present invention provides the method for external treatment tumor. In a first aspect of the present invention, provide a kind of arteannuin and derivant thereof for the preparation of suppressing to be selected from down the medicine of group disease or the purposes of medicine sensitizer: PDGFR α positive tumor, vascular conditions or fibrous lesions. In another preference, described PDGFR α positive tumor cell is the positive ovarian cancer cell of PDGFR α or PDGFR α masculine liver cancer cell. At second portion of the present invention, provide the purposes of a kind of arteannuin and derivant thereof, for the preparation of inhibitor or the antagonist of platelet derived growth factor receptor A (PDGFR α). In another preference, described platelet derived growth factor receptor A (PDGFR α) comes from the people. In another preference, described inhibitor or antagonist also are used for: (i) activation of inhibition PDGFR α tyrosine kinase; And/or The protein stability that (ii) suppresses PDGFR α; And/or (iii) promote the degraded of the proteasome mediation that PDGFR α ubiquitin relies on; And/or (vi) suppress the activation of PDGFR α positive tumor cell signal path PI3K/AKT and MAPK/EPK. In another preference, described artemisinin derivative is selected from down group: Artemether, dihydroartemisinine, artesunate, two hydrogen Artemether, arteether etc. In another preference, described artemisinin derivative is dihydroartemisinine. In a third aspect of the present invention, provide a kind of external non-therapeutic ground to suppress the active method of platelet derived growth factor receptor A (PDGFR α), comprise step: with arteannuin and/or artemisinin derivative and cells contacting, thus platelet derived growth factor receptor A (PDGFR α) in inhibition or the antagonism cell. In another preference, described contact is in the presence of arteannuin and/or artemisinin derivative, cultivates described cell. In another preference, described cell comprises tumor cell, preferably comprise PDGFR α positive tumor cell, more preferably comprise the positive ovarian cancer cell of PDGFR α or hepatoma carcinoma cell, as ovarian cancer cell A2780, ovarian cancer cell OVCAR3, hepatoma carcinoma cell Hep3B. In another preference, described method also is used for following at least a kind of application: External non-therapeutic ground suppresses the activation of PDGFR α tyrosine kinase; External non-therapeutic ground suppresses the protein stability of PDGFR α; External non-therapeutic ground promotes the degraded of the proteasome mediation that PDGFR α ubiquitin relies on; External non-therapeutic ground suppresses the activation of signal path PI3K/AKT and MAPK/EPK; With External non-therapeutic suppresses the growth of PDGFR α positive tumor cell. In a fourth aspect of the present invention, a kind of purposes of preparation combination is provided, described preparation combination comprises: (I) contain the preparation of arteannuin and/or artemisinin derivative; With (II) contain the preparation of gemcitabine or carboplatin, The combination of described preparation for the preparation of: (a) pharmaceutical composition or the medicine box of inhibition platelet derived growth factor receptor A; Or (b) prevent and/or treat pharmaceutical composition or the medicine box of tumor. In another preference, described preparation comprises: tablet, capsule, suppository, injection. In another preference, described tumor is PDGFR α positive tumor. In a fifth aspect of the present invention, a kind of method of the PDGFR of preventing and/or treating alpha associated disorders is provided, wherein said disease is relevant with expression excessively or the hyperactivity of PDGFR α, described method comprises step: use arteannuin and/or artemisinin derivative for the object of needs, or use the pharmaceutical composition that contains arteannuin and/or artemisinin derivative. In another preference, described PDGFR alpha associated disorders comprises tumor (PDGFR α positive tumor), as ovarian cancer or hepatocarcinoma. In another preference, PDGFR α positive tumor is the positive ovarian cancer of PDGFR α or PDGFR α masculine liver cancer. In another preference, described using comprises: in the tumor, intravenous injection, oral tablet, lumbar injection etc. In another preference, described object is mammal. In a sixth aspect of the present invention, a kind of method is provided, described method is used in the body or growth, migration and the invasion and attack of the activation of vitro inhibition PDGFR α tyrosine kinase, the protein stability of inhibition PDGFR α, the degraded that promotes the proteasome mediation that PDGFR α ubiquitin relies on, the activation that suppresses signal path PI3K/AKT and MAPK/EPK and/or inhibition PDGFR α positive tumor cell, and described method comprises step: use arteannuin and/or artemisinin derivative for the object of needs. In a seventh aspect of the present invention, a kind of test kit for the ovarian cancer pathological grading is provided, described test kit comprises the reagent that detects in vitro tissue PDGFR alpha expression amount. In should be understood that within the scope of the present invention, above-mentioned each technical characterictic of the present invention and can making up mutually between specifically described each technical characterictic in below (eg embodiment), thus constitute new or optimized technical scheme.As space is limited, this tired stating no longer one by one. Description of drawings Following accompanying drawing is used for explanation specific embodiments of the present invention, and is not used in the scope of the invention that restriction is defined by claims. Fig. 1 shows that PDGFR α can be used as the direct action target of arteannuin and derivant thereof; Wherein, Fig. 1 a is the vitro kinase experiment, the result shows that arteannuin and derivant arteannuin (ART) thereof, dihydroartemisinine (DHA), artesunate (ARM), Artemether (ARS) can suppress the activity of PDGFR α born of the same parents the inner (aa550-end) tyrosine kinase; Fig. 1 b is surface plasma resonance (SPR) experiment, the result shows, dihydroarteannuin (DHA) can mutually combine with PDGFR α bag outer end (aa24-524) albumen, the positive contrast of Suo Lafeini (Sorafenib), known its can be in conjunction with the activity that suppresses PDGFR α; Fig. 1 c is the experiment of biotin-avidin affinity purification, and the result shows that the DHA of labelling biotin can mutually combine with PDGFR α in the A2780 cell, thereby is come out by affinity purification; Fig. 1 d is that area of computer aided is built with pattern and oppositely butt joint experiment (Computer Assisted Homology modeling and docking), the result shows, dihydroarteannuin (DHA) can be fitted to PDGFR α bag outer end PDGF binding site, simultaneously also can be fitted to it and wrap inner ATP-binding site, block its kinase activator; Fig. 1 e-Fig. 1 f shows that dihydroarteannuin can effectively suppress activity and the protein expression of PDGFR α among PDGFR α positive cell A2780 and the OVCAR3, and little to phosphorylation and the protein level influence of PDGFR β; Fig. 1 g-Fig. 1 i shows that dihydroarteannuin can accelerate the protein degradation of PDGFR α, and this process is the proteasome mediation that ubiquitin relies on. Fig. 2 has shown that arteannuin and derivant thereof have growth and the transfer ability of the ovarian cancer cell that suppresses the PDGFRa positive; Wherein, Fig. 2 a shows, after giving medicine irritation 48h, arteannuin and derivant thereof do not have obvious growth to people's normal ovarian epithelial cell IOSE144 and suppress ability, less for the SK-OV3 cytotoxicity, but A2780 and OVCAR3 for the PDGFRa positive have the ability that suppresses more by force, and wherein the effect of arteannuin and dihydroartemisinine is the most remarkable; Fig. 2 b is the cell migration experiment, the result shows, the low concentration short time is handled (12h) ovarian cancer cell, and arteannuin and derivant thereof can suppress the transfer ability of PDGFRa positive cell A2780 effectively, and do not have obvious inhibition ability for the cell SK-OV3 of PDGFRa feminine gender; Fig. 2 c has shown that the dihydroarteannuin of variable concentrations is to the cyto-inhibition of 5 kinds of cell lines (IOSE144, A2780, OVCAR3, OVCAR5, SK-OV3); Fig. 2 d has shown that the dihydroarteannuin of variable concentrations is to the influence of the cell migration of 3 kinds of cell lines (A2780, OVCAR3, SK-OV3); Fig. 2 e has shown that the dihydroarteannuin of variable concentrations is to the influence of the cell invasion of 2 kinds of cell lines (A2780, OVCAR3). Fig. 3 shows that arteannuin and derivant thereof have growth and the transfer ability of the hepatoma carcinoma cell that suppresses the PDGFRa positive; Wherein, Fig. 3 a shows, in the normal hepatic cell line of people (7702 and LO2) and hepatoma cell line (Hep3B, HepG2,7721,7404, LM3,97L, 97M, Huh-7), has only Hep3B high expressed PDGFRa; Fig. 3 b shows that low concentration dihydroarteannuin (3 μ M) (12h) is in short-term handled the Hep3B cell, can significantly suppress its migration and invasive ability; Fig. 3 c is the cell growth experiment, and the result shows that the Hep3B cell of the PDGFRa positive is more responsive for dihydroarteannuin, and other cells are lower for the dihydroarteannuin sensitivity. Fig. 4 shows that dihydroarteannuin can suppress growth and the transfer of mice original position ovarian cancer model; Wherein, Fig. 4 a demonstration dihydroarteannuin is treated mice, and the malignant progression that suppresses ovarian cancer effectively can be arranged; Fig. 4 b shows, compares with matched group, and the situation of the lung cancer metastasis of dihydroarteannuin treatment group mice reduces greatly, and along with the increase of dose, the treatment situation is more good; The two blue and green artemisin of Fig. 4 c demonstration variable concentrations is treated mice, and the situation that send out in the tumor abdominal cavity (lungs, liver, intestinal) obtains obvious suppression; Fig. 4 d is immunohistochemical experiment, and the result shows that its modality process (EMT) of cell that dihydroarteannuin is handled is inhibited; Fig. 4 e is immunoblot experiment, and the result shows that dihydroarteannuin can effectively suppress expression and the phosphorylation of PDGFRa, and downstream signal path PI3K/AKT and MAPK-ERK are suppressed. Fig. 5 has shown the sensitization of arteannuin and derivant and a line chemotherapeutic; Wherein, to be HepG2 and Hep3B cell handle experiment with arteannuin or dihydroarteannuin individual processing or associating gemcitabine to Fig. 1 a, the result shows, gemcitabine acts on HepG2 and Hep3B cell separately, has certain apoptosis facilitation, arteannuin associating gemcitabine all has the effect of remarkable apoptosis facilitation to HepG2 and Hep3B cell, and two medicine association lists reveal synergism; Fig. 5 b shows, DHA and CBP drug combination had the potentiation facilitation to the OVCAR-3 apoptosis after 24 hours, unite the apoptosis rate that apoptosis rate after 500 μ M CBP (1155%) effect is significantly higher than independent usefulness 1 μ M DHA (266%) or 500 μ M CBP (528%) with the DHA of 1 μ M, and surpassed the apoptosis additive effect of two kinds of chemical compounds, be a kind of potentiation, the A2780 cell has shown additive effect to therapeutic alliance; Fig. 5 c shows, when with the DHA coupling, CBP has significantly suppressed the vigor of ovarian cancer cell, when cellular exposure during in 1 μ M CBP and 1 μ M DHA, the survival rate of A2780 cell has just reduced by 69%, OVCAR-3 cell survival and has then reduced 72%, by contrast, it is more insensitive to treatment that the IOSE144 cell then seems, survival rate had only reduced about 28% when two kinds of medicines all share with 1 μ M; Fig. 5 d is hepatoma carcinoma cell Hep3B and the experiment of HepG2 transplanted tumor in nude mice, the result shows, all has antitumor action in arteannuin and the dihydroarteannuin list medicine body, the cancer suppressing action of dihydroarteannuin is better than arteannuin, arteannuin and dihydroarteannuin all can increase the cancer suppressing action of gemcitabine, associating gemcitabine therapeutic effect is better than single medicine, and especially dihydroarteannuin shows significant chemotherapy sensitization; Fig. 5 e is in ovarian cancer cell A2780 and the experiment of OVCAR3 transplanted tumor in nude mice, the result shows, DHA (dosage be 10 with 25mg/kg) causes A2780 heteroplastic transplantation tumor 24% and 41% growth inhibited (comparing with the matched group of giving normal saline) (P<0.05) respectively, and OVCAR-3 model 14% and 37% tumor growth suppress (P<0.05); Be suppressed 56% (A2780) and 46% (OVCAR-3) only for the treatment group tumor growth of single CBP, drug combination (25mg/kgDHA) group then all produces 70% tumor growth and suppresses (P<0.05) in A2780 and OVCAR-3 animal tumor. Fig. 6 shows the expression of PDGFR α and the relation of ovarian cancer pathology rank and transfering state; Wherein, Fig. 6 a shows, compares with the low level ovarian cancer, and in the high-level ovarian cancer case, the expression of tumor cell and Interstitial cell PDGFR α on every side significantly increases; Fig. 6 b is PDGFR α coloration result, and the result shows that in high-level ovarian cancer case, the expression of PDGFR α significantly increases. The specific embodiment The inventor is through extensive and deep research, find the purposes of arteannuin and derivant thereof, inhibitor or antagonist for the preparation of platelet derived growth factor receptor A (PDGFR α), in addition, arteannuin and derivant thereof can also suppress the activation of PDGFR α tyrosine kinase, the protein stability that suppresses PDGFR α, promote the degraded of the proteasome mediation that PDGFR α ubiquitin relies on, suppress the activation of signal path PI3K/AKT and MAPK/EPK, suppress the growth of PDGFR α positive tumor cell, migration and invasion and attack, the sensitizer that can also be used for the treatment of PDGFR α positive tumor.Finished the present invention on this basis. Term Ovarian cancer Ovarian cancer is grave danger of global WomanHealth.In the U.S., ovarian cancer has become women's cancer of the 4th lethal.Though diagnosed 5 annual survival rates of sending out ovarian cancer patients early stage in disease can reach 80%-90%, be diagnosed as the ovarian cancer patients survival rate in late period but only less than 25%, in addition, most of ovarian cancer patients are that ovarian cancer is to late period diagnosing out.The mortality rate many decades in the past of ovarian cancer patients does not have to take place too big change at present, therefore in oncotherapy and prognosis, seek effective therapeutic scheme, strengthening tumor cell is research worker and clinical practice personnel target for a long time to the sensitivity of chemotherapeutics and the drug resistance that overcomes tumor. Hepatocarcinoma Hepatocarcinoma is one of modal malignant tumor, and China is the district occurred frequently of hepatocarcinoma, and its sickness rate has risen to second of malignant tumor.Because the early hepatocarcinoma symptom is not obvious, during therefore the most patient of making a definite diagnosis has been in, late period.The first-selection treatment of primary hepatocarcinoma is excision, and along with the raising for the treatment of technology, 5 years survival rates of postoperative have been increased to 50%-60% at present, but because an excision application diameter is no more than 5cm, the cancer number is no more than 3 small liver cancer.In addition, whether be fit to blood vessel enrichment degree and the individual patient difference that direct excision also depends on the cancer position, these restrictions cause the hepatocarcinoma about 90% to be not suitable for operative treatment.Even can excise hepatocarcinoma, it is that main comprehensive therapy also is necessary that postoperative implements to get involved chemotherapy.Yet at present, rarely have medicine can effectively suppress the growth of hepatocarcinoma and further deterioration, hepatocarcinoma is low to the response rate of traditional chemotherapeutics, the toxic and side effects highly significant, so the slow development of chemotherapy is the main cause of restriction antitumor drug clinical practice.Therefore for chemotherapy of tumors, press for and seek better chemical-therapy synergistic agent and better therapeutic scheme, thereby improve tumor to the sensitivity of chemotherapy, reduce it to the drug resistance of chemotherapy. Platelet derived growth factor and receptor thereof Platelet derived growth factor (Platelet derived growth factor, PDGF) be that a class can be synthesized the somatomedin of justacrine in the extracellular matrix, have cell division, propagation, the migration of multiple tissues such as promoting fibrocyte, smooth muscle cell, the ability of sticking of increase cell, in people's fetal development and normal physiological activity, bringing into play important effect.PDGF activates platelet derived growth factor receptor (PDGFR) with autocrine and paracrine form and plays a role. PDGFR comprises tyrosine kinase receptor PDGFR α and the PDGFR β of two kinds of similar, and wherein the abnormal activation of PDGFR α and multiple disease are closely related, and particularly, the PDGFR relevant disease can be divided three classes: 1. tumor Because PDGFR (particularly PDGFR α) is present in the kinds of tumors, it may be as a new treatment target spot.The generation that has been found that kinds of tumors is relevant with the excessive activation of PDGFR (particularly PDGFR α), as ovarian cancer, glioma, carcinoma of prostate; In addition, in some tumors, exist the sudden change of PDGFR to activate, as the chronic myeloid leukemia of dermatofibrosarcoma protuberans, gastrointestinal stromal tumor, Bcr-Abl feminine gender, hypereosinophilic syndrome etc. 2. vascular conditions Discover, PDGF and PDGFR etc. exist overexpression and excessive activation phenomenon in multiple vascular conditions, as atherosclerosis and restenosis, pulmonary hypertension, retinal vasculopathy etc., the symptom of above-mentioned disease can be effectively alleviated in the activation that suppresses the PDGFR signal path, increases its therapeutic effect. 3. fibrous lesions The PDGF-PDGFR signal path plays an important role in multiple fibrous lesions process, as pulmonary fibrosis, hepatic fibrosis and liver cirrhosis, skin fiber hypertrophy (scleroderma), renal fibrosis, myocardial fibrosis etc., wherein the propagation of the Interstitial cell of PDGF-PDGFR signal path mediation is the common trait of this chronic inflammatory disease. In the above-mentioned three class diseases, the PDGF-PDGFR signal path plays an important role, and wherein PDGFR β has mainly mediated the vascular system pathological changes, and PDGFR α has mainly mediated the pathological changes of Interstitial cell and fibroblast driving.(Johanna Andrae, et al.Role of platelet-derived growth factors in physiology and medicine, Genes Dev.2008; 22:1276-1312; Zhang Xiuhua etc., platelet derived growth factor receptor and tumor. life sciences, Vol.18, No.3 Jun., 2006) Arteannuin and derivant thereof Artemisinine is the sesquiterpene lactones medicine that peroxy-radical is arranged that extracts from the Chinese medicine Artemisia annua L., because arteannuin is complicated macromole, chemical total man worker is difficult to synthetic, therefore mainly is biosynthesis and artificial the extraction at present. The biosynthesis of sesquiterpenoidss such as arteannuin carries out in Cytoplasm, approach belongs to Plant Isoprenoid Metabolic Pathway, can be divided into three goes on foot greatly: form FPP by acetic acid, synthetic sesquiterpene, formation arteannuin again lactonizes, be specially: FPP → 4,11-diene sesquiterpene → artelinic acid → dihydroartemisinic acid → dioxy artelinic acid peroxide → arteannuin. The chemical formula of the artemisinin derivative that arteannuin and this area are several frequently seen is as follows: The application of arteannuin and derivant thereof The invention provides arteannuin and derivant thereof for the preparation of the inhibitor of platelet derived growth factor receptor A (PDGFR α) or the purposes of antagonist. In another preference, arteannuin and derivant thereof also are used for: (i) activation of inhibition PDGFR α tyrosine kinase; And/or The protein stability that (ii) suppresses PDGFR α; And/or (iii) promote the degraded of the proteasome mediation that PDGFR α ubiquitin relies on; And/or (vi) suppress the activation of PDGFR α positive tumor cell signal path PI3K/AKT and MAPK/EPK; And/or (v) suppress growth, migration and the invasion and attack of PDGFR α positive tumor cell; And/or (vi) preparation suppresses medicine or the sensitizer of PDGFR α positive tumor; And/or (vii) medicine or the sensitizer of vascular conditions and fibrous lesions treated in preparation. In a preference of the present invention, provide a kind of external non-therapeutic ground to suppress the active method of platelet derived growth factor receptor A (PDGFR α), comprise step: with arteannuin and/or artemisinin derivative and cells contacting, thus platelet derived growth factor receptor A (PDGFR α) in inhibition or the antagonism cell. Described contact is in the presence of arteannuin and/or artemisinin derivative, cultivates described cell.Cell comprises tumor cell, preferably comprises PDGFR α positive tumor cell, more preferably comprises the positive ovarian cancer cell of PDGFR α or hepatoma carcinoma cell, as ovarian cancer cell A2780, ovarian cancer cell OVCAR3, hepatoma carcinoma cell Hep3B.In another preference, described method also is used for following at least a kind of application: external non-therapeutic ground suppresses the activation of PDGFR α tyrosine kinase; External non-therapeutic ground suppresses the protein stability of PDGFR α; External non-therapeutic ground promotes the degraded of the proteasome mediation that PDGFR α ubiquitin relies on; External non-therapeutic ground suppresses the activation of signal path PI3K/AKT and MAPK/EPK; Growth with external non-therapeutic inhibition PDGFR α positive tumor cell. The present invention also provides a kind of method of the PDGFR of preventing and/or treating alpha associated disorders, wherein said disease is relevant with expression excessively or the hyperactivity of PDGFR α, described method comprises step: use arteannuin and/or artemisinin derivative for the object of needs, or use the pharmaceutical composition that contains arteannuin and/or artemisinin derivative.The PDGFR alpha associated disorders comprises tumor (PDGFR α positive tumor), as ovarian cancer or hepatocarcinoma.In another preference, described using comprises: in the tumor, intravenous injection, oral tablet, lumbar injection etc.Described object is mammal (as the people). Medicament composition and application thereof The present invention also provides medicament composition, and in a preference, described preparation combination comprises: (I) contain the preparation of arteannuin and/or artemisinin derivative; (II) contain the preparation of gemcitabine or carboplatin, The combination of described preparation for the preparation of: (a) suppress pharmaceutical composition or the medicine box of platelet derived growth factor receptor A; Or (b) prevent and/or treat pharmaceutical composition or the medicine box of tumor. Described preparation comprises tablet, capsule, suppository, injection; Described pharmaceutical preparation is used for prevention and treatment PDGFR α positive tumor. Medicament composition of the present invention can be solid or liquid.But solid preparation comprises powder, tablet, pill, capsule, cachet, suppository and dispersible granule, and solid carrier can be one or more materials, and they can be used as diluent, correctives, adhesive, antiseptic, tablet disintegrant or coating material.In powder, carrier is the solid of fine branch, and the active constituent of chemical compound of the present invention and fine branch is present in the mixture.In tablet, this chemical compound mixes with proper proportion with required bonding carrier, and is pressed into required shape and size.Preferentially contain 5 to 70% reactive compounds in powder and the tablet, suitable carrier is magnesium carbonate, magnesium stearate, Talcum, sugar, lactose, pectin, dextrin, starch, gelatin, carboxymethyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, low melting point is cured and cocoa butter etc.Equally, cachet or lozenge, tablet, powder, capsule, pill, cachet and lozenge can be the solid dosage formss that is suitable for oral administration.In order to prepare suppository, can be with the mixture melt of the cured butter oil acid glyceride of low melting point or cocoa butter, and by stirring this reactive compound component is evenly dispersed in wherein, the homogeneous mixture of fusing is poured into allowed its cooling in the sizeable mould then, and solidify thus.The preparation of solution form comprises solution, suspending agent and Emulsion, for example water or aqueous propylene glycol solution.For non-intestinal injecting fluid preparation, can in moisture polyglycol solution, prepare.Being suitable for oral aqueous solution can be by being dissolved in the water active constituent, and adds suitable coloring agent, correctives, emulsifying agent and thickening agent preparation as required.Be suitable for oral aqueous suspensions and can be scattered in by the active constituent with fine branch in the moisture stickum and prepare, as natural or rubber polymer, resin, methylcellulose, Carboxymethyl cellulose sodium and other suspensoids of knowing.These liquid forms comprise solution, suspensoid and Emulsion, and except active constituent, these preparations can contain coloring agent, correctives, stabilizing agent, buffer agent, synthetic or natural sweetener, dispersant, thickening agent and cosolvent etc.This pharmaceutical preparation preferentially is unit dosage forms, in this dosage form, this preparation is subdivided into the unit dose that contains an amount of active constituent, and this unit dose can be the preparation of packing, this packing contains a certain amount of preparation, as tablet, capsule and the powder in bottle or capsule of packing.This unit dosage forms can also be capsule, tablet, cachet or lozenge itself, or can there be any of these powder of the right quantity in the packaged form in it. The amount of active constituent can change according to the effectiveness of concrete application and active constituent in the unit dose formulations, treat for non-human mammal (as mice), can be with 0.01mg to about 0.5g, preferably 0.1 to about 3mg capsule is administered three times every day, and said composition can also contain other compatible therapeutic agents in case of necessity.Treatment for the people, can be according to patient's needs, changed by the chemical compound of sanatory seriousness and use, preferably, beginning is with the smaller dose treatment less than this chemical compound optimal dose, after this, increasing this dosage reaches optimum efficiency in a small amount, for the purpose of making things convenient for, total daily dose can be subdivided into again gradation administration in a day if desired.In a preference of the present invention, the dosage of administration of human is approximately between the 0.1/kg-0.5g/kg. Major advantage of the present invention: (1) arteannuin and derivant thereof can be for the preparation of inhibitor or the antagonisies of platelet derived growth factor receptor A (PDGFR α); (2) arteannuin and derivant thereof can suppress growth, migration and the invasion and attack of the activation of PDGFR α tyrosine kinase, the protein stability of PDGFR α, the activation that suppresses signal path PI3K/AKT and MAPK/EPK, inhibition PDGFR α positive tumor cell; (3) arteannuin and derivant thereof can promote the degraded of the proteasome mediation that PDGFR α ubiquitin relies on; (4) arteannuin and derivant thereof can be used for the sensitizer of PDGFR α positive tumor treatment. Below in conjunction with specific embodiment, further set forth the present invention.Should be understood that these embodiment only to be used for explanation the present invention and be not used in and limit the scope of the invention.The experimental technique of unreceipted actual conditions in the following example, usually according to people such as normal condition such as Sambrook, molecular cloning: laboratory manual (New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) condition described in, or the condition of advising according to manufacturer. Experimental technique and material 1. surface plasma resonance Surface plasma resonance (SPR) is a kind of optical phenomena, can be used to real-time tracking interaction between biomolecule under native state.In the experiment, with recombined human PDGFR α born of the same parents outer ends (Met1-Glu524) albumen, be bonded in biosensor surface, with the dihydroarteannuin solution of variable concentrations with have interactional chemical compound Suo Lafeini and SU11248 solution to inject and the biosensor surface of flowing through with PDGFR α always.Combination between biomolecule causes the increase of biosensor surface quality, causes refractive index to strengthen in same ratio, and the variation of reacting between biomolecule namely is observed, and this reaction is weighed with reacton (RU). 2. cell culture The non-tumorigenic epithelial cell IOSE-144 of people's ovary immortalization and ovarian cancer cell (A2780, OVCAR-3, SK-OV3, OVCAR-5) available from U.S. ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA).All cells requires (RPMI-1640 or DMEM culture fluid add 10% hyclone (GIBCO), 100IU/ml penicillin, 100IU/ml streptomycin) to cultivate in 37 ℃ of incubators of 5%CO2 according to the cultivation of ATCC. 3. cell growth inhibition test Cell growth and propagation inhibition test are by the CCK-8 measuring.Cell with the density cover plant in 3 * 103 every holes of cell in 96 orifice plates.After 12~18 hours, after handling 48 hours with the artemisine compounds of finite concentration gradient (0,1,5,10,25 μ M), add the cells growth activity evaluation after 10 μ L CCK-8 solution carry out drug treating in the every hole of 96 orifice plates, experiment is last by microplate reader (SpectraMax190microplate reader; Molecular Devices, the USA) light absorption (OD value) at measurement 450nm place (every experimental concentration arranges three multiple holes at least, tests triplicate at least at every turn). 4. cell migration, invasion and attack experiment The migration of ovarian cancer cell and invasive ability are by the transwell measuring, the low concentration artemisinin derivative short time (12h) is handled ovarian cancer cell, cell (5 * 104) with similar number is resuspended in the culture medium of serum-free then, plantation is in transwell (when measuring the invasive ability of cell, transwell spreads matrigel in the upper strata) upper strata culturing room.With 10% hyclone culture medium as chemical chemoattractant.Approximately behind the 8-12h, Qian Yi cell is not wiped with cotton swab, the cell of migration is fixed dyeing, and carry out statistical analysis. 5.SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and protein immunoblot analysis DHA with variable concentrations handled cultured cell 24 hours, and collecting cell is also used cell pyrolysis liquid (RIPA buffer #9806, Cell Signaling) cracking.Change in 4 ℃ of centrifugal 15min with 13,000 afterwards, get supernatant and carry out follow-up analyzing and testing.Protein concentration is by test kit (the protein assay kit of Bio-Rad company; Hercules, CA) quantitative Tot Prot.Equal protein is carried out the separation of SDS-PAGE gel electrophoresis on every hole afterwards.Electrophoresis finishes, with the electrophoresis protein band be transferred to the pvdf membrane that methanol activated (Millipore, Bedford, MA) on.After the commentaries on classics film finishes, film seals with 5% skim milk (PBS dissolving), add primary antibodie and two anti-hatching (the BSA configuration with 5%) then, change with albumen development test kit (ECL plus system, Amersham Pharmacia Biotech) development by the protein band differential expression afterwards and analyze. 6. mice original position ovarian cancer heteroplastic transplantation tumor model body internal therapy experiment The female BALB/c (nu/nu) in four to six ages in week and raises in SPF level Animal House in accordance with regulations available from Shanghai Slac Experimental Animal Co., Ltd. (Shanghai Experimental Animal Center).All zoopery operations all obtain the approval of animal Ethics Committee of nutrition institute of the Chinese Academy of Sciences.。General steps is as follows: with the A2780 cell of luciferase labelling, be resuspended in RPMI 1640 culture medium of serum-free.Lumbar injection equivalent cell (~3 * 106 cells/0.2ml) is in the inside, abdominal cavity of mice then.Utilize IVIS Lumina bioluminescence system to monitor the growth of tumor situation in real time, and the body weight of record mice.Inject after 5 days, during according to the fluorescence intensity of tumor mice is divided into treatment group and matched group (every group of 8 mouse).Treatment group medicine DHA be dissolved in Oleum Ricini, ethanol and normal saline mixture (Cremophor EL: Ethanol: Saline=5: 5: 90, v/v/v) in, all medicines all pass through intraperitoneal administration.The dosage of DHA is 10 or the 25mg/kg body weight, and administration frequency is administration every day, rests weekly two days.The matched group injecting normal saline.In therapeutic process, utilize the living imaging system to monitor the growth of tumor situation in real time.After treatment finished, the careful taking-up moved abdominal tumor (removing fat and connective tissue), with PIPA solution (the 100mg tissue adds 1ml RIPA) homogenate.The tumor tissues homogenate liquid that obtains is analyzed requirement of experiment by above-mentioned protein immunoblot and is handled, and carries out protein immunoblot afterwards and detects; Or tumor tissues fixed and immunostaining. Embodiment 1 Arteannuin and derivant thereof suppress its phosphorylation activity directly in conjunction with PDGFR α, promote its degraded Utilize the experiment of PDGFR α vitro kinase, surface plasma resonance, area of computer aided are built with pattern and oppositely advanced persons such as equimolecular pharmacology and biophysics are tested in butt joint biology techniques and means, confirm that artemisinin derivatives can be directly in conjunction with PDGFR α, the receptor tyrosine kinase activity that suppresses PDGFR α, discover that simultaneously dihydroarteannuin can suppress the protein stability of PDGFR α in the PDGFR α positive cell, promote the degradation process that its ubiquitin relies on. Fig. 1 shows that arteannuin and derivant thereof can be directly in conjunction with PDGFR α, and PDGFR α is as the direct target of arteannuin and derivant effect thereof, and can suppress its phosphorylation activity, promotes its degraded.Vitro kinase experiment shows arteannuin and derivant thereof: arteannuin (ART), dihydroartemisinine (DHA), artesunate (ARM), Artemether (ARS) can suppress the activity of born of the same parents the inner (aa550-end) tyrosine kinase of PDGFR α (Fig. 1 a).Surface plasma resonance (SPR) experiment shows that dihydroarteannuin (DHA) can mutually combine with PDGFR α bag outer end (aa24-524) albumen, and Suo Lafeini (Sorafenib) is as positive control, known can be in conjunction with the activity (Fig. 1 b) that suppresses PDGFR α.The DHA of biotin-avidin affinity purification experiment show tags biotin can mutually combine with PDGFR α in the A2780 cell, thereby is come out (Fig. 1 c) by affinity purification.Area of computer aided is built and is oppositely docked experiment (Computer Assisted Homology modeling and docking) experiment and shows that dihydroarteannuin (DHA) can be fitted to PDGFR α bag outer end PDGF binding site with pattern, simultaneously also can be fitted to it and wrap inner ATP-binding site, block its kinase activator (Fig. 1 d).Fig. 1 e-Fig. 1 f has shown that dihydroarteannuin can effectively suppress activity and the protein expression of PDGFR α among PDGFR α positive cell A2780 and the OVCAR3, and little to phosphorylation and the protein level influence of PDGFR β.Fig. 1 g-Fig. 1 i experiment shows that dihydroarteannuin can accelerate the protein degradation of PDGFR α, and this process is the proteasome mediation that ubiquitin relies on. Embodiment 2 Arteannuin and derivant thereof suppress growth and the transfer of the tumor cell of the PDGFR α positive Utilize nude mice original position ovarian cancer heteroplastic transplantation tumor model, research dihydroarteannuin ovarian cancer resistance activity in animal body.The Proliferation of Human Ovarian Cell A2780 of luciferase labelling is injected into the abdominal cavity of Balb-c nude mice, sets up the former bit model of nude mice ovarian cancer, give the dihydroarteannuin treatment then: matched group (normal saline), low dose group (DHA 10mg/kg).High dose group (DHA 25mg/kg) is treated weekly five times, rests two days, gives for 6 treatment times in week altogether.Utilize growth and the transfer case of living imaging systematic observation mouse ovarian cancer during this time. A series of researchs by cellular level and animal level, show that artemisinin derivatives can suppress growth, migration and the invasion and attack (ovarian cancer and hepatocarcinoma) of the tumor cell of the PDGFR α positive effectively, and less for the inhibition ability of the growth of tumour cell of PDGF-B expression R α not and transfer ability.Concrete outcome is as follows: Fig. 2 shows that arteannuin and derivant thereof suppress growth and the transfer ability of the ovarian cancer cell of the PDGFRa positive.Particularly, shown in Fig. 1 e and Fig. 2 a, PDGFRa is at ovary normal cell epithelial cell IOSE144, and ovarian cancer cell SK-OV3 does not have among the OVCAR5 and expresses high expressed in ovarian cancer cell A2780 and OVCAR3; After giving medicine irritation 48h, the arteannuin of variable concentrations and derivant people normal ovarian epithelial cell IOSE144 thereof do not have obvious growth and suppress ability, less for the SK-OV3 cytotoxicity, but A2780 and OVCAR3 for the PDGFRa positive have the ability that suppresses more by force, and wherein the effect of arteannuin and dihydroartemisinine is the most remarkable.The cell migration experiment show lower concentration short time is handled (12h) ovarian cancer cell, arteannuin and derivant thereof can suppress the transfer ability of PDGFRa positive cell A2780 effectively, and do not have obvious inhibition ability (Fig. 2 b) for the cell SK-OV3 of PDGFRa feminine gender.Dihydroarteannuin suppresses the most obviously (Fig. 2 c-Fig. 2 e) for growth and the migration invasive ability of PDGFRa positive cells in the artemisinin derivative. Also obtained similar result in the hepatoma carcinoma cell, Fig. 3 shows that arteannuin and derivant thereof can suppress growth and the transfer ability of the hepatoma carcinoma cell of the PDGFRa positive.Particularly, numerous people's normal liver cells (7702 and LO2) and hepatoma cell line (Hep3B, HepG2,7721,7404, LM3,97L, 97M, Huh-7) in, (Fig. 3 is a) for Hep3B high expressed PDGFRa; Low concentration dihydroarteannuin (3 μ M) (12h) processing Hep3B cell in short-term can significantly suppress its migration and invasive ability (Fig. 3 b); The cell growth experiment shows that simultaneously the Hep3B cell of the PDGFRa positive is more responsive for dihydroarteannuin, and express on other PDGFRa ground and the hepatoma carcinoma cell of not having an expression for dihydroarteannuin sensitivity lower (Fig. 3 c). Zoopery assessment result (Fig. 4) shows, dihydroarteannuin has an inhibition ability for the growth of PDGFRa positive cell A2780 and transfer.Particularly, (Fig. 4 a) after two blue and green artemisins are treated the malignant progression that suppresses ovarian cancer effectively; Compare with the contrast group, the situation for shifting that gives dihydroarteannuin treatment group mice reduces greatly, and the situation that send out in the tumor abdominal cavity also obtains obvious suppression (Fig. 4 b, Fig. 4 c); SABC and immunoblot experiment show simultaneously, dihydroarteannuin can suppress expression and the phosphorylation of PDGFRa effectively, downstream signal path PI3K/AKT and MAPK-ERK are suppressed, matter modality process (EMT) be inhibited (Fig. 4 d, Fig. 4 e) between epithelium. Embodiment 3 The sensitization of arteannuin and derivant thereof and a line chemotherapeutic The external independent application of arteannuin and dihydroarteannuin all can significantly suppress growth, propagation and the migration invasive ability of ovarian cancer and hepatoma carcinoma cell.Whether present embodiment has the chemotherapy sensitizing effect to it is detected, arteannuin and dihydroarteannuin are united gemcitabine respectively and are acted on human liver cancer cell HepG2 and Hep3B, and the associating carboplatin acts on the inhibitory action of ovarian cancer A2780 and OVCAR3 observation drug combination cell growth.Result (Fig. 5) is as follows: HepG2, the Hep3B cell is with 10 μ mol/L arteannuin or dihydroarteannuin individual processing or unite 10 μ g/L gemcitabines processing 48 hours, carries out the apoptosis detection by quantitative as stated above.Particularly, gemcitabine list medicine acts on HepG2, and the Hep3B cell demonstrates certain apoptosis facilitation, and (Fig. 5 a), arteannuin associating gemcitabine is to HepG2, the Hep3B cell has the effect of remarkable apoptosis facilitation, and two medicine association lists reveal synergism, and (Fig. 5 a).DHA and CBP drug combination had potentiation facilitation (Fig. 5 b) to the OVCAR-3 apoptosis after 24 hours; Unite the apoptosis rate that apoptosis rate after 500 μ M CBP (1155%) effect is significantly higher than independent usefulness 1 μ M DHA (266%) or 500 μ M CBP (528%) with 1 μ M DHA, and surpassed the apoptosis additive effect of two kinds of chemical compounds, what demonstrate is a kind of potential potentiation.Yet what the A2780 cell showed therapeutic alliance is additive effect rather than synergy.This may be because their causes lower to the sensitivity of DHA chemical compound (Fig. 5 b, P<0.05).The effect of longer time may produce better effect.Aspect the inhibition of cell proliferation vigor, when with the DHA coupling, CBP has suppressed the vigor of ovarian cancer cell very significantly.In fact, when cellular exposure during in the DHA of 1 μ M CBP and 1 μ M, the survival rate of A2780 cell has reduced by 69%, OVCAR-3 cell survival and has then reduced 72%.By contrast, it is more insensitive to treatment that the IOSE144 cell then seems, survival rate had only reduced about 28% (Fig. 5 c) when two kinds of medicines all share with 1 μ M. Cell experiment proof arteannuin and dihydroarteannuin all demonstrate for gemcitabine external, and carboplatin is handled killing and wounding and apoptosis-induced sensitization of cancerous cell.In addition, the transplanted tumor in nude mice experiment proves that further they are effective too for the chemotherapy of in-vivo tumour.Particularly, show in hepatoma carcinoma cell Hep3B and the experiment of HepG2 transplanted tumor in nude mice, all to have antitumor action in arteannuin and the dihydroarteannuin list medicine body as Fig. 5 d, the cancer suppressing action of dihydroarteannuin is better than arteannuin.Arteannuin and dihydroarteannuin all can increase the cancer suppressing action of gemcitabine, and associating gemcitabine therapeutic effect is better than single medicine, and especially dihydroarteannuin shows significant chemotherapy sensitization.In ovarian cancer cell A2780 and the experiment of OVCAR3 transplanted tumor in nude mice (Fig. 5 e), DHA (dosage be 10 with 25mg/kg) causes A2780 heteroplastic transplantation tumor 24% and 41% growth inhibited (comparing with the matched group of giving normal saline) (P<0.05) respectively, and OVCAR-3 model 14% and 37% tumor growth suppress (P<0.05); Be suppressed 56% (A2780) and 46% (OVCAR-3) only for the treatment group tumor growth of single CBP.Drug combination (25mg/kg DHA) group then all produces 70% tumor growth and suppresses (P<0.05) in A2780 and OVCAR-3 animal tumor. Above cell and the experiment of animal level show, arteannuin and derivant thereof have the sensitization of good independent chemotherapy and associating one linearize treatment medicine, in conjunction with the artemisine derivative compound directly targeting PDGFRa bring into play this result of its anti-tumor activity, the prompting artemisinin-based drug can be used for clinical associating multiclass chemotherapeutics and treat tumour patient, and especially pathological diagnosis is the tumour patient of the PDGFRa positive Embodiment 4 PDGFR α is with pathological grading and shift relevant Present embodiment according to the clinical pathology diagnostic message strictness chosen 45 routine ovarian cancer patients' pathology sample, comprising 21 routine low level ovarian cancers (the clinical case rank is I-II, and moderate or highly differentiation do not have tangible lymph node, transfers such as abdominal cavity and nethike embrane); 24 routine high-level ovarian cancer patients (the clinical case rank is III-IV, and low differentiation has large-area lymphatic metastasis, abdominal cavity, nethike embrane, uterus, adnexa and other organ metastasis). The result shows (see figure 6), compares with the low level ovarian cancer, and in the high-level ovarian cancer case, the expression of tumor cell and Interstitial cell PDGFR α on every side significantly increases.Cell experiment shows, utilizes the gene perturbation technique of slow virus mediation that silence is carried out in the expression of PDGFR α among ovarian cancer cell A2780 and the OVCAR3, finds that the growth of tumor cell and migration invasive ability significantly reduce. Embodiment 5 Preparation of drug combination Compositions 1 Compositions 2 Discuss Existing discovery shows, PDGFR gene mutation or excessive activation can promote the transformation ability and then cause the generation of malignant tumor, as gastrointestinal stromal tumors (GISTs), and pulmonary carcinoma, carcinoma of prostate and breast carcinoma.Somatomedin such as PDGFR is combined the degraded that improves the iuntercellular adhesion molecule with its part, promote invasion by tumor cells and transfer, can also activate the VEGF in the microenvironment simultaneously, FGF and then promote angiogenesis have accelerated the malignant progression process of tumor.Zoopery and Clinical pathological study find that PDGFR α overexpression and activation have participated in generation and the evolution of ovarian cancer, with patient's pathology rank and poor prognosis significant correlation. Content of the present invention shows, compare with ovarian cancer patient's pathological tissue that low level shifts, the expression of PDGFR α significantly increases in extensive its cancerous cell of ovarian cancer patient that shifts of high-level generation and the mesenchyma stroma of tumors cell, this just shows that PDGFR α can be used as a target spot of ovarian cancer treatment. Find artemisinin derivatives among the present invention, especially arteannuin and dihydroarteannuin can directly be attached in the PDGFRa molecule, have both suppressed the receptor tyrosine kinase activity of PDGFRa, suppress the protein stability of PDGFRa again, promote its ubiquitin degraded. Molecule and zoopery show that the medicine of artemisine can be by suppressing multiple growth of tumor, migration and the invasive ability that PDGFRa and then inhibition comprise ovarian cancer and hepatocarcinoma.This result shows that artemisinin-based drug can be used as a kind of special inhibitor of PDGFR, is used for the tumour patient of PDGFRa sudden change clinically or excessive activation, comprises ovarian cancer, hepatocarcinoma, gastrointestinal stromal tumors (GISTs), acute leukemia etc.Artemisinin derivatives also has good anticancer sensitizing activity, for example artemisinin-based drug can significantly improve a line chemotherapeutic carboplatin, gemcitabines etc. are for the therapeutic effect of ovarian cancer and hepatocarcinoma, especially dihydroarteannuin has stronger chemotherapy sensitization to carboplatin and gemcitabine, its characteristics of high efficiency and low toxicity makes it to be expected to as chemotherapeutic sensitizer, is applied to the clinical combined chemotherapy of tumor. All quote in this application as a reference at all documents that the present invention mentions, just quoted as a reference separately as each piece document.Should be understood that in addition those skilled in the art can make various changes or modifications the present invention after having read above-mentioned teachings of the present invention, these equivalent form of values fall within the application's appended claims institute restricted portion equally.    
    Claims (10) Hide Dependent    1. arteannuin and derivant thereof are for the preparation of suppressing to be selected from down the medicine of group disease or the purposes of medicine sensitizer: PDGFR α positive tumor, vascular conditions or fibrous lesions. 2. the purposes of an arteannuin and derivant thereof is characterized in that, for the preparation of inhibitor or the antagonist of platelet derived growth factor receptor A (PDGFR α).   3. purposes as claimed in claim 2 is characterized in that, described inhibitor or antagonist also are used for: (i) activation of inhibition PDGFR α tyrosine kinase; And/or The protein stability that (ii) suppresses PDGFR α; And/or (iii) promote the degraded of the proteasome mediation that PDGFR α ubiquitin relies on; And/or (vi) suppress the activation of PDGFR α positive tumor cell signal path PI3K/AKT and MAPK/EPK.   4. as the arbitrary described purposes of claim 1-2, it is characterized in that described artemisinin derivative is selected from down group: Artemether, dihydroartemisinine, artesunate, two hydrogen Artemether, arteether etc. 5. an external non-therapeutic ground suppresses the active method of platelet derived growth factor receptor A (PDGFR α), it is characterized in that, comprise step: with arteannuin and/or artemisinin derivative and cells contacting, thus platelet derived growth factor receptor A (PDGFR α) in inhibition or the antagonism cell. 6. the purposes of preparation combination, described preparation combination comprises: (I) contain the preparation of arteannuin and/or artemisinin derivative; With (II) contain the preparation of gemcitabine or carboplatin, It is characterized in that, the combination of described preparation for the preparation of: (a) pharmaceutical composition or the medicine box of inhibition platelet derived growth factor receptor A; Or (b) prevent and/or treat pharmaceutical composition or the medicine box of tumor.   7. purposes as claimed in claim 6 is characterized in that, described tumor is PDGFR α positive tumor. 8. method that prevents and/or treats the PDGFR alpha associated disorders, wherein said disease is relevant with expression excessively or the hyperactivity of PDGFR α, it is characterized in that, comprise step: use arteannuin and/or artemisinin derivative for the object of needs, or use the pharmaceutical composition that contains arteannuin and/or artemisinin derivative. 9. method, described method is used in the body or growth, migration and the invasion and attack of the activation of vitro inhibition PDGFR α tyrosine kinase, the protein stability of inhibition PDGFR α, the degraded that promotes the proteasome mediation that PDGFR α ubiquitin relies on, the activation that suppresses signal path PI3K/AKT and MAPK/EPK and/or inhibition PDGFR α positive tumor cell, it is characterized in that described method comprises step: use arteannuin and/or artemisinin derivative for the object of needs. 10. a test kit that is used for the ovarian cancer pathological grading is characterized in that, described test kit comprises the reagent that detects in vitro tissue PDGFR alpha expression amount.   Patent Citations (1)
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    青蒿素及其衍生物在抑制血小板衍生生长因子受体A中的作用及其应用 技术领域 本发明涉及生物医药领域,具体地,本发明涉及青蒿素及其衍生物在抑制血小板衍生生长因子受体A中的作用及其应用。 背景技术 青蒿又名黄花蒿(Artemisia anaua L),属菊科,是一年生草本植物。青蒿素是我国药学工作者于20世纪70年代初从中药青蒿中提取的倍半萜内酯类抗疟药物。鉴于传统的奎宁类药物普遍遇到抗药性问题,青蒿素和它的衍生物目前已取代它们,成为世界上抗疟疾的主流药物。青蒿素的大环上有一个内过氧化物桥,在亚铁离子或亚铁血红素的催化下,会放出以碳为中心的自由基。细胞内的蛋白质和核酸被这些自由基烷化后死亡。疟原虫寄生在红血球内,含有大量来自血红蛋白的亚铁血红素,因而青蒿素很易被活化,进而将疟原虫杀死。青蒿素和它的衍生物,如二氢青蒿素,蒿甲醚,蒿乙醚及青蒿琥酯等已广泛应用于疟疾治疗,更多的青蒿素衍生物正在研制中。 青蒿素及其衍生物的抗疟活性已得到世界公认,具有起效快、药效高、毒副作用低等优点。除广泛应用于抗疟治疗外,青蒿素类药物还具有其它多种药理作用,如抗血吸虫作用、抗心律失常、平喘、抗内毒素、抗变态反应、抗红斑狼疮、免疫抑制等作用。 随着对青蒿素及其衍生物活性研究的不断深入,人们发现,该类化合物对多种肿瘤细胞的生长具有抑制作用和良好的治疗效果,然而,其具体作用靶点及相关信号通路及作用机制还不明确。因此本领域迫切需要了解青蒿素及其衍生物在一直肿瘤中的作用。 发明内容 本发明的目的是提供青蒿素及其衍生物在抑制血小板衍生生长因子受体A中的作用。 本发明的另一目的是提供青蒿素及其衍生物作为血小板衍生生长因子受体A抑制剂/拮抗剂的应用。 本发明的另一目的是提供体外治疗肿瘤的方法。 在本发明的第一方面,提供了一种青蒿素及其衍生物用于制备抑制选自下组疾病的药物或药物增敏剂的用途:PDGFRα阳性肿瘤、血管性疾病、或纤维性病变。 在另一优选例中,所述的PDGFRα阳性肿瘤细胞为PDGFRα阳性卵巢癌细胞或PDGFRα阳性肝癌细胞。 在本发明的第二部分,提供了一种青蒿素及其衍生物的用途,用于制备血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)的抑制剂或拮抗剂。 在另一优选例中,所述的血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)来自于人。 在另一优选例中,所述的抑制剂或拮抗剂还用于: (i)抑制PDGFRα酪氨酸激酶的活化;和/或 (ii)抑制PDGFRα的蛋白稳定性;和/或 (iii)促进PDGFRα泛素依赖的蛋白酶体介导的降解;和/或 (vi)抑制PDGFRα阳性肿瘤细胞信号通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化。 在另一优选例中,所述的青蒿素衍生物选自下组:蒿甲醚、二氢青蒿素、青蒿琥酯、双氢蒿甲醚、蒿乙醚等。 在另一优选例中,所述的青蒿素衍生物为二氢青蒿素。 在本发明的第三方面,提供了一种体外非治疗性地抑制血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)活性的方法,包括步骤:将青蒿素和/或青蒿素衍生物与细胞接触,从而抑制或拮抗细胞中血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)。 在另一优选例中,所述的接触是在青蒿素和/或青蒿素衍生物存在下,培养所述细胞。 在另一优选例中,所述的细胞包括肿瘤细胞,较佳地包括PDGFRα阳性肿瘤细胞,更佳地包括PDGFRα阳性卵巢癌细胞或肝癌细胞,如卵巢癌细胞A2780、卵巢癌细胞OVCAR3、肝癌细胞Hep3B。 在另一优选例中,所述方法还用于至少以下一种应用: 体外非治疗性地抑制PDGFRα酪氨酸激酶的活化; 体外非治疗性地抑制PDGFRα的蛋白稳定性; 体外非治疗性地促进PDGFRα泛素依赖的蛋白酶体介导的降解; 体外非治疗性地抑制信号通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化;和 体外非治疗性抑制PDGFRα阳性肿瘤细胞的生长。 在本发明的第四方面,提供了一种制剂组合的用途,所述制剂组合包括: (I)含青蒿素和/或青蒿素衍生物的制剂;和 (II)含吉西他宾或卡铂的制剂, 所述制剂组合用于制备: (a)抑制血小板衍生生长因子受体A的药物组合物或药盒;或 (b)预防和/或治疗肿瘤的药物组合物或药盒。 在另一优选例中,所述制剂包括:片剂、胶囊、栓剂、注射剂。 在另一优选例中,所述肿瘤为PDGFRα阳性肿瘤。 在本发明的第五方面,提供了一种预防和/或治疗PDGFRα相关疾病的方法,其中所述疾病与PDGFRα的过表达或活性过高有关,所述方法包括步骤:给需要的对象施用青蒿素和/或青蒿素衍生物,或施用含青蒿素和/或青蒿素衍生物的药物组合物。 在另一优选例中,所述的PDGFRα相关疾病包括肿瘤(PDGFRα阳性肿瘤),如卵巢癌或肝癌。 在另一优选例中,PDGFRα阳性肿瘤为PDGFRα阳性卵巢癌或PDGFRα阳性肝癌。 在另一优选例中,所述的施用包括:瘤内、静脉注射、口服片剂、腹腔注射等。 在另一优选例中,所述的对象为哺乳动物。 在本发明的第六方面,提供了一种方法,所述方法用于体内或体外抑制PDGFRα酪氨酸激酶的活化、抑制PDGFRα的蛋白稳定性、促进PDGFRα泛素依赖的蛋白酶体介导的降解、抑制信号通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化、和/或抑制PDGFRα阳性肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭,所述方法包括步骤:给需要的对象施用青蒿素和/或青蒿素衍生物。 在本发明的第七方面,提供了一种用于卵巢癌病理分级的试剂盒,所述试剂盒包含检测离体组织PDGFRα表达量的试剂。 应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。 附图说明 下列附图用于说明本发明的具体实施方案,而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。 图1显示PDGFRα可以作为青蒿素及其衍生物的直接作用靶标;其中,图1a为体外激酶实验,结果显示,青蒿素及其衍生物青蒿素(ART)、二氢青蒿素(DHA)、青蒿琥酯(ARM)、蒿甲醚(ARS)可以抑制PDGFRα胞内端(aa550-末端)酪氨酸激酶的活性;图1b为表面等离子共振(SPR)实验,结果显示,双氢青蒿素(DHA)可以与PDGFRα包外端(aa24-524)蛋白相互结合,索拉菲尼(Sorafenib)为阳性对照,已知其可以结合抑制PDGFRα的活性;图1c为生物素-亲和素亲和纯化实验,结果显示,标记生物素的DHA可以与A2780细胞内PDGFRα相互结合,从而被亲和纯化出来;图1d为计算机辅助同型模建及反向对接实验(ComputerAssisted Homology modeling and docking),结果显示,双氢青蒿素(DHA)可以嵌合到PDGFRα包外端PDGF结合位点,同时也可嵌合到其包内端ATP结合位点,阻断其激酶激活;图1e-图1f显示双氢青蒿素能够有效抑制PDGFRα阳性细胞A2780和OVCAR3中PDGFRα的活性和蛋白表达,而对PDGFRβ的磷酸化和蛋白水平影响不大;图1g-图1i显示双氢青蒿素可以加速PDGFRα的蛋白降解,这一过程是泛素依赖的蛋白酶体介导的。 图2显示了青蒿素及其衍生物具有抑制PDGFRa阳性的卵巢癌细胞的生长和迁移能力;其中,图2a显示,给予药物刺激48h后,青蒿素及其衍生物对人正常卵巢上皮细胞IOSE144无明显的生长抑制能力,对于SK-OV3细胞毒性较小,但对于PDGFRa阳性的A2780和OVCAR3具有较强抑制能力,其中青蒿素和二氢青蒿素的作用最为显著;图2b为细胞迁移实验,结果显示,低浓度短时间处理(12h)卵巢癌细胞,青蒿素及其衍生物能够有效地抑制PDGFRa阳性细胞A2780的迁移能力,而对于PDGFRa阴性的细胞SK-OV3无明显抑制能力;图2c显示了不同浓度的双氢青蒿素对5种细胞系(IOSE144、A2780、OVCAR3、OVCAR5、SK-OV3)的细胞抑制作用;图2d显示了不同浓度的双氢青蒿素对3种细胞系(A2780、OVCAR3、SK-OV3)的细胞迁移的影响;图2e显示了不同浓度的双氢青蒿素对2种细胞系(A2780、OVCAR3)的细胞侵袭的影响。 图3显示青蒿素及其衍生物具有抑制PDGFRa阳性的肝癌细胞的生长和迁移能力;其中,图3a显示,在人正常的肝细胞系(7702和LO2)和肝癌细胞系(Hep3B、HepG2、7721、7404、LM3、97L、97M、Huh-7)中,只有Hep3B高表达PDGFRa;图3b显示,低浓度双氢青蒿素(3μM)短时(12h)处理Hep3B细胞,能够显著抑制其迁移和侵袭能力;图3c为细胞生长实验,结果显示,PDGFRa阳性的Hep3B细胞对于双氢青蒿素更敏感,而其他细胞对于双氢青蒿素敏感程度较低。 图4显示双氢青蒿素能抑制小鼠原位卵巢癌模型的生长和转移;其中,图4a显示双氢青蒿素给予治疗小鼠,能有有效地抑制卵巢癌的恶性进展;图4b显示,与对照组相比,双氢青蒿素治疗组小鼠的肺癌转移的情况大大降低,且随着药量的增加,治疗情况越好;图4c显示不同浓度的双青青蒿素给予治疗小鼠,肿瘤腹腔播散的情况(肺脏、肝脏、肠)得到明显的抑制;图4d为免疫组化实验,结果显示,双氢青蒿素处理的细胞其形态转换过程(EMT)得到抑制;图4e为免疫印迹实验,结果显示,双氢青蒿素能够有效抑制PDGFRa的表达和磷酸化,下游信号通路PI3K/AKT和MAPK-ERK得以抑制。 图5显示了青蒿素及其衍生物与一线化疗药的增敏作用;其中,图1a为HepG2和Hep3B细胞用青蒿素或双氢青蒿素单独处理或联合吉西他宾处理实验,结果显示,吉西他宾单独作用于HepG2和Hep3B细胞,具有一定的凋亡促进作用,青蒿素联合吉西他宾对HepG2和Hep3B细胞都具有显著凋亡促进作用作用,两药联合表现出协同作用;图5b显示,DHA和CBP联合用药24小时后对OVCAR-3细胞凋亡有增效促进作用,用1μM的DHA联合500μM CBP(1155%)作用后的细胞凋亡率显著高于单独用1μM DHA(266%)或500μM CBP(528%)的细胞凋亡率,而且超过了两种化合物的凋亡累加效应,是一种增效作用,A2780细胞对联合治疗显示了累加效应;图5c显示,当与DHA联用时,CBP显著抑制了卵巢癌细胞的活力,当细胞暴露于1μM CBP和1μM DHA时,A2780细胞的存活率就降低了69%,而OVCAR-3细胞存活则减少了72%,相比之下,IOSE144细胞则显得对治疗较不敏感,两种药物均以1μM合用时存活率只降低了约28%;图5d为肝癌细胞Hep3B和HepG2裸鼠移植瘤实验,结果显示,青蒿素和双氢青蒿素单药体内均具有抗肿瘤作用,双氢青蒿素的抑癌作用强于青蒿素,青蒿素及双氢青蒿素均能增加吉西他宾的抑癌作用,联合吉西他宾治疗效果优于单药,尤其是双氢青蒿素表现出显著的化疗致敏作用;图5e为在卵巢癌细胞A2780和OVCAR3裸鼠移植瘤实验中,结果显示,DHA(剂量为10和25mg/kg)分别导致A2780异体移植肿瘤24%和41%的生长抑制(与给生理盐水的对照组相比)(P<0.05),OVCAR-3模型14%和37%肿瘤生长抑制(P<0.05);只给单一CBP的治疗组肿瘤生长被抑制了56%(A2780)和46%(OVCAR-3),联合用药(25mg/kgDHA)组则在A2780和OVCAR-3动物肿瘤中均产生70%肿瘤生长抑制(P<0.05)。 图6显示PDGFRα的表达与卵巢癌病理级别和转移状态的关系;其中,图6a显示,与低级别卵巢癌相比,高级别卵巢癌病例中,肿瘤细胞及周围的间质细胞PDGFRα的表达量显著增加;图6b为PDGFRα染色结果,结果显示,在高级别卵巢癌病例中,PDGFRα的表达显著增加。 具体实施方式 本发明人经过广泛而深入的研究,发现青蒿素及其衍生物的用途,用于制备血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)的抑制剂或拮抗剂,此外,青蒿素及其衍生物还可以抑制PDGFRα酪氨酸激酶的活化、抑制PDGFRα的蛋白稳定性、促进PDGFRα泛素依赖的蛋白酶体介导的降解、抑制信号通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化、抑制PDGFRα阳性肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭、还可以用于PDGFRα阳性肿瘤治疗的增敏剂。在此基础上完成了本发明。 术语 卵巢癌 卵巢癌是全世界的妇女健康的巨大威胁。在美国,卵巢癌已成为第四位致死性的女性癌症。虽然被诊断于病发早期的卵巢癌患者的5年存活率可以达到80%-90%,但是被诊断为晚期的卵巢癌患者存活率却只有不到25%,此外,大多数卵巢癌患者在诊断出是卵巢癌是已至晚期。目前卵巢癌患者的死亡率在过去的数十年没有发生太大的改变,因此在肿瘤治疗和预后中,寻找有效的治疗方案,增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,和克服肿瘤的耐药性是研究人员和临床实践人员长期以来的目标。 肝癌 肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,我国是肝癌的高发区,其发病率已上升到恶性肿瘤的第二位。由于肝癌早期症状不明显,因此确诊的大多数病人已处于中、晚期。原发性肝癌的首选治疗是手术切除,随着治疗技术的提高,目前术后5年生存率已提高至50%-60%,但由于手术切除只适用直径不超过5cm、癌灶数目不超过3个的小肝癌。此外,是否适合直接手术切除还取决于癌灶部位的血管富集程度及病人个体差异,这些限制导致90%左右的肝癌不适合手术治疗。即使是可切除肝癌,术后实施以介入化疗为主的综合性治疗也是必要的。然而目前,鲜有药物能够有效抑制肝癌的生长和进一步恶化,肝癌对传统化疗药物的反应率低,毒副作用非常显著,因此化疗的缓慢发展是制约抗肿瘤药物临床应用的主要原因。因此对于肿瘤化疗来说,迫切需要寻求更好的化疗增效剂和更好的治疗方案,从而提高肿瘤对化疗的敏感度,降低其对化疗的耐药性。 血小板衍生生长因子及其受体 血小板衍生生长因子(Platelet derived growth factor,PDGF)是一类能够合成并分泌到细胞外基质中的生长因子,具有促进纤维细胞、平滑肌细胞等多重组织的细胞分裂、增殖、迁移、增加细胞的黏附能力,在人胚胎发育和正常生理活动中发挥着重要作用。PDGF以自分泌和旁分泌形式激活血小板衍生生长因子受体(PDGFR)而发挥作用。 PDGFR包含两种结构类似的酪氨酸激酶受体PDGFRα和PDGFRβ,其中PDGFRα的异常激活与多重疾病密切相关,具体地,PDGFR相关疾病可以分为三类: 1.肿瘤 由于PDGFR(特别是PDGFRα)存在于多种肿瘤中,它可能作为一个新的治疗靶点。已经发现,多种肿瘤的发生与PDGFR(特别是PDGFRα)的过度激活相关,如卵巢癌、神经胶质瘤、前列腺癌;此外,在一些肿瘤中存在PDGFR的突变激活,如隆突性皮肤纤维肉瘤、胃肠道间质瘤、Bcr-Abl阴性的慢性髓样白血病、嗜酸细胞增多综合征等等。 2.血管性疾病 研究发现,PDGF及PDGFR等在多种血管性疾病中存在过量表达和过度激活现象,如动脉粥样硬化和再狭窄、肺动脉高压、视网膜血管病变等,抑制PDGFR信号通路的激活可以有效缓解上述疾病的症状,增加其治疗效果。 3.纤维性病变 PDGF-PDGFR信号通路在多种纤维性病变过程中发挥重要的作用,如肺纤维化、肝纤维化和肝硬化、皮肤纤维增生(硬皮病)、肾纤维化、心肌纤维化等等,其中PDGF-PDGFR信号通路介导的间质细胞的增殖是该慢性炎症的共同特征。 上述三类疾病中,PDGF-PDGFR信号通路发挥重要的作用,其中PDGFRβ主要介导了血管系统病变,而PDGFRα主要介导了间质细胞和成纤维细胞驱动的病变。(Johanna Andrae,et al.Role of platelet-derived growth factors inphysiology and medicine,Genes Dev.2008;22:1276-1312;张秀华等,血小板源生长因子受体与肿瘤.生命科学,Vol.18,No.3 Jun.,2006) 青蒿素及其衍生物 青篙素是从中药青篙中提取的有过氧基团的倍半萜内酯药物,由于青蒿素是复杂的大分子,化学全人工很难合成,因此目前主要是生物合成和人工提取。 青蒿素等倍半萜类的生物合成在细胞质中进行,途径属于植物类异戊二烯代谢途径,可分为三大步:由乙酸形成FPP,合成倍半萜,再内酯化形成青蒿素,具体为:FPP→4,11-二烯倍半萜→青蒿酸→二氢青蒿酸→二氧青蒿酸过氧化物→青蒿素。 青蒿素和本领域几种常见的青蒿素衍生物的化学式见下: 青蒿素及其衍生物的应用 本发明提供了青蒿素及其衍生物用于制备血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)的抑制剂或拮抗剂的用途。 在另一优选例中,青蒿素及其衍生物还用于: (i)抑制PDGFRα酪氨酸激酶的活化;和/或 (ii)抑制PDGFRα的蛋白稳定性;和/或 (iii)促进PDGFRα泛素依赖的蛋白酶体介导的降解;和/或 (vi)抑制PDGFRα阳性肿瘤细胞信号通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化;和/或 (v)抑制PDGFRα阳性肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭;和/或 (vi)制备抑制PDGFRα阳性肿瘤的药物或增敏剂;和/或 (vii)制备治疗血管性疾病和纤维性病变的药物或增敏剂。 在本发明的一个优选例中,提供了一种体外非治疗性地抑制血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)活性的方法,包括步骤:将青蒿素和/或青蒿素衍生物与细胞接触,从而抑制或拮抗细胞中血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)。 所述的接触是在青蒿素和/或青蒿素衍生物存在下,培养所述细胞。细胞包括肿瘤细胞,较佳地包括PDGFRα阳性肿瘤细胞,更佳地包括PDGFRα阳性卵巢癌细胞或肝癌细胞,如卵巢癌细胞A2780、卵巢癌细胞OVCAR3、肝癌细胞Hep3B。在另一优选例中,所述方法还用于至少以下一种应用:体外非治疗性地抑制PDGFRα酪氨酸激酶的活化;体外非治疗性地抑制PDGFRα的蛋白稳定性;体外非治疗性地促进PDGFRα泛素依赖的蛋白酶体介导的降解;体外非治疗性地抑制信号通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化;和体外非治疗性抑制PDGFRα阳性肿瘤细胞的生长。 本发明还提供了一种预防和/或治疗PDGFRα相关疾病的方法,其中所述疾病与PDGFRα的过表达或活性过高有关,所述方法包括步骤:给需要的对象施用青蒿素和/或青蒿素衍生物,或施用含青蒿素和/或青蒿素衍生物的药物组合物。PDGFRα相关疾病包括肿瘤(PDGFRα阳性肿瘤),如卵巢癌或肝癌。在另一优选例中,所述的施用包括:瘤内、静脉注射、口服片剂、腹腔注射等。所述的对象为哺乳动物(如人)。 药剂组合物及其应用 本发明还提供了药剂组合物,在一个优选例中,所述制剂组合包括: (I)含青蒿素和/或青蒿素衍生物的制剂;和(II)含吉西他宾或卡铂的制剂, 所述制剂组合用于制备:(a)抑制血小板衍生生长因子受体A的药物组合物或药盒;或(b)预防和/或治疗肿瘤的药物组合物或药盒。 所述制剂包括片剂、胶囊、栓剂、注射剂;所述药物制剂用于预防和治疗PDGFRα阳性肿瘤。 本发明的药剂组合物可以是固体或液体。固体制剂包括散剂、片剂、丸剂、胶囊、扁囊剂、栓剂和可分散颗粒剂,固体载体可以是一种或多种物质,它们可以作为稀释剂、矫味剂、黏合剂、防腐剂、片剂崩解剂或包囊材料。在散剂中,载体是微细分的固体,本发明的化合物与微细分的活性组份存在于混合物中。在片剂中,此化合物与所需的粘合载体以适当比例混合,并压制成所需的形状和大小。散剂和片剂中优先含有5至70%活性化合物,适宜的载体是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点腊和可可脂等。同样,扁囊剂或锭剂、片剂、散剂、胶囊、丸剂、扁囊剂和锭剂可以是适合于口服给药的固体剂型。为了制备栓剂,可以将低熔点腊乳脂肪酸甘油脂或可可脂的混合物熔化,并通过搅拌将此活性化合物组份均匀地分散在其中,然后将熔化的均匀混合物倒入大小合适的模中让其冷却,并由此固化。溶液形式的制剂包括溶液、悬浮剂和乳剂,例如水或含水丙二醇溶液。对于非肠道注射液体制剂,可以在含水聚乙二醇溶液中制备。适于口服的含水溶液可以通过将活性组份溶解于水中,并按照需要加入适宜的着色剂、矫味剂、乳化剂和增稠剂制备。适于口服的含水混悬剂可以通过将微细分的活性组份分散于含水粘性物质中制备,如天然或合成胶、树脂、甲基纤维素、羟甲基纤维素钠及其他熟知的混悬剂。这些液体形式包括溶液、混悬剂和乳剂,除活性组份外,这些制剂可含有着色剂、矫味剂、稳定剂、缓冲剂、合成或天然甜味剂、分散剂、增稠剂和助溶剂等。此药物制剂优先是单位剂型,在此剂型中,此制剂被再分为含适量活性组份的单位剂量,此单位剂量可以是包装的制剂,该包装含有一定量的制剂,如包装的片剂、胶囊和在小瓶或胶囊中的散剂。此单位剂型还可以是胶囊、片剂、扁囊剂或锭剂本身,或其可以存在包装形式中的适当数量的任何这些散剂。 单位剂量制剂中活性组份的量可根据具体的应用和活性组份的效力而变化,对于非人哺乳动物(如小鼠)治疗,可以将0.01mg至约0.5g,较佳地0.1至约3mg的胶囊每天给药三次,必要时该组合物还可以含其他相容的治疗剂。对于人的治疗,可以根据患者的需要、被治疗病症的严重性以及使用的化合物而变化,较佳地,开始以小于该化合物最佳剂量的较小剂量治疗,此后,小量增加此剂量达到最佳效果,方便起见,如果需要可将总日剂量再细分为一天内分次给药。在本发明的一个优选例中,给予人的剂量大约为0.1/kg-0.5g/kg之间。 本发明的主要优点: (1)青蒿素及其衍生物可以用于制备血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)的抑制剂或拮抗剂; (2)青蒿素及其衍生物可以抑制PDGFRα酪氨酸激酶的活化、PDGFRα的蛋白稳定性、抑制信号通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化、抑制PDGFRα阳性肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭; (3)青蒿素及其衍生物可以促进PDGFRα泛素依赖的蛋白酶体介导的降解; (4)青蒿素及其衍生物可以用于PDGFRα阳性肿瘤治疗的增敏剂。 下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。 实验方法和材料 1.表面等离子共振 表面等离子共振(SPR)是一种光学现象,可被用来实时跟踪在天然状态下生物分子间的相互作用。实验中,将重组人PDGFRα胞外端(Met1-Glu524)蛋白,键合在生物传感器表面,将不同浓度的双氢青蒿素溶液和一直与PDGFRα有相互作用的化合物索拉菲尼及SU11248溶液注入并流经生物传感器表面。生物分子间的结合引起生物传感器表面质量的增加,导致折射指数按同样的比例增强,生物分子间反应的变化即被观察到,这种反应用反应单位(RU)来衡量。 2.细胞培养 人卵巢永生化的非致瘤性上皮细胞IOSE-144和卵巢癌细胞(A2780,OVCAR-3,SK-OV3,OVCAR-5)购自美国ATCC(American Type CultureCollection,Manassas,VA)。所有细胞依据ATCC的培养要求(RPMI-1640或DMEM培养液加入10%胎牛血清(GIBCO)、100IU/ml青霉素、100IU/ml链霉素)于5%CO2的37℃培养箱中培养。 3.细胞生长抑制实验 细胞生长及增殖抑制试验通过CCK-8实验测定。细胞以3×103个细胞每孔的密度铺种于96孔板中。12~18小时后,以一定浓度梯度(0、1、5、10、25μM)的青蒿素类化合物处理48小时之后,在96孔板每孔中加10μL CCK-8溶液进行药物处理后的细胞生长活性评价,实验最后通过酶标仪(SpectraMax190microplate reader;Molecular Devices,USA)测量450nm处的光吸收(OD值)(每实验浓度至少设置三个复孔,每次实验至少重复三次)。 4.细胞迁移、侵袭实验 卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力通过transwell实验测定,低浓度青蒿素衍生物短时间(12h)处理卵巢癌细胞,然后将相同数目的细胞(5×104个)重悬在无血清的培养基中,种植到transwell(测定细胞的侵袭能力时,transwell上层铺上基质胶)上层培养室中。以10%胎牛血清培养基作为化学趋化剂。大约8-12h后,未迁移的细胞用棉签擦去,将迁移的细胞进行固定染色,并进行统计分析。 5.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹分析 以不同浓度的DHA处理培养细胞24小时,收集细胞并用细胞裂解液(RIPAbuffer #9806,Cell Signaling)裂解。之后以13,000转于4℃离心15min,取上清进行后续的分析检测。蛋白浓度通过Bio-Rad公司的试剂盒(protein assay kit;Hercules,CA)定量蛋白总量。之后每孔上等量蛋白进行SDS-PAGE胶电泳分离。电泳完毕,将电泳蛋白条带转移至甲醇活化过的PVDF膜(Millipore,Bedford,MA)上。转膜完毕后,膜以5%的脱脂牛奶(PBS溶解)封闭,然后后加一抗和二抗孵育(以5%的BSA配置),之后通过蛋白条带表达差异变化以蛋白显影试剂盒(ECL plus system,Amersham Pharmacia Biotech)显影分析。 6.小鼠原位卵巢癌异体移植瘤模型体内治疗实验 四到六周龄的雌性BALB/c(nu/nu)购自上海斯莱克实验动物有限公司(Shanghai Experimental Animal Center),并按规定饲养于SPF级动物房。所有动物实验操作均得到中科院营养所动物伦理委员会的批准。。大体步骤如下:将荧光素酶标记的A2780细胞,重悬于无血清的RPMI 1640培养基中。然后腹腔注射等量细胞(~3×106 cells/0.2ml)于小鼠的腹腔内部。利用IVIS Lumina生物荧光系统实时监测肿瘤的生长情况,并记录小鼠的体重。注射5天后,根据肿瘤的荧光强度时将小鼠平均分成治疗组和对照组(每组8只老鼠)。治疗组药物DHA溶解在蓖麻油、乙醇和生理盐水的混合物(CremophorEL∶Ethanol∶Saline=5∶5∶90,v/v/v)中,所有药物均通过腹腔给药。DHA的给药剂量为10或25mg/kg体重,给药频率为每天给药,每周停歇两天。对照组注射生理盐水。在治疗过程中利用活体成像系统实时监测肿瘤的生长状况。治疗结束后,小心取出移腹部肿瘤(除掉脂肪和结缔组织),以PIPA溶液(100mg组织加入1ml RIPA)匀浆。得到的肿瘤组织匀浆液按上述的蛋白免疫印迹分析实验要求进行处理,之后进行蛋白免疫印迹检测;或将肿瘤组织进行固定和免疫染色。 实施例1 青蒿素及其衍生物直接结合PDGFRα,抑制其磷酸化活性,促进其降解 利用PDGFRα体外激酶实验、表面等离子共振、计算机辅助同型模建及反向对接实验等分子药理学以及生物物理学等先进的生物学技术和手段,证实青蒿素类衍生物可以直接结合PDGFRα,抑制PDGFRα的受体酪氨酸激酶活性,同时研究发现双氢青蒿素可以抑制PDGFRα阳性细胞中PDGFRα的蛋白稳定性,促进其泛素依赖的降解过程。 图1表明,青蒿素及其衍生物能够直接结合PDGFRα,PDGFRα作为青蒿素及其衍生物作用的直接靶标,且能够抑制其磷酸化活性,促进其降解。体外激酶实验显示青蒿素及其衍生物:青蒿素(ART)、二氢青蒿素(DHA)、青蒿琥酯(ARM)、蒿甲醚(ARS)可以抑制PDGFRα的胞内端(aa550-末端)酪氨酸激酶的活性(图1a)。表面等离子共振(SPR)实验显示,双氢青蒿素(DHA)可以与PDGFRα包外端(aa24-524)蛋白相互结合,索拉菲尼(Sorafenib)做为阳性对照,已知可以结合抑制PDGFRα的活性(图1b)。生物素-亲和素亲和纯化实验显示标记生物素的DHA可以与A2780细胞内PDGFRα相互结合,从而被亲和纯化出来(图1c)。计算机辅助同型模建及反向对接实验(Computer Assisted Homology modeling anddocking)实验显示双氢青蒿素(DHA)可以嵌合到PDGFRα包外端PDGF结合位点,同时也可嵌合到其包内端ATP结合位点,阻断其激酶激活(图1d)。图1e-图1f显示了双氢青蒿素能够有效抑制PDGFRα阳性细胞A2780和OVCAR3中PDGFRα的活性和蛋白表达,而对PDGFRβ的磷酸化和蛋白水平影响不大。图1g-图1i实验显示双氢青蒿素可以加速PDGFRα的蛋白降解,这一过程是泛素依赖的蛋白酶体介导的。 实施例2 青蒿素及其衍生物抑制PDGFRα阳性的肿瘤细胞的生长和转移 利用裸鼠原位卵巢癌异体移植瘤模型,研究双氢青蒿素在动物体内的抗卵巢癌活性。将荧光素酶标记的人卵巢癌细胞A2780注射入Balb-c裸鼠的腹腔,建立裸鼠卵巢癌原位模型,然后给予双氢青蒿素治疗:对照组(生理盐水),低剂量组(DHA 10mg/kg)。高剂量组(DHA 25mg/kg)每周治疗五次,停歇两天,共给予6周治疗时间。期间利用活体成像系统观察小鼠卵巢癌的生长和转移情况。 通过细胞水平和动物水平的一系列研究,显示青蒿素类衍生物能够有效地抑制PDGFRα阳性的肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭(卵巢癌和肝癌),而对于不表达PDGFRα的肿瘤细胞生长和迁移能力的抑制能力较小。具体结果如下: 图2表明,青蒿素及其衍生物抑制PDGFRa阳性的卵巢癌细胞的生长和迁移能力。具体地,如图1e和图2a所示,PDGFRa在卵巢正常细胞上皮细胞IOSE144,卵巢癌细胞SK-OV3,OVCAR5中无表达,在卵巢癌细胞A2780和OVCAR3中高表达;给予药物刺激48h后,不同浓度的青蒿素及其衍生物人正常卵巢上皮细胞IOSE144无明显的生长抑制能力,对于SK-OV3细胞毒性较小,但对于PDGFRa阳性的A2780和OVCAR3具有较强抑制能力,其中青蒿素和二氢青蒿素的作用最为显著。细胞迁移实验显示低浓度短时间处理(12h)卵巢癌细胞,青蒿素及其衍生物能够有效地抑制PDGFRa阳性细胞A2780的迁移能力,而对于PDGFRa阴性的细胞SK-OV3无明显抑制能力(图2b)。青蒿素衍生物中双氢青蒿素对于PDGFRa阳性的细胞的生长和迁移侵袭能力抑制最为明显(图2c-图2e)。 肝癌细胞中也得到了类似的结果,图3表明,青蒿素及其衍生物能够抑制PDGFRa阳性的肝癌细胞的生长和迁移能力。具体地,在众多人正常肝细胞(7702和LO2)和肝癌细胞系(Hep3B,HepG2,7721,7404,LM3,97L,97M,Huh-7)中,Hep3B高表达PDGFRa(图3a);低浓度双氢青蒿素(3μM)短时(12h)处理Hep3B细胞能够显著抑制其迁移和侵袭能力(图3b);细胞生长实验同时显示PDGFRa阳性的Hep3B细胞对于双氢青蒿素更为敏感,而其他PDGFRa地表达和无表达的肝癌细胞对于双氢青蒿素敏感程度较低(图3c)。 动物实验评估结果(图4)表明,双氢青蒿素对于PDGFRa阳性细胞A2780的生长和转移的具有抑制能力。具体地,双青青蒿素给予治疗后能有有效地抑制卵巢癌的恶性进展(图4a);与对照组别相比,给予双氢青蒿素治疗组小鼠的为转移的情况大大降低,肿瘤腹腔播散的情况也得到明显的抑制(图4b、图4c);免疫组化和免疫印迹实验同时显示,双氢青蒿素能够有效地抑制PDGFRa的表达和磷酸化,下游信号通路PI3K/AKT和MAPK-ERK得以抑制,上皮间质形态转换过程(EMT)得到抑制(图4d、图4e)。 实施例3 青蒿素及其衍生物与一线化疗药的增敏作用 青蒿素及双氢青蒿素体外单独应用均能够显著抑制卵巢癌和肝癌细胞的生长、增殖和迁移侵袭能力。本实施例对其是否具有化疗增敏作用进行了检测,青蒿素及双氢青蒿素分别联合吉西他宾作用于人肝癌细胞HepG2和Hep3B,以及联合卡铂作用于卵巢癌A2780和OVCAR3观察联合用药对细胞生长的抑制作用。结果(图5)如下所示: HepG2,Hep3B细胞用10μmol/L青蒿素或双氢青蒿素单独处理或联合10μg/L吉西他宾处理48小时,按上述方法进行细胞凋亡定量检测。具体地,吉西他宾单药作用于HepG2,Hep3B细胞显示出一定的凋亡促进作用(图5a),青蒿素联合吉西他宾对HepG2,Hep3B细胞具有显著凋亡促进作用作用,两药联合表现出协同作用(图5a)。DHA和CBP联合用药24小时后对OVCAR-3细胞凋亡有增效促进作用(图5b);用1μM DHA联合500μM CBP(1155%)作用后的细胞凋亡率显著高于单独用1μM DHA(266%)或500μM CBP(528%)的细胞凋亡率,而且超过了两种化合物的凋亡累加效应,显示出的是一种潜在的增效作用。然而,A2780细胞对联合治疗则显示的是累加效应而不是增效效应。这可能是由于它们对DHA化合物的敏感度较低的缘故(图5b,P<0.05)。更长时间的作用可能产生更好的效果。在细胞增殖活力抑制方面,当与DHA联用时,CBP非常显著地抑制了卵巢癌细胞的活力。事实上,当细胞暴露于1μM CBP和1μM的DHA时,A2780细胞的存活率降低了69%,而OVCAR-3细胞存活则减少了72%。相比之下,IOSE144细胞则显得对治疗较不敏感,两种药物均以1μM合用时存活率只降低了约28%(图5c)。 细胞实验证明青蒿素以及双氢青蒿素在体外都显示出对于吉西他宾,卡铂处理癌细胞的杀伤和诱导凋亡的增敏作用。此外,裸鼠移植瘤实验进一步证明它们对于体内肿瘤的化疗也一样有效。具体地,如图5d显示,在肝癌细胞Hep3B和HepG2裸鼠移植瘤实验中,青蒿素和双氢青蒿素单药体内均具有抗肿瘤作用,双氢青蒿素的抑癌作用强于青蒿素。青蒿素及双氢青蒿素均能增加吉西他宾的抑癌作用,联合吉西他宾治疗效果优于单药,尤其是双氢青蒿素表现出显著的化疗致敏作用。在卵巢癌细胞A2780和OVCAR3裸鼠移植瘤实验中(图5e),DHA(剂量为10和25mg/kg)分别导致A2780异体移植肿瘤24%和41%的生长抑制(与给生理盐水的对照组相比)(P<0.05),OVCAR-3模型14%和37%肿瘤生长抑制(P<0.05);只给单一CBP的治疗组肿瘤生长被抑制了56%(A2780)和46%(OVCAR-3)。联合用药(25mg/kg DHA)组则在A2780和OVCAR-3动物肿瘤中均产生70%肿瘤生长抑制(P<0.05)。 以上细胞和动物水平实验显示,青蒿素及其衍生物具有良好的单独化疗和联合一线化疗药物的增敏作用,结合青蒿素类衍生化合物可以直接靶向PDGFRa发挥其抗肿瘤活性这一结果,提示青蒿素类药物可以用于临床中联合多类化疗药物来治疗肿瘤病人,尤其是病理诊断为PDGFRa阳性的肿瘤病人 实施例4 PDGFRα与病理分级和转移相关 本实施例根据临床病理诊断信息严格选取了45例卵巢癌病人的病理样本,其中包括21例低级别卵巢癌(临床病例级别为I-II,中度或高度分化,无明显的淋巴结,腹腔和网膜等转移);24例高级别卵巢癌病人(临床病例级别为III-IV,低分化,具有大面积的淋巴结转移,腹腔,网膜,子宫,附件及其他器官转移)。 结果显示(见图6),与低级别卵巢癌相比,高级别卵巢癌病例中,肿瘤细胞及周围的间质细胞PDGFRα的表达量显著增加。细胞实验显示,利用慢病毒介导的基因干扰技术将卵巢癌细胞A2780和OVCAR3中PDGFRα的表达进行沉默,发现肿瘤细胞的生长和迁移侵袭能力显著降低。 实施例5 药物组合物的制备 组合物1 组合物2 讨论 已有发现表明,PDGFR基因突变或过度激活可以促进细胞的转化能力进而导致恶性肿瘤的发生,如胃肠间质瘤,肺癌,前列腺癌和乳腺癌。PDGFR与其配体结合提高细胞间黏附分子的降解,促进肿瘤细胞的侵袭和转移,同时还能激活微环境中的VEGF,FGF等生长因子进而促进血管生成,加速了肿瘤的恶性进展过程。动物实验和临床病理研究发现,PDGFRα过度表达和激活参与了卵巢癌的发生和发展过程,与病人的病理级别和不良预后显著相关。 本发明内容表明,与低级别未发生转移的卵巢癌病人病理组织相比,高级别发生大规模转移的卵巢癌病人其癌细胞和肿瘤间质细胞中PDGFRα的表达量显著增加,这就表明,PDGFRα可以作为卵巢癌治疗的一个靶点。 本发明中发现青蒿素类衍生物,尤其是青蒿素和双氢青蒿素可以直接结合到PDGFRa分子中,既抑制PDGFRa的受体酪氨酸激酶活性,又抑制PDGFRa的蛋白稳定性,促进其泛素化降解。 分子和动物实验显示,青蒿素类的药物可以通过抑制PDGFRa进而抑制包括卵巢癌和肝癌在内的多重肿瘤的生长、迁移和侵袭转移能力。该结果表明,青蒿素类药物可以作为PDGFR的一种特殊的抑制剂,用于临床上PDGFRa突变或过度激活的肿瘤病人,包括卵巢癌、肝癌、胃肠间质瘤、急性白血病等等。青蒿素类衍生物也具有良好的抗癌增敏活性,例如青蒿素类药物可以显著提高一线化疗药卡铂,吉西他滨等对于卵巢癌和肝癌的治疗效果,尤其是双氢青蒿素对卡铂和吉西他宾具有更强的化疗致敏作用,其高效低毒的特点使之有望作为化疗增敏剂,应用于肿瘤的临床联合化疗。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。    
    Claims (10)   1.青蒿素及其衍生物用于制备抑制选自下组疾病的药物或药物增敏剂的用途:PDGFRα阳性肿瘤、血管性疾病、或纤维性病变。 2.一种青蒿素及其衍生物的用途,其特征在于,用于制备血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)的抑制剂或拮抗剂。   3.如权利要求2所述的用途,其特征在于,所述的抑制剂或拮抗剂还用于: (i)抑制PDGFRα酪氨酸激酶的活化;和/或 (ii)抑制PDGFRα的蛋白稳定性;和/或 (iii)促进PDGFRα泛素依赖的蛋白酶体介导的降解;和/或 (vi)抑制PDGFRα阳性肿瘤细胞信号通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化。   4.如权利要求1-2任一所述的用途,其特征在于,所述的青蒿素衍生物选自下组:蒿甲醚、二氢青蒿素、青蒿琥酯、双氢蒿甲醚、蒿乙醚等。 5.一种体外非治疗性地抑制血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)活性的方法,其特征在于,包括步骤:将青蒿素和/或青蒿素衍生物与细胞接触,从而抑制或拮抗细胞中血小板衍生生长因子受体A(PDGFRα)。 6.一种制剂组合的用途,所述制剂组合包括: (I)含青蒿素和/或青蒿素衍生物的制剂;和 (II)含吉西他宾或卡铂的制剂, 其特征在于,所述制剂组合用于制备: (a)抑制血小板衍生生长因子受体A的药物组合物或药盒;或 (b)预防和/或治疗肿瘤的药物组合物或药盒。   7.如权利要求6所述的用途,其特征在于,所述肿瘤为PDGFRα阳性肿瘤。 8.一种预防和/或治疗PDGFRα相关疾病的方法,其中所述疾病与PDGFRα的过表达或活性过高有关,其特征在于,包括步骤:给需要的对象施用青蒿素和/或青蒿素衍生物,或施用含青蒿素和/或青蒿素衍生物的药物组合物。 9.一种方法,所述方法用于体内或体外抑制PDGFRα酪氨酸激酶的活化、抑制PDGFRα的蛋白稳定性、促进PDGFRα泛素依赖的蛋白酶体介导的降解、抑制信号通路PI3K/AKT和MAPK/EPK的活化、和/或抑制PDGFRα阳性肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭,其特征在于,所述方法包括步骤:给需要的对象施用青蒿素和/或青蒿素衍生物。 10.一种用于卵巢癌病理分级的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含检测离体组织PDGFRα表达量的试剂。   Patent Citations (1)
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  13. Roger
    The invention discloses a kind of applications in the hepatoma Hep G 2 cells drug candidate of preparation treatment EMT activation.Qinghaosu has extensive biology and pharmacological action, and wherein effective antitumour effect causes extensive concern in recent years.The mechanism that qinghaosu plays specific anticancer activity is still unclear, this may limit its further development in preclinical and clinical setting.It is inhibited to hepatocellular carcinoma H22 that the present invention explores qinghaosu;And have found the mechanism of action of its anti-liver cancer and anti-, new method is provided for the treatment and diagnosis of liver cancer patient, is application based theoretical of the qinghaosu in clinical liver cancer treatment.Therefore, qinghaosu can be used as induction apoptosis of human hepatoma cell drug candidate and be researched and developed.   本发明公开了一种在制备治疗EMT激活的肝癌HepG2细胞候选药物中的应用。青蒿素具有广泛的生物和药理作用,其中有效的抗肿瘤作用近年来引起了广泛的关注。青蒿素发挥特定抗癌活性的机制仍不清楚,这可能限制其在临床前和临床环境中的进一步发展。本发明探索了青蒿素对肝癌细胞HepG2具有抑制作用;及发现了其抗肝癌的作用机制,为肝癌患者的治疗和诊断提供新方法,为青蒿素在临床肝癌治疗中的应用奠定理论基础。因此,青蒿素可作为诱导人肝癌细胞凋亡候选药物进行研究和开发。   Artemisinin is in the hepatoma Hep G 2 cells drug candidate of preparation treatment EMT activation Using Technical field The present invention relates to a kind of cancer treatment drugs, belong to biopharmaceutical technology, and in particular to a kind of qinghaosu exists Application in the hepatoma Hep G 2 cells drug candidate of preparation treatment EMT activation. Background technique One of the main reason for liver cancer (HCC) is global cancer related mortality, the liver cancer case more than 80% occur in The developing countries such as state and Africa.HCC has long latency, but while quickly growing usually to advanced stage is just diagnosed.These A possibility that feature is invaded plus its height causes the patient with the disease that cannot obtain the effective treatment.Non-operative treatment It is necessary, because the patient with big tumour (diameter > 5cm) or multiple lesions (> 3) is often unsuitable for hepatectomy.It is unfortunate , the activity of single chemotherapeutant is limited, with low-down treatment rate. Qinghaosu (ART) is a kind of natural products separated from plant ginghao (Artemesiaannua L), quilt It is widely used as anti-malaria medicaments.In recent years, ART and its derivative also have shown that with antitumaous effect, anticancer activity Main mechanism is to induce cell apoptosis.The selective anticancer potentiality and c-MYC, cdc25A, EGFR of qinghaosu and its derivative, The expression of the different moleculars such as gamma-glutamyl amine synzyme (GLCLR) is related.ART also plays in kinds cancer type and in vivo anti- Cancer effect. ART also adjusts the level of u-PA, MMP2, MMP7 and MMP9, all these all related to transfer.But qinghaosu is in liver Application and study on mechanism in cancer cell is still few, although detailed mechanism still needs to be illustrated. Summary of the invention Of the existing technology in order to solve the problems, such as, the purpose of the present invention is to provide a kind of biological therapy tumor candidate medicines Object qinghaosu is preparing the application in antitumor. The present invention is achieved through the following technical solutions: The present invention discloses a kind of application of qinghaosu in the hepatoma Hep G 2 cells drug candidate of preparation treatment EMT activation, Qinghaosu containing treatment effective dose pharmaceutically, the qinghaosu can be by inhibiting Beta- in hepatocellular carcinoma H22 Conversion of the catenin albuminous cell matter to cytoplasm, and then inhibit the generation of EMT, to inhibit the proliferation of HepG2. Application of the present invention, the qinghaosu be extracted from compound inflorescence plant Artemisia annua cauline leaf have peroxy A kind of colourless acicular crystal of the sesquiterpene lactone of group, molecular formula C15H22O5, belong to sesquiterpene lactone, preparing fusing point is 156- 157 DEG C, [a]D17=+66.3 ° (C=1.64 chloroform). Application of the present invention, concentration >=100 μM of the qinghaosu, the drug candidate can be made into tablet, system Preparation Method are as follows: 1) qinghaosu and starch are crossed into 80 meshes; 2) preparation of 10% starch slurry: 0.3g citric acid is dissolved in 20ml distilled water, and it is equal to add 2g starch dispersion Even, about 80 DEG C of heating makes starch gelatinization, uses after being cooled to temperature slurry; 3) fine powder of 30g qinghaosu is weighed in mortar, and 2g starch is added by several times and is ground for equivalent, is uniformly mixed, adds Enter appropriate amount of starch slurry and prepares softwood; 4) 20 mesh nylon mesh are prepared into wet granular, wet granular and 50~60 DEG C of oven drying 30min is carried out with 20 meshes Whole grain, particle is uniformly mixed with 1.5g talcum powder and 1g starch after whole grain, carries out punch die tabletting with 8mm punch die;Up to qinghaosu Tablet. Application of the present invention, the drug can be made into suspension injection, preparation method are as follows: 1) it takes oil for injection to be heated to 115~125 DEG C, keeps the temperature 1~2 hour, suspending agent is added, stirring and dissolving cools to 50 DEG C hereinafter, spare; 2) substance of step 1) is placed in colloid mills, 0.5~10.0g of qinghaosu is added, with the speed of 4000r/min Degree, suspension is made in high speed shear 30min, spare; 3) by the liquid of step 2), 0.1~5.0g of suspending agent, 0.05~0.5g of antioxidant, wetting agent are sequentially added 1.0~3.0g, flocculant 0.2~2.0g, it is stirring while adding, until substantially uniformity, then continuously grinding 10min, it is spare; 4) it by the liquid after the grinding of step 3), is placed in high pressure homogenizer, with pressure 50-55 megapascal, it is equal to carry out high pressure Matter, then, filling and sealing is packed to get 100mL sweet wormwood suspension injection. The invention has the advantages that and advantageous effects: 1) discovery qinghaosu is inhibited to human hepatoma HepG2 cell, and good time and concentration dependant is presented Property; 2) qinghaosu can induce the apoptosis of human hepatoma HepG2 cell; 3) qinghaosu can inhibit transhipment of the Beta-catenin from cytoplasm to nucleus, and then inhibit the generation of EMT, from And inhibit the invasion and transfer of tumour cell; The present invention provides scientific basis to develop new antitumor drug candidate, has important meaning to exploitation new Chinese medicine Justice. Detailed description of the invention Fig. 1 is that cell viability experiment detects qinghaosu to the Proliferation Ability of human hepatoma HepG2 cell in implementation column 1 of the present invention Effect. Fig. 2 is that cell clonal formation experiment detects qinghaosu to the proliferation of human hepatoma HepG2 cell in implementation column 1 of the present invention Inhibiting effect. Fig. 3 is the work that cell streaming experiment detection qinghaosu induces human hepatoma HepG2 cell's apoptosis in implementation column 2 of the present invention With. Fig. 4 is the expression that Western blot detects qinghaosu PARP albumen intracellular to HepG2 in implementation column 3 of the present invention Amount. Fig. 5 is that Western blot detects qinghaosu to Beta-catenin in HepG2 cytoplasm in implementation column 4 of the present invention The influence of albumen. Specific embodiment Below with reference to specific implementation column and the chart technical solution that the present invention will be described in detail, but the present invention be not limited in Under embodiment. The present invention provides a kind of biological therapy tumor candidate drug artemisinin and is preparing the application in antitumor.It is specifically related to A kind of qinghaosu inhibits Beta-catenin albumen in cytoplasm to the conversion of nucleus and then hepatoma Hep G 2 cells is induced to wither It dies;Cell strain used in the experiment in vitro is source of people liver cancer cells (HepG2). The low host toxicity of qinghaosu is the major impetus for developing qinghaosu as anticancer agent.Therefore it is the inventors discovered that green Artemisin has antihepatocarcinoma effect in human hepatoma HepG2 cell, can be used as the potential value of anti-liver cancer and anti-drug candidate exploitation. The present invention is tested by cell viability, cell clonal formation is tested, the experiment of cell streaming, Western blot reality It tests, the researchs such as immunofluorescence experiment confirm that qinghaosu has the mechanism of action of induction hepatocellular carcinoma H22 apoptosis. Testing qinghaosu used below is purchase in sigma company, the U.S.. Various test apparatuses and reagent are commercial goods, are that can buy to obtain by commercial sources.Wherein, qinghaosu It is made by effective component extracting in Chinese traditional herbs artemisia annua, in sigma company, the U.S., product type 361593 is green for purchase Artemisin content is 98%, and cell strain used in experiment in vitro is source of people liver cancer cells (HepG2), derives from U.S. ATCC cell Library. Embodiment 1: Tablet, preparation method is made in qinghaosu drug are as follows: 1) qinghaosu and starch are crossed into 80 meshes; 2) preparation of 10% starch slurry: 0.3g citric acid is dissolved in 20ml distilled water, and it is equal to add 2g starch dispersion Even, about 80 DEG C of heating makes starch gelatinization, uses after being cooled to temperature slurry; 3) fine powder of 30g qinghaosu is weighed in mortar, and 2g starch is added by several times and is ground for equivalent, is uniformly mixed, adds Enter appropriate amount of starch slurry and prepares softwood; 4) 20 mesh nylon mesh are prepared into wet granular, wet granular and 50~60 DEG C of oven drying 30min is carried out with 20 meshes Whole grain, particle is uniformly mixed with 1.5g talcum powder and 1g starch after whole grain, carries out punch die tabletting with 8mm punch die;Up to qinghaosu Tablet. Medication: Adult usual amounts: oral administration first takes 1g, takes within 6~8 hours 0.5g again, respectively takes within the 2nd, 3 0.5g, and the course for the treatment of 3 days, Total amount is 2.5g.Children 15mg/kg takes in 3 days according to the above method. Points for attention: First Trimester is used with caution. Embodiment 2: Suspension injection, preparation method is made in qinghaosu drug are as follows: 1) it takes oil for injection to be heated to 115~125 DEG C, keeps the temperature 1~2 hour, suspending agent is added, stirring and dissolving cools to 50 DEG C hereinafter, spare; 2) substance of step 1) is placed in colloid mills, 0.5~10.0g of qinghaosu is added, with the speed of 4000r/min Degree, suspension is made in high speed shear 30min, spare; 3) by the liquid of step 2), 0.1~5.0g of suspending agent, 0.05~0.5g of antioxidant, wetting agent 1.0 are sequentially added ~3.0g, flocculant 0.2~2.0g, it is stirring while adding, until substantially uniformity, then continuously grinding 10min, it is spare; 4) it by the liquid after the grinding of step 3), is placed in high pressure homogenizer, with pressure 50-55 megapascal, it is equal to carry out high pressure Matter, then, filling and sealing is packed to get 100mL sweet wormwood suspension injection. Medication: deep intramuscular injection: the 1st 200mg gives 100mg, each intramuscular injection 100mg on the the 2nd, 3 again after 6~8 hours, Accumulated dose 500mg (gives 100mg in other severe the 4th day) again.It is used in conjunction 3, daily intramuscular injection 300mg, total amount 900mg.Children 15mg/ Kg has been infused in 3 days according to the above method. Points for attention: First Trimester is used with caution. Compliance test result test example Test example 1-1 (inhibited proliferation of the qinghaosu to human hepatoma HepG2 cell) 1, Cell Viability Assay method measures cell Proliferation 1) it takes in logarithmic growth phase, the good HepG2 cell of growth conditions, it is (green containing 10%FBS and 1% with DMEM Mycin, 1% streptomysin) culture medium adjusts cell density to 3*104A/ml, is inoculated into 96 orifice plates, and every 100 μ L cell of hole is outstanding Liquid, while blank group is set, 37 DEG C, 5%CO2Overnight incubation. 2) after cell adherent growth well for 24 hours after, abandon old culture solution, the sweet wormwood diluted with DMEM culture medium be added Element, concentration are followed successively by 0 μM, 50 μM, 100 μM, 150 μM, 200 μM, and 6 repetitions are arranged in every kind of concentration.Negative control group adds equivalent DMEM.Be put into incubator cultivate respectively for 24 hours, 48h and 72h. 3) after drug effect to corresponding time point, 96 orifice plates are taken out from incubator, are separately added into 20 μ LCellTiter-Luminescent Cell Viability Assay, pays attention to being protected from light, and is put into incubator and is incubated for 10 points Zhong Hou uses the absorbance of Bio-Rad cell town and country detector measurement Luminescent. 4) cell survival rate (cell viability%)=(dosing group/negative control group) × 100%. Experiment in triplicate, calculates separately under different time qinghaosu to the inhibition situation of human hepatoma HepG2 cell. Test example 1-2(cell clonal formation experiment) 1) it prepares cell suspension: abandoning old culture medium, after PBS washes one time plus the pancreatin of 1mL 0.25% digests 3min, micro- When microscopic observation most cells are rounded, abandon pancreatin, add 2 times added by the complete medium of pancreatin amount terminate digestion, will be thin in bottle Born of the same parents gently blow down, and are transferred in 15mL centrifuge tube, and 1000rpm is centrifuged 5min. 2) supernatant is abandoned, fresh culture is added, 1/3 cell suspension is reserved seed for planting, remaining is spare. 3) cell count and bed board: after cell suspension piping and druming mixes, 10 μ L are drawn, blood counting chamber is added under the microscope It counts.The adjusted cell suspension of 2ml concentration is added to every hole of 12 orifice plates, cell number is 2000/hole, 37 DEG C are placed in, 5%CO2It is cultivated in incubator, keeps it adherent overnight. 4) dosing: discarding old culture medium, and the qinghaosu diluted with DMEM culture medium is added, and concentration is followed successively by 0 μM, 50 μ M, 3 repetitions are arranged in 100 μM, 150 μM, every kind of concentration. 5) by plate at 37 DEG C, 5%CO2It is lower to be incubated for 7 days to allow bacterium colony to grow.During prolonged incubation, every three days more Change the fresh complete medium of the qinghaosu (0 μM, 50 μM, 100 μM, 150 μM) containing various concentration.It is washed carefully with 1X PBS Twice, 0.01% crystal violet solution dyes born of the same parents.Gel Doc TM XR+Imager (Bio-Rad) captures image.In order to quantify to collect The rate to be formed is fallen, the staining cell of colony form is dissolved in 10% (v/v) acetic acid, the quantitative absorbance at 540nm. 6) data statistics: Cell colonies assay=(dosing group/negative control group) × 100%. Cell viability is as the result is shown: act on respectively for 24 hours, after 48h, 72h, qinghaosu energy dose-dependant and time dependence suppression The proliferation of HepG2 cell processed. By Figure 1A as it can be seen that the drug concentration in same action time is higher, the cell proliferation inhibition rate compared with blank control Also with increasing. By Figure 1B as it can be seen that when qinghaosu concentration is 100 μM, to the variant statistics of the inhibition of human hepatoma HepG2 cell Meaning. Cell clonal formation experimental result is shown: compared with blank control group, and qinghaosu increases human hepatoma HepG2 cell It grows and significantly inhibits.And when qinghaosu concentration is 100 μM, the Colony formings of liver cancer cells inhibit 50% with Under, and as qinghaosu concentration increases, inhibitory effect is better.Therefore subsequent experimental we choose qinghaosu concentration be 100 μM.Such as Shown in Fig. 2. Test example 2 The influence of cell streaming experiment detection qinghaosu induction human hepatoma HepG2 cell's apoptosis. 1) it takes in logarithmic growth phase, the good HepG2 cell of growth conditions, it is (green containing 10%FBS and 1% with DMEM Mycin, 1% streptomysin) culture medium adjusts cell density to 5*106A/ml, is inoculated into 6 orifice plates, every 100 μ L cell suspension of hole, While blank group is set, and 37 DEG C, 5%CO2Overnight incubation. 2) after cell adherent growth well for 24 hours after, abandon old culture solution, the sweet wormwood diluted with DMEM culture medium be added Element, concentration are followed successively by 0 μM, 100 μM, and 3 repetitions are arranged in every kind of concentration.Negative control group adds the DMEM of equivalent.It is put into incubator Culture is for 24 hours. 3) cell culture fluid is sucked out to a suitable centrifuge tube, PBS washing attached cell is primary, and it is thin that appropriate pancreatin is added Born of the same parents' digestive juice (EDTA can be contained) vitellophag.Incubation at room temperature is absorbed to when gently piping and druming can be such that attached cell blows and beats Pancreatin cell dissociation buffer.It need to avoid the excessive digestion of pancreatin. 4) cell culture fluid collected in step 2a is added, slightly mixes, is transferred in centrifuge tube, 1000g is centrifuged 5 minutes, Supernatant is abandoned, cell is collected, cell is gently resuspended with PBS and counts.Note: the cell culture fluid being added in step 1 on the one hand can To collect the cell that apoptosis or necrosis occurs to have suspended, the serum in another aspect cell culture fluid can effectively inhibit or Neutralize remaining pancreatin;Remaining pancreatin can digest and the Annexin V-PE for subsequent addition of degrading causes dyeing to fail. 5) cell for taking 5-10 ten thousand to be resuspended, 1000g are centrifuged 5 minutes, abandon supernatant, and 195 μ l Annexin V-PE knot is added It closes liquid and cell is gently resuspended. 6) 5 μ l Annexin V-PE are added, mix gently.Note: due to the difference of cell sample, apoptosis and degree of necrosis Difference, can according to preliminary result optimize Annexin V-PE usage amount. 7) room temperature (20-25 DEG C) is protected from light incubation 10-20 minutes, is subsequently placed in ice bath.Aluminium foil can be used to be protected from light. Cell can be resuspended 2-3 times during incubation to improve and mark effect. 😎 flow cytomery is carried out immediately. 9) data statistics. The above experiment is in triplicate. Experimental result is shown: the bis- dyes of Annexin V-FITC/PI are the results show that be 100 μM of works in qinghaosu drug concentration With for 24 hours when, compared with blank control, the apoptosis rate of experimental group increases.The apoptosis rate of control group HepG2 cell is respectively 13.36%, after 100 μM of qinghaosu processing for 24 hours, the apoptosis rate of experimental group HepG2 cell is 24.16%, and apoptosis rate is obvious It increases (Fig. 3). Test example 3 The variation of Western blot detection qinghaosu PARP protein expression intracellular to HepG2. The GAP-associated protein GAP of investigation has: PARP. 1) it takes in logarithmic growth phase, the good HepG2 cell of growth conditions, it is (green containing 10%FBS and 1% with DMEM Mycin, 1% streptomysin) culture medium adjusts cell density to 5*106A/ml, is inoculated into 6 orifice plates, every 100 μ L cell suspension of hole, While blank group is set, and 37 DEG C, 5%CO2Overnight incubation. 2) after cell adherent growth well for 24 hours after, abandon old culture solution, the sweet wormwood diluted with DMEM culture medium be added Element, concentration are followed successively by 0 μM, 100 μM, 200 μM of every kind of concentration 3 repetitions of setting.Negative control group adds the DMEM of equivalent.It is put into Incubator culture is for 24 hours. 3) cell is taken out from incubator, sops up culture medium, and the PBS that ice is gently added is cleaned one time, discards residual liquid. 4) it is washed one time with PBS, cell is collected by centrifugation, tries one's best and exhausts supernatant, it is spare to leave cell precipitation. 5) it uses BCA kit to survey protein concentration: using BSA to do standard curve as standard specimen, 2 μ l are added in 96 orifice plates 37 DEG C of reaction 30min of protein solution and 200ul BCA working solution (A:B=50:1) detect absorbance in 450nm with microplate reader, Concentration of specimens is calculated using absorbance concentration calculation formula.It is reference by the minimum sample of wherein concentration, by all samples concentration It adjusts consistent. 6) v/2 albuminous degeneration loading Buffer 95 DEG C of denaturation 10min in metal bath are added, after centrifugation can it is direct on Sample or long-term preservation are in -80 DEG C of refrigerators. 7) loading: westernblotting loading, every hole loading 20ul select hole count, voltage according to sample size 200V, time 30min or so (pre-prepared colloid). 😎 transferring film: the filter paper of one piece of long 9cm, the pvdf membrane of wide 6cm and two same sizes are cut, film is put and is soaked in methyl alcohol Bubble, filter paper, film, gel and filter paper " sandwich " formula place it is wet turn 250mA, 90min, it is cathode that glue surface is surveyed to black one, is sure not Position is misplaced, bearing mark is carried out. 9) it closes: film being placed on after closing 1h in the milk of TBST preparation 5%, TBST is cleaned 4 times, each 5min. 10) be incubated for primary antibody: primary antibody is diluted with the Sodium azide 1:1000 of 5% BSA+0.02%.4 DEG C of shaking tables are incubated overnight, Primary antibody dilution can be placed on -20 DEG C of preservations and be used for multiple times. 11) it cleans: being cleaned 4 times with TBST, be placed on shaking table, low speed rocks, each 10min. 12) be incubated for secondary antibody: secondary antibody is diluted with 5% milk that TBST is prepared by 1:5000, is placed on shaking table, is incubated at room temperature 2h.Secondary antibody diluent had better not Reusability. 13) it cleans: rocking cleaning 4 times, each 5min using TBST. 14) expose: development liquid kit A and B liquid press 1:1 adapted, in use, covering film reaction 1min or so is put into egg It is exposed in white imaging system. The above experiment is in triplicate. As the result is shown: compared with blank control, after qinghaosu is added, the intracellular PARP protein expression up-regulation of HepG2 is poor Different statistically significant (P < 0.05), qinghaosu can cross induction HepG2 Apoptosis.As shown in Figure 4. Test example 4 4-1 qinghaosu influences the variation of Beta-catenin protein expression in HepG2 cytoplasm. Beta-catenin protein expression in 1.Western Blot experiment detection HepG2 cytoplasm 1) it takes in logarithmic growth phase, the good HepG2 cell of growth conditions, it is (green containing 10%FBS and 1% with DMEM Mycin, 1% streptomysin) culture medium adjusts cell density to 5*106A/ml, is inoculated into 6 orifice plates, every 100 μ L cell suspension of hole, While blank group is set, and 37 DEG C, 5%CO2Overnight incubation. 2) after cell adherent growth well for 24 hours after, abandon old culture solution, the sweet wormwood diluted with DMEM culture medium be added Element, concentration are followed successively by 0 μM, 100 μM, 200 μM of every kind of concentration 3 repetitions of setting.Negative control group adds the DMEM of equivalent.It is put into Incubator culture is for 24 hours. 3) cell is taken out from incubator, sops up culture medium, and the PBS that ice is gently added is cleaned one time, discards residual liquid. 4) 200 microlitres of suppressor proteins extraction agent A for being added to PMSF are added in every 20 microlitres of cell precipitations. 5) the violent Vortex of most high speed 5 seconds, completely suspends cell precipitation and scatter.If (cell precipitation is not complete It suspends and scatter entirely, the vortex time can be appropriately extended.) 6) ice bath 10-15 minutes. 7) B10 microlitres of suppressor proteins extraction agent is added.The violent Vortex of most high speed 5 seconds, ice bath 1 minute. 😎 the violent Vortex of most high speed 5 seconds, 4 DEG C of 12,000-16,000g are centrifuged 5 minutes. 9) supernatant is drawn immediately into the plastic tube of a pre-cooling, the suppressor proteins as extracted.It can make immediately With can also freeze.(precipitating must not be touched, the supernatant of minimum volume can be retained above precipitating, so as not to touch it is heavy It forms sediment.Obtainable supernatant after suppressor proteins extraction agent A cracking of every 2,000,000 cell in 200 microlitres of this products, cell Starching protein concentration is about 2-5mg/ml, and different cells are different.) 10) for precipitating, remaining supernatant is exhausted completely, and 50 microlitres of Nuclear extract extracting examinations for being added to PMSF are added Agent.(pollution of suppressor proteins can be brought by not exhausting supernatant.) 11) violent Vortex 15-30 seconds of most high speed completely suspend cell precipitation and scatter.Then ice bath is put back to In, violent Vortex 15-30 seconds, totally 30 minutes of high speed again every 1-2 minutes. 12) 4 DEG C of 12,000-16,000g are centrifuged 10 minutes. 13) supernatant is drawn immediately into the plastic tube of a pre-cooling, the Nuclear extract as extracted.It can make immediately With can also be frozen with -70 DEG C. 14) the RIPA cell pyrolysis liquid (containing protease inhibitors) of 100 μ l is added, scrapes cell with cell spatula, inhales Into EP pipe, it is inserted into ice and cracks 1h, during which overturn makes cell cracking abundant several times. 15) EP pipe is placed on 14000rpm in 4 DEG C of centrifuges and is centrifuged 20min, take supernatant. 16) it uses BCA kit to survey protein concentration: using BSA to do standard curve as standard specimen, 2 μ l are added in 96 orifice plates 37 DEG C of reaction 30min of protein solution and 200ul BCA working solution (A:B=50:1) detect absorbance in 450nm with microplate reader, Concentration of specimens is calculated using absorbance concentration calculation formula.It is reference by the minimum sample of wherein concentration, by all samples concentration It adjusts consistent. 17) v/2 albuminous degeneration loading Buffer 95 DEG C of denaturation 10min in metal bath are added, it can be direct after centrifugation Loading or long-term preservation are in -80 DEG C of refrigerators. 18) loading: western blotting loading, every hole loading 20ul select hole count, voltage according to sample size 200V, time 30min or so (pre-prepared colloid). 19) transferring film: the filter paper of one piece of long 9cm, the pvdf membrane of wide 6cm and two same sizes are cut, film is put in methyl alcohol Impregnate, filter paper, film, gel and filter paper " sandwich " formula place it is wet turn 250mA, 90min, it is cathode that glue surface is surveyed to black one, is cut Position is not misplaced, bearing mark is carried out. 20) it closes: film being placed on after closing 1h in the milk of TBST preparation 5%, TBST is cleaned 4 times, each 5min. 21) be incubated for primary antibody: primary antibody is diluted with the Sodium azide 1:1000 of 5% BSA+0.02%.4 DEG C of shaking tables are incubated overnight, Primary antibody dilution can be placed on -20 DEG C of preservations and be used for multiple times. 22) it cleans: being cleaned 4 times with TBST, be placed on shaking table, low speed rocks, each 10min. 23) be incubated for secondary antibody: secondary antibody is diluted with 5% milk that TBST is prepared by 1:5000, is placed on shaking table, is incubated at room temperature 2h.Secondary antibody diluent had better not Reusability. 24) it cleans: rocking cleaning 4 times, each 5min using TBST. 25) expose: development liquid kit A and B liquid press 1:1 adapted, in use, covering film reaction 1min or so is put into egg It is exposed in white imaging system. The above experiment is in triplicate. 4-2 immunofluorescence experiment detects Beta-catenin protein expression in HepG2 cytoplasm 1) it takes in logarithmic growth phase, the good HepG2 cell of growth conditions, it is (green containing 10%FBS and 1% with DMEM Mycin, 1% streptomysin) culture medium adjusts cell density to 5*106A/ml, is inoculated into 6 orifice plates, every 100 μ L cell suspension of hole, While blank group is set, and 37 DEG C, 5%CO2Overnight incubation. 2) after for 24 hours, renew fresh DMEM culture medium, the qinghaosu that concentration is 100 μM, control group addition etc. is added in experimental group The DMSO of amount, culture is for 24 hours. 3) liquid is blotted, one layer of 2-3mm diluted 4% formaldehyde of PBS is then covered on cell. 4) cell 15 minutes are fixed at room temperature. 5) fixer is blotted, three times with PBS rinsing, 5 minutes every time. 6) seal sheet glass 60 minutes in Block buffer. 7) when seal sheet glass, the middle dilution ratio recommended, prepares primary antibody in antibody dilution buffer to specifications. 😎 Block buffer is sucked, the primary antibody after dilution is added. 9) it is incubated overnight at a temperature of 4 DEG C. 10) three times with PBS rinsing, 5 minutes every time. 11) after the secondary antibody dilution of fluorescein will be coupled with antibody dilution buffer, it is small that it is protected from light incubation sample 1-2 at room temperature When. 12) secondary antibody Hoechst is protected from light incubation 1-2 hours, and PBS is washed 3 times, and 5 minutes every time, 5% glycerol mounting was burnt in copolymerization Microscopically observation.Experiment is in triplicate. As the result is shown: Western blot experimental result is shown, compared with blank control, after qinghaosu is added, in HepG2 cytoplasm The up-regulation of Beta-catenin protein expression, difference is statistically significant (P < 0.05), and trendless changes in nucleus, qinghaosu Transhipment of the Beta-catenin from cytoplasm to nucleus can enough be inhibited excessively, and then inhibit the generation of EMT, to inhibit tumour thin The invasion and transfer (as indicated by figures 5 a-5b) of born of the same parents.Immunofluorescence results are consistent (such as Fig. 5 C institute with Western blot result Show). The above described is only a preferred embodiment of the present invention, be not intended to limit the present invention in any form, therefore Without departing from the technical solutions of the present invention, to the above embodiments according to the technical essence of the invention any simply to repair Change, equivalent variations and modification, all of which are still within the scope of the technical scheme of the invention.    
    Claims (5)   1. application of the qinghaosu in the hepatoma Hep G 2 cells drug candidate of preparation treatment EMT activation, it is characterised in that: contain The qinghaosu for the treatment of effective dose pharmaceutically, the qinghaosu can be by inhibiting Beta- in hepatocellular carcinoma H22 Conversion of the catenin albuminous cell matter to cytoplasm, and then inhibit the generation of EMT, to inhibit the proliferation of HepG2.   2. application according to claim 1, it is characterised in that: the qinghaosu is from compound inflorescence plant Artemisia annua cauline leaf A kind of colourless acicular crystal of the sesquiterpene lactone for having peroxy-radical of middle extraction, molecular formula C15H22O5, belong to sesquiterpene lactone, Preparing fusing point is 156-157 DEG C, [a]D17=+66.3 ° (C=1.64 chloroform).   3. application according to claim 1, it is characterised in that: concentration >=100 μM of the qinghaosu.   4. application according to claim 1-3, it is characterised in that: the drug candidate can be made into tablet, system Preparation Method are as follows: 1) qinghaosu and starch are crossed into 80 meshes; 2) preparation of 10% starch slurry: 0.3g citric acid is dissolved in 20ml distilled water, and it is uniform to add 2g starch dispersion, is added About 80 DEG C of heat makes starch gelatinization, uses after being cooled to temperature slurry; 3) fine powder of 30g qinghaosu is weighed in mortar, and 2g starch is added by several times and is ground for equivalent, is uniformly mixed, and is added suitable Amount starch slurry prepares softwood; 4) 20 mesh nylon mesh are prepared into wet granular, wet granular and 50~60 DEG C of oven drying 30min is carried out whole with 20 meshes , particle is uniformly mixed with 1.5g talcum powder and 1g starch after whole grain, carries out punch die tabletting with 8mm punch die;Up to Artemisinin Tablets Agent.   5. application according to any one of claim 1-3, it is characterised in that: the drug can be made into suspension injection, Preparation method are as follows: 1) it takes oil for injection to be heated to 115~125 DEG C, keeps the temperature 1~2 hour, suspending agent is added, stirring and dissolving cools to 50 DEG C Hereinafter, spare; 2) substance of step 1) is placed in colloid mills, 0.5~l0.0g of qinghaosu is added, with the speed of 4000r/min, Suspension is made in high speed shear 30min, spare; 3) by the liquid of step 2), sequentially add 0.1~5.0g of suspending agent, 0.05~0.5g of antioxidant, wetting agent 1.0~ 3.0g, flocculant 0.2~2.0g, it is stirring while adding, until substantially uniformity, then continuously grinding 10min, it is spare; 4) it by the liquid after the grinding of step 3), is placed in high pressure homogenizer, with pressure 50-55 megapascal, progress is high-pressure homogeneous, so Afterwards, filling and sealing is packed to get 100mL sweet wormwood suspension injection.   Patent Citations (1)
    Publication numberPriority datePublication dateAssigneeTitle CN101856352A *2009-04-102010-10-13中国科学院上海生命科学研究院Synergistic effect of arteannuim and derivative thereof on chemotherapeutic agent Family To Family Citations * Cited by examiner, † Cited by third party Non-Patent Citations (1)
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    ApplicationFiling dateTitle CN201910349857.7A2019-04-28Application of the qinghaosu in the hepatoma Hep G 2 cells drug candidate of preparation treatment EMT activation     https://patents.google.com/patent/CN110354118A/en     青蒿素在制备治疗EMT激活的肝癌HepG2细胞候选药物中的 应用 技术领域 本发明涉及一种肝癌治疗药物,属于生物制药技术领域,具体涉及一种青蒿素在制备治疗EMT激活的肝癌HepG2细胞候选药物中的应用。 背景技术 肝癌(HCC)是全球癌症相关死亡的主要原因之一,超过80%的肝癌病例发生在中国和非洲等发展中国家。HCC具有长潜伏期,但发展迅速通常到晚期时才被诊断出来。这些特征加上其高度入侵的可能性,导致患有该疾病的患者不能得到有效的治疗。非手术方法是必要的,因为患有大肿瘤(直径>5cm)或多个病灶(>3)的患者通常不适合肝切除术。不幸的是,单一化学治疗剂的活性是有限的,具有非常低的治疗率。 青蒿素(ART)是一种从植物青蒿(Artemesiaannua L)中分离出来的天然产物,被广泛用作抗疟疾药物。近年来,ART及其衍生物也已经显示出具有抗癌作用,其抗癌活性的主要机制是诱导细胞凋亡。青蒿素及其衍生物的选择性抗癌潜力与c-MYC, cdc25A,EGFR,γ-谷氨酰胺合成酶(GLCLR)等不同分子的表达有关。ART还在多种癌症类型及体内发挥抗癌作用。 ART还调节u-PA,MMP2,MMP7和MMP9的水平,所有这些都与转移相关。但青蒿素在肝癌细胞中的应用和作用机制研究尚少,虽然详细的机制仍有待阐明。 发明内容 为了解决现有技术存在的问题,本发明的目的在于提供一种生物治疗肿瘤候选药物青蒿素在制备抗肿瘤中的应用。 本发明是通过如下技术方案实现的: 本发明公开一种青蒿素在制备治疗EMT激活的肝癌HepG2细胞候选药物中的应用,含有药学上的治疗有效剂量的青蒿素,所述青蒿素能够通过抑制肝癌细胞HepG2 中Beta-catenin蛋白细胞质向细胞浆的转换,进而抑制EMT的发生,从而抑制HepG2 的增殖。 本发明所述的应用,所述青蒿素是从复合花序植物黄花蒿茎叶中提取的有过氧基团的倍半萜内酯的一种无色针状晶体,分子式为C15H22O5,属倍半萜内酯,制备熔点为 156-157℃,[a]D17=+66.3°(C=1.64氯仿)。 本发明所述的应用,所述青蒿素的浓度≥100μM,所述候选药物可制成片剂,其制备方法为: 1)将青蒿素和淀粉过80目筛; 2)10%淀粉浆的制备:将0.3g枸橼酸溶解于20ml蒸馏水中,再加入2g淀粉分散均匀,加热约80℃使淀粉糊化,冷却至温浆后使用; 3)称取30g青蒿素的细粉于乳钵中,等量分次加入2g淀粉进行研磨,混合均匀,加入适量淀粉浆制备软材; 4)将20目尼龙筛制备湿颗粒,将湿颗粒与50~60℃烘箱干燥30min,用20目筛进行整粒,整粒后颗粒与1.5g滑石粉和1g淀粉混合均匀,以8mm冲模进行冲模压片;即得青蒿素片剂。 本发明所述的应用,所述药物可制成混悬注射液,其制备方法为: 1)取注射用油加热至115~125℃,保温1~2小时,加入助悬剂,搅拌溶解,降温到50℃以下,备用; 2)将步骤1)的物质置于高速胶体磨中,加入青蒿素0.5~10.0g,以4000r/min的速度,高速剪切30min,制成混悬液,备用; 3)将步骤2)的液体,依次加入助悬剂0.1~5.0g、抗氧化剂0.05~0.5g、湿润剂1.0~3.0g、絮凝剂0.2~2.0g,边加边搅拌,直至完全均匀,再连续研磨10min,备用; 4)将步骤3)的研磨后的液体,置于高压均质机中,以压力50-55兆帕,进行高压均质,然后,灌装封口,包装,即得100mL青蒿混悬注射液。 本发明具有如下优点和有益技术效果: 1)发现青蒿素对人肝癌HepG2细胞具有抑制作用,并呈现良好的时间和浓度依赖性; 2)青蒿素可诱导人肝癌HepG2细胞的凋亡; 3)青蒿素可抑制Beta-catenin从细胞质向细胞核的转运,进而抑制EMT的发生,从而抑制肿瘤细胞的侵袭和转移; 本发明为研制新的抗肿瘤候选药物提供了科学依据,对开发中药新药具有重要意义。 附图说明 图1为本发明实施列1中细胞活力实验检测青蒿素对人肝癌HepG2细胞的增殖抑制作用。 图2为本发明实施列1中细胞克隆形成实验检测青蒿素对人肝癌HepG2细胞的增殖抑制作用。 图3为本发明实施列2中细胞流式实验检测青蒿素诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的作用。 图4为本发明实施列3中Western blot检测青蒿素对HepG2细胞内PARP蛋白的表达量。 图5为本发明实施列4中Western blot检测青蒿素对HepG2细胞质内Beta-catenin蛋白的影响。 具体实施方式 下面结合具体实施列和图表详细说明本发明的技术方案,但本发明并不仅限于以下的实施例。 本发明提供一种生物治疗肿瘤候选药物青蒿素在制备抗肿瘤中的应用。具体涉及一种青蒿素抑制细胞质内Beta-catenin蛋白向细胞核的转换进而诱导肝癌HepG2细胞凋亡;所述的体外实验所用的细胞株为人源肝癌细胞(HepG2)。 青蒿素的低宿主毒性,是开发青蒿素作为抗癌剂的主要动力。故本发明人发现青蒿素在人肝癌HepG2细胞中具有抗肝癌作用,可以作为抗肝癌候选药物开发的潜在价值。 本发明通过细胞活力测试、细胞克隆形成实验、细胞流式实验、Western blot实验、免疫荧光实验等研究证实了青蒿素具有诱导肝癌细胞HepG2凋亡的作用机制。 以下实验所用的青蒿素是购买于美国sigma公司。 各种试验仪器与试剂均为市售商品,均为可通过商业途径购买获得。其中,青蒿素由传统中草药黄花蒿中提取有效成分制得,购买于美国sigma公司,产品型号为361593,青蒿素含量为98%,体外实验所用的细胞株为人源肝癌细胞(HepG2),来源于美国ATCC 细胞库。 实施例1: 将青蒿素药物制成片剂,其制备方法为: 1)将青蒿素和淀粉过80目筛; 2)10%淀粉浆的制备:将0.3g枸橼酸溶解于20ml蒸馏水中,再加入2g淀粉分散均匀,加热约80℃使淀粉糊化,冷却至温浆后使用; 3)称取30g青蒿素的细粉于乳钵中,等量分次加入2g淀粉进行研磨,混合均匀,加入适量淀粉浆制备软材; 4)将20目尼龙筛制备湿颗粒,将湿颗粒与50~60℃烘箱干燥30min,用20目筛进行整粒,整粒后颗粒与1.5g滑石粉和1g淀粉混合均匀,以8mm冲模进行冲模压片;即得青蒿素片剂。 给药方法: 成人常用量:口服给药,先服1g,6~8小时再服0.5g,第2、3日各服0.5g,疗程3日,总量为2.5g。小儿15mg/kg,按上述方法3日内服完。 注意事项:妊娠早期慎用。 实施例2: 将青蒿素药物制成混悬注射液,其制备方法为: 1)取注射用油加热至115~125℃,保温1~2小时,加入助悬剂,搅拌溶解,降温到50℃以下,备用; 2)将步骤1)的物质置于高速胶体磨中,加入青蒿素0.5~10.0g,以4000r/min的速度,高速剪切30min,制成混悬液,备用; 3)将步骤2)的液体,依次加入助悬剂0.1~5.0g、抗氧化剂0.05~0.5g、湿润剂1.0~3.0g、絮凝剂0.2~2.0g,边加边搅拌,直至完全均匀,再连续研磨10min,备用; 4)将步骤3)的研磨后的液体,置于高压均质机中,以压力50-55兆帕,进行高压均质,然后,灌装封口,包装,即得100mL青蒿混悬注射液。 给药方法:深部肌注:第1次200mg,6~8小时后再给100mg,第2、3日各肌注100mg,总剂量500mg(别重症第4天再给100mg)。连用3日,每日肌注300mg,总量900mg。小儿15mg/kg,按上述方法3日内注完。 注意事项:妊娠早期慎用。 效果验证试验例 试验例1-1(青蒿素对人肝癌HepG2细胞的增殖抑制作用) 1、Cell Viability Assay法测定细胞增殖 1)取处于对数生长期,生长状态良好的HepG2细胞,用DMEM(含有10%FBS 和1%青霉素、1%链霉素)培养基调整细胞密度到3*104个/ml,接种到96孔板,每孔 100μL细胞悬液,同时设置空白组,37℃,5%CO2培养过夜。 2)待细胞贴壁生长良好24h后,弃旧的培养液,加入用DMEM培养基稀释过的青蒿素,浓度依次为0μM、50μM、100μM、150μM、200μM,每种浓度设置6个重复。阴性对照组加等量的DMEM。放入培养箱分别培养24h、48h和72h。 3)待药物作用到相应时间点后,从培养箱中取出96孔板,分别加入 20μLCellTiter-Luminescent Cell Viability Assay,注意避光,放入培养箱孵育10分钟后,使用Bio-Rad细胞城乡检测仪测量Luminescent的吸光度。 4)细胞存活率(cell viability%)=(加药组/阴性对照组)×100%。 实验重复三次,分别计算不同时间下青蒿素对人肝癌HepG2细胞的抑制情况。 试验例1-2(细胞克隆形成实验) 1)制备细胞悬液:弃旧培养基,PBS洗一遍后加1mL 0.25%的胰酶消化3min,显微镜下观察大部分细胞变圆时,弃胰酶,加2倍所加胰酶量的完全培养基终止消化,将瓶内细胞轻轻吹下,并转移到15mL离心管中,1000rpm离心5min。 2)弃上清,加入新鲜培养基,1/3的细胞悬液留种,其余备用。 3)细胞计数和铺板:细胞悬液吹打混匀后,吸取10μL加入血球计数板在显微镜下计数。向12孔板的每孔加入2ml浓度调整过的细胞悬液,细胞数为2000个/孔,置于 37℃,5%CO2培养箱中培养,使其过夜贴壁。 4)加药:弃去旧培养基,加入用DMEM培养基稀释过的青蒿素,浓度依次为0μM、 50μM、100μM、150μM,每种浓度设置3个重复。 5)将平板在37℃,5%CO2下孵育7天以允许菌落生长。在长期孵育期间,每三天更换含有不同浓度的青蒿素(0μM、50μM、100μM、150μM)的新鲜完全培养基。用 1X PBS洗涤细胞两次,0.01%结晶紫溶液染色。Gel Doc TM XR+Imager(Bio-Rad)捕获图像。为了量化集落形成的速率,将集落形式的染色细胞溶解在10%(v/v)乙酸中,在540nm处定量吸光度。 6)数据统计:细胞克隆形成率=(加药组/阴性对照组)×100%。 细胞活力结果显示:分别作用24h、48h、72h后,青蒿素能剂量依赖和时间依赖性抑制HepG2细胞的增殖。 由图1A可见,在同一作用时间的药物浓度越高,与空白对照相比细胞增殖抑制率也随着增高。 由图1B可见,在青蒿素浓度为100μM时,对人肝癌HepG2细胞的抑制有差异统计学意义。 细胞克隆形成实验结果显示:与空白对照组相比较,青蒿素对人肝癌HepG2细胞增殖具有明显的抑制作用。且在青蒿素浓度为100μM时,肝癌细胞的集落形成抑制在 50%以下,且随着青蒿素浓度增大,抑制效果越好。故后续实验我们选取青蒿素浓度为 100μM。如图2所示。 试验例2 细胞流式实验检测青蒿素诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的影响。 1)取处于对数生长期,生长状态良好的HepG2细胞,用DMEM(含有10%FBS 和1%青霉素、1%链霉素)培养基调整细胞密度到5*106个/ml,接种到6孔板,每孔100μL 细胞悬液,同时设置空白组,37℃,5%CO2培养过夜。 2)待细胞贴壁生长良好24h后,弃旧的培养液,加入用DMEM培养基稀释过的青蒿素,浓度依次为0μM、100μM,每种浓度设置3个重复。阴性对照组加等量的DMEM。放入培养箱培养24h。 3)将细胞培养液吸出至一合适离心管内,PBS洗涤贴壁细胞一次,加入适量胰酶细胞消化液(可含有EDTA)消化细胞。室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时,吸除胰酶细胞消化液。需避免胰酶的过度消化。 4)加入步骤2a中收集的细胞培养液,稍混匀,转移到离心管内,1000g离心5分钟,弃上清,收集细胞,用PBS轻轻重悬细胞并计数。注意:加入步骤1中的细胞培养液一方面可以收集已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞,另一方面细胞培养液中的血清可以有效抑制或中和残留的胰酶;残留的胰酶会消化并降解后续加入的Annexin V-PE导致染色失败。 5)取5-10万重悬的细胞,1000g离心5分钟,弃上清,加入195μl Annexin V-PE 结合液轻轻重悬细胞。 6)加入5μl Annexin V-PE,轻轻混匀。注:由于细胞样品的差异、凋亡和坏死程度的差异,可根据预实验结果优化Annexin V-PE的使用量。 7)室温(20-25℃)避光孵育10-20分钟,随后置于冰浴中。可以使用铝箔进行避光。孵育过程中可以重悬细胞2-3次以改善标记效果。 8)随即进行流式细胞仪检测。 9)数据统计。 以上实验重复三次。 实验结果显示:Annexin V-FITC/PI双染结果显示,在青蒿素药物浓度为100μM作用24h时,与空白对照相比较,实验组的细胞凋亡率增加。对照组HepG2细胞的凋亡率分别为13.36%,经100μM青蒿素处理24h后,实验组HepG2细胞的凋亡率为24.16%,其凋亡率明显升高(图3)。 试验例3 Western blot检测青蒿素对HepG2细胞内PARP蛋白表达的变化。 考察的相关蛋白有:PARP。 1)取处于对数生长期,生长状态良好的HepG2细胞,用DMEM(含有10%FBS 和1%青霉素、1%链霉素)培养基调整细胞密度到5*106个/ml,接种到6孔板,每孔100μL 细胞悬液,同时设置空白组,37℃,5%CO2培养过夜。 2)待细胞贴壁生长良好24h后,弃旧的培养液,加入用DMEM培养基稀释过的青蒿素,浓度依次为0μM、100μM、200μM每种浓度设置3个重复。阴性对照组加等量的 DMEM。放入培养箱培养24h。 3)从培养箱中取出细胞,吸掉培养基,轻轻加入冰的PBS清洗一遍,弃掉残留液体。 4)用PBS洗一遍,离心收集细胞,尽最大努力吸尽上清,留下细胞沉淀备用。 5)使用BCA试剂盒测蛋白浓度:用BSA作为标样做标准曲线,在96孔板中加入 2μl蛋白溶液和200ul BCA工作液(A:B=50:1)37℃反应30min,用酶标仪在450nm 检测吸光度,利用吸光度浓度计算公式计算样本浓度。按其中浓度最低的样品为参照,将所有样品浓度调节一致。 6)加入v/2蛋白变性loading Buffer在金属浴中95℃变性10min,离心后可直接上样,或长期保存在-80℃冰箱。 7)上样:westernblotting上样,每孔上样20ul,根据样品数量选择孔数,电压200V,时间30min左右(预制胶)。 8)转膜:切一块长9cm、宽6cm的PVDF膜和两张相同大小的滤纸,将膜放在甲醇中浸泡,滤纸、膜、凝胶和滤纸“三明治”式放置湿转250mA、90min,胶面向黑的一测即负极,切勿放错位置,做好方向标记。 9)封闭:将膜放在TBST配制5%的牛奶中封闭1h后,TBST清洗4次,每次5min。 10)孵育一抗:一抗用5%的BSA+0.02%的叠氮钠1:1000稀释。4℃摇床孵育过夜,一抗稀释液可有放在-20℃保存多次使用。 11)清洗:用TBST清洗4次,放在摇床,低速摇晃,每次10min。 12)孵育二抗:二抗用TBST配制的5%牛奶按1:5000稀释,放置在摇床,室温孵育2h。二抗稀释液最好不要反复使用。 13)清洗:使用TBST摇晃清洗4次,每次5min。 14)曝光:显影液试剂盒A与B液按1:1配用,使用时,覆盖住膜反应1min左右放入蛋白成像系统中曝光。 以上实验重复三次。 结果显示:与空白对照相比较,加入青蒿素后,HepG2细胞内PARP蛋白表达上调,差异有统计学意义(P<0.05),青蒿素能过诱导HepG2细胞凋亡。如图4所示。 试验例4 4-1青蒿素对HepG2细胞质内Beta-catenin蛋白表达的变化影响。 1.Western Blot实验检测HepG2细胞质内Beta-catenin蛋白表达 1)取处于对数生长期,生长状态良好的HepG2细胞,用DMEM(含有10%FBS 和1%青霉素、1%链霉素)培养基调整细胞密度到5*106个/ml,接种到6孔板,每孔100μL 细胞悬液,同时设置空白组,37℃,5%CO2培养过夜。 2)待细胞贴壁生长良好24h后,弃旧的培养液,加入用DMEM培养基稀释过的青蒿素,浓度依次为0μM、100μM、200μM每种浓度设置3个重复。阴性对照组加等量的 DMEM。放入培养箱培养24h。 3)从培养箱中取出细胞,吸掉培养基,轻轻加入冰的PBS清洗一遍,弃掉残留液体。 4)每20微升细胞沉淀加入200微升添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A。 5)最高速剧烈Vortex 5秒,把细胞沉淀完全悬浮并分散开。(如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开,可以适当延长vortex时间。) 6)冰浴10-15分钟。 7)加入细胞浆蛋白抽提试剂B10微升。最高速剧烈Vortex 5秒,冰浴1分钟。 8)最高速剧烈Vortex 5秒,4℃12,000-16,000g离心5分钟。 9)立即吸取上清至一预冷的塑料管中,即为抽提得到的细胞浆蛋白。可以立即使用,也可以冻存。(千万不要触及沉淀,可以在沉淀上方保留极小体积的上清,以免触及沉淀。每200万细胞用200微升本产品中的细胞浆蛋白抽提试剂A裂解后可获得的上清,其细胞浆蛋白浓度约为2-5mg/ml,不同细胞有所不同。) 10)对于沉淀,完全吸尽残余的上清,加入50微升添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂。(不吸尽上清会带来细胞浆蛋白的污染。) 11)最高速剧烈Vortex 15-30秒,把细胞沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中,每隔1-2分钟再高速剧烈Vortex 15-30秒,共30分钟。 12)4℃12,000-16,000g离心10分钟。 13)立即吸取上清至一预冷的塑料管中,即为抽提得到的细胞核蛋白。可以立即使用,也可以-70℃冻存。 14)加入100μl的RIPA细胞裂解液(含有蛋白酶抑制剂),用细胞刮铲刮下细胞,吸到EP管中,插入冰里裂解1h,期间颠倒几次使细胞裂解充分。 15)将EP管放在4℃离心机中14000rpm离心20min,取上清。 16)使用BCA试剂盒测蛋白浓度:用BSA作为标样做标准曲线,在96孔板中加入2μl蛋白溶液和200ul BCA工作液(A:B=50:1)37℃反应30min,用酶标仪在450nm 检测吸光度,利用吸光度浓度计算公式计算样本浓度。按其中浓度最低的样品为参照,将所有样品浓度调节一致。 17)加入v/2蛋白变性loading Buffer在金属浴中95℃变性10min,离心后可直接上样,或长期保存在-80℃冰箱。 18)上样:western blotting上样,每孔上样20ul,根据样品数量选择孔数,电压200V,时间30min左右(预制胶)。 19)转膜:切一块长9cm、宽6cm的PVDF膜和两张相同大小的滤纸,将膜放在甲醇中浸泡,滤纸、膜、凝胶和滤纸“三明治”式放置湿转250mA、90min,胶面向黑的一测即负极,切勿放错位置,做好方向标记。 20)封闭:将膜放在TBST配制5%的牛奶中封闭1h后,TBST清洗4次,每次5min。 21)孵育一抗:一抗用5%的BSA+0.02%的叠氮钠1:1000稀释。4℃摇床孵育过夜,一抗稀释液可有放在-20℃保存多次使用。 22)清洗:用TBST清洗4次,放在摇床,低速摇晃,每次10min。 23)孵育二抗:二抗用TBST配制的5%牛奶按1:5000稀释,放置在摇床,室温孵育2h。二抗稀释液最好不要反复使用。 24)清洗:使用TBST摇晃清洗4次,每次5min。 25)曝光:显影液试剂盒A与B液按1:1配用,使用时,覆盖住膜反应1min左右放入蛋白成像系统中曝光。 以上实验重复三次。 4-2免疫荧光实验检测HepG2细胞质内Beta-catenin蛋白表达 1)取处于对数生长期,生长状态良好的HepG2细胞,用DMEM(含有10%FBS 和1%青霉素、1%链霉素)培养基调整细胞密度到5*106个/ml,接种到6孔板,每孔100μL 细胞悬液,同时设置空白组,37℃,5%CO2培养过夜。 2)24h后,换新鲜的DMEM培养基,实验组加入浓度为100μM的青蒿素,对照组加入等量的DMSO,培养24h。 3)吸干液体,随后在细胞上覆盖一层2-3mm用PBS稀释的4%甲醛。 4)室温下固定细胞15分钟。 5)吸干固定液,用PBS漂洗三次,每次5分钟。 6)在封闭缓冲液中封闭标本60分钟。 7)封闭标本时,按照说明书中推荐的稀释比例,在抗体稀释缓冲液中配制一抗。 8)吸去封闭缓冲液,加入稀释后的一抗。 9)4℃温度下孵育过夜。 10)用PBS漂洗三次,每次5分钟。 11)用抗体稀释缓冲液将偶联荧光素的二抗稀释后,室温下避光孵育标本1-2小时。 12)二抗Hoechst避光孵育1-2小时,PBS洗3遍,每次5分钟,5%甘油封片,在共聚焦显微镜下观察。实验重复三次。 结果显示: Western blot实验结果显示,与空白对照相比较,加入青蒿素后,HepG2细胞质内Beta-catenin蛋白表达上调,差异有统计学意义(P<0.05),而细胞核内无趋势变化,青蒿素能过够抑制Beta-catenin从细胞质向细胞核的转运,进而抑制EMT的发生,从而抑制肿瘤细胞的侵袭和转移(如图5A-5B所示)。免疫荧光结果与Western blot结果相符合(如图5C所示)。 以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非对本发明作任何形式上的限制,故凡是未脱离本发明技术方案内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。    
    Claims (5)     1.青蒿素在制备治疗EMT激活的肝癌HepG2细胞候选药物中的应用,其特征在于:含有药学上的治疗有效剂量的青蒿素,所述青蒿素能够通过抑制肝癌细胞HepG2中Beta-catenin蛋白细胞质向细胞浆的转换,进而抑制EMT的发生,从而抑制HepG2的增殖。 2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述青蒿素是从复合花序植物黄花蒿茎叶中提取的有过氧基团的倍半萜内酯的一种无色针状晶体,分子式为C15H22O5,属倍半萜内酯,制备熔点为156-157℃,[a]D17=+66.3°(C=1.64氯仿)。 3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述青蒿素的浓度≥100μM。 4.根据权利要求1-3任一项所述的应用,其特征在于:所述候选药物可制成片剂,其制备方法为: 1)将青蒿素和淀粉过80目筛; 2)10%淀粉浆的制备:将0.3g枸橼酸溶解于20ml蒸馏水中,再加入2g淀粉分散均匀,加热约80℃使淀粉糊化,冷却至温浆后使用; 3)称取30g青蒿素的细粉于乳钵中,等量分次加入2g淀粉进行研磨,混合均匀,加入适量淀粉浆制备软材; 4)将20目尼龙筛制备湿颗粒,将湿颗粒与50~60℃烘箱干燥30min,用20目筛进行整粒,整粒后颗粒与1.5g滑石粉和1g淀粉混合均匀,以8mm冲模进行冲模压片;即得青蒿素片剂。 5.根据权利要求1-3中任一项所述的应用,其特征在于:所述药物可制成混悬注射液,其制备方法为: 1)取注射用油加热至115~125℃,保温1~2小时,加入助悬剂,搅拌溶解,降温到50℃以下,备用; 2)将步骤1)的物质置于高速胶体磨中,加入青蒿素0.5~l0.0g,以4000r/min的速度,高速剪切30min,制成混悬液,备用; 3)将步骤2)的液体,依次加入助悬剂0.1~5.0g、抗氧化剂0.05~0.5g、湿润剂1.0~3.0g、絮凝剂0.2~2.0g,边加边搅拌,直至完全均匀,再连续研磨10min,备用; 4)将步骤3)的研磨后的液体,置于高压均质机中,以压力50-55兆帕,进行高压均质,然后,灌装封口,包装,即得100mL青蒿混悬注射液。   Patent Citations (1)
    Publication numberPriority datePublication dateAssigneeTitle CN101856352A *2009-04-102010-10-13中国科学院上海生命科学研究院青蒿素及其衍生物对化疗剂的协同作用 Family To Family Citations * Cited by examiner, † Cited by third party Non-Patent Citations (1)
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  14. Roger
    The invention belongs to biomedicine technical fields, specifically, being related to a kind of combination product and its application for preventing and/or treating cerebral ischemia.The combination product is the pharmaceutical composition containing Sur1 inhibitor and qinghaosu Sesquiterpene lactones compound;Or the combination for the first medicament containing Sur1 inhibitor and the second medicament containing qinghaosu Sesquiterpene lactones compound.Sur1 inhibitor and qinghaosu Sesquiterpene lactones compound are formed combination product by the present invention in appropriate proportions, has the function of synergy, than being applied alone Sur1 inhibitor or qinghaosu Sesquiterpene lactones compound to have better therapeutic effect to cerebral ischemia diseases. 本发明属于生物医药技术领域,具体地说,涉及一种用于预防和/或治疗脑缺血的组合产品及其应用。所述的组合产品为含有Sur1抑制剂和青蒿素倍半萜内酯类化合物的药物组合物;或为含有Sur1抑制剂的第一药剂和含有青蒿素倍半萜内酯类化合物的第二药剂的组合。本发明将Sur1抑制剂和青蒿素倍半萜内酯类化合物以适当比例形成组合产品,具有协同增效的作用,比单用Sur1抑制剂或者青蒿素倍半萜内酯类化合物对脑缺血性疾病有更好的治疗效果。   A kind of combination product and its application for preventing and/or treating cerebral ischemia Technical field The invention belongs to biomedicine technical fields, specifically, being related to a kind of for preventing and/or treating cerebral ischemia Combination product and its application. Background technology Cerebral arterial thrombosis has high incidence, high mortality, high disability rate, high relapse rate, the several spies of high health care costs Point is the great chronic disease for endangering China's residents ' health.Clinical data statistics display, the global cerebral apoplexy death rate already exceed cancer Disease becomes the highest disease of the Single diseases death rate.It is well known that inflammatory reaction is the important set during cerebral ischemia pathology damage At part, and aggravate the latency of cerebral ischemia.In addition to this, cerebral arterial thrombosis is often accompanied by brain edema and hemorrhagic Conversion, wherein brain edema is the complication of cerebral arterial thrombosis most serious, and 80% dies of the palsy later stage in apoplexy patient death Pernicious brain edema.Therefore the prevention of inflammation and brain edema is significant to the treatment of cerebral arterial thrombosis. Sulfonylureas receptor 1 (sulfonylurea receptor 1, Sur1)-transient receptor potential channel M4 types The channel (transient receptor potential melastatin 4, Trpm4) plays the formation of brain edema important Effect.Pertinent literature reports, cerebral arterial thrombosis occur be within 4-8 hour brain edema formation critical period, in this period ischemic The Sur1 receptors in the position channels cerebrovascular tapetum cell film Sur1-Trpm4 will appear the expression of irritability height, the Sur1 of great expression Receptor causes the channels Sur1-Trpm4 to be activated.The activation in the channels Sur1-Trpm4 increases cationic especially sodium ion and enters cell It is interior, since the reason driving water of osmotic pressure pours in into the cell, causes ishemic part cell or even tissue that oedema occurs, be soldier There is the key pathological mechanism of brain edema in middle patient.Sur1 inhibitor is combined the opening for inhibiting this channel with Sur1 receptors, from And effectively inhibit the formation of brain edema.Representative Sur1 inhibitor glibenclamide is directed to the treatment of palsy associated with hydrocephalus in U.S. State enters the clinical III phases. Qinghaosu and its derivative are a kind of new antimalarial agents of China scientific worker research and development, are now widely used for The treatment of malaria.With the continuous deepening of research, other than its Antimalarial, scientist is also found that qinghaosu and its spreads out in succession Biology pharmacological action in other respects, including antitumor action, the effect to immunocyte, anti-fibrosis effect, it is anti-it is fat, Anti-diabetic and antifungic action etc., wherein Antimalarial and antitumor action are the most noticeable.Qinghaosu and its derivative Research of the object in terms of inflammatory is based primarily upon its therapeutic effect to autoimmune disease, such as lupus erythematosus and rheumatoid arthrosis Inflammation, researches show that it includes NF-Kb and cell factor, such as IL-1, IL-6 and IL-8 etc. equal to multiple inflammatory relevant target proteins There is regulating and controlling effect.But the application of qinghaosu and its derivative in terms for the treatment of cerebral ischemia diseases so far there are no research report. In view of this special to propose the present invention. Invention content The technical problem to be solved in the present invention is to overcome the deficiencies of the prior art and provide a kind of for preventing and/or controlling Combination product and its application of cerebral ischemia are treated, has synergistic effect between the ingredient of the combination product. In order to solve the above technical problems, the present invention adopts the following technical scheme that: A kind of combination product for preventing and/or treating cerebral ischemia, wherein the combination product is to press down containing Sur1 The pharmaceutical composition of preparation and qinghaosu Sesquiterpene lactones compound; Or it is the first medicament containing Sur1 inhibitor and the second medicament containing qinghaosu Sesquiterpene lactones compound Combination. Specifically, on the one hand, it is provided by the present invention for preventing and/or treating the combination product of cerebral ischemia, it can be with It is that Sur1 inhibitor and qinghaosu Sesquiterpene lactones compound are put together and to form a kind of pharmaceutical composition, the pharmaceutical composition Can a kind of compound preparation further be made with pharmaceutically acceptable auxiliary material in object. On the other hand, provided by the present invention for preventing and/or treat the combination product of cerebral ischemia, can also be by containing There are the first medicament of Sur1 inhibitor and the second medicament containing qinghaosu Sesquiterpene lactones compound to carry out drug combination. When drug combination, the medication of the first medicament and second medicament sequence in no particular order, can be first with the first medicament, can also be first with the Two medicaments can simultaneously be used with two medicaments. Further, in the pharmaceutical composition Sur1 inhibitor and qinghaosu Sesquiterpene lactones compound quality Than for (1~3):(2500~5000); Qinghaosu Sesquiterpene lactones compound in Sur1 inhibitor and second medicament in first medicament in the combination Mass ratio be (1~3):(2500~5000). Further, the pharmaceutical composition is Sur1 inhibitor, qinghaosu Sesquiterpene lactones compound and pharmacy Pharmaceutically acceptable dosage form, optimizing injection, more preferable injection or freeze-dried powder is made in upper acceptable auxiliary material. Its supplementary product kind and preparation method can refer to the prior art. Further, first medicament is made with pharmaceutically acceptable auxiliary material for Sur1 inhibitor and can pharmaceutically connect The dosage form received; The second medicament is that pharmacy is made with pharmaceutically acceptable auxiliary material in qinghaosu Sesquiterpene lactones compound Upper acceptable dosage form, optimizing injection, more preferable injection or freeze-dried powder. In the present invention, by the first medicament containing Sur1 inhibitor and qinghaosu Sesquiterpene lactones compound can be contained Second medicament carry out drug combination.First medicament or second medicament can be existing preparations in the prior art, Can be that Sur1 inhibitor or qinghaosu Sesquiterpene lactones compound are added pharmaceutically acceptable auxiliary material respectively to make respectively At pharmaceutically acceptable dosage form.The preparation method of supplementary product kind and each dosage form can refer to the prior art. Further, the Sur1 inhibitor is selected from glibenclamide, orinase, Repaglinide, meglitinide, miaow One or more of lattice row azoles or Glimepiride. Further, the qinghaosu Sesquiterpene lactones compound be the sesquiterpene lactone extracted from artemisia annua and The derivative of qinghaosu. Further, the qinghaosu Sesquiterpene lactones compound is Artesunate, dihydroartemisinine or Artemether. The present invention also provides the combination products to prepare the application in treating Imaging in Patients with Cerebral Ischemia Disease drug. The cerebral ischemia is cerebral apoplexy. After adopting the above technical scheme, the present invention has the advantages that compared with prior art: The present invention provides a kind of containing Sur1 inhibitor and qinghaosu Sesquiterpene lactones compound, wherein Sur1 inhibitor Can be by inhibiting sur1 to mitigate brain edema, and qinghaosu Sesquiterpene lactones compound can be by inhibiting inflammatory factor and related egg White hair waves anti-inflammatory effect.The two has the function of synergy when being used cooperatively in appropriate proportions.By Sur1 inhibitor and sweet wormwood Plain Sesquiterpene lactones compound drug combination in appropriate proportions, can be than being applied alone in Sur1 inhibitor or qinghaosu sequiterpene Ester type compound has better therapeutic effect to cerebral ischemia diseases. The specific implementation mode of the present invention is described in further detail below in conjunction with the accompanying drawings. Description of the drawings Fig. 1 shows cerebral infarction volume percentage, sham-operation group vs model groups,###P < 0.001;Administration group vs model groups,**P < 0.01,*P < 0.05; Fig. 2 shows edema volume percentage, sham-operation group vs model groups,###p<0.001;Administration group vs model groups,**P < 0.01; Fig. 3 shows Serum TNF-α and IL-6 expressions, sham-operation group vs model groups,###P < 0.001;Administration group vs models Group,***P < 0.001,*P < 0.05; It should be noted that these attached drawings and verbal description are not intended to the design model limiting the invention in any way It encloses, but is that those skilled in the art illustrate idea of the invention by referring to specific embodiments. Specific implementation mode In order to make the object, technical scheme and advantages of the embodiment of the invention clearer, below in conjunction with the embodiment of the present invention In attached drawing, the technical solution in embodiment is clearly and completely described, following embodiment for illustrating the present invention, but It is not limited to the scope of the present invention. It is below embodiment 1 to embodiment 7, the composition of pharmaceutical composition is shown in Table 1 in each embodiment, preparation method To weigh each substance by the quality, then it is mixed uniformly to get pharmaceutical composition. Table 1   Aforementioned pharmaceutical compositions can further add pharmaceutically acceptable auxiliary material and be prepared into pharmaceutically acceptable dosage form, Optimizing injection, including but not limited to injection or freeze-dried powder. The research of test example 1, glibenclamide and Artesunate to cerebral ischemia reperfusion mouse brain injury protective effect It prepares Kunming mouse MCAO ischemia-reperfusion models and causes cerebral ischemia and Brain edema, give glibenclamide and sweet wormwood amber Ester injection treatment, does positive control, after the treatment by infarction of brain volume ratio, edema volume with Edaravone Injection Than, the evaluation of measuring Sur1 inhibitor glibenclamide and sweet wormwood of Neuroscore and brain tissue inflammation's factor TNF-α and IL-6 Plain Sesquiterpene lactones compound is combined the therapeutic effect to cerebral apoplexy. 1, experimental animal and grouping Kunming mouse 90 (is purchased from Kunming Medical University's SPF Animal Lab), male, 25-28g.It is randomly divided into 9 Experimental group, every group 10, including: 1. sham-operation group:Arteria carotis communis, external carotid artery and internal carotid, but the not embolism cerebrovascular are isolated, iv approach is given Give the solvent (0.9% physiological saline) for the treatment of group's equivalent; 2. model control group:It prepares cerebral ischemia (MCAO) and fills model again, intravenous injection (iv) approach is given with treatment group etc. The solvent (0.9% physiological saline) of amount; 3. 10 μ g/kg groups of glibenclamide:Cerebral ischemic model is prepared, iv approach gives glibenclamide; 4. 30 μ g/kg groups of glibenclamide:Cerebral ischemic model is prepared, iv approach gives glibenclamide; 5. Artesunate 25mg/kg groups:Cerebral ischemic model is prepared, iv approach gives Artesunate; 6. Artesunate 50mg/kg groups:Cerebral ischemic model is prepared, iv approach gives Artesunate; 7. 10 μ g/kg+ Artesunate 25mg/kg groups of glibenclamide:Cerebral ischemic model is prepared, iv approach gives glibenclamide And Artesunate 8. 30 μ g/kg+ Artesunate 50mg/kg groups of glibenclamide:Cerebral ischemic model is prepared, iv approach gives glibenclamide And Artesunate Positive drug 9. (Edaravone 3mg/kg) control group:Cerebral ischemic model is prepared, iv approach gives Edaravone; 2, prepared by model: Arterial occlusion (MCAO) model in transience mouse brain is prepared using line brush.Its operating procedure is as follows:First will Record of weighing after healthy Kunming mouse number is lain on the back and is fixed on operating table with 4% chloraldurate intraperitoneal injection of anesthesia, 60 DEG C of incandescent lamp irradiations are being placed at operating table 30cm, and mouse temperature is made to maintain 37 DEG C or so.It cuts neck and hits exactly skin Skin detaches subcutaneous tissue and is bubbled body of gland, exposes ectotrachea muscle, and separating mouse right muscles, to isolate right side neck total Artery (CCA), external carotid artery (ECA) and internal carotid (ICA), in CCA proximal parts and ECA distal ends, (distance CCA crotches are about 5mm) place's hanging wire is spare.Then distal end ligatures CCA and ECA.With No. 2 syringe needles from CCA away from slotting from the about 0.5cm of the forks ECA and ICA Enter line bolt.Insertion depth touches bolt line to when about 1cm (at mark point) with ophthalmic tweezers, feels that the when of having resistance indicates to have been inserted into Position, at this moment gently fastens bolt line, skin suture with filament.Nylon embolus line is extracted after 2h, so that its blood flow is led to again, is divided cage to put mouse Raising, pays attention to warming in steaming again. 3, it is administered Glibenclamide is administered successively in three times for 0h after ischemia-reperfusion (being administered immediately after pulling out Outlet bolt), 3h and 6h, Administering mode is tail vein injection (iv).Artesunate is 0h Bolos intravenous administrations after ischemia-reperfusion.Artesunate is with 5% NaHCO3Dissolving, glibenclamide are dissolved by heating with 1% meglumine. 4, experimental endpoints sample collection It before putting to death rat, detaches abdominal aorta and takes blood 4mL, after standing 1h, 3000r/min centrifuges 10min, draws blood Clearly.- 20 DEG C of refrigerators are put into, TNF-α and IL-6 concentration are measured using Double antibody sandwich-ELISA (ELISA).Strictly It is operated by ELISA kit operation instructions. 5, evaluation index 5.1 Neuroscore:After rat operation for 24 hours, neurological deficit score is carried out to experimental animal and recorded, methods of marking For Longa methods, standards of grading are as follows: 0 point:Impassivity defective symptom; 1 point:Offside forelimb cannot stretch completely; 2 points:It turn-takes to offside; 3 points:It walks and is tilted to offside; 4 points:It spontaneous cannot walk, the loss of consciousness. 5.2 cerebral infarction volumes detect 5.3 brain water contents measure:Swelling volume and swelling percentage are calculated using swelling volumetric method. 6, statistical analysis Each level area of brain section, infarct size etc. are measured using Imagepro plus6.0.Pass through Graphpad 5 softwares of Prism are for statistical analysis to data, one-way or two-way repeat measure ANOVA post-hoc Dunnett ' test carry out comparison among groups, and the standard of significant difference is 0.05. 7, experimental result 7.1 cerebral infarction volumes detect:By ischemia-reperfusion for 24 hours after mouse row excessively anaesthetize, directly take brain after broken end, set In in mouse brain mold, then it is sliced from front to back by brain is coronal, is divided into 4, is put in 1.0%TTC solution, 37 DEG C are protected from light 10min dyeing is incubated, infarcted region is not colored, and normal cerebral tissue dyes red.Then it takes pictures, passes through to every a piece of brain piece Imagepro plus6.0 image analysis systems measure each level area, ischemic areas, half brain area of ischemic side (homonymy area), Half brain area (to lateral area) of non-ischemic side calculates respective volume (mm in conjunction with slice thickness3), and calculate Infarction volume and account for offside The percentage of cerebral hemisphere volume.The results are shown in Figure 1, model group, positive controls (Edaravone -3mg/kg), Ge Lieben Urea 10ug/kg, glibenclamide 30ug/kg, Artesunate 25mg/kg groups, Artesunate 50mg/kg groups, glibenclamide 10ug/kg + Artesunate 25mg/kg combinations group, glibenclamide 30ug/kg+ Artesunate 50mg/kg combination groups are compared with sham-operation group, all There is different degrees of infarct, shows that MCAO ischemia-reperfusion models are successfully established;Wherein, compared with model group, Artesunate 25mg/kg groups, Artesunate 50mg/kg groups, glibenclamide 10ug/kg+ Artesunate 25mg/kg combination group glibenclamides 30ug/kg+ Artesunate 50mg/kg combinations groups can be substantially reduced infarct size, and be better than positive controls. 7.2 experiments calculate swelling volume and swelling percentage using swelling volumetric method.As shown in Fig. 2, compared with model group, Glibenclamide 30ug/kg and glibenclamide 30ug/kg+ Artesunate 50mg/kg combinations groups can significantly mitigate Brain edema, and be better than Positive controls. 7.3 Neurological deficits Neurological deficits reflect the case where drug improves prognosis to mouse cerebral apoplexy, and the results are shown in Table 1: Table 1, embodiment MACO mouse Nerves neurological deficit score (n=6) Group Neurological deficits (average value) Sham-operation group 0 Model group 3.2 Glibenclamide 10ug/kg 2.1 Glibenclamide 30ug/kg 2.0 Artesunate 25mg/kg 2.4 Artesunate 50mg/kg 2.1 Glibenclamide 10ug/kg+ Artesunates 25mg/kg 1.6 Glibenclamide 30ug/kg+ Artesunates 50mg/kg 1.2 Edaravone 3mg/kg 1.8 TNF-α and IL-6 are horizontal in 7.4 serum Using enzyme-linked immunization, detects separate groups of mice serum cytokines TNF-α and IL-6 is horizontal.As a result it shows:With Normal group mouse is compared, model group TNF-α and IL-6 contents significantly increase (###p<0.001);Compared with model group mouse, Artesunate group, glibenclamide 10ug/kg+ Artesunates 25mg/kg combinations group and glibenclamide 30ug/kg+ Artesunates 50mg/kg combinations group can significantly reduce TNF-α and IL-6 contents in serum (***p<0.001,*p<0.05).As a result see Fig. 3: 8, conclusion Show from the mouse MCAO ischemia-reperfusion models treatment drug effect evaluation result carried out in animal level green in the present invention Artemisic succinate, glibenclamide and Artesunate combination can significantly reduce Serum TNF-α and IL-6 contents, reduce brain edema and infraction, Especially combination group can improve prognosis, improve life in patients, have good development and application values. Above-mentioned experiment is also carried out to the other combination products of the present invention, the result obtained is similar to above-mentioned test result. The above is only presently preferred embodiments of the present invention, is not intended to limit the present invention in any form, though So the present invention has been disclosed as a preferred embodiment, and however, it is not intended to limit the invention, the technology people of any familiar present invention Member without departing from the scope of the present invention, when the technology contents using above-mentioned prompt make it is a little variation or be modified to The equivalent embodiment of equivalent variations, it is right according to the technical essence of the invention as long as being the content without departing from technical solution of the present invention Any simple modification, equivalent change and modification made by above example, in the range of still falling within the present invention program.    
    Claims (9)   1. a kind of for preventing and/or treating the combination product of cerebral ischemia, which is characterized in that the combination product be containing The pharmaceutical composition of Sur1 inhibitor and qinghaosu Sesquiterpene lactones compound; Or the group for the first medicament containing Sur1 inhibitor and the second medicament containing qinghaosu Sesquiterpene lactones compound It closes.   2. combination product according to claim 1, which is characterized in that Sur1 inhibitor and blueness in the pharmaceutical composition The mass ratio of artemisin Sesquiterpene lactones compound is (1~3):(2500~5000); In the combination in the first medicament in Sur1 inhibitor and second medicament qinghaosu Sesquiterpene lactones compound matter Amount is than being (1~3):(2500~5000).   3. combination product according to claim 1 or 2, which is characterized in that the pharmaceutical composition be Sur1 inhibitor, Pharmaceutically acceptable dosage form is made with pharmaceutically acceptable auxiliary material in qinghaosu Sesquiterpene lactones compound, preferably injects Agent, more preferable injection or freeze-dried powder.   4. combination product according to claim 1 or 2, which is characterized in that first medicament be Sur1 inhibitor with Pharmaceutically acceptable dosage form is made in pharmaceutically acceptable auxiliary material; The second medicament is that qinghaosu Sesquiterpene lactones compound and pharmaceutically acceptable auxiliary material are made and pharmaceutically may be used The dosage form of receiving, optimizing injection, more preferable injection or freeze-dried powder.   5. combination product according to any one of claims 1-4, which is characterized in that the Sur1 inhibitor is selected from lattice Arrange one or more of this urea, orinase, Repaglinide, meglitinide, midaglizole or Glimepiride.   6. according to the combination product described in claim 1-5 any one, which is characterized in that the qinghaosu sesquiterpene lactone Class compound is the sesquiterpene lactone extracted from artemisia annua and the derivative of qinghaosu.   7. combination product according to claim 6, which is characterized in that the qinghaosu Sesquiterpene lactones compound is Artesunate, dihydroartemisinine or Artemether.   8. the combination product described in claim 1-7 any one is preparing the application in treating Imaging in Patients with Cerebral Ischemia Disease drug.   9. application according to claim 8, which is characterized in that the cerebral ischemia is cerebral apoplexy.   Patent Citations (2)
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    ApplicationFiling dateTitle CN201810246790.XA2018-03-23A kind of combination product and its application for preventing and/or treating cerebral ischemia   https://patents.google.com/patent/CN108310387A/en         一种用于预防和/或治疗脑缺血的组合产品及其应用 技术领域 本发明属于生物医药技术领域,具体地说,涉及一种用于预防和/或治疗脑缺血的组合产品及其应用。 背景技术 缺血性脑卒中具有高发病率、高死亡率、高致残率、高复发率、高医疗花费几个特点,是危害我国居民健康的重大慢性病。临床数据统计显示,全球脑卒中死亡率已经超过癌症成为单病种死亡率最高的疾病。众所周知,炎症反应是脑缺血病理损伤过程中的重要组成部分,也是加重脑缺血损伤的潜在因素。除此之外,缺血性脑卒中常伴有脑水肿和出血性转化,其中脑水肿是缺血性脑卒中最严重的并发症,卒中患者死亡中80%死于卒中后期的恶性脑水肿。因此炎症及脑水肿的防治对缺血性脑卒中的治疗有重要意义。 磺脲类受体1(sulfonylurea receptor 1,Sur1)-瞬时受体电位通道M4型(transient receptor potential melastatin 4,Trpm4)通道对于脑水肿的形成起着重要作用。相关文献报道,缺血性脑卒中发生4-8小时是脑水肿形成的关键时期,在这时期缺血部位脑血管内壁细胞膜Sur1-Trpm4通道的Sur1受体会出现应激性高表达,大量表达的Sur1受体导致Sur1-Trpm4通道激活。Sur1-Trpm4通道的激活增加阳离子特别是钠离子进入细胞内,由于渗透压的缘故驱动水大量涌入细胞内,引起缺血部位细胞乃至组织发生水肿,是卒中患者出现脑水肿的关键病理机制。Sur1抑制剂与Sur1受体结合抑制这个通道的开放,从而有效地抑制脑水肿的形成。代表性Sur1抑制剂格列本脲针对卒中后脑水肿的治疗已在美国进入临床III期。 青蒿素及其衍生物是我国科学工作者研究开发的一类抗疟新药,目前广泛应用于疟疾的治疗。随着研究的不断深入,除了其抗疟作用外,科学家还相继发现了青蒿素及其衍生物在其他方面的药理作用,包括抗肿瘤作用、对免疫细胞的作用、抗纤维化作用、抗肥胖、抗糖尿病以及抗真菌作用等,其中抗疟作用和抗肿瘤作用最为引人关注。青蒿素及其衍生物在炎性方面的研究主要基于其对自身免疫性疾病的治疗作用,如红斑狼疮和类风湿关节炎,研究显示其对多个炎性相关靶蛋白包括NF-Kb和细胞因子,例如IL-1、IL-6和IL-8等均有调控作用。但青蒿素及其衍生物在治疗脑缺血性疾病方面的应用至今未见研究报道。 有鉴于此特提出本发明。 发明内容 本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足,提供一种用于预防和/或治疗脑缺血的组合产品及其应用,该组合产品的成分之间具备协同增效的作用。 为解决上述技术问题,本发明采用如下技术方案: 一种用于预防和/或治疗脑缺血的组合产品,其中,所述的组合产品为含有Sur1抑制剂和青蒿素倍半萜内酯类化合物的药物组合物; 或为含有Sur1抑制剂的第一药剂和含有青蒿素倍半萜内酯类化合物的第二药剂的组合。 具体地说,一方面,本发明所提供的用于预防和/或治疗脑缺血的组合产品,可以是将Sur1抑制剂和青蒿素倍半萜内酯类化合物放在一起形成一种药物组合物,该药物组合物可进一步与药学上可接受的辅料制成一种复方制剂。 另一方面,本发明所提供的用于预防和/或治疗脑缺血的组合产品,也可以是将含有Sur1抑制剂的第一药剂和含有青蒿素倍半萜内酯类化合物的第二药剂进行联合用药。在联合用药时,第一药剂与第二药剂的用药顺序不分先后,可以先用第一药剂,也可以先用第二药剂,还可以两个药剂同时使用。 进一步的,所述的药物组合物中Sur1抑制剂和青蒿素倍半萜内酯类化合物的质量比为(1~3):(2500~5000); 所述的组合中第一药剂中Sur1抑制剂和第二药剂中青蒿素倍半萜内酯类化合物的质量比为(1~3):(2500~5000)。 进一步的,所述的药物组合物为Sur1抑制剂、青蒿素倍半萜内酯类化合物与药学上可接受的辅料制成药学上可接受的剂型,优选注射剂,更优选注射液或冻干粉针。 其辅料种类和制备方法可参照现有技术。 进一步的,所述的第一药剂为Sur1抑制剂与药学上可接受的辅料制成药学上可接受的剂型; 所述的第二药剂为青蒿素倍半萜内酯类化合物与药学上可接受的辅料制成药学上可接受的剂型,优选注射剂,更优选注射液或冻干粉针。 本发明中,可以将含有Sur1抑制剂的第一药剂和含有青蒿素倍半萜内酯类化合物的第二药剂进行联合用药。所述的第一药剂或第二药剂可以是现有技术中已有的制剂,也可以是将Sur1抑制剂或青蒿素倍半萜内酯类化合物分别添加药学上可接受的辅料分别制成药学上可接受的剂型。辅料种类和各剂型的制备方法可参照现有技术。 进一步的,所述的Sur1抑制剂选自格列本脲、甲苯磺丁脲、瑞格列奈、美格列奈、咪格列唑或格列美脲中的一种或几种。 进一步的,所述的青蒿素倍半萜内酯类化合物是从黄花蒿中提取的倍半萜内酯及青蒿素的衍生物。 进一步的,所述的青蒿素倍半萜内酯类化合物为青蒿琥酯、双氢青蒿素或蒿甲醚。 本发明还提供所述的组合产品在制备治疗脑缺血疾病药物中的应用。 所述的脑缺血为脑卒中。 采用上述技术方案后,本发明与现有技术相比具有以下有益效果: 本发明提供一种含有Sur1抑制剂和青蒿素倍半萜内酯类化合物,其中Sur1抑制剂可通过抑制sur1减轻脑水肿,而青蒿素倍半萜内酯类化合物可通过抑制炎症因子及相关蛋白发挥抗炎作用。两者以适当比例配合使用时具有协同增效的作用。将Sur1抑制剂和青蒿素倍半萜内酯类化合物以适当比例联合用药,可以比单用Sur1抑制剂或者青蒿素倍半萜内酯类化合物对脑缺血性疾病有更好的治疗效果。 下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。 附图说明 图1示脑梗死体积百分比,假手术组vs模型组,###p<0.001;给药组vs模型组,**p<0.01,*p<0.05; 图2示脑水肿体积百分比,假手术组vs模型组,###p<0.001;给药组vs模型组,**p<0.01; 图3示血清TNF-α和IL-6表达水平,假手术组vs模型组,###p<0.001;给药组vs模型组,***p<0.001,*p<0.05; 需要说明的是,这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围,而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。 具体实施方式 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例中的附图,对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。 以下为实施例1至实施例7,各实施例中药物组合物的组成见表1所示,其制备方法为按所述质量称取各物质,然后将其混合均匀,即得药物组合物。 表1   上述药物组合物可进一步添加药学上可接受的辅料制备成药学上可接受的剂型,优选注射剂,包括但不限于注射液或冻干粉针。 试验例1、格列本脲与青蒿琥酯对脑缺血再灌小鼠脑损伤保护作用的研究 制备昆明种小鼠MCAO缺血再灌模型造成脑缺血及脑肿胀,给予格列本脲及青蒿琥酯注射治疗,用依达拉奉注射液做阳性对照,在治疗后通过对大脑梗死体积比、水肿体积比、神经功能评分、及脑组织炎症因子TNF-α和IL-6的测定评价Sur1抑制剂格列本脲及青蒿素倍半萜内酯类化合物联用对脑卒中的治疗作用。 1、实验动物及分组 昆明种小鼠90只(购自昆明医科大学SPF动物实验室),雄性,25-28g。随机分为9个实验组,每组10只,包括: ①假手术组:分离出颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉,但不栓塞脑血管,iv途径给予治疗组等量的溶剂(0.9%生理盐水); ②模型对照组:制备脑缺血(MCAO)再灌模型,静脉注射(iv)途径给予与治疗组等量的溶剂(0.9%生理盐水); ③格列本脲10μg/kg组:制备脑缺血模型,iv途径给予格列本脲; ④格列本脲30μg/kg组:制备脑缺血模型,iv途径给予格列本脲; ⑤青蒿琥酯25mg/kg组:制备脑缺血模型,iv途径给予青蒿琥酯; ⑥青蒿琥酯50mg/kg组:制备脑缺血模型,iv途径给予青蒿琥酯; ⑦格列本脲10μg/kg+青蒿琥酯25mg/kg组:制备脑缺血模型,iv途径给予格列本脲及青蒿琥酯 ⑧格列本脲30μg/kg+青蒿琥酯50mg/kg组:制备脑缺血模型,iv途径给予格列本脲及青蒿琥酯 ⑨阳性药(依达拉奉3mg/kg)对照组:制备脑缺血模型,iv途径给予依达拉奉; 2、模型制备: 采用线栓法制备短暂性小鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型。其操作步骤如下:先将健康昆明种小鼠编号后称重记录,以4%的水合氯醛腹腔注射麻醉,仰卧固定于手术台上,在距离手术台30cm处放置60℃白炽灯照射,使小鼠体温维持在37℃左右。切开颈部正中皮肤,分离皮下组织及鼓泡腺体,暴露出气管外层肌肉,分离小鼠右侧肌肉、分离出右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA),在CCA近心端及ECA远心端(距离CCA分叉处约5mm)处挂线备用。然后远心端结扎CCA和ECA。用2号针头从CCA距ECA和ICA岔口约0.5cm处插入线栓。插入深度到约1cm(标记点处)时用眼科镊轻推栓线,感觉到有阻力时即表示已插到位,这时用细线轻轻系牢栓线,缝合皮肤。2h后拔出尼龙栓线,使其血流再通,将小鼠分笼放回笼内饲养,注意保暖。 3、给药 格列本脲为缺血再灌注后0h(即拔出线栓后立即给药)、3h和6h分三次依次给药,给药方式为尾静脉注射(iv)。青蒿琥酯为缺血再灌注后0h静注给药。青蒿琥酯用5%的NaHCO3溶解,格列本脲均用1%的葡甲胺加热溶解。 4、实验终点样品采集 在处死大鼠前,分离腹主动脉并取血4mL,静置1h后,3000r/min离心10min,吸取血清。放入-20℃冰箱,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定TNF-α和IL-6浓度。严格按ELISA试剂盒使用说明书操作。 5、评价指标 5.1神经功能评分:大鼠手术后24h,对实验动物进行行为学评分并记录,评分方法为Longa法,评分标准如下: 0分:无神经缺损症状; 1分:对侧前肢不能完全伸直; 2分:向对侧转圈; 3分:行走向对侧倾斜; 4分:不能自发行走,意识丧失。 5.2脑梗死体积检测 5.3脑含水量测定:采用肿胀体积法计算肿胀体积及肿胀百分比。 6、统计学分析 采用Imagepro plus6.0测定脑切片各层面面积、梗死面积等。通过GraphpadPrism 5软件对数据进行统计分析,one-way或two-way repeat measure ANOVA post-hocDunnett’test进行组间比较,显著性差异的标准为0.05。 7、实验结果 7.1脑梗死体积检测:将缺血再灌注24h后的小鼠行过量麻醉,直接断头后取脑,置于小鼠脑模具内,然后将大脑冠状从前向后切片,分为4片,放于1.0%TTC溶液中,37℃避光温育10min染色,梗死区不着色,正常脑组织染成红色。然后对每一片脑片进行拍照,经Imagepro plus6.0图像分析系统测量各层面面积、缺血面积、缺血侧半脑面积(同侧面积)、未缺血侧半脑面积(对侧面积),结合切片厚度计算相应体积(mm3),并计算梗死体积占对侧大脑半球体积的百分比。结果如图1所示,模型组、阳性对照组(依达拉奉-3mg/kg)、格列本脲10ug/kg、格列本脲30ug/kg、青蒿琥酯25mg/kg组、青蒿琥酯50mg/kg组、格列本脲10ug/kg+青蒿琥酯25mg/kg联用组、格列本脲30ug/kg+青蒿琥酯50mg/kg联用组与假手术组相比,都出现了不同程度梗死,表明MCAO缺血再灌模型成功建立;其中,与模型组相比,青蒿琥酯25mg/kg组、青蒿琥酯50mg/kg组、格列本脲10ug/kg+青蒿琥酯25mg/kg联用组格列本脲30ug/kg+青蒿琥酯50mg/kg联用组能显著减小梗死面积,且优于阳性对照组。 7.2实验采用肿胀体积法计算肿胀体积及肿胀百分比。如图2所示,与模型组比较,格列本脲30ug/kg和格列本脲30ug/kg+青蒿琥酯50mg/kg联用组能显著减轻脑肿胀,且优于阳性对照组。 7.3神经行为学评分 神经行为学评分反映药物对小鼠脑卒中改善预后的情况,结果见表1所示: 表1、实施例MACO小鼠神经行为学评分(n=6) 组别 神经行为学评分(平均值) 假手术组 0 模型组 3.2 格列苯脲10ug/kg 2.1 格列苯脲30ug/kg 2.0 青蒿琥酯25mg/kg 2.4 青蒿琥酯50mg/kg 2.1 格列苯脲10ug/kg+青蒿琥酯25mg/kg 1.6 格列苯脲30ug/kg+青蒿琥酯50mg/kg 1.2 依达拉奉3mg/kg 1.8 7.4血清中TNF-α和IL-6水平 采用酶联免疫法,检测不同组小鼠血清细胞因子TNF-α和IL-6水平。结果显示:与正常对照组小鼠比较,模型组TNF-α和IL-6含量显著增高(###p<0.001);与模型组小鼠比较,青蒿琥酯组、格列本脲10ug/kg+青蒿琥酯25mg/kg联用组及格列本脲30ug/kg+青蒿琥酯50mg/kg联用组可显著降低血清中TNF-α和IL-6含量(***p<0.001,*p<0.05)。结果见图3: 8、结论 从在动物水平进行的小鼠MCAO缺血再灌模型治疗药效评价结果表明,本发明中青蒿琥酯、格列本脲与青蒿琥酯联用能显著降低血清TNF-α和IL-6含量,减少脑水肿及梗塞,特别是联用组能改善预后、提高患者生存质量,具有很好的开发应用价值。 对本发明其它组合产品也进行了上述试验,其获得的结果与上述试验结果相似。 以上所述仅是本发明的较佳实施例而已,并非对本发明作任何形式上的限制,虽然本发明已以较佳实施例揭露如上,然而并非用以限定本发明,任何熟悉本发明的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内,当可利用上述提示的技术内容作出些许变动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明方案的范围内。    
    Claims (9)   1.一种用于预防和/或治疗脑缺血的组合产品,其特征在于,所述的组合产品为含有Sur1抑制剂和青蒿素倍半萜内酯类化合物的药物组合物; 或为含有Sur1抑制剂的第一药剂和含有青蒿素倍半萜内酯类化合物的第二药剂的组合。   2.根据权利要求1所述的组合产品,其特征在于,所述的药物组合物中Sur1抑制剂和青蒿素倍半萜内酯类化合物的质量比为(1~3):(2500~5000); 所述的组合中第一药剂中Sur1抑制剂和第二药剂中青蒿素倍半萜内酯类化合物的质量比为(1~3):(2500~5000)。   3.根据权利要求1或2所述的组合产品,其特征在于,所述的药物组合物为Sur1抑制剂、青蒿素倍半萜内酯类化合物与药学上可接受的辅料制成药学上可接受的剂型,优选注射剂,更优选注射液或冻干粉针。   4.根据权利要求1或2所述的组合产品,其特征在于,所述的第一药剂为Sur1抑制剂与药学上可接受的辅料制成药学上可接受的剂型; 所述的第二药剂为青蒿素倍半萜内酯类化合物与药学上可接受的辅料制成药学上可接受的剂型,优选注射剂,更优选注射液或冻干粉针。   5.根据权利要求1-4任意一项所述的组合产品,其特征在于,所述的Sur1抑制剂选自格列本脲、甲苯磺丁脲、瑞格列奈、美格列奈、咪格列唑或格列美脲中的一种或几种。   6.根据权利要求1-5任意一项所述的组合产品,其特征在于,所述的青蒿素倍半萜内酯类化合物是从黄花蒿中提取的倍半萜内酯及青蒿素的衍生物。   7.根据权利要求6所述的组合产品,其特征在于,所述的青蒿素倍半萜内酯类化合物为青蒿琥酯、双氢青蒿素或蒿甲醚。   8.权利要求1-7任意一项所述的组合产品在制备治疗脑缺血疾病药物中的应用。   9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述的脑缺血为脑卒中。   Patent Citations (2)
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  15. Roger
    The invention provides a novel dihydroartemisinin derivative, which can be used as an active ingredient to prepare a medicine for preventing and treating ischemic cerebral apoplexy, and the medicine can pass through a blood brain barrier more easily and has higher brain tissue medicine concentration. 本发明提供了一种新的双氢青蒿素衍生物,以该双氢青蒿素衍生物为活性成分可制备成预防、治疗缺血性脑卒中的药物,而且所述药物更容易通过血脑屏障,具有更高的脑组织药物浓度。     Dihydroartemisinin derivative, medicine and application thereof in preparation of medicine for preventing and treating cerebrovascular diseases Technical Field The invention relates to a dihydroartemisinin derivative and a pharmaceutical application thereof. Background With the aging process of China, cerebrovascular diseases become the first cause of death disability. The main cause is that the nerve cells die from ischemia and hypoxia due to the interruption of blood flow caused by cerebral vascular embolism or thrombosis, and the severity of the illness is closely related to the infarct volume of brain tissues. Neural stem cells (Neural Stem Cells, NSCs), which are mainly present in the subtubular region of the lateral ventricle wall and the dentate gyrus region of the hippocampus, are a group of special cells that can self-renew, stem maintain and differentiate into functional neurons. Since neurons are terminally differentiated cells and cannot self-renew, the neurons can only repair functions through proliferation and differentiation of neural stem cells after ischemic death, and how to activate rapid proliferation of endogenous neural stem cells to repair infarcted brain tissues in the research of cerebrovascular diseases is always a hot spot field. The subject group is directed towards artemisinin and its use in the treatment of neurological related disorders. CN104523679a provides the use of dihydroartemisinin in the treatment of cerebrovascular diseases. Although dihydroartemisinin is found to have a promoting effect on neural stem cell proliferation, neural stem cell proliferation can be induced in vitro, and ischemic sites of cerebral infarction can be reduced in vivo. However, studies have shown that long-term low doses of dihydroartemisinin may lead to side effects such as bone marrow suppression, peripheral red blood cell depletion and extramedullary hematopoiesis of the spleen, while reduced doses may effectively avoid the occurrence of related side effects [ Yin Jiye. Toxicology reevaluation of two artemisinin derivatives and its cardiotoxicity mechanism study [ D ]. National discharge military medical sciences, 2014 ]. In addition, as the research is in progress, dihydroartemisinin belongs to a water-soluble drug, and can pass through the blood brain barrier, but has limited transmittance, and higher blood drug concentration is required to reach the brain tissue concentration required by neuroprotection [ Yepu He et al, synergistic integration of dihydro-artemsinin with gamma-aminobutyric acid results in a more potential anti-depressant. Bioorg chem.2021.110:104769 ]. In conclusion, the search of the dihydroartemisinin derivative can achieve higher blood brain barrier permeability, and has important clinical significance in reducing side reactions generated in the treatment of cerebrovascular diseases. Disclosure of Invention Based on the problem, through intensive research, the invention aims to provide a novel dihydroartemisinin derivative which has the function of treating and preventing cerebrovascular diseases, improves the problem of low permeability of dihydroartemisinin blood brain barrier and improves the drug concentration in brain tissues. The aim of the invention is achieved by the following measures: a dihydroartemisinin derivative, which has the structural formula: the invention also provides a medicine. A medicament comprising a dihydroartemisinin derivative as described above. The medicament may also comprise one or more pharmacologically acceptable auxiliary materials including diluents, excipients, fillers, wetting agents, absorption enhancers, surfactants, lubricants or stabilizers and the like which are conventional in the pharmaceutical arts. The medicine is preferably prepared into aqueous solution or powder and other medicine forms suitable for injection; more preferably an aqueous solution, the drug concentration is 150mg/kg. The medicine can be used by intravenous drip or intramuscular injection, and is generally applied for 1 time in 1 day, 40mg each time, and 14 days are a course of treatment. The dosage is reduced by 30% compared with the conventional dosage of dihydroartemisinin (60 mg). It is another object of the present invention to provide the use of the above dihydroartemisinin derivatives. The application of the dihydroartemisinin derivative in the medicaments for treating and preventing the cerebrovascular diseases. Furthermore, the dihydroartemisinin derivative is applied to the preparation of medicines for treating and preventing ischemic cerebral apoplexy. Furthermore, the dihydroartemisinin derivative is applied to the preparation of medicines for relieving or eliminating cerebral infarction and ischemia. The application of the dihydroartemisinin derivative in preparing medicines for promoting proliferation of neural stem cells. Further, the use of said dihydroartemisinin derivatives to promote proliferation of brain subventricular zone (Subventricular Zone, SVZ) neural stem cells (Neural Stem Cells, NSCs). The dihydroartemisinin derivative has a promoting effect on the proliferation of the neural stem cells; in vitro, neural stem cell proliferation can be induced; can effectively reduce ischemic focus of cerebral infarction and improve neurological deficit caused by cerebral apoplexy. The dihydroartemisinin derivative can be used as an active ingredient to prepare a medicine for treating ischemic cerebral apoplexy, and the medicine can pass through the blood brain barrier more easily, so that the medicine has higher brain tissue medicine concentration. Advantageous effects 1. After cerebral ischemia, a large number of functional nerve cells die in a short period of time due to the special tolerance of neurons to blood oxygen, which has an extremely adverse effect on prognosis. The dihydroartemisinin derivative provided by the invention maintains the related functions of dihydroartemisinin in treating the related diseases, and particularly can promote endogenous NSCs to activate, proliferate and differentiate into nerve precursor cells (neurobalasts) and migrate to lesion sites after the nerve cells in an ischemic area are damaged, and the dihydroartemisinin derivative is re-integrated in a damaged nerve network system, restores a damaged nerve network structure and can replace necrotic neurons to play corresponding nerve functions. The dihydroartemisinin derivative functions by early activation (figure 2) of proliferation of NSCs endogenous to neural stem cells instead of periischemic necrotic neurons, and can be used for treating cerebral infarction. 2. The dihydroartemisinin derivative provided by the invention not only has the efficacy, but also has better blood brain barrier transmittance (figure 4) than dihydroartemisinin, can have higher drug concentration for central nervous system diseases, can effectively reduce the drug dosage, improve the drug curative effect, and further reduce the toxic and side effects. Drawings FIG. 1 chemical structural Change in the preparation of Dihydroartemisinin derivatives (Dihydroartemisinin derivatives, DD) in example 1 FIG. 2 example 2 immunofluorescence results show: the NSC proliferation number (Nestin/Ki 67 double-dyeing) of the DD group is obviously increased compared with that of the control group; FIG. 3 MRI photograph of the MCAO animal of example 3 after 72 hours of surgery, it can be seen that the cerebral infarction focus of the DD group animal is significantly reduced compared with the control group and the Dihydroartemsinin (DHA) group FIG. 4 high performance liquid chromatography of MCAO animals of example 4 after 72h of surgery to determine plasma and brain tissue drug concentrations; A. determining a chromatogram of DHA in plasma; B. DD determination chromatogram in brain tissue; C. no significant difference in plasma concentration versus the two groups; D. the concentration in brain tissue is significantly higher than in DHA. Detailed Description The invention will be described in further detail with reference to the drawings and examples. The following examples are merely illustrative of the present invention and are not intended to limit the scope of the invention. Throughout the specification, unless specifically indicated otherwise, the terms used herein should be understood as meaning as commonly used in the art. Accordingly, unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In case of conflict, the present specification will control. Embodiments of the present invention will be described in detail with reference to examples, in which specific conditions are not noted, according to conventional conditions or conditions suggested by the manufacturer. The reagents or apparatus used were conventional products commercially available without the manufacturer's knowledge. EXAMPLE 1 preparation of Dihydroartemisinin derivative (Dihydroartemisinin derivatives, DD) 1.10 preparation of beta- (2-bromoethoxy) dihydroartemisinin 3.103g (24 mmol) of 2-bromoethyl alcohol and 100mL of tetrahydrofuran are introduced into a 250mL round bottom flask, followed by 4mL of BF3.Et2O (C) under ice-bath conditions 4 H 10 BF 3 O, boron trifluoride etherate, commercially available) and 5.690g (20 mmol) of dihydroartemisinin (C) 15 H 24 O 5 ). The mixture was stirred in an ice bath for 1.5 hours. The reaction progress was monitored by TLC. The reaction is completed, saturated NaHCO is added respectively 3 Solution and 50mL EtOAc (CH) 3 COOC 2 H 5 ) After extraction of the layers, the aqueous layer was extracted with EtOAc (30 ml×2) and the organic layers were combined. The organic layer was washed with 40mL of saturated brine solution, anhydrous solid Na 2 SO 4 After drying and filtration, the organic solvent was distilled under reduced pressure. The crude product obtained was recrystallized (petroleum ether was added dropwise to EtOAc dissolved in sample), left to stand, filtered, and dried in vacuo to give white crystals. 2. Preparation of dihydroartemisinin derivatives 10 beta- (2-bromoethoxy) dihydroartemisinin, CH 3 CN,KI,K 2 CO 3 And furbenamine% Sigma-Aldrich company) was added to a 100mL round bottom flask, and the mixture was reacted by heating at a controlled temperature (50 ℃). The reaction progress was monitored by TLC. Then 15mL of methylene chloride and 20mL of saturated NaCl solution were added. After the separation by extraction, the aqueous layer was extracted with dichloromethane (10 ml×2) and the organic layers were combined. The organic layer was washed with 20mL of saturated brine solution, anhydrous solid Na 2 SO 4 Drying; after filtration, dichloromethane was distilled under reduced pressure. After silica gel column chromatography (petroleum ether mixed EtOAc) the pure product was obtained. The structure change process of the compound is shown in figure 1. Respectively obtaining under the conditions of 600MHz and 151MHz of an Agilent nuclear magnetic resonance apparatus 1 H spectrum 13 C spectrum, the compound is measured by high resolution mass spectrum using a Waters SYNPAT G2 instrument, and the spectrum information is as follows: 1H NMR (600 MHz, DMSO) d 7.75 (s, 1H), 6.57 (s, 1H), 6.52 (s, 1H), 5.40 (s, 1H), 4.71 (s, 1H), 4.20 (s, 2H), 3.89 (s, 1H), 3.55 (s, 1H), 3.08 (s, 2H), 2.42 (s, 1H), 2.18 (s, 1H), 2.01 (s, 1H), 1.80 (s, 1H), 1.66 (M, 2H), 1.54 (s, 1H), 1.32 (M, 6H), 1.14 (s, 1H), 0.88 (M, 7H) 13C NMR (MHz, DMSO) d 146.84,143.96,111.41,110.87,103.43,101.06,86.89,80.34,63.65,51.90,45.75,43.83,42.83,36.46,36.01,34.09,30.27,25.62,24.22,23.95,20.11,12.62.HRMS M/z [ M+H 151]+:408.2375(Calcd for C22H33NO6:407.230788)。 EXAMPLE 2 Effect of Dihydroartemisinin Derivative (DD) on proliferation of neural Stem cells under ex vivo conditions Pregnant 14.5d SD rats were selected, 5% chloral hydrate was anesthetized intraperitoneally, the peritoneum was opened, embryos were removed, scalp, skull and dura were removed, and the rat brain was stripped. Under a dissecting microscope, longitudinal cutting is carried out by taking the olfactory bulb as a central sagittal position, and materials are obtained in the subventricular zone. Proliferation medium (DMEM/F12, bFGF 20ng/mL, EGF 20ng/mL,2% B27) was added, and after filtration through a 200 mesh screen, trypan blue staining was performed, and the cell count was adjusted to 1X 10 6 Transfer to a culture flask, put into a 5% CO2 incubator at a constant temperature of 37 ℃ for culture, and passaged once in three days. Taking NSCs grown in logarithmic phase, digesting with 0.25% EDTA trypsin for 2min, adjusting cell number to 8000/100 μl after stopping digestion with 10% DMEM/F12, inoculating into 96-well plate, and placing into 5% CO 2 And placing the mixture in a constant temperature incubator at 37 ℃. After 24 hours, the wall-attached growth is carried out, the supernatant is discarded, and a blank control group and an 800nmol/L DD group are arranged. Each group had 6 duplicate wells and were removed after 72h incubation. PBS buffer was washed 3 times, 75% ethanol was fixed for 30min, PBS buffer was washed 3 times, 0.5% Triton X-100 was added, and the mixture was allowed to stand for 20min, buffer was washed 3 times, BSA was blocked for 20min, and Ki67 primary antibody (cell proliferation marker) and Nestin primary antibody (NSC marker) were added, respectively. Washing 3 times at 4 ℃ overnight with buffer solution, adding corresponding fluorescent secondary antibody, reacting for lh at 37 ℃, washing 3 times with buffer solution, counterstaining DAPI, and sealing with glycerol. Ki67 and Nestin biscationic cells were observed under a phase contrast inverted microscope and counted in photographs. Dihydroartemisinin Derivative (DD) group Ki67 and Nestin double cationsThe rate is significantly higher than that of the control group (p < 0.05). Example 3 Effect of Dihydroartemisinin derivatives on ischemic foci in rats with middle cerebral artery occlusion model Rat middle cerebral artery thrombosis establishes a rat MCAO model. The experimental animal is injected with chloral hydrate 5% into abdominal cavity, and the general anesthesia is cut through the front middle of neck, the right common carotid artery and carotid bifurcation are exposed and separated, a small opening is cut on the common carotid artery under the direct vision of ophthalmic scissors, a bolt wire is placed into the common carotid artery through the small opening to advance to the bifurcation of the middle cerebral artery, and the middle cerebral artery blood flow is obstructed. A negative Control group (postoperative daily intraperitoneal injection of 150mg/kg of physiological saline, control group), a positive Control group (postoperative daily intraperitoneal injection of aqueous solution of dihydroartemisinin (Dihydro artemisinin, DHA), 150mg/kg, DHA group) and an experimental group (postoperative daily intraperitoneal injection of aqueous solution of Dihydroartemisinin Derivative (DD) 150mg/kg, DD group) were set. Six animals per group. The animals were 7.0T cranium MR-examined 72h later and the examination results are shown in FIG. 4. And performing histogram analysis to find that: the volume of the cerebral infarction of the animals in the DD group is obviously lower than that of the Control group (p is less than 0.05), and the volume of the cerebral infarction of the animals in the DD group is obviously lower than that of the DHA group, but no statistical difference exists (p is more than 0.05). It is shown that the same dose of the Dihydroartemisinin Derivative (DD) has better effect than the dihydroartemisinin in treating cerebral infarction. After the three groups of animals are injected with the medicine, the animals move normally, no obvious toxicity appears, no death occurs after 14 days of continuous observation, and no obvious toxicity difference exists among the three groups. EXAMPLE 4 comparative study of Dihydroartemisinin derivatives across the blood brain barrier The rat middle cerebral artery occlusion model is established by the rat middle cerebral artery line embolism method. The experimental animal is injected with chloral hydrate 5% into abdominal cavity, and the general anesthesia is cut through the front middle of neck, the right common carotid artery and carotid bifurcation are exposed and separated, a small opening is cut on the common carotid artery under the direct vision of ophthalmic scissors, a bolt wire is placed into the common carotid artery through the small opening to advance to the bifurcation of the middle cerebral artery, and the middle cerebral artery blood flow is obstructed. A negative control group (daily intra-abdominal injection of physiological saline 150mg/kg after the operation), a positive control group (daily intra-abdominal injection of dihydroarteannuin aqueous solution (DHA) 150mg/kg after the operation) and an experimental group (daily intra-abdominal injection of dihydroarteannuin derivative aqueous solution (DD) 150mg/kg after the operation) were set, six animals per group. And taking a mouse brain tissue homogenate and a plasma sample after 72 hours, and detecting the concentration of the injection medicine respectively contained in the homogenate brain tissue and the plasma sample by using a high performance liquid chromatography. The plasma concentration of the dihydroartemisinin derivative group is not significantly different from that of the dihydroartemisinin group (p is more than 0.05). The brain tissue drug concentration of the dihydroartemisinin derivative group is obviously higher than that of the equivalent dose dihydroartemisinin group (p is less than 0.05). The blood brain barrier permeability of the same dose DD is increased by 40% compared with DHA, and according to the measurement, compared with DHA and DD, the same neuroprotective effect is achieved, and the dosage can be reduced by 30%.    
    Claims (10) Hide Dependent    1. A dihydroartemisinin derivative, which has the structural formula: 2. a medicament comprising a dihydroartemisinin derivative of claim 1.   3. The medicament of claim 2, further comprising one or more pharmacologically acceptable excipients including diluents, excipients, fillers, wetting agents, absorption promoters, surfactants, lubricants or stabilizers and the like conventional in the pharmaceutical arts.   4. The medicament of claim 2, which is an injection.   5. The medicament of claim 4, wherein the injection is an aqueous solution with a medicament concentration of 150mg/kg.   6. Use of a dihydroartemisinin derivative according to claim 1 or a medicament according to any one of claims 2 to 5 in the treatment of, or prophylaxis of, cerebrovascular disease.   7. Use of a dihydroartemisinin derivative according to claim 1 or a medicament according to any one of claims 2 to 5 for the preparation of a medicament for the treatment and prevention of ischemic stroke.   8. Use of a dihydroartemisinin derivative according to claim 1 or a medicament according to any one of claims 2 to 5 for the preparation of a medicament for the alleviation or elimination of cerebral infarction ischemic events.   9. Use of a dihydroartemisinin derivative according to claim 1 or a medicament according to any one of claims 2 to 5 for the preparation of a medicament for promoting proliferation of neural stem cells.   10. Use of a dihydroartemisinin derivative according to claim 1 or a medicament according to any one of claims 2 to 5 for the preparation of a medicament for promoting proliferation of neural stem cells in the subventricular zone of the ventricle.   Patent Citations (7)
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    ApplicationFiling dateTitle CN20211051436182021-05-11 CN202110514361.8A2021-05-11Dihydroartemisinin derivative and application thereof in preparation of drugs for treating and preventing cerebrovascular diseases   https://patents.google.com/patent/CN116120337A/en       一种双氢青蒿素衍生物、药物及其在制备治疗预防脑血管病药物中的应用 技术领域 本发明涉及一种双氢青蒿素衍生物,并涉及其药物用途。 背景技术 随着我国老龄化进程,脑血管病已成为致死致残第一病因。主要病因是由于脑血管栓塞或者血栓形成所导致的血流中断,而造成神经细胞缺血缺氧死亡,病情严重程度与脑组织梗死体积密切相关。 神经干细胞(Neural Stem Cells,NSCs)主要存在于侧脑室壁的室管膜下区和海马的齿状回区,是一群可以自我更新、干性维持和分化为有功能神经元的特殊细胞。由于神经元为终末分化细胞,无法自我更新,其缺血死亡后只能通过神经干细胞增殖分化予以修复功能,而脑血管病研究中如何激活内源性神经干细胞快速增殖以修复梗死脑组织一直是热点领域。 本课题组一直致力于青蒿素及其在治疗神经性相关疾病的应用。 CN104523679A提供了双氢青蒿素在治疗、脑血管病的用途。虽然双氢青蒿素被发现对神经干细胞增殖有促进作用,体外可诱导神经干细胞增殖,体内可以减少脑梗塞的缺血灶。但是,研究表明长期低剂量的双氢青蒿素可能导致骨髓抑制、外周血红细胞减少和脾脏髓外造血等副反应,而减少剂量可以有效避免相关副反应的发生[尹纪业.两种青蒿素衍生物毒理学再评价及其心脏毒性机制研究[D].中国人民解放军军事医学科学院,2014.]。另外随着研究的深入发现,双氢青蒿素属于水溶性药物,虽可通过血脑屏障,但透过率有限,需要较高的血药浓度才能达到神经保护所需的脑组织浓度[Yepu He et al,Synergistic integration of dihydro-artemisinin withγ-aminobutyric acidresults in a more potential anti-depressant.Bioorg Chem.2021.110:104769.]。综上,寻找一种双氢青蒿素衍生物可达到更高的血脑屏障通透率,对减少其治疗脑血管病中产生的副反应具有重要临床意义。 发明内容 基于此问题,经过潜心研究,本发明的目的在于提供了一种新的双氢青蒿素衍生物,具备治疗预防脑血管病功能,改善了双氢青蒿素血脑屏障透过率低的问题,提高了脑组织中的药物浓度。 本发明的目的是通过以下措施实现的: 一种双氢青蒿素衍生物,其结构式为:   本发明还提供了一种药物。 一种药物,包括上述双氢青蒿素衍生物。所述药物还可以包括一种或多种药理学上可接受的辅料,所述辅料包括药学领域中常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活化剂、润滑剂或稳定剂等。所述药物优选制成水溶液或粉剂等适用于注射用的药物形式;更优选为水溶液,药物浓度为150mg/kg。所述药物在使用时可静脉滴注或肌肉注射,一般1天应用1次,每次40mg,14天为一个疗程。较双氢青蒿素常规剂量(60mg)减少30%用量。 本发明的另一目的在于提供上述双氢青蒿素衍生物的用途。 上述双氢青蒿素衍生物在治疗、预防脑血管病药物中的应用。进一步的,所述双氢青蒿素衍生物在制备治疗、预防缺血性脑卒中药物中的应用。更进一步的,所述双氢青蒿素衍生物在制备减轻或消除脑梗塞缺血灶药物中的应用。 上述双氢青蒿素衍生物在制备促进神经干细胞增殖药物中的应用。进一步地,所述双氢青蒿素衍生物促进大脑室管膜下区(Subventricular Zone,SVZ)神经干细胞(Neural Stem Cells,NSCs)增殖的应用。 所述双氢青蒿素衍生物对神经干细胞增殖有促进作用;体外可诱导神经干细胞增殖;体内可有效减少脑梗塞的缺血灶梗死灶并改善脑卒中造成的神经功能缺损。以所述双氢青蒿素衍生物为活性成分可制备成治疗缺血性脑卒中的药物,而且所述药物更容易通过血脑屏障,具有更高的脑组织药物浓度。 有益效果 1.脑缺血发生后,由于神经元对血氧的特殊依耐性,短期内就会有大量的有功能神经细胞死亡,给预后带来极其不利的影响。本发明所提供的双氢青蒿素衍生物,其保持了双氢青蒿素治疗神经性相关疾病的相关功能,具体而言,可促进内源性NSCs在缺血区神经细胞受到损伤后激活、增殖、分化为神经前体细胞(Neuroblasts)并向损伤灶迁移,在损伤的神经网络系统中重新整合,修复损伤的神经网络结构并可替代坏死神经元发挥相应的神经功能。所述双氢青蒿素衍生物通过早期激活(图2)神经干细胞内源性NSCs的增殖替代缺血灶周围坏死神经元而发挥功能,可用于脑梗塞的治疗。 2.本发明所提供的双氢青蒿素衍生物,不仅具有所述药效,而且更优的是较双氢青蒿素具有更优的血脑屏障透过率(图4),可以对于中枢神经系统疾病具有更高的药物浓度,能够有效的减少药物用量,提高药物疗效,并进一步降低毒、副作用。 附图说明 图1实施例1中双氢青蒿素衍生物(Dihydroartemisinin derivatives,DD)制备中化学结构变化 图2实施例2免疫荧光结果显示:DD组的NSC增殖数量(Nestin/Ki67双染)较对照组明显增加; 图3实施例3中MCAO动物手术72h后的MRI照片,可见DD组动物脑梗死灶较对照组与双氢青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA)组显著缩小 图4实施例4中MCAO动物手术72h后的高效液相色谱法测定血浆与脑组织药物浓度;A.血浆中DHA测定色谱图;B.脑组织中DD测定色谱图;C.血浆中浓度对比两组无显著差异;D.脑组织中浓度对比DD显著高于DHA。 具体实施方式 下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。以下实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。 在整个说明书中,除非另有特别说明,本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此,除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术人员的理解相同的含义。若存在矛盾,本说明书优先。 下面将结合实施例对本发明的实施方式进行详细描述,实施例中未注明具体条件的,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商的,为可以通过商购获得的常规产品。 实施例1一种双氢青蒿素衍生物(Dihydroartemisinin derivatives,DD)的制备 1.10β-(2-溴乙氧基)双氢青蒿素的制备 将3.103g(24毫摩尔)2-溴乙基醇和100mL四氢呋喃加入到250mL的圆底烧瓶中,然后在冰浴条件下加入4mL BF3.Et2O(C4H10BF3O,三氟化硼乙醚溶液,商业购买),再加入5.690g(20毫摩尔)的双氢青蒿素(C15H24O5)。该混合物在冰浴中搅拌反应1.5小时。反应过程用TLC监测。反应完成,分别加入饱和NaHCO3溶液和50mL EtOAc(CH3COOC2H5),萃取分层后,将水层用EtOAc(30mL×2)萃取,然后将有机层合并。将有机层用40mL饱和盐水溶液洗涤,无水固体Na2SO4干燥,过滤后,减压旋转蒸馏有机溶剂。将所得到的粗产物重结晶(将石油醚滴加到溶解有样品EtOAc中),静置,过滤,真空干燥,得白色晶体。 2.双氢青蒿素衍生物的制备 10β-(2-溴乙氧基)双氢青蒿素,CH3CN,KI,K2CO3和呋喃苄胺(Sigma-Aldrich公司商业购买)分别加入到一个100mL的圆底烧瓶中,该混合物反应在受控的温度下(50℃)加热反应。反应过程通过TLC监测。然后加入15mL二氯甲烷和20mL饱和NaCl溶液。萃取分层后,水层用二氯甲烷(10mL×2)萃取,然后将有机层合并。将有机层用20mL饱和盐水溶液洗涤,无水固体Na2SO4干燥;过滤后,减压旋转蒸馏二氯甲烷。硅胶柱色谱法(石油醚混合EtOAc)后,获得纯的产物。化合物结构变化过程如图1。 在Agilent核磁共振仪600MHz和151MHz条件下分别得到1H谱和13C谱,利用WatersSYNPAT G2仪器完成高分辨质谱测定所述化合物,谱图信息如下:1H NMR(600MHz,DMSO)d7.75(s,1H),6.57(s,1H),6.52(s,1H),5.40(s,1H),4.71(s,1H),4.20(s,2H,),3.89(s,1H),3.55(s,1H),3.08(s,2H),2.42(s,1H),2.18(s,1H),2.01(s,1H),1.80(s,1H),1.66(m,2H),1.54(s,1H),1.32(m,6H),1.14(s,1H),0.88(m,7H).13C NMR(151MHz,DMSO)d 146.84,143.96,111.41,110.87,103.43,101.06,86.89,80.34,63.65,51.90,45.75,43.83,42.83,36.46,36.01,34.09,30.27,25.62,24.22,23.95,20.11,12.62.HRMS m/z[M+H]+:408.2375(Calcd for C22H33NO6:407.230788)。 实施例2一种双氢青蒿素衍生物(DD)在离体条件下对神经干细胞增殖的影响 选取孕14.5d SD大鼠,5%水合氯醛腹腔麻醉,打开腹膜,取出胚胎,去除头皮、头骨和硬膜,剥离鼠脑。在解剖显微镜下,以嗅球为中心矢状位纵切,于室管膜下区取材。加入增殖培养基(DMEM/F12,bFGF 20ng/mL,EGF 20ng/mL,2%B27),经200目滤网过滤后,台盼蓝染色后细胞计数,调整细胞数为1×106/ml,转入培养瓶,放入5%CO2、37℃恒温孵箱中培养,三天传代一次。 取对数期生长的NSCs,0.25%EDTA胰蛋白酶消化2min,10%DMEM/F12终止消化后,调整细胞数至8000/100μL,接种于的96孔板,置于5%CO2、37℃恒温培育箱中。24h后贴壁生长,弃上清,设置空白对照组、800nmol/L DD组共两组。每组6个复孔,孵育72h后取出。PBS缓冲液清洗3次,75%乙醇固定30min,PBS缓冲液清洗3次,加入0.5%的Triton X-100,静置20min,缓冲液洗3次,BSA封闭20min,分别加入Ki67一抗(细胞增殖标志物)与Nestin一抗(NSC标志物)。4℃过夜,缓冲液洗3次,加入相应的荧光二抗,37℃下反应lh,用缓冲液洗3次,复染DAPI,甘油封片。在相差倒置显微镜下观察Ki67与Nestin双阳性细胞并拍照计数。双氢青蒿素衍生物(DD)组Ki67与Nestin双阳性率明显高于对照组(p<0.05)。 实施例3一种双氢青蒿素衍生物对大脑中动脉闭塞模型大鼠缺血灶的影响 大鼠大脑中动脉线栓法建立大鼠MCAO模型。实验动物5%水合氯醛腹腔注射全麻,经颈前正中切口、暴露并分离右侧颈总动脉及颈动脉分叉,眼科剪直视下于颈总动脉剪一小口,将栓线经此小口置入颈总动脉内向前推进至大脑中动脉分叉发出处,梗阻大脑中动脉血流。设置阴性对照组(术后每日腹腔注射生理盐水150mg/kg,Control组),阳性对照组(术后每日腹腔注射双氢青蒿素水溶液(Dihydro artemisinin,DHA),150mg/kg,DHA组)和实验组(术后每日腹腔注射双氢青蒿素衍生物水溶液(DD)150mg/kg,DD组)。每组六只动物。72h后行小动物7.0T头颅MR检查,检查结果如图4。并做柱状图分析发现:DD组动物脑梗死体积显著低于Control组(p<0.05),且DD组动物脑梗死体积明显低于DHA组,但无统计学差异(p>0.05)。说明同样剂量治疗脑梗死,双氢青蒿素衍生物(DD)较双氢青蒿素具有更好效果。 以上三组动物在注射药物后,活动正常,无明显毒性呈现,连续观察14天无动物发生死亡,三组间无明显的毒性差异。 实施例4一种双氢青蒿素衍生物透过血脑屏障的对比研究 大鼠大脑中动脉线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞模型。实验动物5%水合氯醛腹腔注射全麻,经颈前正中切口、暴露并分离右侧颈总动脉及颈动脉分叉,眼科剪直视下于颈总动脉剪一小口,将栓线经此小口置入颈总动脉内向前推进至大脑中动脉分叉发出处,梗阻大脑中动脉血流。设置阴性对照组(术后每日腹腔注射生理盐水150mg/kg),阳性对照组(术后每日腹腔注射双氢青蒿素水溶液(Dihydroartemisinin,DHA),150mg/kg)和实验组(术后每日腹腔注射双氢青蒿素衍生物水溶液(DD)150mg/kg),每组六只动物。72h后取小鼠脑组织匀浆与血浆标本,利用高效液相色谱法检测匀浆脑组织与血浆标本中分别所含注射药物的浓度。双氢青蒿素衍生物组血浆药浓度与双氢青蒿素组对比无显著差异(p>0.05)。双氢青蒿素衍生物组脑组织药浓度明显高于等剂量双氢青蒿素组(p<0.05)。同样剂量DD较DHA增加40%的血脑屏障通透率,据此测算,较DHA,DD达到同样神经保护效应,可减少30%用药量。    
    Claims (10)     1.一种双氢青蒿素衍生物,其结构式为: 2.一种药物,包括权利要求1所述的双氢青蒿素衍生物。 3.如权利要求2所述的药物,还包括一种或多种药理学上可接受的辅料,所述辅料包括药学领域中常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活化剂、润滑剂或稳定剂等。 4.如权利要求2所述的药物,所述药物为注射剂。 5.如权利要求4所述的药物,所述注射剂为水溶液,药物浓度为150mg/kg。 6.如权利要求1所述双氢青蒿素衍生物或权利要求2-5任一所述药物在治疗、预防脑血管病药物中的应用。 7.如权利要求1所述双氢青蒿素衍生物或权利要求2-5任一所述药物在制备治疗、预防缺血性脑卒中药物中的应用。 8.如权利要求1所述双氢青蒿素衍生物或权利要求2-5任一所述药物在制备减轻或消除脑梗塞缺血灶药物中的应用。 9.如权利要求1所述双氢青蒿素衍生物或权利要求2-5任一所述药物在制备促进神经干细胞增殖药物中的应用。 10.如权利要求1所述双氢青蒿素衍生物或权利要求2-5任一所述药物在制备促进大脑室管膜下区神经干细胞增殖药物中的应用。   Patent Citations (7)
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  16. Roger
    The invention provides a method for increasing artemisinin content in sweet wormwood by DBR2 (double bond reductase 2) gene transfer in the field of biotechnology. The method includes the steps: cloning genes of artemisinic aldehyde delta 11(13) DBR2 from the sweet wormwood, constructing a plant expression vector containing the DBR2 genes, using agrobacterium tumefaciens for mediation to transfer the DBR2 genes into the sweet wormwood so that plants regenerate, using PCR (polymerase chain reaction) to detect integration conditions of the exogenous targeted DBR2 genes, determining the artemisinin content in the transgenic sweet wormwood by means of HPLC-ELSD (high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector), and screening the transgenic sweet wormwood plants with the improved artemisinin content. The artemisinin content in the obtained transgenic sweet wormwood can be remarkably increased and is 2.83 times maximally of that of a non-transgenic control plant, and accordingly the method for increasing the artemisinin content in the sweet wormwood lays a foundation for large-scale artemisinin production by the aid of the transgenic sweet wormwood. 本发明是一种生物技术领域的转DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。本发明从青蒿中克隆青蒿醛Δ11(13)还原酶DBR2的基因,构建含DBR2基因的植物表达载体,用根癌农杆菌介导,将DBR2基因转入青蒿并再生出植株,PCR检测外源目的基因DBR2的整合情况,高效液相色谱法及蒸发光散射检测器测定(HPLC-ELSD)转基因青蒿中青蒿素的含量,筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。本发明获得的转基因青蒿中青蒿素的含量显著提高,最高达到非转化对照植株的2.83倍,从而提供了一种提高青蒿中青蒿素含量的方法,为利用转基因青蒿大规模生产青蒿素打下了基础。      
    Description Turn the method that DBR2 gene improves content of artemisinin in sweet wormwood Technical field What the present invention relates to is a kind of method of raising artemislnin content of biological technical field, particularly a kind ofly turns the method that DBR2 gene improves content of artemisinin in sweet wormwood. Background technology Sweet wormwood (Artemisia annua L.) is the annual herb plant of composite family artemisia.Artemisinin (artemisinin) is a kind of sesquiterpene lactones compound containing peroxide bridge structure be separated from its over-ground part, be the medicine of the most effectively treating malaria of generally acknowledging in the world at present, particularly for encephalic malaria and anti-chloroquine malaria, there is quick-acting and feature that is low toxicity.At present, the method for the most effectively treating malaria of world health organisation recommendations is exactly Artemisinin conjoint therapy (ACTs).In addition, along with progressively going deep into Artemisinin pharmacological research, scientist finds that Artemisinin and derivative thereof also have anti-inflammatory, schistosomicide, antitumor and immunoregulatory function.Visible Artemisinin is a kind of natural drug of great potential. The main source of current Artemisinin extracts from the over-ground part of sweet wormwood plant, but the content of Artemisinin in Artemisia annuna is very low, in different planting environment and varieties of plant, its average content is at the 0.01-1% of sweet wormwood leaf dry weight, the large-scale commercial of this medicine is produced and is restricted.Due to Artemisinin complex structure, synthetic difficulty is large, and yield poorly, cost is high, does not have feasibility.The method of someone trial tissue culture and cell engineering produces Artemisinin, however Artemisinin in callus, content is lower than 0.1% of dry weight, the highest in bud also only have 0.16% of dry weight, and great majority research does not detect Artemisinin in root.Therefore utilize tissue culture and cell engineering not high to the feasibility of producing Artemisinin yet. Through finding prior art literature search, Waleerat Banyai etc. are in " Plant Cell Tissue and OrganCulture " (plant cell tissue's organ culture), within 2010,103 volume 255-265 pages have delivered the paper being entitled as " Overexpressionof farnesyl pyrophosphate synthase (FPS) gene affected artemisinin content and growth ofArtemisia annua L. " (" overexpression farnesyl pyrophosphate synthase gene can affect the content of Artemisinin in Artemisia annuna and the growth of sweet wormwood "), report by crossing most representation farnesyl pyrophosphate synthase (farnesyl pyrophosphatesynthase, FPS), the content of render transgenic Artemisinin in Artemisia annuna improves 2.5-3.6 doubly, but still only have about 1.3%.But, plant genetic engineering is improve the content of Artemisinin in Artemisia annuna to provide a feasible method. Sweet wormwood aldehyde Δ 11 (13) reductase enzyme (artemisinic aldehyde Δ 11 (13) double bondreductase in prior art, DBR2) being a key enzyme in artemisinin synthesis approach, is the important target spot of Artemisinin metabolic engineering.Adopt genetic engineering means, transform sweet wormwood with key gene DBR2, the biosynthetic speed limit bottleneck of Artemisinin will be broken, obtain the sweet wormwood plant of Artemisinin high yield, for large-scale production Artemisinin provides a new way. Summary of the invention The object of the invention is to overcome deficiency of the prior art, provide a kind of and turn the method that DBR2 gene improves content of artemisinin in sweet wormwood.The key gene clone that the present invention relates to, vector construction, genetic transformation, Molecular Detection, Artemisinin extraction and assay are for the present invention, establishing the stable method improving content of artemisinin in sweet wormwood, establishing solid basis for utilizing sweet wormwood scale operation Artemisinin. The present invention is achieved by the following technical solutions: Turn the method that DBR2 gene improves content of artemisinin in sweet wormwood, comprise following concrete steps: (1) gene clone method is adopted to obtain sweet wormwood key gene DBR2; (2) described DBR2 gene is linked to expression regulation sequence, builds the plant expression vector containing DBR2 gene; (3) by the described plant expression vector transform Agrobacterium tumefaciens containing DBR2 gene, the Agrobacterium tumefaciens strain containing described DBR2 gene plant expression vector is obtained; (4) utilize the described Agrobacterium tumefaciens strain containing DBR2 gene plant expression vector to transform sweet wormwood, obtain the transgene abrotanum plant of the integration external source goal gene DBR2 detected through PCR; (5) carry out HPLC-ELSD mensuration to artemislnin content in described transgene abrotanum, screening obtains the transgene abrotanum plant that artemislnin content improves. Preferably, in described step (1), described gene clone method comprises the following steps: extract sweet wormwood genome total serum IgE, obtained sweet wormwood genome total serum IgE is obtained the first chain cDNA by ThermoScript II XL reverse transcription, DNA sequence dna according to SEQ ID NO.1, design amplifies upstream primer and the downstream primer of complete encoder block, described upstream primer is the DNA sequence dna shown in SEQ ID NO.2, described downstream primer is the DNA sequence dna shown in SEQ ID NO.3, and restriction endonuclease sites is introduced respectively so that construction of expression vector on described upstream and downstream primer, with the first described chain cDNA for template, check order after pcr amplification. Preferably, in described step (2), described structure comprises the following steps containing the plant expression vector of DBR2 gene: first build intermediate carrier pMDT18-DBR2, intermediate carrier pMDT18-DBR2 and expression vector FSN is cut again with XmaI and SacI enzyme, reclaim DBR2 gene fragment and FSN carrier large fragment, connect and transform, picking mono-clonal, extract plasmid and do PCR detection and digestion verification. Preferred further, described structure intermediate carrier pMDT18-DBR2 comprises following concrete steps: by introducing the full length gene of XmaI and SacI restriction enzyme site before and after high-fidelity enzymatic amplification DBR2 gene respectively, be connected on pMDT18 carrier by ligase enzyme. Preferably, in described step (4), described conversion comprises the following steps: the preculture of explant; The Dual culture of Agrobacterium and explant; The screening of resistance regeneration plant. Preferred further, described preculture comprises the following steps: seeds of southernwood 75% alcohol immersion 1min, 20min is soaked again with 20%NaClO, aseptic water washing 3-4 time, blots surface-moisture with aseptic thieving paper, is inoculated in the MS solid medium without hormone, 25 DEG C of illumination cultivation, can obtain sweet wormwood aseptic seedling, grow to after about 5cm until seedling, clip tests for sterility explant is used for transforming. Preferred further, described Dual culture comprises the following steps: forwarded to by described leaf explant in Dual culture substratum, drip the 1/2MS suspension containing the described agrobacterium tumefaciens engineering bacteria containing DBR2 gene plant binary expression vector activated, explant is fully contacted with bacterium liquid, 28 DEG C of light culture 3 days, to drip leaf explant at the 1/2MS liquid nutrient medium suspension of the agrobacterium tumefaciens without goal gene for contrast. Preferred further, described screening comprises the following steps: be transferred in germination screening culture medium the described Dual culture sweet wormwood explant of 3 days in 25 DEG C of illumination cultivation, every two weeks succeeding transfer culture once, Kan resistance Multiple Buds can be obtained after 2-3 subculture, described well-grown resistance Multiple Buds is cut proceed to root media is cultured to and take root, Kan resistance regeneration sweet wormwood plant can be obtained. Preferably, in described step (4), described PCR detects and comprises the following steps: the primer of design and synthesis DBR2 gene; Carry out DNA cloning; Viewed under ultraviolet radiation, if object band is positive, then this strain is described transgene abrotanum plant. Preferably, in described step (5), described HPLC-ELSD measures and comprises following condition: chromatographic column used is C-18 reverse phase silica gel post, moving phase select volume ratio be 70: 30 methyl alcohol: water, column temperature 30 DEG C, flow velocity 1.0mL/min, sample size 20 μ L, light scattering detector drift tube temperature 40 DEG C, scale-up factor is 7, nebulizer gas pressure 5bar. The method turning DBR2 gene raising content of artemisinin in sweet wormwood of the present invention; adopt gene engineering method; key gene DBR2 is imported in sweet wormwood plant; obtain the transgene abrotanum strain that artemislnin content significantly improves; the content turning DBR2 gene Artemisinin in Artemisia annuna can reach the 22.6mg/g of dry weight; be 2.83 times of non-transformed common sweet wormwood (8mg/g dry weight), this invention provides high yield for the large-scale production for Artemisinin, to stablize source new drugs significant. Accompanying drawing explanation Fig. 1 is the content detection result figure of Artemisinin in sweet wormwood plant of the present invention. Embodiment Below embodiments of the invention are elaborated: the present embodiment is implemented under premised on technical solution of the present invention, give detailed embodiment and concrete operating process, but protection scope of the present invention is not limited to following embodiment.The experimental technique of unreceipted actual conditions in the following example, usual conveniently condition, such as Sambrook equimolecular clone: laboratory manual (New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) condition described in, or according to the condition that manufacturer advises. embodiment Step one, the clone of sweet wormwood DBR2 gene (1) extraction of sweet wormwood genome total serum IgE Get 100-200mg sweet wormwood young leaflet tablet, after liquid nitrogen flash freezer, grind with mortar rapidly, add and fill 1mL TRlzol (TRlzol Reagents, GIBCOBRL, USA) 1.5mL Eppendorf pipe in, fully after vibration, 5min is put in ambient temperatare, add 200 μ L chloroforms, use forced oscillation 15sec, after room temperature places 2-3min, 12,000rmp centrifugal 15min at 4 DEG C; Supernatant liquor (about 600 μ L) is sucked in clean 1.5mL Eppendorf pipe, adds isopyknic Virahol, put upside down mixing, after ambient temperatare puts 10min, 12,000rmp centrifugal 10min at 4 DEG C; Abandon supernatant, add 1mL 75% ethanol purge, after vibration, 7,500rmp centrifugal 5min at 4 DEG C; Be dissolved in appropriate (30-40 μ L) RNAase-free water after drying at room temperature 10-15min; By denaturing formaldehyde gel electrophoresis qualification total serum IgE quality, then on spectrophotometer, measure rna content. (2) clone of sweet wormwood DBR2 gene Obtained sweet wormwood genome total serum IgE is obtained the first chain cDNA by ThermoScript II XL (AMV) reverse transcription, according to the encoding sequence (DNA sequence dna shown in SEQ ID NO.1) of described sweet wormwood DBR2 gene, design amplifies upstream primer (DNA sequence dna shown in SEQ ID NO.2) and the downstream primer (DNA sequence dna shown in SEQ ID NO.3) of complete encoder block, and on upstream and downstream primer, introduce restriction endonuclease sites (this is determined by the carrier selected) respectively, so that construction of expression vector.With the first described chain cDNA for template, check order after pcr amplification.Determined dna sequence has been checked order by Shanghai Ying Jun biotechnology Services Co., Ltd.Sequencing result shows, the sequence of cloning is consistent with the encoding sequence (DNA sequence dna shown in SEQ ID NO.1) of the sweet wormwood DBR2 gene reported in GenBank. The present embodiment adopts gene clone method from sweet wormwood, obtain the correct Artemisinin biosynthesizing key gene DBR2 of sequence, for providing an important key gene by turning DBR2 gene raising content of artemisinin in sweet wormwood. Step 2, containing the structure of the plant binary expression vector of DBR2 gene (1) structure of intermediate carrier pMDT18-DBR2 Select pMDT18 carrier (Takara, Dalian) for primary element, build intermediate carrier pMDT18-DBR2.Particularly, by introducing the full length gene of XmaI and SacI restriction enzyme site before and after high-fidelity enzymatic amplification DBR2 gene respectively, be connected on pMDT18 carrier by ligase enzyme, being checked order by Shanghai Ying Jun biotechnology Services Co., Ltd confirms the exactness of gene. (2) containing the structure of the plant expression vector of DBR2 gene For expression vector, above-mentioned DBR2 gene is connected into the restriction enzyme site position of its correspondence with described FSN (FSN expression vector obtains for transforming on pCAMBIA2300 expression vector and preserves).Particularly, XmaI and SacI double digestion intermediate carrier pMDT18-dbr2 and expression vector FSN.Reclaim DBR2 gene fragment and FSN carrier large fragment, connect and transform, picking mono-clonal, extract plasmid and do PCR detection and digestion verification. Artemisinin biosynthetic pathway key gene DBR2 is connected to expression regulation sequence by the present embodiment operably, and form the plant expression vector containing DBR2 gene, this expression vector can be used for the content being improved Artemisinin in Artemisia annuna by metabolic engineering strategies. Step 3, containing the acquisition of DBR2 gene double base plant expression vector agrobacterium tumefaciens engineering bacteria The above-mentioned plant binary expression vector containing DBR2 gene is proceeded to agrobacterium tumefaciens (as EHA105, for there is the biomaterial of public sale in market, can buy from Australian CAMBIA company, strain number is Gambar 1), and performing PCR of going forward side by side is verified. Step 4, Agrobacterium tumefaciens mediated DBR2 gene transformation sweet wormwood (1) preculture of explant Seeds of southernwood 75% alcohol immersion 1min, 20min is soaked again with 20%NaClO, aseptic water washing 3-4 time, surface-moisture is blotted with aseptic thieving paper, be inoculated in MS (the Murashige and Skoog without hormone, 1962), in solid medium, 25 DEG C, 16h/8h (light/dark) illumination cultivation, can obtain sweet wormwood aseptic seedling.Grow to after about 5cm until seedling, clip tests for sterility explant is used for transforming. (2) Dual culture of Agrobacterium and explant By described leaf explant, forward in Dual culture substratum (1/2MS+AS 100 μm of ol/L), drip the 1/2MS suspension containing the described agrobacterium tumefaciens engineering bacteria containing DBR2 gene plant binary expression vector activated, explant is fully contacted, 28 DEG C of light culture 3 days with bacterium liquid.With drip the 1/2MS liquid nutrient medium suspension of the agrobacterium tumefaciens without goal gene leaf explant for contrast. (3) screening of resistance regeneration plant The described Dual culture sweet wormwood explant of 3 days is transferred in germination screening culture medium (MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L) in 25 DEG C, 16h/8h (light/dark) illumination cultivation, every two weeks succeeding transfer culture once, can obtain Kan resistance Multiple Buds after 2-3 subculture.Well-grown resistance Multiple Buds is cut proceed to root media (1/2MS+Cb 125mg/L) is cultured to and take root, thus obtain Kan resistance regeneration sweet wormwood plant. Step 5, the PCR of transgene abrotanum plant detects Forward primer is designed respectively and reverse primer detects goal gene according to goal gene place expression cassette p35s-dbr2-nos sequence p35s and dbr2.Result shows, the PCR special primer designed by utilization, can amplify the specific DNA fragment of 458bp.And with non-transformed sweet wormwood genomic dna for template time, do not amplify any fragment. The present embodiment is by described plant expression vector transform Agrobacterium tumefaciens, obtain the Agrobacterium tumefaciens strain containing DBR2 gene plant expression vector for transforming sweet wormwood, Agrobacterium tumefaciens strain constructed by utilization transforms sweet wormwood, obtains the transgene abrotanum plant detected through PCR.The acquisition of transgene abrotanum plant is screen the sweet wormwood strain obtaining higher artemislnin content to provide direct material. Step 6, utilizes HPLC-ELSD to measure artemislnin content in transgene abrotanum (1) preparation of HPLC-ELSD condition and system suitability and standardized solution HPLC: adopt water alliance 2695 system, chromatographic column is C-18 reverse phase silica gel post (Symmetry ShieldTM C18,5 μm, 250 × 4.6mm, Waters), moving phase is methyl alcohol: water, methyl alcohol: the volume ratio of water is 70: 30, column temperature 30 DEG C, flow velocity 1.0mL/min, sample size 10 μ L, sensitivity (AUFS=1.0), theoretical plate number calculates by Artemisinin peak and is not less than 2000. ELSD: adopt water alliance 2420 system, light scattering detector drift tube temperature 40 DEG C, scale-up factor (gain) is 7, nebulizer gas pressure 5bar; Precision takes Artemisinin standard substance (Sigma company) 2.0mg 1mL methyl alcohol and dissolves completely, obtains 2mg/mL Artemisinin standard solution, be stored in-20 DEG C for subsequent use. In the present embodiment, moving phase is methyl alcohol: water, and when ratio is 70%: 30%, the retention time of Artemisinin is 5.1min, and peak type is good.Theoretical plate number calculates by Artemisinin and is not less than 2000. (2) making of typical curve By described reference substance solution difference sample introduction 2 μ L under corresponding chromatographic condition, 4 μ L, 6 μ L, 8 μ L, 10 μ L record collection of illustrative plates and chromatographic parameters, carry out regression analysis respectively with peak area (Y) to standard substance content (X, μ g).By research, in the present embodiment, Artemisinin presents good log-log linear relationship within the scope of 4-20 μ g.The log-log equation of linear regression of Qinghaosu is Y=5.404e+0000X+1.858e+0000, R 2=0.999184. (3) preparation of sample and the mensuration of artemislnin content The leaching process of Artemisinin is based on the method reported in Van Nieuwerburgh et al. (2006): the sweet wormwood blade (1-2g fresh weight) taking a morsel fresh, be immersed in 50ml test tube in 10ml chloroform and swayed 1 minute, leach liquor is poured in new test tube and make chloroform volatilize completely, get 3ml dehydrated alcohol and fully dissolve extract, filter after filter filters through 0.22 μm and detect for HPLC.Meanwhile, 60 DEG C of baking ovens are put in the blade collection after chloroform extraction dries, weigh (dry weight calculating sweet wormwood blade); HPLC-ELSD is adopted to measure artemislnin content, sample feeding volume is 20 μ L, the artemislnin content (mg) in sample is gone out according to peak area substitution linear regression Equation for Calculating, again divided by artemisia leaf dry weight (g) of sample, thus calculate the content of Artemisinin in sweet wormwood plant. Turn DBR2 gene in an embodiment and significantly improve content of artemisinin in sweet wormwood.The content turning DBR2 gene blue or green senior middle school Artemisinin can reach the 22.6mg/g (as shown in Figure 1) of dry weight, is 2.83 times of non-transformed common sweet wormwood (8mg/g dry weight). The present embodiment adopts HPLC-ELSD method to determine artemislnin content in transgene abrotanum, adopts the metabolic engineering strategies transforming DBR2 gene to obtain the sweet wormwood plant of Artemisinin high yield, for large-scale production Artemisinin provides a kind of Perfected process.          
    Claims (7)     1. turn the method that DBR2 gene improves content of artemisinin in sweet wormwood, it is characterized in that, comprise following concrete steps: (1) gene clone method is adopted to obtain sweet wormwood key gene DBR2; (2) described DBR2 gene is linked to expression regulation sequence, builds the plant expression vector containing DBR2 gene; (3) by the described plant expression vector transform Agrobacterium tumefaciens containing DBR2 gene, the Agrobacterium tumefaciens strain containing described DBR2 gene plant expression vector is obtained; (4) utilize the described Agrobacterium tumefaciens strain containing DBR2 gene plant expression vector to transform sweet wormwood, obtain the transgene abrotanum plant of the integration external source goal gene DBR2 detected through PCR; (5) carry out HPLC-ELSD mensuration to artemislnin content in described transgene abrotanum, screening obtains the transgene abrotanum plant that artemislnin content improves; In described step (1), described gene clone method comprises the following steps: extract sweet wormwood genome total serum IgE, obtained sweet wormwood genome total serum IgE is obtained the first chain cDNA by ThermoScript II XL reverse transcription, DNA sequence dna according to SEQ IDNO.1, design amplifies upstream primer and the downstream primer of complete encoder block, described upstream primer is the DNA sequence dna shown in SEQ ID NO.2, described downstream primer is the DNA sequence dna shown in SEQ ID NO.3, and restriction endonuclease sites is introduced respectively so that construction of expression vector on described upstream and downstream primer, with the first described chain cDNA for template, check order after pcr amplification, In described step (2), described structure comprises the following steps containing the plant expression vector of DBR2 gene: first build intermediate carrier pMDT18-DBR2, intermediate carrier pMDT18-DBR2 and expression vector FSN is cut again with XmaI and SacI enzyme, reclaim DBR2 gene fragment and FSN carrier large fragment, connect and transform, picking mono-clonal, extracts plasmid and does PCR detection and digestion verification; Described structure intermediate carrier pMDT18-DBR2 comprises following concrete steps: by introducing the full length gene of XmaI and SacI restriction enzyme site before and after high-fidelity enzymatic amplification DBR2 gene respectively, be connected on pMDT18 carrier by ligase enzyme.   2. the method turning DBR2 gene raising content of artemisinin in sweet wormwood according to claim 1, it is characterized in that, in described step (4), described conversion comprises the following steps: the preculture of explant; The Dual culture of Agrobacterium and explant; The screening of resistance regeneration plant.   3. the method turning DBR2 gene raising content of artemisinin in sweet wormwood according to claim 2, it is characterized in that, described preculture comprises the following steps: seeds of southernwood 75% alcohol immersion 1min, then soaks 20min with 20%NaClO, aseptic water washing 3-4 time, surface-moisture is blotted with aseptic thieving paper, be inoculated in the MS solid medium without hormone, 25 DEG C of illumination cultivation, can obtain sweet wormwood aseptic seedling, grow to after about 5cm until seedling, clip tests for sterility explant is used for transforming.   4. the method turning DBR2 gene raising content of artemisinin in sweet wormwood according to claim 2, it is characterized in that, described Dual culture comprises the following steps: forwarded to by described leaf explant in Dual culture substratum, drip the 1/2MS suspension containing the described agrobacterium tumefaciens engineering bacteria containing DBR2 gene plant binary expression vector activated, explant is fully contacted with bacterium liquid, 28 DEG C of light culture 3 days, to drip leaf explant at the 1/2MS liquid nutrient medium suspension of the agrobacterium tumefaciens without goal gene for contrast.   5. the method turning DBR2 gene raising content of artemisinin in sweet wormwood according to claim 2, it is characterized in that, described screening comprises the following steps: be transferred in germination screening culture medium the described Dual culture sweet wormwood explant of 3 days in 25 DEG C of illumination cultivation, every two weeks succeeding transfer culture once, Kan resistance Multiple Buds can be obtained after 2-3 subculture, described well-grown resistance Multiple Buds is cut proceed to root media is cultured to and take root, Kan resistance regeneration sweet wormwood plant can be obtained.   6. the method turning DBR2 gene raising content of artemisinin in sweet wormwood according to claim 1, is characterized in that, in described step (4), described PCR detects and comprises the following steps: the primer of design and synthesis DBR2 gene; Carry out DNA cloning; Viewed under ultraviolet radiation, if object band is positive, then this strain is described transgene abrotanum plant.   7. the method turning DBR2 gene raising content of artemisinin in sweet wormwood according to claim 1, it is characterized in that, in described step (5), described HPLC-ELSD measures and comprises following condition: chromatographic column used is C-18 reverse phase silica gel post, and moving phase selects volume ratio to be the methyl alcohol of 70:30: water, column temperature 30 DEG C, flow velocity 1.0mL/min, sample size 20 μ L, light scattering detector drift tube temperature 40 DEG C, scale-up factor is 7, nebulizer gas pressure 5bar. https://patents.google.com/patent/CN102676578B/en           转DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法 技术领域 本发明涉及的是一种生物技术领域的提高青蒿素含量的方法,特别是一种转DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。 背景技术 青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素(artemisinin)是从其地上部分分离的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物,是目前世界上公认的最有效的治疗疟疾的药物,特别是对于脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有速效和低毒的特点。目前,世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法就是青蒿素联合疗法(ACTs)。另外,随着对青蒿素药理研究的逐步深入,科学家发现青蒿素及其衍生物还具有抗炎、抗血吸虫、抗肿瘤以及免疫调节的功能。可见青蒿素是一种极具潜力的天然药物。 目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取,然而青蒿中青蒿素的含量非常低,不同种植环境和种植品种中其平均含量在青蒿叶片干重的0.01-1%,使得这种药物的大规模商业化生产受到了限制。由于青蒿素结构复杂,人工合成难度大,产量低,成本高,不具有可行性。有人尝试用组织培养和细胞工程的方法来生产青蒿素,然而青蒿素在愈伤组织中含量低于干重的0.1%,在芽中最高也只有干重的0.16%,而大多数研究在根中没有检测到青蒿素。因此利用组织培养及细胞工程来生产青蒿素的可行性也不高。 经对现有技术文献检索发现,Waleerat Banyai等在《Plant Cell Tissue and OrganCulture》(植物细胞组织器官培养),2010年103卷255-265页发表了题为“Overexpressionof farnesyl pyrophosphate synthase(FPS)gene affected artemisinin content and growth ofArtemisia annua L.”(“过量表达法尼基焦磷酸合酶基因能影响青蒿中青蒿素的含量及青蒿的生长”)的论文,报道通过过最表达法尼基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphatesynthase,FPS),使转基因青蒿中青蒿素的含量提高了2.5-3.6倍,但仍然只有1.3%左右。不过,植物基因工程为提高青蒿中青蒿素的含量提供了一条可行的方法。 现有技术中青蒿醛Δ11(13)还原酶(artemisinic aldehydeΔ11(13)double bondreductase,DBR2)是青蒿素合成途径中的一个关键酶,是青蒿素代谢工程的重要靶点。采用基因工程手段,用关键酶基因DBR2转化青蒿,将打破青蒿素生物合成的限速瓶颈,获得青蒿素高产的青蒿植株,为规模化生产青蒿素提供一条新途径。 发明内容 本发明的目的在于克服现有技术中的不足,提供一种转DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。本发明涉及的关键酶基因克隆、载体构建、遗传转化、分子检测、青蒿素提取及含量测定用于本发明,建立了稳定提高青蒿中青蒿素含量的方法,为利用青蒿大规模生产青蒿素奠定坚实的基础。 本发明是通过以下技术方案实现的: 一种转DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法,包括如下具体步骤: (1)采用基因克隆方法获得青蒿关键酶基因DBR2; (2)把所述DBR2基因连结于表达调控序列,构建含DBR2基因的植物表达载体; (3)将所述含DBR2基因的植物表达载体转化根癌农杆菌,获得含所述DBR2基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株; (4)利用所述含DBR2基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株转化青蒿,获得经PCR检测的整合外源目的基因DBR2的转基因青蒿植株; (5)对所述转基因青蒿中青蒿素含量进行HPLC-ELSD测定,筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。 优选的,在所述步骤(1)中,所述基因克隆方法包括以下步骤:提取青蒿基因组总RNA,将所获的青蒿基因组总RNA通过反转录酶XL反转录获得第一链cDNA,根据SEQ ID NO.1所示的DNA序列,设计扩增出完整编码框的上游引物和下游引物,所述上游引物为SEQ ID NO.2所示的DNA序列,所述下游引物为SEQ ID NO.3所示的DNA序列,并在所述上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点以便构建表达载体,以所述的第一链cDNA为模板,经PCR扩增后进行测序。 优选的,在所述步骤(2)中,所述构建含DBR2基因的植物表达载体包括以下步骤:先构建中间载体pMDT18-DBR2,再用XmaI和SacI酶切中间载体pMDT18-DBR2和表达载体FSN,回收DBR2基因片段和FSN载体大片段,连接转化,挑取单克隆,提取质粒做PCR检测和酶切验证。 进一步优选的,所述构建中间载体pMDT18-DBR2包括以下具体步骤:通过高保真酶扩增DBR2基因前后分别引入XmaI和SacI酶切位点的基因全长,通过连接酶连接到pMDT18载体上。 优选的,在所述步骤(4)中,所述转化包括以下步骤:外植体的预培养;农杆菌与外植体的共培养;抗性再生植株的筛选。 进一步优选的,所述预培养包括以下步骤:青蒿种子用75%乙醇浸泡1min,再用20%NaClO浸泡20min,无菌水冲洗3-4次,用无菌吸水纸吸干表面水分,接种于无激素的MS固体培养基中,25℃光照培养,即可获得青蒿无菌苗,待苗长至5cm左右后,剪取无菌苗叶片外植体用于转化。 进一步优选的,所述共培养包括以下步骤:将所述叶片外植体转到共培养培养基中,滴加含活化好的所述含DBR2基因植物双元表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液,使外植体与菌液充分接触,28℃暗培养3天,以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。 进一步优选的,所述筛选包括以下步骤:将所述共培养3天的青蒿外植体转入到发芽筛选培养基上于25℃光照培养,每两周继代培养一次,经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽,将所述生长良好的抗性丛生芽剪下转入生根培养基上培养至生根,即可获得Kan抗性再生青蒿植株。 优选的,在所述步骤(4)中,所述PCR检测包括以下步骤:设计合成DBR2基因的引物;进行DNA扩增;紫外线下观察,若目的条带为阳性,则该株系即为所述转基因青蒿植株。 优选的,在所述步骤(5)中,所述HPLC-ELSD测定包括以下条件:所用色谱柱为C-18反相硅胶柱,流动相选用体积比为70∶30的甲醇∶水,柱温30℃,流速1.0mL/min,进样量20μL,蒸发光散射检测器漂移管温度40℃,放大系数为7,载气压力5bar。 本发明的转DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法,采用基因工程方法,将关键酶基因DBR2导入青蒿植株中,获得了青蒿素含量显著提高的转基因青蒿株系,转DBR2基因青蒿中青蒿素的含量最高可达到干重的22.6mg/g,是非转化普通青蒿(8mg/g干重)的2.83倍,该发明对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。 附图说明 图1为本发明的青蒿植株中青蒿素的含量检测结果图。 具体实施方式 下面对本发明的实施例作详细说明:本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。 实施例 步骤一,青蒿DBR2基因的克隆 (1)青蒿基因组总RNA的提取 取100-200mg青蒿幼嫩叶片,用液氮速冻后,迅速用研钵研碎,加入盛有1mL TRlzol(TRlzol Reagents,GIBCOBRL,USA)的1.5mL Eppendorf管中,充分振荡后,于室温下放置5min,加200μL氯仿,用力振荡15sec,室温放置2-3min后,于4℃下12,000rmp离心15min;将上清液(约600μL)吸入干净的1.5mL Eppendorf管中,加入等体积的异丙醇,颠倒混匀,室温下放置10min后,于4℃下12,000rmp离心10min;弃上清,加1mL 75%乙醇清洗,振荡后,于4℃下7,500rmp离心5min;室温干燥10-15min后溶于适量(30-40μL)RNAase-free水中;用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量,然后在分光光度计上测定RNA含量。 (2)青蒿DBR2基因的克隆 将所获的青蒿基因组总RNA通过反转录酶XL(AMV)反转录获得第一链cDNA,根据所述青蒿DBR2基因的编码序列(SEQ ID NO.1所示的DNA序列),设计扩增出完整编码框的上游引物(SEQ ID NO.2所示的DNA序列)和下游引物(SEQ ID NO.3所示的DNA序列),并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定),以便构建表达载体。以所述的第一链cDNA为模板,经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海英骏生物技术服务有限公司测序完成。测序结果表明,所克隆的序列与GenBank中所报道的青蒿DBR2基因的编码序列(SEQ ID NO.1所示的DNA序列)一致。 本实施例采用基因克隆方法从青蒿中获得序列正确的青蒿素生物合成关键酶基因DBR2,为通过转DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量提供了一个重要关键酶基因。 步骤二,含DBR2基因的植物双元表达载体的构建 (1)中间载体pMDT18-DBR2的构建 选用pMDT18载体(Takara,Dalian)为基本元件,构建中间载体pMDT18-DBR2。具体地,通过高保真酶扩增DBR2基因前后分别引入XmaI和SacI酶切位点的基因全长,通过连接酶连接到pMDT18载体上,由上海英骏生物技术服务有限公司测序确认基因的正确性。 (2)含DBR2基因的植物表达载体的构建 以所述的FSN(FSN表达载体为在pCAMBIA2300表达载体上改造获得并保存)为表达载体,将上述DBR2基因连入其对应的酶切位点位置。具体地,XmaI和SacI双酶切中间载体pMDT18-dbr2和表达载体FSN。回收DBR2基因片段和FSN载体大片段,连接转化,挑取单克隆,提取质粒做PCR检测和酶切验证。 本实施例将青蒿素生物合成途径关键酶基因DBR2可操作性地连接于表达调控序列,形成含DBR2基因的植物表达载体,该表达载体可用于通过代谢工程策略来提高青蒿中青蒿素的含量。 步骤三,含DBR2基因双元植物表达载体根癌农杆菌工程菌的获得 将上述含DBR2基因的植物双元表达载体转入根癌农杆菌(如EHA105,为市场有公开出售的生物材料,可以从澳大利亚CAMBIA公司购得,菌株编号为Gambar 1),并进行PCR验证。 步骤四,根癌农杆菌介导DBR2基因转化青蒿 (1)外植体的预培养 青蒿种子用75%乙醇浸泡1min,再用20%NaClO浸泡20min,无菌水冲洗3-4次,用无菌吸水纸吸干表面水分,接种于无激素的MS(Murashige and Skoog,1962)固体培养基中,25℃、16h/8h(light/dark)光照培养,即可获得青蒿无菌苗。待苗长至5cm左右后,剪取无菌苗叶片外植体用于转化。 (2)农杆菌与外植体的共培养 将所述的叶片外植体,转到共培养培养基(1/2MS+AS 100μmol/L)中,滴加含活化好的所述含DBR2基因植物双元表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液,使外植体与菌液充分接触,28℃暗培养3天。以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。 (3)抗性再生植株的筛选 将所述的共培养3天的青蒿外植体转入到发芽筛选培养基(MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L)上于25℃、16h/8h(light/dark)光照培养,每两周继代培养一次,经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽。将生长良好的抗性丛生芽剪下转入生根培养基(1/2MS+Cb 125mg/L)上培养至生根,从而获得Kan抗性再生青蒿植株。 步骤五,转基因青蒿植株的PCR检测 根据目的基因所在表达盒p35s-dbr2-nos序列p35s和dbr2分别设计正向引物和反向引物对目的基因进行检测。结果表明,利用所设计的PCR特异引物,能扩增出458bp的特异DNA片段。而以非转化青蒿基因组DNA为模板时,没有扩增出任何片段。 本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌,获得用于转化青蒿的含DBR2基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株,利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿,获得经PCR检测的转基因青蒿植株。转基因青蒿植株的获得为筛选获得较高青蒿素含量的青蒿株系提供了直接素材。 步骤六,利用HPLC-ELSD测定转基因青蒿中青蒿素含量 (1)HPLC-ELSD条件及系统适用性以及标准溶液的配制 HPLC:采用water alliance 2695系统,色谱柱为C-18反相硅胶柱(Symmetry ShieldTM C18,5μm,250×4.6mm,Waters),流动相为甲醇∶水,甲醇∶水的体积比为70∶30,柱温30℃,流速1.0mL/min,进样量10μL,灵敏度(AUFS=1.0),理论塔板数按青蒿素峰计算不低于2000。 ELSD:采用water alliance 2420系统,蒸发光散射检测器漂移管温度40℃,放大系数(gain)为7,载气压力5bar; 精密称取青蒿素标准品(Sigma公司)2.0mg用1mL甲醇完全溶解,得到2mg/mL青蒿素标准品溶液,保存于-20℃备用。 本实施例中流动相为甲醇∶水,比例为70%∶30%时,青蒿素的保留时间为5.1min,峰型良好。理论塔板数按青蒿素计算不低于2000。 (2)标准曲线的制作 将所述对照品溶液在相应色谱条件下分别进样2μL,4μL,6μL,8μL,10μL记录图谱及色谱参数,分别以峰面积(Y)对标准品含量(X,μg)进行回归分析。通过研究,本实施例中青蒿素在4-20μg范围内呈现良好的log-log线性关系。青蒿素对照品的log-log线性回归方程为Y=5.404e+0000X+1.858e+0000,R2=0.999184。 (3)样品的制备和青蒿素含量的测定 青蒿素的提取过程基于Van Nieuwerburgh et al.(2006)中报道的方法:取少量新鲜的青蒿叶片(1-2g鲜重),于50ml试管中将其浸没在10ml氯仿中摇荡1分钟,将浸出液倒入新的试管中使氯仿挥发完全,取3ml无水乙醇充分溶解提取物,经0.22μm过滤滤头过滤后用于HPLC检测。同时,氯仿提取后的叶片收集放入60℃烘箱进行烘干,称重(计算青蒿叶片的干重); 采用HPLC-ELSD测定青蒿素含量,样品进样体积为20μL,根据峰面积代入线形回归方程计算出样品中的青蒿素含量(mg),再除以样品的青蒿叶干重(g),从而计算出青蒿植株中青蒿素的含量。 在实施例中转DBR2基因显著提高青蒿中青蒿素含量。转DBR2基因青高中青蒿素的含量最高可达到干重的22.6mg/g(如图1所示),是非转化普通青蒿(8mg/g干重)的2.83倍。 本实施例采用HPLC-ELSD法测定了转基因青蒿中青蒿素含量,采用转化DBR2基因的代谢工程策略获得了青蒿素高产的青蒿植株,为规模化生产青蒿素提供了一种理想方法。          
    Claims (7)   1.一种转DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征是,包括如下具体步骤: (1)采用基因克隆方法获得青蒿关键酶基因DBR2; (2)把所述DBR2基因连结于表达调控序列,构建含DBR2基因的植物表达载体; (3)将所述含DBR2基因的植物表达载体转化根癌农杆菌,获得含所述DBR2基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株; (4)利用所述含DBR2基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株转化青蒿,获得经PCR检测的整合外源目的基因DBR2的转基因青蒿植株; (5)对所述转基因青蒿中青蒿素含量进行HPLC-ELSD测定,筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株; 在所述步骤(1)中,所述基因克隆方法包括以下步骤:提取青蒿基因组总RNA,将所获的青蒿基因组总RNA通过反转录酶XL反转录获得第一链cDNA,根据SEQ IDNO.1所示的DNA序列,设计扩增出完整编码框的上游引物和下游引物,所述上游引物为SEQ ID NO.2所示的DNA序列,所述下游引物为SEQ ID NO.3所示的DNA序列,并在所述上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点以便构建表达载体,以所述的第一链cDNA为模板,经PCR扩增后进行测序; 在所述步骤(2)中,所述构建含DBR2基因的植物表达载体包括以下步骤:先构建中间载体pMDT18-DBR2,再用XmaI和SacI酶切中间载体pMDT18-DBR2和表达载体FSN,回收DBR2基因片段和FSN载体大片段,连接转化,挑取单克隆,提取质粒做PCR检测和酶切验证;所述构建中间载体pMDT18-DBR2包括以下具体步骤:通过高保真酶扩增DBR2基因前后分别引入XmaI和SacI酶切位点的基因全长,通过连接酶连接到pMDT18载体上。   2.根据权利要求1所述的转DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征是,在所述步骤(4)中,所述转化包括以下步骤:外植体的预培养;农杆菌与外植体的共培养;抗性再生植株的筛选。   3.根据权利要求2所述的转DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征是,所述预培养包括以下步骤:青蒿种子用75%乙醇浸泡1min,再用20%NaClO浸泡20min,无菌水冲洗3-4次,用无菌吸水纸吸干表面水分,接种于无激素的MS固体培养基中,25℃光照培养,即可获得青蒿无菌苗,待苗长至5cm左右后,剪取无菌苗叶片外植体用于转化。   4.根据权利要求2所述的转DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征是,所述共培养包括以下步骤:将所述叶片外植体转到共培养培养基中,滴加含活化好的所述含DBR2基因植物双元表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液,使外植体与菌液充分接触,28℃暗培养3天,以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。   5.根据权利要求2所述的转DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征是,所述筛选包括以下步骤:将所述共培养3天的青蒿外植体转入到发芽筛选培养基上于25℃光照培养,每两周继代培养一次,经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽,将所述生长良好的抗性丛生芽剪下转入生根培养基上培养至生根,即可获得Kan抗性再生青蒿植株。   6.根据权利要求1所述的转DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征是,在所述步骤(4)中,所述PCR检测包括以下步骤:设计合成DBR2基因的引物;进行DNA扩增;紫外线下观察,若目的条带为阳性,则该株系即为所述转基因青蒿植株。   7.根据权利要求1所述的转DBR2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征是,在所述步骤(5)中,所述HPLC-ELSD测定包括以下条件:所用色谱柱为C-18反相硅胶柱,流动相选用体积比为70:30的甲醇:水,柱温30℃,流速1.0mL/min,进样量20μL,蒸发光散射检测器漂移管温度40℃,放大系数为7,载气压力5bar。   Patent Citations (2)
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  17. Roger
    A method of content of artemisinin in sweet wormwood is improved using AaSPL2 gene, include the following steps: to clone salicylic acid signal pathway AaSPL2 gene from sweet wormwood, construct the plant expression vector of the gene containing AaSPL2, with Agrobacterium tumefaciens mediated, AaSPL2 gene is transferred to sweet wormwood and regenerates plant, PCR detects the integration of external source target gene AaSPL2, then measures the content of qinghaosu in transgene abrotanum, and screening obtains the transgene abrotanum plant that artemislnin content improves.The content of qinghaosu significantly improves in the transgene abrotanum that the present invention obtains, up to the 1.8 of nontransformed control plant times, lays the foundation for qinghaosu is mass produced using transgene abrotanum. 一种利用AaSPL2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法,包括如下步骤:从青蒿中克隆水杨酸信号途径AaSPL2基因,构建含AaSPL2基因的植物表达载体,用根癌农杆菌介导,将AaSPL2基因转入青蒿并再生出植株,PCR检测外源目的基因AaSPL2的整合情况,再测定转基因青蒿中青蒿素的含量,筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。本发明获得的转基因青蒿中青蒿素的含量显著提高,最高达到非转化对照植株的1.8倍,为利用转基因青蒿大规模生产青蒿素打下了基础。        
    Description A method of content of artemisinin in sweet wormwood is improved using AaSPL2 gene Technical field The invention belongs to field of biotechnology.A kind of method for improving artemislnin content is particularly related to, in particular to It is a kind of method for improving content of artemisinin in sweet wormwood using AaSPL2 gene. Background technique Sweet wormwood (Artemisia annua L.) is the annual herb plant of composite family artemisia.Qinghaosu (artemisinin) it is a kind of sesquiterpene lactone containing peroxide bridge structure separated from its aerial part, is current The drug of generally acknowledged most effective treatment malaria in the world has quick-acting and low especially for encephalic malaria and anti-chlorine quinoline malaria The feature of poison.Currently, the method for the most effective treatment malaria of world health organisation recommendations is exactly qinghaosu conjoint therapy (ACTs).In addition, it is anti-that scientist has found that qinghaosu and its derivative also have with gradually going deep into qinghaosu pharmacological research Inflammation, anti-schistosome, antitumor and immunoregulatory function.It can be seen that qinghaosu is a kind of natural drug of great potential. The main source of qinghaosu is extracted from the aerial part of sweet wormwood plant at present, however the content of Artemisinin in Artemisia annuna Very low (0.01%-1%), so that the large-scale commercial production of this drug is restricted.Since qinghaosu structure is multiple Miscellaneous, artificial synthesized difficulty is big, and low output is at high cost, does not have feasibility.Have tried to the side with tissue cultures and cell engineering Method produces qinghaosu, however qinghaosu content in callus is lower than the 0.1% of dry weight, and highest also only has dry weight in bud 0.16%, and most of research does not detect qinghaosu in root.Therefore it is produced using tissue cultures and cell engineering The feasibility of qinghaosu is not also high. Through to existing technical literature retrieve find, Qian Shen etc. " New Phytologist " (" new plant scholar ", 1269-1281 pages of 210 phase in 2016) deliver entitled " The jasmonate-responsive AaMYC2transcription factor positively regulates artemisinin biosynthesis in Artemisia annua " (" is closed by the biology that the AaMYC2 transcription factor that methyl jasmonic acid responds just is regulating and controlling Artemisinin in Artemisia annuna At ") paper, report mentions artemislnin content by being overexpressed the AaMYC2 that is responded by hormone methyl jasmonic acid in sweet wormwood It is 1.6 times high.Therefore, it is provided by being overexpressed the gene responded by methyl jasmonic acid to improve the content of Artemisinin in Artemisia annuna One feasible method. Summary of the invention The purpose of the present invention is to provide a kind of methods for improving content of artemisinin in sweet wormwood using AaSPL2 gene, will be green The AaSPL2 gene cloned in wormwood artemisia, which is transferred in sweet wormwood, obtains transgenosis AaSPL2 sweet wormwood, sweet wormwood in transgenosis AaSPL2 sweet wormwood Cellulose content significantly improves, and qinghaosu is mass produced using sweet wormwood to realize. The present invention is achieved by the following technical solutions: the present invention clones AaSPL2 gene from sweet wormwood, and building contains The plant expression vector of AaSPL2 gene, use is Agrobacterium tumefaciens mediated, by AaSPL2 channel genes sweet wormwood and regenerates plant; PCR detects the integration of external source target gene AaSPL2, HPLC ELSD detector (HPLC-ELSD) Content of artemisinin in sweet wormwood is measured, screening obtains the transgene abrotanum plant that artemislnin content improves. The method provided by the invention for improving content of artemisinin in sweet wormwood using AaSPL2 gene, includes the following steps: S1: sweet wormwood key gene AaSPL2 is obtained using gene clone method; S2: AaSPL2 gene is operatively connectable to expression regulation sequence, constructs the plant table of the gene containing AaSPL2 Up to carrier; S3: the plant expression vector of the gene containing AaSPL2 is converted into Agrobacterium tumefaciems, is obtained for converting containing for sweet wormwood The Agrobacterium tumefaciens strain of AaSPL2 gene plant expression vector; S4: sweet wormwood is converted using constructed Agrobacterium tumefaciens strain, obtains the transgene abrotanum through PCR test positive Plant; S5: HPLC-ELSD measurement is carried out to artemislnin content in the transgene abrotanum of acquisition, screening obtains artemislnin content The transgene abrotanum plant significantly improved. Preferably, step S1: sweet wormwood genome total serum IgE is extracted;Sweet wormwood genome total serum IgE is obtained first by reverse transcription Chain cDNA;According to the design of the coded sequence of the sweet wormwood AaSPL2 gene as shown in SEQ ID NO.1 amplifies complete encoder block Upstream and downstream primer, and restriction endonuclease sites are introduced respectively on upstream and downstream primer, so as to construction of expression vector;With institute Stating the first chain cDNA is template, is sequenced after PCR amplification, obtains and correct sweet wormwood AaSPL2 gene is sequenced, and wherein PCR expands The nucleotide sequence for increasing upstream and downstream primer used is respectively as follows: AaSPL2-PF:atggagtggaattgggacaa, AaSPL2- PR:ttaatttgaacaaaagtagtcaaaa. Preferably, in step S2, the plant expression vector of building gene containing AaSPL2 includes the following steps: to select PBI121 and pCAMBIA2300 is primary element, constructs binary plant expression vector pCAMBIA2300::p35S-gus-nos; BamHI and SacI double digestion carrier pCAMBIA2300::p35S-gus-nos is used again, recycles pCAMBIA2300::p35S-nos Large fragment will be formed by seamless Cloning Kit in AaSPL2 gene swapping to pCAMBIA2300::p35S-nos PCAMBIA2300::p35S-pCAMBIA2300::p35S-gus-AaSPL2-nos, conversion, picking monoclonal extract plasmid and do PCR detection and digestion verification. It is furthermore preferred that the building binary plant expression vector pCAMBIA2300::p35S-gus-nos includes following step It is rapid: to use HindIII and EcoRI double digestion pBI121 and pCAMBIA2300 plasmid;Recycle pBI121 gus expression cassette and PCAMBIA2300 large fragment;Recovery product is connected, transformation and selection takes out plasmid enzyme restriction verifying. Preferably, described to convert the preculture for including the following steps: explant in step S4;Agrobacterium and explant It co-cultures;The screening of resistance regeneration plant. It is furthermore preferred that the preculture of the explant includes the following steps: that 75% ethyl alcohol of seeds of southernwood impregnates 1min, then 20min is impregnated with 20%NaClO, aseptic water washing 3-4 times blots surface moisture with sterile blotting paper, is inoculated in no hormone In MS solid medium, illumination cultivation 16h, dark culture 8h, can be obtained sweet wormwood aseptic seedling at 25 DEG C, long to 5~8cm to seedling Afterwards, clip tests for sterility explant is for converting. It is furthermore preferred that the co-cultivation of the Agrobacterium and explant includes the following steps: the tests for sterility explant Body is gone in co-culture medium, is added dropwise containing the activated binary expression vector of gene plant containing AaSPL2 The 1/2MS of the Agrobacterium tumefaciems engineering bacteria of pCAMBIA2300::p35S-pCAMBIA2300::p35S-gus-AaSPL2-nos is outstanding Liquid comes into full contact with explant with bacterium solution, 28 DEG C of dark culture 3d. It is furthermore preferred that include the following steps: will be outside the sweet wormwood of the described co-cultivation 3d for the screening of the resistance regeneration plant Implant is transferred on germination screening and culturing medium illumination cultivation 16h, dark culture 8h at 25 DEG C, and squamous subculture is primary every two weeks, warp It can be obtained Kan resistance Multiple Buds after crossing 2-3 subculture, well-grown resistance Multiple Buds cut and are transferred on root media Culture obtains Kan resistance and regenerates sweet wormwood plant to taking root. Preferably, in step S4, the method for the PCR detection are as follows: separately design synthesis expression cassette p35s-AaSPL2-nos The specific primer of AaSPL2 gene carries out PCR amplification in sequence, observes purpose in the UV lamp after agarose gel electrophoresis The positive strain of band is transgene abrotanum plant;The specific primer includes upstream primer, downstream primer, particular sequence It is respectively as follows: PF:gagagactggtgatttcagcg, PR:ttaatttgaacaaaagtagtcaaaa. In step S5, the HPLC-ELSD measures content of artemisinin in sweet wormwood, method are as follows: chromatographic column C-18 reverse phase silicon Rubber column gel column, mobile phase are methanol: water, methanol: the volume ratio of water be 70:30,30 DEG C of column temperature, flow velocity 1.0mL/min, 10 μ of sample volume L, 40 DEG C of evaporative light scattering detector drift tube temperature, amplification coefficient (gain) is 7, nebulizer gas pressure 5bar. Agrobacterium tumefaciems used is the biomaterial that there is public offering in market in step S3 of the present invention, can be from more companies As Australian CAMBIA company buys. The present invention also provides sweet wormwood AaSPL2 genes to improve the application in content of artemisinin in sweet wormwood. This invention demonstrates that AaSPL2 gene is the important transcription factor of salicylic acid signal pathway and qinghaosu metabolic engineering Important target spot.The present invention has broken the limit of qinghaosu biosynthesis with AaSPL2 genetic transformation sweet wormwood using genetic engineering means Fast bottleneck obtains the sweet wormwood plant of qinghaosu high yield, establishes the method stablized and improve content of artemisinin in sweet wormwood, is scale Production qinghaosu provides a new way. Beneficial effects of the present invention: The method provided by the invention for improving content of artemisinin in sweet wormwood using AaSPL2 gene, using genetic engineering side Key gene AaSPL2 is imported in sweet wormwood plant, obtains the transgene abrotanum strain that artemislnin content significantly improves by method, The content for turning AaSPL2 gene Artemisinin in Artemisia annuna can reach 20.6mg/g DW, be non-transformed common sweet wormwood (10.9mg/g DW) 1.8 times, content of artemisinin in sweet wormwood is significantly improved, provides high yield, stable new drug for the large-scale production of qinghaosu Source is of great significance. Detailed description of the invention Fig. 1 is AaSPL2 gene in the embodiment of the present invention 1 by MeJA induced map. Fig. 2 be the embodiment of the present invention 1 in AaSPL2 gene different tissues express spectra. Fig. 3 is 3 plant expression vector of the embodiment of the present invention: the building signal of pCAMBIA2300::p35S-AaSPL2-nos Figure. Fig. 4 is the content detection result figure of 5 transgenic Artemisinin in Artemisia annuna of the embodiment of the present invention. Specific embodiment Elaborate below to the embodiment of the present invention: the present embodiment carries out under the premise of the technical scheme of the present invention Implement, the detailed implementation method and specific operation process are given, but protection scope of the present invention is not limited to following implementation Example. In the following examples, the experimental methods for specific conditions are not specified, usually according to normal condition, such as Sambrook etc. Molecular cloning: described in laboratory manual (New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) Condition, or according to the normal condition proposed by manufacturer. Embodiment 1 Hormone MeJA plays a significant role in induction secondary metabolite.MeJA can induce a variety of secondary metabolites Synthesis, such as danshinolic acid, qinghaosu in Radix Salviae Miltiorrhizae.SBP class transcription factor is a kind of important transcription factor, raw in regulation plant It plays a crucial role in long development, secondary metabolism.The research that SPL regulates and controls qinghaosu in sweet wormwood at present not yet has been reported that. 1.MeJA handles sweet wormwood It (uses by the sweet wormwood plant that the hormone MeJA of 100mM handles 30 days sizes and originates in Chongqing tenth of the twelve Earthly Branches sun artemislnin content Higher sweet wormwood kind), screen the SBP class transcription factor induced by MeJA.Respectively hormone MeJA handle 0h, 1h, 3h, 6h, 9h, 12h and sweet wormwood blade is taken for 24 hours.It is placed in liquid nitrogen, the extraction for RNA. 2. the extraction of sweet wormwood genome total serum IgE A small amount of sweet wormwood young leaflet tablet is taken to be ground with mortar rapidly after liquid nitrogen flash freezer, addition fills 1mL TRIzol In the 1.5mL Eppendorf pipe of (TRIzol Reagents, GIBCO BRL, USA), sufficiently after oscillation, place at room temperature 5min adds 200 μ L chloroforms, with forced oscillation 15sec, after being placed at room temperature for 2-3min, is centrifuged 15min in 4 DEG C, 12,000g;By supernatant Liquid (about 600 μ L) sucks in clean 1.5mL Eppendorf pipe, and isometric isopropanol is added, is mixed by inversion, room temperature decentralization After setting 10min, 10min is centrifuged in 4 DEG C, 12,000g;Supernatant is abandoned, 75% ethyl alcohol of 1mL is added to clean, after oscillation, in 4 DEG C, 7, 500g is centrifuged 5min;It is dissolved in after drying at room temperature 15-20min in appropriate (30-50 μ L) RNAase-free water;With denaturing formaldehyde glue Electroresis appraisal total serum IgE quality, then measures rna content on spectrophotometer. 3. screening the SBP class transcription factor induced by MeJA 0h, 1h, 3h, 6h, 9h, 12h are handled in hormone MeJA respectively and takes sweet wormwood blade for 24 hours, extract sweet wormwood according to step 2 Genome total serum IgE.The expression that SBP genoid is detected by Q-PCR generates thermal map file by MeV 4.9, referring to Fig. 1. As shown in Figure 1, AaSPL2 is induced obviously by MeJA in sweet wormwood SPL, after MeJA is handled sweet wormwood plant 1 hour, expression quantity It increases, between 3 hours to 24, expression quantity is also in raised trend, shows the induction of AaSPL2 response MeJA, and AaSPL2 may Participate in the regulation of qinghaosu. 4, sweet wormwood different tissues expression pattern analysis Sweet wormwood plant (identical as kind in step 1) different tissues position (COT, the cotyledon of 3 months sizes are taken respectively;ML, Mature leaf;Meristem, separate living tissue;YL, tender leaf;Bud, bud), RNA is extracted according to step 2 method.It is examined by Q-PCR The expression for surveying SBP genoid generates thermal map file by MeV 4.9, referring to fig. 2.Fig. 2 shows different groups in sweet wormwood (COT, cotyledon are knitted in position;ML, mature leaf;Meristem, separate living tissue;YL, tender leaf;Bud, bud), AaSPL2 is presented Different expressions.AaSPL2 expression quantity in colored and blade is higher, has class with artemisinin synthesis pathway key enzyme gene As express spectra, screening obtain AaSPL2 be by MeJA induce important transcription factor. Therefore, complex chart 1 and Fig. 2's as a result, show AaSPL2 may have regulation artemisinin synthesis potentiality. The clone of 2 sweet wormwood AaSPL2 gene of embodiment The sweet wormwood genome total serum IgE obtained is obtained into the first chain cDNA by reverse transcriptase XL (AMV) reverse transcription, according to institute The coded sequence (as shown in SEQ ID NO:1) of sweet wormwood AaSPL2 gene is stated, the upstream and downstream that design amplifies complete encoder block is drawn Object, AaSPL2-PF:atggagtggaattgggacaa, AaSPL2-PR:ttaatttgaacaaaagtagtcaaaa, and upper Restriction endonuclease sites (this can be depending on the carrier of selection) is introduced respectively in trip and downstream primer, is carried to construct expression Body. Using the first chain cDNA as template, it is sequenced after PCR amplification.Determined dna sequence is by Shanghai Ying Junsheng Object Technology Service Co., Ltd is completed using 3730 automatic sequencers.Sequencing result shows cloned sweet wormwood AaSPL2 gene Sequence is consistent with sequence shown in SEQ ID NO:1. The KOD reaction system of pcr amplification reaction is as shown in table 1. Table 1 Constituent Content 5×KOD buffer 5μL dNTP 5μL MgSO4 2μL PF(10μM) 1μL PR(10μM) 1μL Template DNA 1μL KOD enzyme 1μL dH2O up to 50μL PCR response procedures are as follows:   The present embodiment obtains the important transcription factor AaSPL2 of salicylic acid signal pathway using gene clone method from sweet wormwood Gene, to provide an important key gene by turning AaSPL2 gene raising content of artemisinin in sweet wormwood. The building of the plant binary expression vector of 3 gene containing AaSPL2 of embodiment 1. the building of intermediate vector pCAMBIA2300::p35S-gus-nos It selects pBI121 (Clontech) and pCAMBIA2300 (Australian CAMBIA research institute) is primary element, structure Build binary plant expression vector pCAMBIA2300::p35S-gus-nos.Specifically, HindIII and EcoRI double digestion pBI121 With pCAMBIA2300 plasmid;Recycle the gus expression cassette and pCAMBIA2300 large fragment of pBI121;Connect recovery product, conversion Screening takes out plasmid enzyme restriction verifying, obtains binary plant expression vector pCAMBIA2300::p35S-gus-nos.Wherein, digestion is anti- Answer system as shown in table 2. Table 2 Constituent Content 10 × buffer of digestion 5μL Carrier 20μL Restriction endonuclease 1 1μL Interior enzyme 2 1μL dH2O up to 50μL 2. the building of plant expression vector pCAMBIA2300::p35S-AaSPL2-nos Using the pCAMBIA2300::p35S-gus-nos of building as expression vector, obtained with clone in embodiment 1 The gus gene of AaSPL2 gene replacement thereon, obtains plant expression vector pCAMBIA2300::p35S-AaSPL2-nos, building Schematic diagram is as shown in Figure 3.Specifically, BamHI/SacI double digestion pCAMBIA2300::p35S-gus-nos, recycling PCAMBIA2300::p35S-nos large fragment is arrived AaSPL2 gene swapping by seamless Cloning Kit (Nanjing Novi praises) PCAMBIA2300::p35S-pCAMBIA2300::p35S-gus-AaSPL2- is formed on pCAMBIA2300::p35S-nos Nos, conversion, picking monoclonal extract plasmid and do PCR detection and digestion verification, obtain plant expression vector pCAMBIA2300:: p35S-AaSPL2-nos.Wherein, seamless cloning reaction system is as shown in table 3. Table 3 Constituent Content Gene PCR product 1μL Linearized vector 3μL Seamless clone Buffer 4μL Seamless clone enzyme 2μL dH2O up to 20μL Salicylic acid signal pathway important gene AaSPL2 is operatively connectable to expression regulation sequence, shape by the present embodiment At the plant expression vector of the gene containing AaSPL2, which can be used for improving sweet wormwood in sweet wormwood by metabolic engineering strategies The content of element. The Agrobacterium tumefaciens mediated AaSPL2 gene genetic of embodiment 4 converts sweet wormwood and obtains transgene abrotanum plant 1. the acquisition of the double base plant expression vector Agrobacterium tumefaciems engineering bacteria of gene containing AaSPL2 By the plant binary expression vector pCAMBIA2300::p35S-AaSPL2-nos of the gene containing AaSPL2 in embodiment 2 Being transferred to Agrobacterium tumefaciems, (such as EHA105 has the biomaterial of public offering for market, can purchase from Australian CAMBIA company , strain number is Gambar 1), and carry out PCR verifying.Wherein, plasmid be transferred to Agrobacterium method it is as follows: 1 μ L plasmid adds Enter into 50 μ L Agrobacterium competence, ice bath 30 minutes, freeze 5 minutes in liquid nitrogen, 37 DEG C heat shock 3 minutes, add LB culture Base activates 3 hours in 37 DEG C of shaking tables, coated plate, identification. The result shows that the binary expression vector of gene plant containing AaSPL2 is successfully building up in Agrobacterium tumefaciens strain. 2. Agrobacterium tumefaciens mediated AaSPL2 genetic transformation sweet wormwood 2.1. the preculture of explant 75% ethyl alcohol of seeds of southernwood impregnates 1min, then impregnates 20min with 20%NaClO, and aseptic water washing 3-4 times is used Sterile blotting paper blots surface moisture, is inoculated in MS (Murashige and Skoog, 1962) solid medium of no hormone In, 25 DEG C, 16h/8h (light/dark) illumination cultivation can be obtained sweet wormwood aseptic seedling.After seedling length to 5cm or so, clip Tests for sterility explant is for converting. 2.2. the co-cultivation of Agrobacterium and explant The blade explant is gone in co-culture medium (100 μm of ol/L of 1/2MS+AS), dropwise addition, which contains, to be activated The binary expression vector of gene plant containing AaSPL2 Agrobacterium tumefaciems engineering bacteria 1/2MS suspension, make explant and bacterium Liquid comes into full contact with, 28 DEG C of dark culture 3d.It is outstanding in the 1/2MS fluid nutrient medium of the Agrobacterium tumefaciems without target gene with dropwise addition The blade explant of liquid is control. 2.3. the screening of resistance regeneration plant The sweet wormwood explant for co-culturing 3d is transferred to germination screening and culturing medium (MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L) in 25 DEG C, 16h/8h illumination cultivation, squamous subculture is primary every two weeks, warp It can be obtained Kan resistance Multiple Buds after crossing 2-3 subculture.Well-grown resistance Multiple Buds are cut and are transferred to root media It is cultivated on (1/2MS+Cb 125mg/L) to taking root, to obtain Kan resistance regeneration sweet wormwood plant. 3. the PCR of transgene abrotanum plant is detected (sweet wormwood is extracted by DNA extraction kit (Tiangeng) by template of the Kan resistance of acquisition regeneration sweet wormwood plant DNA The DNA of plant), forward direction is separately designed according to expression cassette p35s-AaSPL2-nos sequence p35s and AaSPL2 where target gene Design of primers and reverse primer detect target gene, detection primer PF:gagagactggtgatttcagcg, PR: ttaatttgaacaaaagtagtcaaaa.Wherein, it using DNA as template, is expanded by TAKARA enzyme (Dalian treasured bioengineering), Rtaq-MIX enzyme reaction system is as shown in table 4 and program is as follows: Table 4 Constituent Content 2×rtaq-MIX buffer 5μL PF(10μM) 1μL PR(10μM) 1μL Template DNA 1μL Rtaq enzyme 1μL dH2O up to 20μL PCR response procedures are as follows:   The result shows that the specific DNA fragment of 1000bp, i.e. agarose can be amplified using designed PCR special primer Purpose band is observed after gel electrophoresis in the UV lamp, the Kan resistance regeneration sweet wormwood plant of acquisition is to turn AaSPL2 gene Sweet wormwood plant.And when using non-transformed sweet wormwood genomic DNA as template, do not amplify any segment. The plant expression vector is converted Agrobacterium tumefaciems by the present embodiment, obtain for convert sweet wormwood containing AaSPL2 The Agrobacterium tumefaciens strain of gene plant expression vector converts sweet wormwood using constructed Agrobacterium tumefaciens strain, obtains through PCR The transgene abrotanum plant of detection.The acquisition of transgene abrotanum plant is that the sweet wormwood strain of the higher artemislnin content of screening acquisition mentions Direct material is supplied. Embodiment 5 utilizes artemislnin content in HPLC-ELSD measurement transgene abrotanum The preparation of 1.HPLC-ELSD condition and system suitability and standard solution HPLC: using 2695 system of water alliance, and chromatographic column is C-18 reverse phase silica gel column (SymmetryShieldTM C18,5 μm, 250 × 4.6mm, Waters), mobile phase is methanol: water, methanol: the volume ratio of water For 70:30,30 DEG C of column temperature, flow velocity 1.0mL/min, 10 μ L of sample volume, sensitivity (AUFS=1.0), theoretical cam curve presses sweet wormwood Plain peak, which calculates, is not less than 2000. ELSD: 2420 system of water alliance is used, 40 DEG C of evaporative light scattering detector drift tube temperature, is amplified Coefficient (gain) is 7, nebulizer gas pressure 5bar. Precision weighs qinghaosu standard items (Sigma company) 2.0mg and is completely dissolved with 1mL methanol, obtains 2mg/mL sweet wormwood Plain standard solution, be stored in -20 DEG C it is spare. Mobile phase is methanol (methanol): water in the present invention, when ratio is 70%:30%, the retention time of qinghaosu For 5.1min, peak type is good.Theoretical cam curve is calculated by qinghaosu is not less than 2000. 2. the production of standard curve Above-mentioned standard product solution is distinguished to sample introduction 2 μ l, 4 μ l, 6 μ l, 8 μ l, 10 μ l under corresponding chromatographic condition and records map And chromatographic parameter, regression analysis is carried out to standard items content (X, μ g) with peak area (Y) respectively.It is green in the present invention by research Good log-log linear relationship is presented in artemisin in 4-20 μ g range.The log-log equation of linear regression of Qinghaosu Are as follows: Y=1.28e+000X+4.71e+000, R=0.979546. 3. the preparation of sample and the measurement of artemislnin content The extraction process of qinghaosu is based on the method reported in Van Nieuwerburgh et al. (2006): taking a small amount of Fresh sweet wormwood blade (1-2g fresh weight), is immersed into 10ml chloroform in 50ml test tube and sways 1 minute, leachate is fallen Enter to make in new test tube chloroform volatilization completely, 3ml dehydrated alcohol is taken sufficiently to dissolve extract, is detected for HPLC.Meanwhile chloroform Blade collection after extraction, which is put into 60 degree of baking ovens, is dried, and weighing (calculates the dry weight of sweet wormwood blade); Artemislnin content is measured using HPLC-ELSD, sample feeding volume is 20 μ l, substitutes into linear regression according to peak area Equation calculation goes out the artemislnin content (mg) in sample, then divided by the sweet wormwood leaf dry weight (g) of sample, to calculate sweet wormwood plant The content of middle qinghaosu. After measured, the content of transfer AaSPL2 gene Artemisinin in Artemisia annuna of the present invention can reach 20.6mg/g DW, be 1.8 times (as shown in Figure 4) of non-transformed common sweet wormwood (10.9mg/g DW), AaSPL2 gene significantly improve sweet wormwood in sweet wormwood Cellulose content. The present embodiment determines artemislnin content in transgene abrotanum using HPLC-ELSD method, using conversion AaSPL2 base The metabolic engineering strategies of cause obtain the sweet wormwood plant of qinghaosu high yield, provide a kind of ideal side for large-scale production qinghaosu Method. Sequence table <110>Second Military Medical University, PLA <120>a kind of method for improving content of artemisinin in sweet wormwood using AaSPL2 gene <130>specification, claims <160> 1 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 954 <212> DNA <213>sweet wormwood (Artemisia annua) <400> 1 atggagtgga attgggacaa taatgaagtt cccaagagtt tagcggtttc aagccacgaa 60 aatggcgagt atttgggggg tgaagatgtg caaaggagtt tttctaatga tataattgag 120 gaaggctcgg ttatatctgg tgaagcacta tttggtttga agctcgggca agagacatat 180 aatcaagata atcttagaat gagctcattc ccattagtac ctacctcttt gagttctccg 240 gttgtgaaaa aatctagagc ggtgtaccaa agttcacatt cgccacgttg tcaagttgag 300 gggtgcaacc ttgaccttgt gtcggctaaa gattaccacc gtcggcataa aatttgtgct 360 gatcattcta agagcccaaa agttgttgtt ggggggatgg aacgaaggtt ttgtcagcaa 420 tgtagcaggt tgcatgattt atcggagttt gacgatagga agcgtagttg tcgcaggcgc 480 ctctcggcac acaatgctag acgtcgtagg ccacaatcag aggacaagtt cagccccaca 540 catcgaagac catatatggg tttctttgtg aacggggtct cgacctcgac cccatcacca 600 aattcgacac cacaaagttc atctaacttt aaacgtgaag atgttgacat gatctcgagt 660 ggtgccttat cggacatctc gtcgtctttc catggggtca cacctagact tgctaaccac 720 gagggtttag atgcaaactc taactcgatc tgtaagatgg aagttcgaca ttctttctct 780 cttcaagcca cgagctcttg gggattcaac agtcgcgatg agccctcttc ctttgatcaa 840 ttcattaatg gacacaacgc cggcttgacg caacatggga caccactcga gatgcaacat 900 acccgaaaca ctcaaattcc acctcatgat tttgactact tttgttcaaa ttaa 954    
    Claims (10) ]   1. a kind of method for improving content of artemisinin in sweet wormwood using AaSPL2 gene, includes the following steps: S1: sweet wormwood key gene AaSPL2 is obtained using gene clone method; AaSPL2 gene: being operatively connectable to expression regulation sequence by S2, and the plant for forming the gene containing AaSPL2, which is expressed, to be carried Body; S3: converting Agrobacterium tumefaciems for the plant expression vector of the gene containing AaSPL2, obtain for convert sweet wormwood containing AaSPL2 The Agrobacterium tumefaciens strain of gene plant expression vector; S4: converting sweet wormwood using constructed Agrobacterium tumefaciens strain, obtains the transgene abrotanum through PCR test positive and plants Strain; S5: HPLC-ELSD measurement is carried out to artemislnin content in the transgene abrotanum of acquisition, it is significant that screening obtains artemislnin content The transgene abrotanum plant of raising.   2. the method according to claim 1 for improving content of artemisinin in sweet wormwood using AaSPL2 gene, which is characterized in that Step S1 includes the following steps: to extract sweet wormwood genome total serum IgE;Sweet wormwood genome total serum IgE is obtained into the first chain by reverse transcription cDNA;It using the first chain cDNA as template, is sequenced after PCR amplification, obtains and correct sweet wormwood AaSPL2 gene is sequenced; The DNA sequence dna according to shown in SEQ ID NO.1 when PCR amplification, design amplifies the upstream and downstream primer of complete encoder block, described The nucleotide sequence of upstream and downstream primer is respectively as follows: AaSPL2-PF:atggagtggaattgggacaa;AaSPL2-PR: ttaatttgaacaaaagtagtcaaaa。   3. the method according to claim 1 for improving content of artemisinin in sweet wormwood using AaSPL2 gene, which is characterized in that In step S2, it is described building the gene containing AaSPL2 plant expression vector include the following steps: select pBI121 and PCAMBIA2300 is primary element, constructs binary plant expression vector pCAMBIA2300::p35S-gus-nos;BamHI is used again With SacI double digestion carrier pCAMBIA2300::p35S-gus-nos, pCAMBIA2300::p35S-nos large fragment is recycled, it will PCAMBIA2300::p35S-pCAMBIA2300: is formed in AaSPL2 gene swapping to pCAMBIA2300::p35S-nos: P35S-gus-AaSPL2-nos, conversion, picking monoclonal extract plasmid and do PCR detection and digestion verification.   4. the method according to claim 3 for improving content of artemisinin in sweet wormwood using AaSPL2 gene, which is characterized in that The building binary plant expression vector pCAMBIA2300::p35S-gus-nos include the following steps: with HindIII and EcoRI double digestion pBI121 and pCAMBIA2300 plasmid;Recycle the gus expression cassette and pCAMBIA2300 large fragment of pBI121; Recovery product is connected, transformation and selection takes out plasmid enzyme restriction verifying.   5. the method according to claim 1 for improving content of artemisinin in sweet wormwood using AaSPL2 gene, which is characterized in that It is described to convert the preculture for including the following steps: explant in step S4;The co-cultivation of Agrobacterium and explant;Resistance regeneration The screening of plant.   6. the method according to claim 5 for improving content of artemisinin in sweet wormwood using AaSPL2 gene, which is characterized in that The preculture of the explant includes the following steps: that seeds of southernwood impregnates 1min with 75% ethyl alcohol, then is impregnated with 20%NaClO 20min, aseptic water washing 3-4 times blot surface moisture with sterile blotting paper, are inoculated in the MS solid medium of no hormone, Illumination cultivation 16h, dark culture 8h, can be obtained sweet wormwood aseptic seedling at 25 DEG C, after seedling length to 5~8cm, clip tests for sterility Explant is for converting.   7. the method according to claim 5 for improving content of artemisinin in sweet wormwood using AaSPL2 gene, which is characterized in that The co-cultivation of the Agrobacterium and explant includes the following steps: the tests for sterility explant going to co-culture medium In, it is added dropwise containing the activated binary expression vector of gene plant containing the AaSPL2 pCAMBIA2300::p35S- The 1/2MS suspension of the Agrobacterium tumefaciems engineering bacteria of pCAMBIA2300::p35S-gus-AaSPL2-nos, makes explant and bacterium solution It comes into full contact with, 28 DEG C of dark culture 3d.   8. the method according to claim 5 for improving content of artemisinin in sweet wormwood using AaSPL2 gene, which is characterized in that The screening of the resistance regeneration plant includes the following steps: that the sweet wormwood explant by the co-cultivation 3d is transferred to germination screening On culture medium at 25 DEG C illumination cultivation 16h, dark culture 8h, squamous subculture is primary every two weeks, can obtain after 2-3 subculture Kan resistance Multiple Buds are obtained, well-grown resistance Multiple Buds are cut to be transferred on root media and are cultivated to taking root, Kan is obtained Resistance regenerates sweet wormwood plant.   9. the method according to claim 1 for improving content of artemisinin in sweet wormwood using AaSPL2 gene, which is characterized in that In step S4, the method for the PCR detection are as follows: separately design AaSPL2 gene in expression cassette p35s-AaSPL2-nos sequence Specific primer carries out PCR amplification, observes that the positive strain of purpose band is after agarose gel electrophoresis in the UV lamp Transgene abrotanum plant;The specific primer includes upstream primer, downstream primer, and particular sequence is respectively as follows: PF: Gagagactggtgatttcagcg, PR:ttaatttgaacaaaagtagtcaaaa. 10. sweet wormwood AaSPL2 gene is improving the application in content of artemisinin in sweet wormwood. https://patents.google.com/patent/CN110438148A/en       一种利用AaSPL2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法 技术领域 本发明属于生物技术领域。具体涉及的是一种提高青蒿素含量的方法,特别涉及是一种利用AaSPL2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。 背景技术 青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素(artemisinin)是从其地上部分分离的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物,是目前世界上公认的最有效的治疗疟疾的药物,特别是对于脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有速效和低毒的特点。目前,世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法就是青蒿素联合疗法(ACTs)。另外,随着对青蒿素药理研究的逐步深入,科学家发现青蒿素及其衍生物还具有抗炎、抗血吸虫、抗肿瘤以及免疫调节的功能。可见青蒿素是一种极具潜力的天然药物。 目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取,然而青蒿中青蒿素的含量非常低(0.01%-1%),使得这种药物的大规模商业化生产受到了限制。由于青蒿素结构复杂,人工合成难度大,产量低,成本高,不具有可行性。有人尝试用组织培养和细胞工程的方法来生产青蒿素,然而青蒿素在愈伤组织中含量低于干重的0.1%,在芽中最高也只有干重的0.16%,而大多数研究在根中没有检测到青蒿素。因此利用组织培养及细胞工程来生产青蒿素的可行性也不高。 经对现有技术文献检索发现,Qian Shen等在《New Phytologist》(《新植物学家》,2016年210期1269-1281页)发表了题为“The jasmonate-responsiveAaMYC2transcription factor positively regulates artemisinin biosynthesis inArtemisia annua”(“受甲基茉莉酸响应的AaMYC2转录因子正调控青蒿中青蒿素的生物合成”)的论文,报道通过在青蒿中过表达受激素甲基茉莉酸响应的AaMYC2,使青蒿素含量提高了1.6倍。因此,通过过表达受甲基茉莉酸响应的基因为提高青蒿中青蒿素的含量提供了一条可行的方法。 发明内容 本发明的目的在于提供一种利用AaSPL2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法,将青蒿中克隆出的AaSPL2基因转入青蒿中得到转基因AaSPL2青蒿,该转基因AaSPL2青蒿中青蒿素含量显著提高,从而实现利用青蒿大规模生产青蒿素。 本发明是通过以下技术方案实现的:本发明从青蒿中克隆AaSPL2基因,构建含AaSPL2基因的植物表达载体,用根癌农杆菌介导,将AaSPL2基因导入青蒿并再生出植株;PCR检测外源目的基因AaSPL2的整合情况,高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)测定青蒿中青蒿素含量,筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。 本发明提供的利用AaSPL2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法,包括如下步骤: S1:采用基因克隆方法获得青蒿关键酶基因AaSPL2; S2:把AaSPL2基因可操作性地连接于表达调控序列,构建含AaSPL2基因的植物表达载体; S3:将含AaSPL2基因的植物表达载体转化根癌农杆菌,获得用于转化青蒿的含AaSPL2基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株; S4:利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿,获得经PCR检测为阳性的转基因青蒿植株; S5:对获得的转基因青蒿中青蒿素含量进行HPLC-ELSD测定,筛选获得青蒿素含量显著提高的转基因青蒿植株。 优选的,步骤S1:提取青蒿基因组总RNA;将青蒿基因组总RNA通过反转录获得第一链cDNA;根据如SEQ ID NO.1所示的青蒿AaSPL2基因的编码序列设计扩增出完整编码框的上下游引物,并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点,以便构建表达载体;以所述第一链cDNA为模板,经PCR扩增后进行测序,获得测序正确的青蒿AaSPL2基因,其中PCR扩增所用的上、下游引物的核苷酸序列分别为:AaSPL2-PF:atggagtggaattgggacaa,AaSPL2-PR:ttaatttgaacaaaagtagtcaaaa。 优选的,步骤S2中,所述构建含AaSPL2基因的植物表达载体包括如下步骤:选用pBI121和pCAMBIA2300为基本元件,构建双元植物表达载体pCAMBIA2300::p35S-gus-nos;再用BamHI和SacI双酶切载体pCAMBIA2300::p35S-gus-nos,回收pCAMBIA2300::p35S-nos大片段,通过无缝克隆试剂盒将AaSPL2基因交换到pCAMBIA2300::p35S-nos上形成pCAMBIA2300::p35S-pCAMBIA2300::p35S-gus-AaSPL2-nos,转化,挑取单克隆,提取质粒做PCR检测和酶切验证。 更优选的,所述构建双元植物表达载体pCAMBIA2300::p35S-gus-nos包括如下步骤:用HindIII和EcoRI双酶切pBI121和pCAMBIA2300质粒;回收pBI121的gus表达盒和pCAMBIA2300大片段;连接回收产物,转化筛选,抽质粒酶切验证。 优选的,步骤S4中,所述转化包括如下步骤:外植体的预培养;农杆菌与外植体的共培养;抗性再生植株的筛选。 更优选的,所述外植体的预培养包括如下步骤:青蒿种子用75%乙醇浸泡1min,再用20%NaClO浸泡20min,无菌水冲洗3-4次,用无菌吸水纸吸干表面水分,接种于无激素的MS固体培养基中,25℃下光照培养16h、暗培养8h,即可获得青蒿无菌苗,待苗长至5~8cm后,剪取无菌苗叶片外植体用于转化。 更优选的,所述农杆菌与外植体的共培养包括如下步骤:将所述无菌苗叶片外植体转到共培养培养基中,滴加含活化好的所述含AaSPL2基因植物双元表达载体pCAMBIA2300::p35S-pCAMBIA2300::p35S-gus-AaSPL2-nos的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液,使外植体与菌液充分接触,28℃暗培养3d。 更优选的,所述抗性再生植株的筛选包括如下步骤:将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到发芽筛选培养基上于25℃下光照培养16h、暗培养8h,每两周继代培养一次,经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽,将生长良好的抗性丛生芽剪下转入生根培养基上培养至生根,获得Kan抗性再生青蒿植株。 优选的,步骤S4中,所述PCR检测的方法为:分别设计合成表达盒p35s-AaSPL2-nos序列上AaSPL2基因的特异性引物进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下观察到目的条带的阳性株系即为转基因青蒿植株;所述特异性引物包括上游引物、下游引物,具体序列分别为:PF:gagagactggtgatttcagcg,PR:ttaatttgaacaaaagtagtcaaaa。 步骤S5中,所述的HPLC-ELSD测定青蒿中青蒿素含量,方法为:色谱柱C-18反相硅胶柱,流动相为甲醇:水,甲醇:水的体积比为70:30,柱温30℃,流速1.0mL/min,进样量10μL,蒸发光散射检测器漂移管温度40℃,放大系数(gain)为7,载气压力5bar。 本发明步骤S3中所用根癌农杆菌为市场有公开出售的生物材料,可以从多家公司如澳大利亚CAMBIA公司购得。 本发明还提供青蒿AaSPL2基因在提高青蒿中青蒿素含量中的应用。 本发明证明:AaSPL2基因是水杨酸信号途径重要的转录因子及青蒿素代谢工程的重要靶点。本发明采用基因工程手段,用AaSPL2基因转化青蒿,打破了青蒿素生物合成的限速瓶颈,获得青蒿素高产的青蒿植株,建立了稳定提高青蒿中青蒿素含量的方法,为规模化生产青蒿素提供了一条新途径。 本发明的有益效果: 本发明提供的利用AaSPL2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法,采用基因工程方法,将关键酶基因AaSPL2导入青蒿植株中,获得了青蒿素含量显著提高的转基因青蒿株系,转AaSPL2基因青蒿中青蒿素的含量最高可达到20.6mg/g DW,是非转化普通青蒿(10.9mg/gDW)的1.8倍,显著提高了青蒿中青蒿素含量,为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定的新药源,具有重要意义。 附图说明 图1为本发明实施例1中AaSPL2基因受MeJA诱导图。 图2为本发明实施例1中AaSPL2基因在不同组织的表达谱。 图3为本发明实施例3植物表达载体:pCAMBIA2300::p35S-AaSPL2-nos的构建示意图。 图4为本发明实施例5中转基因青蒿中青蒿素的含量检测结果图。 具体实施方式 下面对本发明的实施例作详细说明:本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。 实施例1 激素MeJA在诱导次生代谢产物中具有重要作用。MeJA能诱导多种次生代谢产物的合成,如丹参中的丹酚酸、青蒿素等。SBP类转录因子是一类重要的转录因子,在调控植物生长发育、次生代谢中起关键作用。目前青蒿中SPL调控青蒿素的研究尚未有报道。 1.MeJA处理青蒿 通过100mM的激素MeJA处理30天大小的青蒿植株(采用产于重庆酉阳青蒿素含量较高的青蒿品种),筛选受MeJA诱导的SBP类转录因子。分别在激素MeJA处理0h、1h、3h、6h、9h、12h和24h取青蒿叶片。置于液氮中,用于RNA的提取。 2.青蒿基因组总RNA的提取 取少量青蒿幼嫩叶片,用液氮速冻后,迅速用研钵研碎,加入盛有1mL TRIzol(TRIzol Reagents,GIBCO BRL,USA)的1.5mL Eppendorf管中,充分振荡后,于室温下放置5min,加200μL氯仿,用力振荡15sec,室温放置2-3min后,于4℃、12,000g离心15min;将上清液(约600μL)吸入干净的1.5mL Eppendorf管中,加入等体积的异丙醇,颠倒混匀,室温下放置10min后,于4℃、12,000g离心10min;弃上清,加1mL 75%乙醇清洗,振荡后,于4℃、7,500g离心5min;室温干燥15-20min后溶于适量(30-50μL)RNAase-free水中;用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量,然后在分光光度计上测定RNA含量。 3.筛选受MeJA诱导的SBP类转录因子 分别在激素MeJA处理0h、1h、3h、6h、9h、12h和24h取青蒿叶片,按照步骤2提取青蒿基因组总RNA。通过Q-PCR检测SBP类基因的表达水平,通过MeV 4.9生成热图文件,参见图1。由图1可知,在青蒿SPL中AaSPL2受MeJA诱导明显,在MeJA处理青蒿植株1小时后,其表达量升高,在3小时到24之间,表达量也呈升高的趋势,表明AaSPL2响应MeJA的诱导,AaSPL2可能参与青蒿素的调控。 4、青蒿不同组织表达谱分析 分别取3个月大小的青蒿植株(与步骤1中品种相同)不同组织部位(COT,子叶;ML,成熟叶片;Meristem,分生组织;YL,嫩叶;Bud,花蕾),按照步骤2方法提取RNA。通过Q-PCR检测SBP类基因的表达水平,通过MeV 4.9生成热图文件,参见图2。图2表明,在青蒿的不同组织部位中(COT,子叶;ML,成熟叶片;Meristem,分生组织;YL,嫩叶;Bud,花蕾),AaSPL2呈现不同的表达水平。AaSPL2在花和叶片中表达量较高,与青蒿素合成途径关键酶基因具有类似的表达谱,筛选得到AaSPL2是受MeJA诱导的重要转录因子。 因此,综合图1和图2的结果,表明AaSPL2可能具有调控青蒿素合成的潜力。 实施例2青蒿AaSPL2基因的克隆 将所获的青蒿基因组总RNA通过反转录酶XL(AMV)反转录获得第一链cDNA,根据所述青蒿AaSPL2基因的编码序列(如SEQ ID NO:1所示),设计扩增出完整编码框的上下游引物,AaSPL2-PF:atggagtggaattgggacaa,AaSPL2-PR:ttaatttgaacaaaagtagtcaaaa,并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定),以便构建表达载体。 以所述的第一链cDNA为模板,经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海英骏生物技术服务有限公司采用3730自动测序仪完成。测序结果表明,所克隆的青蒿AaSPL2基因序列与SEQ ID NO:1所示的序列一致。 PCR扩增反应的KOD反应体系如表1所示。 表1 组成成分 含量 5×KOD buffer 5μL dNTP 5μL MgSO<sub>4</sub> 2μL PF(10μM) 1μL PR(10μM) 1μL 模板DNA 1μL KOD酶 1μL dH<sub>2</sub>O up to 50μL PCR反应程序如下:   本实施例采用基因克隆方法从青蒿中获得水杨酸信号途径重要转录因子AaSPL2基因,为通过转AaSPL2基因提高青蒿中青蒿素含量提供了一个重要关键酶基因。 实施例3含AaSPL2基因的植物双元表达载体的构建 1.中间载体pCAMBIA2300::p35S-gus-nos的构建 选用pBI121(Clontech)和pCAMBIA2300(澳大利亚CAMBIA研究所)为基本元件,构建双元植物表达载体pCAMBIA2300::p35S-gus-nos。具体地,HindIII和EcoRI双酶切pBI121和pCAMBIA2300质粒;回收pBI121的gus表达盒和pCAMBIA2300大片段;连接回收产物,转化筛选,抽质粒酶切验证,得到双元植物表达载体pCAMBIA2300::p35S-gus-nos。其中,酶切反应体系如表2所示。 表2 组成成分 含量 酶切10×buffer 5μL 载体 20μL 内切酶1 1μL 内酶2 1μL dH2O up to 50μL 2.植物表达载体pCAMBIA2300::p35S-AaSPL2-nos的构建 以构建的pCAMBIA2300::p35S-gus-nos为表达载体,用实施例1中克隆得到的AaSPL2基因替换其上的gus基因,得到植物表达载体pCAMBIA2300::p35S-AaSPL2-nos,构建示意图如图3所示。具体地,BamHI/SacI双酶切pCAMBIA2300::p35S-gus-nos,回收pCAMBIA2300::p35S-nos大片段,通过无缝克隆试剂盒(南京诺维赞)将AaSPL2基因交换到pCAMBIA2300::p35S-nos上形成pCAMBIA2300::p35S-pCAMBIA2300::p35S-gus-AaSPL2-nos,转化,挑取单克隆,提取质粒做PCR检测和酶切验证,得到植物表达载体pCAMBIA2300::p35S-AaSPL2-nos。其中,无缝克隆反应体系如表3所示。 表3 组成成分 含量 基因PCR产物 1μL 线性化载体 3μL 无缝克隆Buffer 4μL 无缝克隆酶 2μL dH<sub>2</sub>O up to 20μL 本实施例将水杨酸信号途径重要基因AaSPL2可操作性地连接于表达调控序列,形成含AaSPL2基因的植物表达载体,该表达载体可用于通过代谢工程策略来提高青蒿中青蒿素的含量。 实施例4根癌农杆菌介导AaSPL2基因遗传转化青蒿获得转基因青蒿植株 1.含AaSPL2基因双元植物表达载体根癌农杆菌工程菌的获得 将实施例2中含AaSPL2基因的植物双元表达载体pCAMBIA2300::p35S-AaSPL2-nos转入根癌农杆菌(如EHA105,为市场有公开出售的生物材料,可以从澳大利亚CAMBIA公司购得,菌株编号为Gambar 1),并进行PCR验证。其中,质粒转入农杆菌的方法如下:1μL质粒加入到50μL农杆菌感受态中,冰浴30分钟,液氮中冷冻5分钟,37℃热激3分钟,再加入LB培养基在37℃摇床活化3小时,涂板,鉴定。 结果表明,含AaSPL2基因植物双元表达载体已成功构建到根癌农杆菌菌株中。 2.根癌农杆菌介导AaSPL2基因转化青蒿 2.1.外植体的预培养 青蒿种子用75%乙醇浸泡1min,再用20%NaClO浸泡20min,无菌水冲洗3-4次,用无菌吸水纸吸干表面水分,接种于无激素的MS(Murashige and Skoog,1962)固体培养基中,25℃、16h/8h(light/dark)光照培养,即可获得青蒿无菌苗。待苗长至5cm左右后,剪取无菌苗叶片外植体用于转化。 2.2.农杆菌与外植体的共培养 将所述的叶片外植体转到共培养培养基(1/2MS+AS 100μmol/L)中,滴加含活化好的所述含AaSPL2基因植物双元表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液,使外植体与菌液充分接触,28℃暗培养3d。以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。 2.3.抗性再生植株的筛选 将共培养3d的青蒿外植体转入到发芽筛选培养基(MS+6-BA 0.5mg/L+NAA0.05mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L)上于25℃、16h/8h光照培养,每两周继代培养一次,经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽。将生长良好的抗性丛生芽剪下转入生根培养基(1/2MS+Cb 125mg/L)上培养至生根,从而获得Kan抗性再生青蒿植株。 3.转基因青蒿植株的PCR检测 以获得的Kan抗性再生青蒿植株DNA为模板(通过DNA提取试剂盒(天根)提取青蒿植株的DNA),根据目的基因所在表达盒p35s-AaSPL2-nos序列p35s和AaSPL2分别设计正向引物设计和反向引物对目的基因进行检测,检测引物为PF:gagagactggtgatttcagcg,PR:ttaatttgaacaaaagtagtcaaaa。其中,以DNA为模板,通过TAKARA酶(大连宝生物工程)扩增,rtaq-MIX酶反应体系如表4所示及程序如下: 表4 组成成分 含量 2×rtaq-MIX buffer 5μL PF(10μM) 1μL PR(10μM) 1μL 模板DNA 1μL rtaq酶 1μL dH<sub>2</sub>O up to 20μL PCR反应程序如下:   结果表明,利用所设计的PCR特异引物,能扩增出1000bp的特异DNA片段,即琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下观察到目的条带的,获得的Kan抗性再生青蒿植株为转AaSPL2基因青蒿植株。而以非转化青蒿基因组DNA为模板时,没有扩增出任何片段。 本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌,获得用于转化青蒿的含AaSPL2基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株,利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿,获得经PCR检测的转基因青蒿植株。转基因青蒿植株的获得为筛选获得较高青蒿素含量的青蒿株系提供了直接素材。 实施例5利用HPLC-ELSD测定转基因青蒿中青蒿素含量 1.HPLC-ELSD条件及系统适用性以及标准溶液的配制 HPLC:采用water alliance 2695系统,色谱柱为C-18反相硅胶柱(SymmetryShieldTM C18,5μm,250×4.6mm,Waters),流动相为甲醇:水,甲醇:水的体积比为70:30,柱温30℃,流速1.0mL/min,进样量10μL,灵敏度(AUFS=1.0),理论塔板数按青蒿素峰计算不低于2000。 ELSD:采用water alliance 2420系统,蒸发光散射检测器漂移管温度40℃,放大系数(gain)为7,载气压力5bar。 精密称取青蒿素标准品(Sigma公司)2.0mg用1mL甲醇完全溶解,得到2mg/mL青蒿素标准品溶液,保存于-20℃备用。 本发明中流动相为甲醇(methanol):水,比例为70%:30%时,青蒿素的保留时间为5.1min,峰型良好。理论塔板数按青蒿素计算不低于2000。 2.标准曲线的制作 将上述标准品溶液在相应色谱条件下分别进样2μl,4μl,6μl,8μl,10μl记录图谱及色谱参数,分别以峰面积(Y)对标准品含量(X,μg)进行回归分析。通过研究,本发明中青蒿素在4-20μg范围内呈现良好的log-log线性关系。青蒿素对照品的log-log线性回归方程为:Y=1.28e+000X+4.71e+000,R=0.979546。 3.样品的制备和青蒿素含量的测定 青蒿素的提取过程基于Van Nieuwerburgh et al.(2006)中报道的方法:取少量新鲜的青蒿叶片(1-2g鲜重),于50ml试管中将其浸没在10ml氯仿中摇荡1分钟,将浸出液倒入新的试管中使氯仿挥发完全,取3ml无水乙醇充分溶解提取物,用于HPLC检测。同时,氯仿提取后的叶片收集放入60度烘箱进行烘干,称重(计算青蒿叶片的干重); 采用HPLC-ELSD测定青蒿素含量,样品进样体积为20μl,根据峰面积代入线形回归方程计算出样品中的青蒿素含量(mg),再除以样品的青蒿叶干重(g),从而计算出青蒿植株中青蒿素的含量。 经测定,本发明中转AaSPL2基因青蒿中青蒿素的含量最高可达到20.6mg/g DW,是非转化普通青蒿(10.9mg/g DW)的1.8倍(如图4所示),AaSPL2基因显著提高了青蒿中青蒿素含量。 本实施例采用HPLC-ELSD法测定了转基因青蒿中青蒿素含量,采用转化AaSPL2基因的代谢工程策略获得了青蒿素高产的青蒿植株,为规模化生产青蒿素提供了一种理想方法。 序列表 <110> 中国人民解放军第二军医大学 <120> 一种利用AaSPL2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法 <130> 说明书,权利要求书 <160> 1 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 954 <212> DNA <213> 青蒿(Artemisia annua) <400> 1 atggagtgga attgggacaa taatgaagtt cccaagagtt tagcggtttc aagccacgaa 60 aatggcgagt atttgggggg tgaagatgtg caaaggagtt tttctaatga tataattgag 120 gaaggctcgg ttatatctgg tgaagcacta tttggtttga agctcgggca agagacatat 180 aatcaagata atcttagaat gagctcattc ccattagtac ctacctcttt gagttctccg 240 gttgtgaaaa aatctagagc ggtgtaccaa agttcacatt cgccacgttg tcaagttgag 300 gggtgcaacc ttgaccttgt gtcggctaaa gattaccacc gtcggcataa aatttgtgct 360 gatcattcta agagcccaaa agttgttgtt ggggggatgg aacgaaggtt ttgtcagcaa 420 tgtagcaggt tgcatgattt atcggagttt gacgatagga agcgtagttg tcgcaggcgc 480 ctctcggcac acaatgctag acgtcgtagg ccacaatcag aggacaagtt cagccccaca 540 catcgaagac catatatggg tttctttgtg aacggggtct cgacctcgac cccatcacca 600 aattcgacac cacaaagttc atctaacttt aaacgtgaag atgttgacat gatctcgagt 660 ggtgccttat cggacatctc gtcgtctttc catggggtca cacctagact tgctaaccac 720 gagggtttag atgcaaactc taactcgatc tgtaagatgg aagttcgaca ttctttctct 780 cttcaagcca cgagctcttg gggattcaac agtcgcgatg agccctcttc ctttgatcaa 840 ttcattaatg gacacaacgc cggcttgacg caacatggga caccactcga gatgcaacat 900 acccgaaaca ctcaaattcc acctcatgat tttgactact tttgttcaaa ttaa 954              
    Claims (10)     1.一种利用AaSPL2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法,包括如下步骤: S1:采用基因克隆方法获得青蒿关键酶基因AaSPL2; S2:把AaSPL2基因可操作性地连接于表达调控序列,形成含AaSPL2基因的植物表达载体; S3:将含AaSPL2基因的植物表达载体转化根癌农杆菌,获得用于转化青蒿的含AaSPL2基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株; S4:利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿,获得经PCR检测为阳性的转基因青蒿植株; S5:对获得的转基因青蒿中青蒿素含量进行HPLC-ELSD测定,筛选获得青蒿素含量显著提高的转基因青蒿植株。 2.根据权利要求1所述的利用AaSPL2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征在于,步骤S1包括如下步骤:提取青蒿基因组总RNA;将青蒿基因组总RNA通过反转录获得第一链cDNA;以所述第一链cDNA为模板,经PCR扩增后进行测序,获得测序正确的青蒿AaSPL2基因;PCR扩增时根据SEQ ID NO.1所示的DNA序列,设计扩增出完整编码框的上、下游引物,所述上、下游引物的核苷酸序列分别为:AaSPL2-PF:atggagtggaattgggacaa;AaSPL2-PR:ttaatttgaacaaaagtagtcaaaa。 3.根据权利要求1所述的利用AaSPL2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征在于,步骤S2中,所述构建含AaSPL2基因的植物表达载体包括如下步骤:选用pBI121和pCAMBIA2300为基本元件,构建双元植物表达载体pCAMBIA2300::p35S-gus-nos;再用BamHI和SacI双酶切载体pCAMBIA2300::p35S-gus-nos,回收pCAMBIA2300::p35S-nos大片段,将AaSPL2基因交换到pCAMBIA2300::p35S-nos上形成pCAMBIA2300::p35S-pCAMBIA2300::p35S-gus-AaSPL2-nos,转化,挑取单克隆,提取质粒做PCR检测和酶切验证。 4.根据权利要求3所述的利用AaSPL2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征在于,所述构建双元植物表达载体pCAMBIA2300::p35S-gus-nos包括如下步骤:用HindIII和EcoRI双酶切pBI121和pCAMBIA2300质粒;回收pBI121的gus表达盒和pCAMBIA2300大片段;连接回收产物,转化筛选,抽质粒酶切验证。 5.根据权利要求1所述的利用AaSPL2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征在于,步骤S4中,所述转化包括如下步骤:外植体的预培养;农杆菌与外植体的共培养;抗性再生植株的筛选。 6.根据权利要求5所述的利用AaSPL2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征在于,所述外植体的预培养包括如下步骤:青蒿种子用75%乙醇浸泡1min,再用20%NaClO浸泡20min,无菌水冲洗3-4次,用无菌吸水纸吸干表面水分,接种于无激素的MS固体培养基中,25℃下光照培养16h、暗培养8h,即可获得青蒿无菌苗,待苗长至5~8cm后,剪取无菌苗叶片外植体用于转化。 7.根据权利要求5所述的利用AaSPL2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征在于,所述农杆菌与外植体的共培养包括如下步骤:将所述无菌苗叶片外植体转到共培养培养基中,滴加含活化好的所述含AaSPL2基因植物双元表达载体pCAMBIA2300::p35S-pCAMBIA2300::p35S-gus-AaSPL2-nos的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液,使外植体与菌液充分接触,28℃暗培养3d。 8.根据权利要求5所述的利用AaSPL2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征在于,所述抗性再生植株的筛选包括如下步骤:将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到发芽筛选培养基上于25℃下光照培养16h、暗培养8h,每两周继代培养一次,经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽,将生长良好的抗性丛生芽剪下转入生根培养基上培养至生根,获得Kan抗性再生青蒿植株。 9.根据权利要求1所述的利用AaSPL2基因提高青蒿中青蒿素含量的方法,其特征在于,步骤S4中,所述PCR检测的方法为:分别设计表达盒p35s-AaSPL2-nos序列上AaSPL2基因的特异性引物进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下观察到目的条带的阳性株系即为转基因青蒿植株;所述特异性引物包括上游引物、下游引物,具体序列分别为:PF:gagagactggtgatttcagcg,PR:ttaatttgaacaaaagtagtcaaaa。 10.青蒿AaSPL2基因在提高青蒿中青蒿素含量中的应用。   https://patents.google.com/patent/CN110438148A/zh
  18. Roger
    CN101223177A水溶性青蒿素衍生物
    CN101223177A: Water-Soluble Derivatives of Artemisinin
    水溶性青蒿素衍生物、制法、药物组合物及用途
    本发明公开了一类水溶性青蒿素衍生物、制备方法、药物组合物及它的用途。该类衍生物的结构如右,经药理试验证明该类化合物及药物组合物具有明显的免疫抑制活性作用,可开发成为治疗人体免疫功能亢进引起的疾病(红斑狼疮、类风湿关节炎,多发性硬化症等自身免疫性疾病),以及细胞器官移植后抗移植物排斥反应的新型免疫抑制药物。   PCT国内申请,说明书已公开。   Water-soluble arteannuin derivant, production method, medicine composition and usage
    Water-soluble artemisinin derivatives, their preparation methods, the pharmaceutical compositions containing them and the use thereof are disclosed. The artemisinin derivatives have the structure as following: These compounds and compositions have immuno-suppressive activities which has been proved by pharmacological test, and may be used to prepare novel immuno-suppressants for treating the diseases caused by hypofunction of human immunity( e. g. auto-immune diseases such as lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis and the like), and may be useful as anti-rejection agentsin organ transplantation.     Water-soluble arteannuin derivant, preparation method, pharmaceutical composition and purposes Ice dissolubility artemisinin derivative, preparation method, pharmaceutical composition and purposes Technical field The present invention relates to the chemical synthesis of terpenoid and its immunosuppressive action, and in particular to new artemisine compounds and preparation method thereof and the pharmaceutical composition as immunodepressant.Background technology Qinghaosu is from Chinese medicine sweet wormwood(Plant Artemisia annua Artemisia a draw a L.) the antimalarial active ingredient that extracts, a kind of rare sesquiterpene lactone containing peroxy-radical.It not only has remarkable anti-Zuo effects, it was found that have immunosuppressive action.Its derivative Artesunate has stronger immunosuppressive action, can treat lupus erythematosus and some skin diseases, obtains good therapeutic effect [remaining its refined etc., Artesunate lupus hung classes 56, Chinese journal of dermatology, 1997,39: 51;Chen Hua etc., Artesunate eczema-dermatitis and light sensitive dermatoses clinical observation, institute of Bengbu Medical College report, 1991,16: 251].But patient needs long-term intravenous to inject, the sodium-salt aqueous solution of Artesunate will be in prepared before use, using being inconvenient.Present clinical is often expensive and toxic to kidney, liver with immune suppressive cyclosporin A, causes some patients to adhere to medication.Therefore, present inventor expands the research for finding more efficient, safer immunodepressant.   Qinghaosu Artesunate present inventor, which once studies, finds that the artemisinin derivative that a class contains carboxylic acid functional has stronger immunosuppressive action(Chinese invention patent, application number: 200510023824.1 ).But theirs is water-soluble small, and possible bioavilability is undesirable.Thus continually look for more preferably immunodepressant. It is an object of the invention to provide a class water-soluble arteannuin derivant for the content of the invention. Another object of the present invention is to provide the preparation method of the analog derivative. It is yet another object of the invention to provide the purposes of the analog derivative. It is a further object to provide the pharmaceutical composition of the analog derivative.The present invention provides such as following formula(1) compound shown in, its isomers and pharmaceutical salts:   (1) Formula(1) in As n=0, X=Y=H, Z=NH2 As n=l, X=OH, Y=H, Z=NH2, NHMe, NHEt, NHPr(n), NHBu, As n=l, X=OH, Y=CH3, phenyl etc. Z - NH2, NHR (R = d-C4Alkyl), NHCH2CH2OH, NR,2(R ,=d-C4Alkyl, NH(CH2)2.3NMe2 NQ -CH, 3 Formula(L) isomers of compound shown in includes but is not limited to stereoisomer and optical isomer. Formula(1) pharmaceutical salts of compound shown in include but is not limited to the addition salts with hydrochloric acid, methanesulfonic acid, p-methyl benzenesulfonic acid, maleic acid, oxalic acid, tartaric acid, citric acid etc.. The formula of the present invention(1) it is preferably such as following formula in compound(1) compound, wherein, n = 0, X = Y=H,Z = NH2; n= l;X Offer formula α of the present invention) shown in compound, its isomers and pharmaceutical salts.They are with dihydroartemisinine(2) it is raw material, is reacted under acid catalysed conditions with substituted alcohols.Such as substituted alcohols are halohydrin, then and then with amine react, generate target compound(1, η=0).Such as substituted alcohols are dihydric alcohol, then first generate hydroxyl qinghaosu ether, are then translated into p-methyl benzenesulfonic acid ester, then are reacted with amine, generate target compound(1, η=0 such as substituted alcohols are epoxy prapanol, and obtained sweet wormwood glycidyl ethers react with amine, generate target compound(1, η=1).As substituted alcohols are propenyls, it is necessary to be further oxidized to sweet wormwood glycidyl ethers;Reacted again with amine, generate target compound(1, η=1).In the organic solvents such as alcohol with inorganic acid or organic acid corresponding salt can be made in target compound containing unhindered amina.Formula obtained by the inventive method(1) compound can be refined with conventional technique. Some specific preparation methods can refer to the patent of present inventor(12454.9) and the paper J. Med. Chem. 2000,43 (8) that have delivered ZL 89 1 09562.4, ZL 93 1:1635-1640 includes the formula in safely, effectively dosage range the present invention further provides a kind of pharmaceutical composition with immunosuppressive action, described pharmaceutical composition(1) compound or pharmaceutically acceptable salt thereof shown in and pharmaceutically acceptable carrier. " safely, effectively dosage " is referred to:The amount of compound is enough to be obviously improved the state of an illness, and is unlikely to produce serious side effect.The safely, effectively dosage of compound is determined according to concrete conditions such as treatment target Elderly, body weight, treatment indication, method of administration, the course for the treatment of and any related treatments.Adult generally 10 mg/ days to 800 mg/ days, in single or divided doses.Children are cut down according to the circumstance. Substituted amino qinghaosu ether(By weight percentage) 1-55 % Excipient(By weight percentage) 15-40% Adjuvant(By weight percentage) 20-65% The composition of the present invention can be used for oral, parenteral, intranasal, is administered through tongue, through eye, through respiratory tract or per rectum, especially tablet or enteric coated pill, liquid drugs injection, sublingual tablets, patch, suppository, creme, ointment, skin gel etc.. " pharmaceutically acceptable carrier " is referred to:One or more biocompatible solid or liquid fillers or excipient, they are suitable for people and used and it is necessary to have enough purity and sufficiently low toxicity.In " compatibility " referred to herein as composition each component energy and the compound of the present invention and they between mutually admix, and significantly reduce the drug effect of compound.Pharmaceutically acceptable carrier part example has sugar(Such as glucose, sucrose, lactose), starch(Such as cornstarch, farina), cellulose and its derivates(Such as sodium carboxymethylcellulose, ethyl cellulose sodium, cellulose ethanoate, microcrystalline cellulose), polyethylene glycol, gelatin, talcum powder, stearic acid, magnesium stearate, calcium sulfate, Plant gentry(Such as soya-bean oil, sesame oil, peanut oil, olive oil).It can also be emulsifying agent(Such as tween), wetting agent (such as 12 protective embankment base sodium sulphate), colouring agent, flavor enhancement, stabilizer, preservative, apirogen water etc..Selection of the composition of the present invention to carrier depends on the administering mode of compound. Present inventor uses following method, and the screening and research of the immunosuppressive activity of in vitro and in vivo have been carried out to compound of the invention.(Reference book:Modern pharmacology experimental method, Zhang Juntian chief editors, Beijing Medical University/combined publication society of China Concord Medical Science University publishes for 1998).One, experiment material experimental animals:It is sheerly Balb/c male mices, 6-8 week old. RPMI- 1640 culture mediums (Gibco, pH7.2) add 10% hyclone (FBS), 100'U/ml penicillin, lOO g/ml streptomysins, 10mM HEPES, the and-Μ Ε of 50 μ Μ 2.Stimulant:ConA(), ConA bacteria lipopolysaccharide(LPS, Lai Zi &ceric sCbJ/055:B5), suitable concn is diluted to RPMI- 1640 culture mediums before use.Two, experimental methods [one] lymphocytotoxicity is tested 1. vertebra puts to death mouse, sterile to take its spleen, grind and single cell suspension is made, use MTT lysates(10%SDS, 50% dimethylformamide;PH7.2) remove after red blood cell, cell concentration is tuned into 5xl0 with the RPMI-1640 nutrient solutions containing 10%FBS6/ml。 . 80 μ 1 cell suspension, 40 u 1 sample, 40 nutrient solutions of the μ 1 containing 10%FBS are added in 2.96 well culture plates;Control plus the nutrient solutions of 80 μ 1, cumulative volume are 160 μ 1.And set blank control. 3. it is put into 37 °C, 5% C02Cultivated 48 hours in incubator.6-7 hours before culture is terminated, add the μ 1 of 5mg/ml MTT 16 per hole. 4. terminate culture, add the MTT lysates of 80 μ 1 per hole(10%SDS, 50% dimethylformamide;PH7.2), after being placed 6-7 hours in incubator, 0D is determined at 570nm with ELIASA57.Value. [two] lymphocyte proliferation assay 1. de- vertebra puts to death mouse, sterile to take spleen that single cell suspension is made, cell concentration is tuned into 4xl07ml with the nutrient solutions of RPMI- 1640 containing 10%FBS. 2. adding 100 μ 1 cell suspension in 96 orifice plates, 50 μ 1 sample solution, ConA the or LPS solution of 50 μ 1, control wells add 50 nutrient solutions of the μ 1 containing 10%FBS.Cumulative volume is 200 μ 1. 3. in 37 °C, 5% C02Cultivated 48 hours in incubator.7-8 hours before culture is terminated, add 0. 5 Ci []-thymidine per hole(The holes of 25 μ 1/). 4. terminating culture, cell collector is used(HARVESTER96, Τ Ο Μ Τ Ε Ο collect cell on glass fibre membrane, add scintillation solution, with liquid scintillation numeration instrument(MicroBeta Trilux, PerkinElmer) detection cell DNA in []-thymidine incorporation, reflect cell proliferative conditions. [three] Allogeneic Mixed Lymphocyte breeder reaction (MLR) 1. de- vertebra puts to death C57BL/6 and Balb/c mouse, sterile to take its spleen, grind and single cell suspension is made, remove after red blood cell, cell concentration is tuned into 6xl0 with the RPMI-1640 nutrient solutions containing 10% calf serum6/ml。 2. C57BL/6 splenocytes are reacting cells, Balb/c splenocytes(Irradiated through Co 60,3000 rads) to stimulate cell, two kinds of cells are mixed in equal volume. 3. the μ 1 of cell mixture 100, the μ 1 of sample 100 are added in 96 orifice plates, the nutrient solution of control plus 100 μ 1 containing 10% serum.And do the independent culture control of two kinds of cells. 4. 37 °C, 5% C02Cultivated in incubator 3,4,5 days.Terminate first 1 day of culture, add (that is, 3. 8xl0 of 25 μ of dilution 11DBq []-thymidine). 5. terminate culture, culture plate is frozen in -20 °C of refrigerators. 6. cell collector(HARVESTER96, T0MTEC cell) is collected on glass fibre membrane, incorporations of numeration instrument (MicroBeta Trilux, PerkinElmer) the detection DNA to []-thymidine is dodged with liquid, reflects cell proliferative conditions. [four] delayed type hypersensitivity, DTH animal model(DTH) 1. DayO, Balb/c mouse(Female, 6-8 weeks Elderly)Every group ten, every rear foot is with 20 1 0. 5% DNFB sensitization.Next day is strengthened.(DNFB is dissolved in [acetone:Olive oil=4:1] in finish); 2. each DNFB of 10 μ 1 0. 4% are attacked inside and outside Day (7-9), mouse auris dextra; 3. the preceding 1 day abdominal cavity gavage of attack is once, attacks preceding abdominal cavity gavage once, after 24 hours, then be administered once; 4. 30-48 hours after attack, detect each index. [five] the mouse arthritis animal model ox II Collagen Type VIs of ox II Collagen Type VIs induction(CII, Collagen Research Center, Tokyo, Japan) 0. IN acetums are dissolved in, in 4 °C of refrigerator overnights.Experimental day is by the strain of tuberculosis containing Mycobacterium H37Rv CFA (Walco Pure Chemical industries Ltd., Osaka, Japan) with CII it is isometric it is fully emulsified hook, (the μ containing CII 125 of 25 μ of emulsifying agent 1 are subcutaneously injected in DBA/1 mouse tails§) sensitization is carried out, it is immunized again in afterbody with the emulsifying agent of same dose after 3 weeks, this time adjuvant uses IFA.Begin to be administered second of immune the previous day Jian(Intraperitoneal injection or gavage), successive administration 2 weeks to 3 months.Using rank scores method. 0:Without redness; 1 :Toe joint slightly swells; 2:Toe joint and pedal swelling; 3 :Sufficient pawl swelling below ankle-joint; 4:Whole sufficient pawl swellings including ankle-joint.The summation of every animal foot scoring represents the CIA order of severity. Three, experimental results [one] the effect performance of lymphopoiesis and toxicity test immune response process is mainly made up of the humoral immune reaction of cell immune response and the B cell mediation mediated with T cell.The activated dissociation of cell and cell is directly stimulated to breed to evaluate the inhibitory activity of medicine lymphproliferation response with T cell mitogen ConA and B cell mitogen LPS in vitro;Screening repeatedly has been carried out on 10 μ Μ, Ι μ Μ, 0. 1 concentration of μ Μ tri- first.Wherein three compounds with obvious immunosuppressive activity are embodiment 1, embodiment 11, embodiment 14, and they are not having cytotoxic concentration, breed the inhibiting rate of (Con A) to Τ cells respectively up to 65%, 48%, 52%;To B cell proliferation(LPS inhibiting rate) is respectively up to 73%, 99%, 81%;Embodiment 2, embodiment 3, embodiment 12 are not having cytotoxic concentration, T cell is bred the inhibiting rate of (Con A) respectively up to 48%, 47%, 47 °/., to B cell proliferation(LPS inhibiting rate) is respectively up to 48%, 51%, 47%;Embodiment 8, embodiment 16, embodiment 17, embodiment 18 are not having cytotoxic concentration, and T cell is bred(Con A) inhibiting rate be 13%, 0%, 6%, 9% respectively, to B cell proliferation(LPS as a result inhibiting rate) shows that this four compounds are stronger to the inhibitory activity of B cell proliferation respectively up to 42%, 51%, 24%, 26%, but has in no cytotoxicity seldom or without inhibitory action to T cell.Based on the above results, embodiment 1, embodiment 11, embodiment 14 are selected in vivo and external its immunosupress pharmacology of further inspection Check is active. [two] Allogeneic Mixed Lymphocyte breeder reaction (MLR) alloantigen is the main cause for causing body rejection after blood transfusion, organ transplant.When response lymphocyte and the co-cultivation of heterologous lymphocyte, the alloantigen on heterologous lymphocyte, mainly histocompatibility antigen are expressed MHC- 1, MHC- II molecules, stimulation responses T cell trigger immunoproliferation reaction.Medicine is evaluated to the pharmacological action closer to physiological immune system response to MLR effect by medicine.As illustrated, embodiment 1, embodiment 11, embodiment 14 significantly inhibit the propagation of response lymphocyte in MLR, their EC50 is respectively: 3. 48 ±0. 72 μ Μ 、 0. 59 ±0. 066 μ Μ、 0. 67±0. 012 μ Μ. [three] delayed type hypersensitivity, DTH animal model(DTH) - Wei Jin mono- Walk check embodiment 1, embodiment 11, the immunopharmacological activity of embodiment 14 in vivo, show that embodiment 1, embodiment 11, embodiment 14 respectively can significantly suppress mice ear degree in oral 50mg/kg, 100mg/kg, 50mg/kg from classical mouse DTH reaction model results(P<0. 01) the inhibiting rate difference 56. 5% compared with control group, is 50. 5%, 52. 2%, with ciclosporin A (CsA) 5mg/kg 40. 6 ° of inhibiting rate/.Pharmacological activity is suitable. [four] mouse arthritis animal model Embodiment 1 and embodiment 14 further examine its immunopharmacological activity of Check on mouse arthritis animal model.As a result show that embodiment 1 and embodiment 14 can significantly suppress mouse arthroncus degree (P in oral lmg/kg, 0. 5mg/kg respectively<05) 0. illustrate Fig. 1 is that to significantly reduce DTH mice ears thickness chart 2 be that auricle weight difference embodiment 1, embodiment 11, embodiment 14 significantly reduce DTH mouse swelling auricle weight for ear swelling thickness difference embodiment 1, embodiment 11, embodiment 14 Fig. 3 is the arthritis score of embodiment 1. The mouse arthritis of the preventing and treating ox Type Ⅱ collagen induction of embodiment 11, suppress morbidity arthroncus Fig. 4 is the arthritis score of embodiment 14. The mouse arthritis of the preventing and treating ox Type Ⅱ collagen induction of embodiment 14, suppress morbidity arthroncus embodiment With reference to embodiment, the present invention is further elaborated, but these embodiments are definitely not any limitation of the invention.(Composition is by weight percentage in the following example) Qinghaosu parent nucleus is represented with Q in the examples below that   (Q) wave molding(One)Represent β substitution or/and α substitution ' straight line(One "1) represent β substitutions Dotted line() represent α substitution embodiments 12 ,-amino arteether(β types) With maleic acid into salt.White crystals.Fusing point: 139— 141°C.Elementary analysis(C21H33N09): Calculated value:The N3.16 measured values of 56.87 H of C 7.50:3'- amino -2'- hydroxyl wormwood artemisia the propyl ether of 56.84 H of C, 7.59 N3.10. embodiments 2(β types) Η Q-0-C-C-C-NH. Η Shang HQ 2 OH 2With maleic acid into salt.White crystals.Fusing point: 146— 147°C.Elementary analysis (C22H35O10N): Calculated value:The measured values of 55.80 H of C, 7.45 N 2.96:The light base wormwood artemisia propyl ether of 3'- methylaminos -2'- of 55.92 H of C, 7.43 N 2.94. embodiments 3(β types) Q-0-C-C-C H I I 2 OHNHMe and maleic acid are into salt.White crystals.Fusing point: 145— 146°C.Elementary analysis(C23H37O10N): Calculated value:The measured values of 56.66 H of C, 7.65 N 2.87:3'- methylamino -2'- hydroxyl wormwood artemisia the butyl ether of 56.67 H of C, 7.63 N 2.89. embodiments 4(β types) Η Η Q-0-C-C-C-Me H I I 2 OH NHMe and maleic acid are into salt.White amorphous solid. Elementary analysis(C24H39 O10N): Calculated value:3'- amino -2'- hydroxyl wormwood artemisia the butyl ether of 7.66 N 2.67. embodiments of C 57.47 H, 7.84 N, 2.79 measured value C, 57.72 H 5(β types) With maleic acid into salt.White amorphous solid. Elementary analysis(C23 H3701()N): Calculated value:The measured values of 56.66 H of C, 7.65 N 2.87:3'- hydroxyethylamino -2'- hydroxyl wormwood artemisia the propyl ether of 56.64 H of C, 7.74 N 2.71. embodiments 6(β types) With maleic acid into salt.White amorphous solid. Elementary analysis(C24 H39 OuN): Calculated value:The measured values of 55.70 H of C, 7.59 N 2.71:3'- phenyl -3'- methylamino -2'- hydroxyl wormwood artemisia the propyl ether of 55.69 H of C, 7.89 N 2.58. embodiments 7(β types) It is sour into salt with horse Come.White amorphous solid Elementary analysis (C29l-l4iO10N): Calculated value:The measured values of 61.80 H of C, 7.33 N 2.49:3'- phenyl -3'- amino -2'- hydroxyl wormwood artemisia the propyl ether of 61.64 H of C, 7.41 N 2.48. embodiments 8(β types) It is sour into salt with horse Come.White amorphous solid. Elementary analysis(C28H3901()N): Calculated value:The N measured values of 61.19 H of C 7.15:3'- hydroxyethylamino -2'- hydroxyls the third butyl ether of wormwood artemisia of 61.29 H of C, 7.23 N embodiments 9(β types) With maleic acid into salt.White amorphous solid. Elementary analysis (C25H41OnN): Calculated value:The N measured values of 56.49 H of C 7.77:3'- dimethylamino -2'- hydroxyl wormwood artemisia the butyl ether of 56.21 H of C, 7.94 N embodiments 10(β types) With maleic acid into salt.White amorphous solid. Elementary analysis(C25H4101()N): Calculated value:The measured values of 58.24 H of C 8.02: C 58.06 H 7.99 The 3'- nafoxidine base -2'- hydroxyl wormwood artemisia propyl ether types of embodiment 11) With maleic acid into salt.White crystals.Fusing point: 158- 160 °Co (J. Med. Chem. 2000, 43 (8):1635-1640 reports that the melting point compound is 148-152 °C) Elementary analysis(C26H4101()N): Calculated value: C 59.19 H 7.83 N 2.65 Measured value: C 59.14 H 7.86 N 2.66. 3'- piperidyl -2'- hydroxyl wormwood artemisia the propyl ether of embodiment 12(β types) With maleic acid into salt.White crystals.Fusing point: 157— 159 °C. Elementary analysis(C27H43(½N): Calculated value: C 59.87 H 8.00 N 2.59 Measured value: C 59.86 H 8.02 N 2.58. Light base wormwood artemisia butyl ether (the α types of the 3'- methylaminos -2'- of embodiment 13) With maleic acid into salt.White amorphous solid. Elementary analysis(C24H39 O10N): Calculated value: C 57.47 H 7.84 N 2.79 Measured value: C 57.62 H 7.51 N 2.61. The 3'- tert-butylamine base -2'- hydroxyl wormwood artemisia propyl ether of embodiment 14(β types) With maleic acid into salt.White crystals.Fusing point: 171— 173 °C. Elementary analysis(C26H4301()N): Calculated value: C 58.96 H 8.18 N 2.64 Measured value: C 58.92 H 7.91 N 2.59. 3'- phenyl -3'- nafoxidine base -2'- hydroxyl wormwood artemisia the propyl ether of embodiment 15(β types) With maleic acid into salt.White amorphous solid. Elementary analysis (C32H45O10N): Calculated value:The measured values of 63.67 H of C, 7.51 N 2.32:3'- phenyl -3'- piperidyl -2'- hydroxyl wormwood artemisia the propyl ether of 63.36 H of C, 7.09 N 2.04. embodiments 16(β types) With maleic acid into salt.White crystals.Fusing point: 163— 165 °C.Elementary analysis(C33H47O10N): Calculated value:The measured values of 64.16 H of C, 7.67 N 2.27:The light base wormwood artemisia propyl ether of 3'- phenyl -3'- dimethylaminos -2'- of 64.43 H of C, 7.68 N 2.18. embodiments 17(6 types) It is sour into salt with horse Come.White crystals.Fusing point: 166— 168 °C.Elementary analysis(C^i^C QN): Calculated value:The measured values of 62.38 H of C, 7.50 N 2.42:The tertiary fourth amino -2'- hydroxyls wormwood artemisia propyl ether of 3'- phenyl -3'- diformazans of 62.05 H of C, 7.68 N 2.41. embodiments 18(β types) With maleic acid into salt.White crystals.Fusing point: 167— 169 °C.Elementary analysis (C32H47O10N): Calculated value: C 63.45 H 7.82 N 2.31 Measured value:The N embodiments 19 2 of 63.70 H of C 7.83 ,-amino arteether ^ types) maleate tablet formulation is as follows: 2'- amino arteethers(β types) 35 % starch of maleate, 25 % sodium cellulose glycolates 30 % starch slurries (10 %) 9 % stearic acid 1 % active component is crushed, 100 mesh sieve, mixed with sodium cellulose glycolate, 10% starch slurry, pelletize, dry, add dried starch, lubricant to mix, tabletting. The 3'- tert-butylamine base -2'- hydroxyl wormwood artemisia propyl ether of embodiment 20(β types)Maleate tablet Prescription is as follows: 3'- tert-butylamine base -2'- hydroxyl wormwood artemisia propyl ether(β types) 30 % The % of Macrogol 4000 5 of the % of microcrystalline cellulose 65 micronizings crushes active component, sieves, with microcrystalline cellulose, the uniform rear direct tablet compressing of mix lubricant.Embodiment 21 2 ,-amino arteether(β types) citrate casing piece Prescription is as follows: 2 ,-amino arteether type) 35% starch of citrate, 20 % dried starch 35 % starch slurries (10 %) 8 % talcum powder, 2 % Active component and starch are well mixed, plus softwood is made in 10 % starch slurries, pelletizes, and dries, whole grain, adds dried starch, talcum powder and mixes, tabletting is enteric coated. The light base wormwood artemisia propyl ether of 3'- nafoxidine bases -2'- of embodiment 22(β types)The ebonite Nang of oxalates Prescription is as follows: 3'- nafoxidine base -2'- hydroxyl wormwood artemisia propyl ether(β types)The % of 50% microcrystalline cellulose of oxalates, 30% polyethylene glycol 1500 20 is sufficiently mixed active component and auxiliary material uniformly, is fitted into capsulae vacuus.The 3'- nafoxidine base -2'- hydroxyl wormwood artemisia propyl ether types of embodiment 23)Gel ' prescription is as follows: 3'- nafoxidine base -2'- hydroxyl wormwood artemisia propyl ether(β types)The % of 35 %-polyethylene glycol 65 is by Liquid Macrogol and polyethylene glycol 1500 (1:1) agitating and heating, after fusion, adds the active component of grinding sieving, is sufficiently stirred for into gel.The 2'- amino arteethers of embodiment 24(β types) maleate liquid drugs injection dissolves active component water for injection, filters, embedding, sterilizing.     Claim 1st, a class has water-soluble arteannuin derivant, stereoisomer and the optical isomer and pharmaceutically acceptable salt of following structural formula   (1) Wherein: As n=0, X=Y=H, Z=NH2 ' as n=1, X=OH, Y=H, Z=NH2, NHMe, NHEt, NHPr(n), NHBu, As n=l, X=OH, Y=C, phenyl, Z = N¾, NHR (R = Ci-C4Protective embankment base), NHCH2CH2OH, NR'2(R ,=C C4Alkyl), 2nd, water-soluble arteannuin derivant according to claim 1, it is characterised in that As n=0, X=Y=H, Z=N is 2 ,-amino arteether(β types) and its can hyoscine acid-addition salts. 3rd, water-soluble arteannuin according to claim 1 derives plain thing, it is characterised in that As n=l, X=OH, Y=H, Z=NH2, NHMe, NHEt, NHPr(n), NHBu, Particularly 3'- tert-butylamines base -2'- hydroxyls wormwood artemisia propyl ether(β types) and its can hyoscine acid-addition salts and 3'- nafoxidine base -2'- footpaths base wormwood artemisia propyl ether type)And its can hyoscine acid-addition salts. 4th, water-soluble arteannuin derivant according to claim 1, it is characterised in that As n=l, X=OH, Y=CH3)Phenyl, Z = NH2, NHR (R=C C alkyl), NHCH2CH2OH, NR'2(R ,=d-C4Alkyl), 5th, the preparation method of water-soluble arteannuin derivant as claimed in claim 1, comprises the following steps:A. dihydroartemisinine is that raw material is halohydrin reaction, gained compound and aminated compounds reaction generation target compound with substituted alcohols in acid condition(1, n=0); B. dihydroartemisinine is that raw material is in acid condition diol reaction with substituted alcohols, then first generates hydroxyl qinghaosu ether, be then then converted to p-methyl benzenesulfonic acid ester, finally with amine reaction generation target compound(1, n=0); C. dihydroartemisinine is raw material when being epoxy prapanol reaction with substituted alcohols in acid condition, and obtained qinghaosu reacts with amine, generates target compound(1, n=l); D. dihydroartemisinine be raw material be with substituted alcohols in acid condition propenyl reaction when, be first oxidized to qinghaosu glycidyl ethers, then with amine reaction generation target compound(1, n=l). 6th, the composition of water-soluble arteannuin derivant as claimed in claim 1, it is characterised in that be made up of following composition(By weight percentage): Substituted amino qinghaosu ether 1-55% Excipient 15-40% Adjuvant 20-65%. 7th, the composition of water-soluble arteannuin derivant according to claim 6, it is characterised in that pharmaceutically acceptable excipient is sugar(Glucose, sucrose, lactose), starch(Cornstarch, farina), cellulose and its derivates(Sodium carboxymethylcellulose, ethyl cellulose sodium, cellulose ethanoate, microcrystalline cellulose), it is poly- ^ glycol, bright Glue, talcum powder, stearic acid, magnesium stearate, calcium sulfate, vegetable oil(Soya-bean oil, sesame oil, peanut oil, olive oil);It can also be emulsifying agent(Tween), wetting agent(Lauryl sodium sulfate), colouring agent, flavor enhancement, stabilizer, preservative, apirogen water. 8th, the purposes of water-soluble arteannuin derivant as claimed in claim 1, prepare prevention, treat because of immune function of human body it is hyperfunction caused by apply in disease, including the medicine of autoimmune disease such as lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis. 9th, the purposes of water-soluble arteannuin derivant according to claim 11, it is characterised in that applied in the immunosuppressive drug of anti-rejection after preparing organelle transplanting.    
  19. Roger
    The results of a control group survey conducted in the United States in the 2019/2020 period, focusing on individuals who had not received vaccinations nationwide, indicate that those who consistently refuse vaccination are enjoying good health. Meanwhile, those who have received vaccines are experiencing injuries and suffering from various severe harms, including sudden unexpected deaths. This survey quantifies the long-term health risks associated with completely avoiding vaccination and observes health outcomes in the vast majority of the U.S. population (99.74%) exposed to vaccines.
    Based on the sample size of the control group and the exposed population, p-values, and odds ratios demonstrate the absolute culpability of vaccines. Vaccines are identified as the actual cause of over 90% of disabilities and chronic illnesses suffered by the American population. The true "control group," calculated to represent 0.26% of the population in 2020, has determined the baseline disease risk for individuals not subjected to vaccine administration.
    Significant differences are evident between vaccinated and unvaccinated individuals in various health aspects, including heart disease, diabetes, digestive system disorders, eczema, asthma, allergies, developmental disorders, birth defects, epilepsy, autism, attention deficit hyperactivity disorder (ADHD), cancer, and arthritis. Overwhelming statistical evidence in each comparative group establishes the culpability and mathematical certainty of the vaccines' detrimental effects. As acknowledged by the World Health Organization (WHO) and the U.S. Department of Health and Human Services (HHS), vaccines do not lead people towards better health but rather contribute to the prevalence of lifelong debilitating chronic diseases.
    Before the introduction of the COVID-19 vaccine, Americans who received vaccines had a lifetime cancer risk of 50%. However, in a nationwide control group study, no types of cancer were found in the population of Americans who had never been vaccinated, regardless of age groups. Based on a random sample size of the unvaccinated population, the incidence/risk of cancer in those who have never been vaccinated is below 0.06%, much lower than the vaccinated population. So, is vaccination the sole cause of cancer, or at least a major one? This conclusion is drawn from long-term health follow-ups. Shocking, isn't it? Before the rapid deployment of the COVID-19 "turbo" death vaccine in the United States, vaccines were already a major cause of cancer. Now, with the new COVID-19 vaccine, there is the emergence of "turbocancer" or "warp speed cancer."
    The chart below depicts long-term health outcomes between vaccinated and completely unvaccinated adult Americans. Health agencies in the United States have never bothered to investigate the long-term effects of vaccine exposure on health. The aluminum commonly used as an adjuvant in vaccines can "trigger" the immune system. Therefore, upon careful examination of this chart, one can understand why government health regulators or the entire vaccine industry refuse to conduct such control studies. Hence, the most effective preventive health measure for humans is to completely avoid vaccines and all related bioproducts.

     
    Health versus Disorder, Disease, and Death: Unvaccinated Persons Are Incommensurably Healthier than Vaccinated
    Joy Garner
    Founder of The Control Group
    DOI: https://doi.org/10.56098/ijvtpr.v2i2.40
    Keywords: all-cause mortality, asthma, austism, autoimmune disorders, cancer, causation and correlation, eczema, glyphosate, heart disease, diabetes, thyroid disorders, vaccinated versus unvaccinated, Vaccine Adverse Event Reporting System, VAERS, vaccine-induced braiin damage, vaccines
    Abstract
    Results from the 2019/2020 nationwide Control Group Survey of Unvaccinated Americans (CGS) show that those refusing vaccines are thriving while those accepting them are being injured and met with a multiplicity of grave injuries as well as sudden unexpected death. This survey quantified the long-term health risks of total vaccine avoidance against the health outcomes observed in the 99.74% vaccine-exposed American population. Based upon the sample sizes for the controls vs. the exposed population, the p-values and odds ratios evidence the astronomical odds against the innocence of vaccines as the actual cause of well over 90% of the disabling and life-threatening chronic conditions suffered by Americans. The true “controls” (calculated to represent 0.26% of the population in 2020) have established the baseline disease risk incurred by those without exposure to vaccination. The null hypothesis, that no significant difference would be found between vaccinated vs. unvaccinated persons in heart disease, diabetes, digestive disorders, eczema, asthma, allergies, developmental disabilities, birth defects, epilepsy, autism, ADHD, cancers, and arthritis, is rejected with overwhelming statistical confidence and power in every single contrast. Because 99.74% of the U.S. population is vaccine-exposed, published national disease rates invariably reflect the frequency of observed negative outcomes arising from exposure to vaccines. The Control Group comparison graphs lead to the inescapable conclusion, and near mathematical certainty, that vaccine exposure is the actual cause of the observed disparity in health outcomes between vaccinated and unvaccinated populations. Vaccines are NOT moving the population toward better health, as suggested by the World Health Organization and the US Department of Health & Human Services, but rather toward epidemic levels of lifelong debilitating chronic disorders.
     
     
    癌症?如果从未接种过疫苗,就不会患癌症 
    2019/2020 年美国全国未接种疫苗的人对照组调查的结果显示,那些向来拒绝接种疫苗的人正享受着健康,而那些接受疫苗的人正在受伤,并遭受多种严重伤害以及意外突然死亡。这项调查量化了完全避免接种疫苗的长期健康风险,以及在 99.74% 暴露于疫苗的绝大多数美国人群中观察到的健康结果。
    根据对照组与暴露人群的样本量,p 值和比值比证明了疫苗的绝对有罪,疫苗是导致美国人所遭受的 90% 以上致残和慢性病的实际原因。真正的“对照组”(计算为2020年占人口的0.26%)已经确定了未接触疫苗接种的人所患的基线疾病风险。
    在心脏病、糖尿病、消化系统疾病、湿疹、哮喘、过敏、发育障碍、出生缺陷、癫痫、自闭症、多动症、癌症和关节炎方面,接种疫苗的人与未接种疫苗的人之间有显着差异,在每一个对比组中都以压倒性的统计证明其原罪性及数学上的确定性。正如世界卫生组织(WHO)和美国卫生与公众服务部(HHS)所承认的那样,疫苗并没有使人们走向更健康,而是朝着终生衰弱的慢性疾病的流行水平发展.
    在推出新冠疫苗之前,接种过疫苗的美国人一生中患癌症的风险已经达到 50%。然而,在全国性对照组研究中,在完全未接种疫苗的美国人群中没有发现任何类型的癌症,无论年龄组如何。根据对未接种疫苗人群的随机样本量,从未接种过疫苗的人群的癌症发生率/风险低于 0.06%, 远远低于疫苗接种人群。 那么,接种疫苗是导致癌症的唯一原因吗?至少是主要原因, 这是长期健康随访得出的结果。震惊吗?! 在美国推出新冠“极速”死亡疫苗之前,疫苗已经是导致癌症的主要原因。现在因为新冠疫苗又多出了“涡轮癌”, 或者 “曲速癌症” 。
    下面是“成人”图表,显示了接种疫苗和完全未接种疫苗的美国成年人之间的长期健康结果。 美国的“健康”机构从来没有费心去研究疫苗暴露对健康的长期影响。疫苗工业普遍采用的铝是疫苗中常见的“佐剂” ,可以 “触发” 免疫系统。因此,仔细查看这张图表,就会明白为什么政府医管或整个疫苗工业拒绝做这样的对照研究。 所以, 人类最有效的预防性健康措施是完全避免疫苗和所有相关的生物制品。
     https://gettr.com/post/p2vq0h740c1
     

     
    标题:健康与混乱、疾病和死亡:未接种者的健康状况远胜于接种者
    Joy Garner
    The Control Group创始人
    DOI:https://doi.org/10.56098/ijvtpr.v2i2.40
    关键词:全因死亡率、哮喘、自闭症、自身免疫性疾病、癌症、因果关系和相关性、湿疹、甘油醛、心脏病、糖尿病、甲状腺疾病、接种与未接种、疫苗不良事件报告系统、VAERS、疫苗诱导脑损伤、疫苗
    摘要
    2019/2020年全国范围未接种美国人控制组调查(CGS)的结果表明,拒绝疫苗的人群健康状况良好,而接受疫苗的人群则受到了多种严重伤害以及突发的意外死亡。该调查通过量化完全避免疫苗的长期健康风险,与99.74%的美国接种人口观察到的健康结果进行比较。根据对照组与受暴露人群的样本量,p值和几率比表明,疫苗实际上导致美国人超过90%的致残和生命威胁的慢性病状。真正的“对照组”(2020年计算为人口的0.26%)建立了未接触疫苗的人群所承担的基线疾病风险。在心脏病、糖尿病、消化系统疾病、湿疹、哮喘、过敏、发育障碍、先天缺陷、癫痫、自闭症、注意力缺陷过动障碍、癌症和关节炎等方面,空假设(即接种与未接种人群在这些方面没有显著差异)在每一个对比中都以极大的统计置信度和权力被拒绝。由于99.74%的美国人口接触了疫苗,所以公布的国家疾病率不可避免地反映了由接触疫苗引起的负面结果的频率。控制组对比图表导致不可避免的结论,并近乎数学确定,即疫苗接触是导致接种和未接种人群之间健康结果差异的实际原因。疫苗并没有使人口走向更健康,正如世界卫生组织和美国卫生与人类服务部所建议的那样,而是使人口陷入终身残疾慢性疾病的流行水平。
  20. Roger
    本文短链接:https://gettr.ink/GAxset
     
     
    已接种至少一剂 COVID-19 疫苗的总人口百分比
    WHO, 2023 年 12 月 31 日


    国家 % 波多黎各 100% 尼加拉瓜 97% 开曼群岛 95% 古巴 95% 葡萄牙 95% 秘鲁 93% 柬埔寨 92% 智利 92% 阿根廷 91% 哥斯达黎加 91% 塞舌尔 90% 澳大利亚 88% 马耳他 88% 毛里求斯 88% 巴西 87% 加拿大 87% 厄瓜多尔 87% 马来西亚 87% 巴拿马 87% 西班牙 87% 乌拉圭 87% 爱尔兰 86% 阿鲁巴 85% 哥伦比亚 85% 意大利 85% 特克斯和凯科斯群岛 85% 法国 84% 冰岛 84% 卢旺达 84% 博茨瓦纳 83% 日本 83% 芬兰 82% 以色列 82% 美国 82% 丹麦 81% 科威特 81% 挪威 81% 比利时 80% 大不列颠及北爱尔兰联合王国 79% 奥地利 78% 百慕大 78% 德国 78% 圣马力诺 78% 委内瑞拉玻利瓦尔共和国 78% 利比里亚 77% 荷兰 77% 土库曼斯坦 77% 安道尔 75% 塞浦路斯 75% 卢森堡 75% 墨西哥 75% 突尼斯 75% 希腊 74% 莫桑比克 73% 瑞典 73% 安圭拉 72% 萨尔瓦多 72% 塞拉利昂 71% 拉脱维亚 70% 立陶宛 70% 瑞士 70% 荷属圣马丁 69% 土耳其 69% 白俄罗斯 68% 多明尼加共和国 68% 摩洛哥 68% 洪都拉斯 67% 安提瓜和巴布达 66% 库拉索 66% 几内亚 66% 哈萨克斯坦 66% 乌兹别克斯坦 66% 捷克 65% 匈牙利 65% 玻利维亚(多民族国) 64% 英属维尔京群岛 64% 佛得角 64% 爱沙尼亚 64% 摩纳哥 64% 圣基茨和尼维斯 64% 圣多美和普林西比 64% 赞比亚 64% 圭亚那 63% 波兰 61% 俄罗斯联邦 61% 斯洛文尼亚 60% 伯利兹 59% 坦桑尼亚联合共和国 58% 巴巴多斯 57% 克罗地亚 57% 埃及 56% 巴拉圭 56% 索马里 56% 塔吉克斯坦 56% 阿塞拜疆 54% 中非共和国 54% 特立尼达和多巴哥 54% 斯洛伐克 52% 科特迪瓦 51% 津巴布韦 51% 安哥拉 50% 科摩罗 50% 危地马拉 50% 科索沃 50% 阿富汗 49% 塞尔维亚 49% 阿尔巴尼亚 47% 莱索托 47% 多米尼加 46% 埃塞俄比亚 46% 尼日利亚 46% 苏里南 46% 斯威士兰 45% 加纳 45% 毛里塔尼亚 45% 巴哈马 44% 乌干达 44% 黑山 43% 蒙特塞拉特 42% 罗马尼亚 42% 北马其顿 41% 南非 41% 亚美尼亚 39% 格林纳达 39% 南苏丹 39% 吉布提 38% 瓜德罗普岛 38% 几内亚比绍 38% 乌克兰 37% 苏丹 35% 法属圭亚那 34% 利比亚 34% 圣文森特和格林纳丁斯 34% 乔治亚州 33% 圣卢西亚 33% 保加利亚 31% 乍得 31% 贝宁 30% 布基纳法索 29% 冈比亚 28% 马拉维 28% 摩尔多瓦共和国 28% 肯尼亚 27% 多哥 27% 尼日尔 26% 纳米比亚 25% 牙买加 24% 吉尔吉斯斯坦 23% 马里 22% 刚果民主共和国 19% 赤道几内亚 19% 阿尔及利亚 18% 波斯尼亚和黑塞哥维那 17% 塞内加尔 16% 喀麦隆 14% 加蓬 14% 刚果 13% 马达加斯加 10% 海地 5% 巴布亚新几内亚 4% 也门 4% 布隆迪 没有数据  
     
    已完成 COVID-19 疫苗基础接种的总人口百分比的表格
     

    国家 % 波多黎各 94% 智利 93% 开曼群岛 92% 尼加拉瓜 92% 古巴 89% 柬埔寨 88% 秘鲁 87% 葡萄牙 87% 哥斯达黎加 86% 马耳他 86% 毛里求斯 86% 澳大利亚 85% 马来西亚 85% 塞舌尔 85% 阿根廷 84% 乌拉圭 84% 加拿大 83% 意大利 83% 丹麦 82% 法国 82% 冰岛 82% 爱尔兰 82% 日本 82% 巴西 81% 厄瓜多尔 81% 卢旺达 80% 阿鲁巴 79% 比利时 79% 芬兰 79% 西班牙 79% 特克斯和凯科斯群岛 79% 科威特 78% 百慕大 77% 德国 76% 挪威 76% 土库曼斯坦 76% 奥地利 75% 大不列颠及北爱尔兰联合王国 75% 塞浦路斯 74% 以色列 74% 利比里亚 74% 卢森堡 74% 巴拿马 74% 哥伦比亚 73% 希腊 72% 瑞典 72% 博茨瓦纳 71% 荷兰 71% 哈萨克斯坦 70% 圣马力诺 70% 美国 70% 安道尔 69% 安圭拉 69% 萨尔瓦多 68% 拉脱维亚 68% 立陶宛 68% 莫桑比克 68% 白俄罗斯 67% 瑞士 66% 安提瓜和巴布达 64% 捷克 64% 摩纳哥 64% 摩洛哥 64% 爱沙尼亚 63% 匈牙利 63% 墨西哥 63% 土耳其 63% 塞拉利昂 62% 荷属圣马丁 62% 库拉索 61% 英属维尔京群岛 60% 波兰 60% 洪都拉斯 59% 多明尼加共和国 57% 斯洛文尼亚 57% 伯利兹 56% 佛得角 56% 克罗地亚 55% 俄罗斯联邦 55% 乌兹别克斯坦 55% 巴巴多斯 54% 玻利维亚(多民族国) 54% 塔吉克斯坦 54% 突尼斯 54% 坦桑尼亚联合共和国 54% 中非共和国 51% 圣基茨和尼维斯 51% 圣多美和普林西比 51% 斯洛伐克 51% 特立尼达和多巴哥 51% 巴拉圭 50% 委内瑞拉玻利瓦尔共和国 50% 赞比亚 50% 圭亚那 49% 阿塞拜疆 48% 塞尔维亚 48% 索马里 48% 阿富汗 47% 科摩罗 46% 科特迪瓦 46% 科索沃 46% 几内亚 45% 阿尔巴尼亚 44% 莱索托 44% 多米尼加 43% 巴哈马 42% 罗马尼亚 42% 埃及 41% 苏里南 41% 危地马拉 40% 黑山 40% 北马其顿 40% 蒙特塞拉特 39% 尼日利亚 39% 埃塞俄比亚 38% 南苏丹 38% 津巴布韦 38% 斯威士兰 37% 瓜德罗普岛 37% 吉布提 36% 乌克兰 36% 亚美尼亚 35% 加纳 35% 格林纳达 35% 南非 35% 毛里塔尼亚 33% 乍得 31% 苏丹 31% 保加利亚 30% 法属圭亚那 30% 乔治亚州 30% 圣卢西亚 30% 安哥拉 29% 圣文森特和格林纳丁斯 29% 乌干达 29% 几内亚比绍 28% 摩尔多瓦共和国 27% 牙买加 26% 布基纳法索 25% 贝宁 23% 尼日尔 23% 冈比亚 22% 马拉维 22% 纳米比亚 22% 肯尼亚 21% 吉尔吉斯斯坦 21% 多哥 19% 利比亚 18% 马里 18% 刚果民主共和国 16% 阿尔及利亚 15% 赤道几内亚 15% 波斯尼亚和黑塞哥维那 14% 喀麦隆 12% 刚果 12% 加蓬 12% 马达加斯加 9% 塞内加尔 9% 巴布亚新几内亚 4% 海地 3% 也门 3% 布隆迪 没有数据  
    以下是已接种至少一剂 COVID-19 疫苗加强剂的总人口百分比的表格   国家 % 智利 83% 冰岛 79% 古巴 78% 爱尔兰 76% 意大利 75% 芬兰 73% 荷兰 70% 西班牙 70% 日本 69% 马耳他 69% 挪威 69% 葡萄牙 68% 秘鲁 67% 柬埔寨 64% 比利时 63% 丹麦 63% 法国 63% 德国 63% 波多黎各 63% 土库曼斯坦 63% 阿根廷 61% 奥地利 61% 白俄罗斯 61% 乌拉圭 60% 哥斯达黎加 59% 塞浦路斯 59% 卢森堡 59% 瑞士 58% 希腊 57% 圣马力诺 57% 安道尔 56% 澳大利亚 56% 塔吉克斯坦 56% 瑞典 54% 加拿大 53% 巴西 52% 以色列 52% 百慕大 51% 马来西亚 51% 毛里求斯 51% 乌兹别克斯坦 49% 洪都拉斯 48% 塞舌尔 46% 摩纳哥 45% 卢旺达 45% 厄瓜多尔 44% 墨西哥 44% 尼加拉瓜 44% 捷克 41% 巴拿马 41% 匈牙利 40% 开曼群岛 37% 爱沙尼亚 37% 哈萨克斯坦 36% 美国 36% 阿塞拜疆 35% 科威特 34% 波兰 34% 阿鲁巴 33% 斯洛文尼亚 33% 土耳其 33% 立陶宛 32% 斯洛伐克 31% 哥伦比亚 29% 库拉索 29% 萨尔瓦多 29% 拉脱维亚 29% 乍得 25% 克罗地亚 25% 多明尼加共和国 24% 巴拉圭 23% 安圭拉 22% 巴巴多斯 22% 玻利维亚(多民族国) 22% 博茨瓦纳 22% 瓜德罗普岛 22% 危地马拉 21% 荷属圣马丁 21% 摩洛哥 19% 特克斯和凯科斯群岛 19% 法属圭亚那 16% 圣多美和普林西比 16% 埃及 15% 斯威士兰 15% 加纳 15% 塞拉利昂 15% 津巴布韦 15% 阿尔巴尼亚 14% 伯利兹 13% 英属维尔京群岛 12% 保加利亚 12% 科特迪瓦 12% 纳米比亚 12% 特立尼达和多巴哥 12% 蒙特塞拉特 11% 突尼斯 11% 安提瓜和巴布达 10% 圭亚那 10% 摩尔多瓦共和国 10% 安哥拉 9% 巴哈马 9% 罗马尼亚 9% 中非共和国 8% 莱索托 8% 毛里塔尼亚 8% 尼日利亚 8% 北马其顿 8% 苏里南 8% 乌克兰 8% 赞比亚 8% 阿富汗 7% 格林纳达 7% 莫桑比克 7% 圣基茨和尼维斯 7% 南非 7% 波斯尼亚和黑塞哥维那 6% 多米尼加 6% 乔治亚州 6% 科索沃 6% 马拉维 6% 埃塞俄比亚 5% 吉尔吉斯斯坦 5% 南苏丹 5% 多哥 5% 几内亚比绍 4% 肯尼亚 4% 圣卢西亚 4% 圣文森特和格林纳丁斯 4% 塞内加尔 4% 亚美尼亚 3% 喀麦隆 3% 几内亚 3% 利比亚 3% 冈比亚 2% 牙买加 2% 乌干达 2% 委内瑞拉玻利瓦尔共和国 2% 阿尔及利亚 1% 马达加斯加 1% 贝宁 没有数据 布基纳法索 没有数据 布隆迪 没有数据 佛得角 没有数据 科摩罗 没有数据 刚果 没有数据 刚果民主共和国 没有数据 吉布提 没有数据 赤道几内亚 没有数据 加蓬 没有数据 海地 没有数据 利比里亚 没有数据 马里 没有数据 黑山 没有数据 尼日尔 没有数据 巴布亚新几内亚 没有数据 俄罗斯联邦 没有数据 塞尔维亚 没有数据 索马里 没有数据 苏丹 没有数据 大不列颠及北爱尔兰联合王国 没有数据 坦桑尼亚联合共和国 没有数据 也门 没有数据
  21. Roger
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    2021年
    O6BBGUO1
    美国南区地方法院
    ------------------------------x
    美利坚合众国

    郭文贵(MILES GUO),
    被告。
    ------------------------------x
    纽约,纽约
    2024年6月11日
    上午9:02
    出席人员:
    阿娜丽莎·托雷斯法官
    以及陪审团
    出庭者
    法庭案件中的法律代表, 表格标题如下: 法庭案件中的法律代表, 以下是列出的内容:
    代表:无
    角色:无
    法庭案件中的法律代表
    代表人 角色 达米安·威廉姆斯 美国纽约南区检察官 由: 麦卡·F·费根森     瑞恩·B·芬克尔   贾斯汀·霍顿   茱莉安娜·N·默里   美国助理联邦检察官 萨布里娜·P·肖夫 被告的律师 Pryor Cashman LLP 被告的律师 由: 希德哈·卡马拉朱     马修·巴尔坎 Alston & Bird LLP 被告的律师 由: E·斯科特·斯奇里克   南区记录员有限公司
    (212) 805-0300
    出席法律会议的人员名单,包括法律助理专家、特工、口译员和辩护律师助理,
    下面是表格标题: 出席人员名单
    具体列名如下:
    也在场:出席人员的姓名及职务
    出席人员名单
    序号 也出席者 名字及职务 1 伊莎贝尔·洛夫特斯,美国检察官助理   2 迈克尔·加特兰,美国检察官助理     杰弗里·米恩斯,美国检察官助理   3 罗伯特·斯托特,联邦调查局特工     鲁本·蒙蒂利亚,辩护律师助理   4 黄拓,口译员(普通话)     石峰,口译员(普通话)   5 余马克·汤,口译员(普通话)   2023
    (庭审继续进行;陪审团不在场)
    法官:早上好。请出庭。
    穆雷女士:早上好,法官。我是朱莉安娜·默里,与我一起的是瑞恩·芬克尔和贾斯汀·霍顿。美国代表迈克·费根森也将加入我们。我们在律师席上有助理杰夫·明恩斯。
    卡玛拉朱先生:早上好,法官。我是西德哈尔达·卡玛拉朱,与我一起的是斯科特·希瑞克和克莱尔·蒂尔登,代表郭先生。而郭先生也在我们的律师席上。
    法官:请坐下。关于审判记录的问题解决了吗?
    穆雷女士:还没有,法官。我们昨天庭审结束后试图与辩护律师讨论。目前还没有解决,但我们会在今天早上陪审团到场前的9:30与他们再次交流。
    法官:我想澄清一件事。也许之前让你们误解了,作为辅助的审判记录可以被带回陪审团议室。这是可以的。通常情况下,我已裁定他们依靠实际录音。然而,各方可以同意他们可以同样依赖审判记录的转录内容。
    穆雷女士:是的,法官。我们将继续与辩护律师讨论。这是一个我们需要...
    南区记录员公司, P.C. (212) 805-0300
    2024
    O6BBGUO1
    达成协议,我们的理解是双方同意审判记录,包括英文部分,作为完整的证据被采纳。感谢法官的澄清。我们确实希望审判记录无论作为证据还是作为辅助,都能重新交给陪审团,因为否则,作为证据的中文翻译在缺乏背景信息的情况下将无法理解。但是我们将与辩护律师交流,并在这个问题上再次回到法庭。
    法官:好的。还有其他事情吗?
    穆雷女士:关于时间安排,法官。
    我们已经与辩护律师进行了沟通。如果法庭和陪审团同意,我们建议本周的周三至周五增加15分钟的庭审时间,至下午3点。我们仍在讨论下周潜在的时间安排变动,并希望明天早上能提出一个共同提案。
    法官:好的。还有其他事吗?
    卡玛拉朱先生: 我们没有其他要说的了,法官。
    穆雷女士: 没有了,法官。
    法官:谢谢。
    (休庭)
    (陪审团不在场)
    法官:请让陪审团进入。
    法官助理:陪审团进入。
    南区记录员公司, P.C. (212) 805-0300
    2025
    O6BBGUO1
    (陪审团在场)
    法官:早上好,陪审员。请坐下。
    律师,请过来一下。
    (接下页继续)
    南区记录员公司, P.C. (212) 805-0300
    2026
    O6BBGUO1(在庭审旁听席)
    法官:我想问一下,哪个周三、周四和周五需要额外15分钟?
    穆雷女士:本周。
    法官:我现在问问他们。
    (接下页继续)
    南区记录员公司, P.C. (212) 805-0300
    2027
    O6BBGUO1 卡里德-诉讼
    (在法庭上)
    法官:陪审团成员,我们有点晚了。我想问一下,明天、周四和周五是否可以留到下午3点?可以吗?有人不能留到下午3点吗?好的。那我们就这样做。现在我们继续进行卡里德先生的询问。请记住,先生,你仍处于...
    哈伊瑟姆·卡里德,继续。
    继续询问
    穆雷女士:
    问:卡里德先生,提醒您一下,你可以把麦克风放在嘴前,这样陪审团能听到您说话。
    答:好的。
    问:昨天我们停下时,我们在谈论你做过的一些录音。你还记得吗?
    我想问一下,明天、星期四和星期五你是否能留到下午三点。可以吗?有人不能留到下午三点吗?好的,我们就这样安排。现在我们将继续对哈桑·卡勒德先生进行直接询问。请记住,先生,你仍然处于...
    海桑·卡勒德,继续。
    继续直接询问
    由默里女士提问:
    问:卡勒德先生,请你记住,把麦克风放在嘴前,这样陪审团能听见你说话。
    答:好的。
    问:昨天我们谈到了你录制的一些录音。你还记得吗?
    答:记得。
    问:你昨天作证说,大约有一亿美元在2021年3月和4月进入了克雷恩的账户。
    当时,对于这笔大量汇款活动,你有何反应?
    答:我很紧张,因为这只是一笔大额款项进入我的账户,却没有明确的指示。
    问:你对这笔钱感到紧张的原因是什么?
    答:这是一笔很大的责任。超过1亿美元,担心发生什么情况,特别是没有为G/Club或其他实体开立账户。
    问:您是否曾经被要求将克雷恩账户中的这笔钱转账至另一家公司名下的账户?
    答:是的。
    问:是哪家公司?
    答:喜马拉雅交易所。
    问:据你所知,谁控制喜马拉雅交易所?
    答:那是威廉·杰。
    问:您被要求转账的账户是否是以喜马拉雅交易所的名义开设的?
    答:有关于为克雷恩在喜马拉雅交易所开设一个基金账户来投资加密货币的讨论。
    问:当你说到加密货币时,你指的是什么?
    法官:请稍等。你说有关在喜马拉雅交易所为克雷恩开设一个基金账户来投资的讨论,能否解释一下?
    证人:我被要求为克雷恩与喜马拉雅交易所开设一个基金账户,作为一个投资基金。
    南区记录员行,电话(212) 805-0300
    法官:我没有理解你的意思。也许你可以提一些问题来澄清这一点。
    默里女士:是的,法官。
    资金来源讨论
    问题 答案 无 无 资金来源讨论
    问题 回答 Q. 卡里德先生,我们谈论的是2020年3月和4月Crane账户中约一亿美元左右的资金,对吗? A. 是的。 Q. 您对这些资金的来源了解情况是什么? A. 这些资金来源于G/Club的成员以及投资者。 Q. 有哪些投资者? A. 有两个实体将进行投资。一个是科技公司的私人发行,另一个是H Dollar。 Q. 关于第一个,私人发行与哪家科技公司相关? A. 这是一家将在开曼群岛成立的科技公司,用于建立一个科技平台。 Q. 您知道那家科技公司的名字吗? A. 我记不起来了,不知道。 Q. 谁,如果有的话,控制了那家科技公司? A. 这并不是一个控制,但这家科技公司的创建是由Yvette和一位开曼的律师共同完成的。 Q. 您与谁讨论过这家科技公司?   南区记录员,P.C.(212)805-0300
    2030
    O6BBGUO1 Khaled- 直接质询
    1 A. 就是 Yvette 和律师们。
    2 Q. 那么你提到的投资款项的第一类是什么?第二类是什么?
    3 A. 是 H Dollar。
    4 Q. H Dollar 是什么?
    5 A. 这是一个正在建立的加密货币。
    6 Q. 是谁告诉你的?
    7 A. Yvette。
    8 Q. 所以你提到从Crane账户转移资金的请求,你和谁讨论了这个请求?
    9 A. William Je。
    10 Q. 那些讨论是关于什么的?
    11 A. 是为Crane开设一个投资H Dollar的账户。
    12 Q. 清楚说明一下,William Je要求Crane使用什么资金投资H Dollar?
    13 A. 是Crane名下的资金。
    14 Q. 对于将Crane持有的资金转移至喜马拉雅交易所的请求,你有何反应?
    15 A. 我告诉他们我不能这么做,因为如果没有指示,Crane就不能成为投资者。
    16 Q. 你所说的如果没有指示的意思是什么?
    17 A. 如果没有被向Crane发送资金的人指示。
    18 Q. Crane在何时与G/Clubs签订了合法协议?
    南区记录员,P.C.(212)805-0300
    2031
    O6BBGUO1 Khaled- 直接质询
    1 A. 有。
    2 Q. 是什么类型的协议?
    3 A. 付款促成协议/托管协议。
    4 Q. 你能描述一下这意味着什么吗?
    5 A. 这意味着Crane将代表成员收到G/Club的钱款,并进行合规性、KYC审查,然后将资金转给G/Club。
    6 Q. Loftus女士,如果可以请我们公布作为政府证据的BR-1515。
    7 Khaled先生,你还记得与G/Clubs签订的支付促成协议的生效日期吗?
    8 A. 生效日期是2020年11月。
    9 Q. 那么你何时与G/Clubs签订了支付促成协议?
    10 A. 我想是在2021年5月。
    11 MS. SHROFF: 你是说2021年5月吗?
    12 证人:是的。
    13 Q. 为什么支付促成协议的生效日期会从签署日期之前回溯?
    14 A. 为了涵盖所有汇入Crane的款项。直到那时,大家同意如何妥善转移这笔资金。
    15 Q. 你说大家同意,这是指谁?
    南区记录员,P.C.(212)805-0300
    2032
    O6BBGUO1 Khaled- 直接质询
    支付便利协议讨论记录
    生效日期 签订日期 费用百分比 已清算金额 2022年1月1日 2021年12月15日 5% 100,000美元 以下是有关Crane和G/Club之间的支付便利协议讨论的记录表:
    1 指涉? 2 A. 我的意思是讨论是由Miles Guo,Mileson,公司律师Ana,我的律师进行的。还和William进行了讨论,还有一个名叫David Long Island的先生。 3 Q.看这个,这是您提到的Crane和G/Club之间的支付便利协议吗? 4 A. 是的。 5 Q. Loftus女士,如果我们能放大顶部部分。看第一行,请问Khaled先生,您能读出这份协议的生效日期吗? 6 A. 2020年11月23日。 7 Q. 然后,如果可以的话,Loftus女士,请继续,看一下签订日期。Khaled先生,您代表Crane在什么日期签署了这份协议? 8 A. 2021年5月12日。 9 Q. 根据支付便利协议,Crane有权收取什么样的费用? 10 A. 两个百分点的费用。 11 Q. 两个百分点是针对什么的? 12 A. 针对已结清的金额,那时是一亿三千七百万。 13 Q. 请解释一下您所说的已结清的金额是什么意思。 14 南区记者报告,电话(212)805-0300 2033
    Khaled-直接
    A. 任何经过流程并收到来自寄件人的KYC/赔偿包的付款,附带着指示款项应该去哪里,那笔转账被认为是一个清算金额。每天我们收到的包裹越多,就会有一个总金额转去G/Club。
    问:Loftus女士,我们可以记录下来。
    那么,Khaled先生,一旦Crane清算了资金,那么那些留存在Crane银行账户中的资金会发生什么事情?
    答:它被转入G/Clubs的摩根士丹利账户。
    问:您如何知道要将清算资金发送到哪个账户?
    答:我被告知那是G/Club唯一的摩根士丹利账户。G/Club没有其他账户。这个账户是通过我的开立的,所以那是我们拥有的账户,并且在协议中,在Ana的指示中都有。
    问:各方如何决定为Crane清算的任何清算资金收取两个百分点的费用?
    答:与Mileson讨论过,需要有一个金融交易和一个远离关系的设置,Crane会因为为G/Club所做的工作而获得经济补偿。我们对平均托管费进行了研究,确定并达成了两个百分点。
    问:您说的远离关系是什么意思?
    南区记录员有限公司(212)805-0300
    2034
    Khaled-直接
    答:拥有一个独立的公司,这不仅仅是一个公司,只是一个独立的,独立管理,在这个公司中合规的角色被正确执行。
    问:当Crane与G/Clubs签订付款便利协议时,您在哪个办公地点工作?
    答:我仍然在64街162号的联排别墅。
    问:当Crane与G/Clubs签订付款便利协议时,哪个实体支付您的工资?
    答:莱克星顿。
    问:哪个实体正式雇佣了您?
    答:萨拉卡。
    问:在2021年5月至6月期间,Crane从其账户清算了大约多少G/Club会员资金?
    答:大约9700万左右。
    问:Crane有权清理这些资金的两个百分点费用金额大约是多少?
    答:大约两百万。
    问:G/Club是否曾终止支付便利协议?
    答:是的。
    问:大约是在什么时候?
    答:我想是在2021年6月或7月。
    G/Clubs终止支付便利协议的依据是什么,如果有的话?
    2035
    Khaled-直接
    那份协议?
    答:他们说我违反了合同,而且我花了太多时间来清理资金。
    问:谁,如果有的话,说的?
    答:有几次电话投诉说需要立即将资金转移,需要立即转移。Miles Guo、来自长岛的David,我们在联排别墅工作的一些员工像Ming。Yvette加入了几次电话。
    问:在G/Club终止付款便利协议之后,关于Crane发生了什么,如果有的话,接下来发生了什么?
    答:在终止后,G/Club通过仲裁程序起诉了Crane。
    问:我们稍后会谈到仲裁。在支付便利协议终止后,Crane保留的两个百分点服务费发生了什么,如果有的话?
    答:我将它转移到了我的个人账户。
    问:为什么?
    答:那是我应得的。
    问:这大约是270万美元吗?
    答:是的。
    问:将这笔钱转入您的个人账户后,您有做什么,如果有的话?
    南区记录员有限公司(212)805-0300
    2036
    Khaled-直接
    答:我购买了房产,投资性质的房产。
    问:这些房产是以谁的名义购买的?
    答:我妻子和我妻子名下拥有的实体。
    在支付促成协议终止后,克莱恩掌握的两个百分点服务费发生了什么情况?
    A. 我将它转移到了我的个人账户。
    Q. 为什么?
    A. 我有权拥有这笔钱。
    Q. 这大约是270万美元吗?
    A. 是的。
    Q. 在你将这笔钱转移到个人账户后,你做了什么,如果有的话?
    ——---
    A. 我购买了房产,投资性质的房产。
    Q. 这些房产是以谁的名义购买的?
    A. 我妻子和我妻子拥有的实体公司的名义。
    Q. 为什么,如果有的话,你要以你妻子的名义或你妻子拥有的实体公司名义购买这些房产?
    A. 我想确保如果发生任何事故,比如有诉讼,那些房产是由我信任的其他人名下的。
    Q. 为什么?
    A. 我担心自己会遇到身体上的问题。我有家庭,想要保护他们并给他们至少一定的财务安全。
    Q. 就你在与政府签署的不起诉协议中与这270万美元有关,你同意了做什么?
    A. 我必须全部放弃。
    Q. 这包括放弃你用这些资金购买的房产吗?
    A. 是的,女士。
    Q. 这种放弃的状态目前是什么?
    A. 一处房产已经卖掉了。一处还在等待中,其他的正在待售中。
    Q. 根据你的免于起诉协议,你明白这是一项持续的义务,直到你完全放弃了270万美元吗?
    法庭:这是电话还是视频会议?
    证人:Alex和Yvette在联排别墅里。我在家里通过视频,Miles Guo也在通话中。我不知道是视频还是电话。我看不见。
    法庭:那18.2是你提到的丢失的钱吗?
    证人:是的,他想要32百万的调解,18.2百万是丢失部分。
    法庭:你可以继续。
    代表Ms. Murray:
    问:那18.2百万的来源是什么?
    Ms. Shroff:反对,昨天已经问过了。
    法庭:你可以回答。
    回答:这些钱是由个人转账给G/Club,没有提及受益人,所以没有说是给G/Club或没有任何参考,只是转给了Medici的钱。
    Ms. Murray:Loftus女士,我们可以继续播放。
    (播放录像)
    Ms. Murray:我们可以暂停,Loftus女士。
    问:Khaled先生,你与Miles Guo关于超过1800万的钱数讨论了什么?
    回答:我向他提供了G/Club在Medici的这笔钱的调解。
    Ms. Murray:Loftus女士,我们可以去15分50秒,请看录像第13页。
    (播放录像)
    Ms. Murray:请暂停,Loftus女士。
    问:Khaled先生,在那里你提到的Limarie是谁?
    回答:她被聘为波多黎各G/Club运营的CEO。
    问:你提到的待处理投诉指的是什么?
    回答:这些投诉类似于客户服务案例。
    问:由谁投诉?
    回答:那些寄钱的人。
    问:寄了什么钱?
    回答:那1800万,我们假定是寄给G/Club,从Medici发给G/Club的。
    问:你提到了Orbit—
    Ms. Shroff:实际上,法官。我要求撤销任何假设性的内容。如果他知道,他就知道,如果不知道,就不知道。
    法庭:是的。他不应该被要求做出假设。
    Ms. Murray:可以请再读一遍Khaled先生上一个答案吗?
    (读音频)
    Ms. Shroff:这是我反对的那个。
    Ms. Murray:如果可以读回被撤销前的部分。我明白你撤销了假设后的内容。
    (读音频)
    问:Khaled先生,你说那与人们投诉有关,那些人是谁?
    回答:寄钱的人。
    问:他们寄钱的目的是什么?
    Ms. Shroff:反对。他刚刚证明他不知道。
    法庭:如果你知道他们寄钱的目的,你可以说出来。
    回答:给G/Club。
    问:那些人为什么要给G/Club寄钱呢?
    Ms. Shroff:同样的反对。
    法庭:如果你知道,你可以回答。
    回答:我不知道为什么。
    问:你提到了Orbit与投诉有什么关系?
    回答:Orbit是为G/Club提供客户服务的公司。
    Ms. Murray:Loftus女士,我们可以继续。
    (播放录像)
    Ms. Murray:请暂停,Loftus女士。
    问:Khaled先生,在Yvette刚才说的中提到了CCP。
    致 G/Club。
    问:那些人为什么向 G/Club 转账?
    SHROFF女士:同样的异议。
    法庭:如果你知道的话,可以回答。
    答:我不知道为什么。
    问:你提到有关投诉的 Orbit 是什么?
    答:Orbit 是为 G/Club 提供客户服务的公司。
    MURRAY女士:我们可以继续了,Loftus女士。
    19.(媒体播放)
    MURRAY女士:请暂停,Loftus女士。
    问:Khaled 先生,在 Yvette 刚才说的内容中提到了 CCP。你认为这指的是什么?
    答:中国共产党。
    问:在 2021 年 4 月 28 日这次会议或电话时,你对银行问题是否与中国共产党有关有什么了解吗?
    答:在很多事件中,Yvette、内部律师和郭文贵都告诉我,中共正在试图干扰 G 实体的业务流程。
    问:大约什么时候 Yvette、郭文贵和律师告诉了你这个?
    答:自从我开始与 Yvette 和郭文贵合作以来。
    问:那是在 2020 年 8 月吗?
    SHROFF女士:引导性问题提出异议。已经问过并回答。
    法庭:异议不成立。你可以回答。
    答:是的。
    问:在开始在 Saraca 工作时,你是否相信有关共产党的解释?
    答:我相信。
    问:为什么?
    答:那是一个好理论,一个好故事。关于中美之间有很多新闻报道,所以那时候这是有道理的。
    问:是否有时候你不再相信共产党对 G 系列银行问题负责?
    答:是的。
    问:大约是在什么时候?
    答:在 2021 年 4 月或 5 月。
    问:为什么,如果有的话,你的看法会改变?
    答:因为实际上并没有任何东西来支持 G/Club 和其他实体之间正在发生的使命。
    问:你什么意思?
    答:最初,G/Club 是为了帮助个人获得美国的服务和资源。到了 4 月或 5 月,G/Club 账户中有很多钱,Crane 的账户中也是如此,但是之前被告知会提供的服务都没有到位。
    G/Club 依旧只有极少数量的员工,几乎没有服务,所以我们所做的已经不再真实。
    MURRAY女士:Loftus女士,我们可以继续播放,请。
    45.(媒体播放)
    MURRAY女士:请暂停。
    SHROFF女士:法官,抱歉。录音中的英文部分需要为郭文贵先生翻译。抱歉。
    法庭:当然。口译员需要翻译任何英语部分,包括录音中表述的内容。
    SHROFF女士:谢谢,法官。
    问:Khaled 先生,在我们刚刚听到的录音中,谁或谁给出了有关 G/Club 应该怎么做的指示?
    答:Miles Guo。
    问:还有其他人吗?
    答:还有 Yvette。
    MURRAY女士:Loftus女士,请跳到录音中的 19 分 45 秒处,开始播放。
    55.(媒体播放)
    MURRAY女士:Loftus女士,请暂停。
    问:Khaled 先生,您知道在录音中的这部分提到的合同是指什么吗?
    答:合同是指为了促成 2000 万或 5000 万的电汇而签订的贷款协议。
    问:您知道那个贷款协议的各方当事人是谁吗?
    答:我认为是 Fiesta。
    问:那个实体的全名是什么?
    答:我不记得全名。
    问:在我们刚刚听到的录音片段中,Khaled先生,有人指导G/Clubs应该做什么吗?
    答:Miles Guo。
    问:还有谁?
    答:还有Yvette。
    默里女士:Loftus女士,我们能否跳转到第19分45秒,开始播放。
    (播放媒体)
    默里女士:Loftus女士,请暂停。
    问:Khaled先生,您知道这段录音中提到的合同是指什么吗?
    答:这份合同是为了方便2千万或5千万美元的电汇所签订的贷款协议。
    问:您知道这份贷款协议的签约方是谁吗?
    答:我想是Fiesta。
    问:这个实体的全称是什么?
    答:我记不清全称了,类似于Fiesta Properties。
    默里女士:Loftus女士,我们可以继续。
    (播放媒体)
    默里女士:Loftus女士,请暂停。
    问:Khaled先生,在这些通过中文字幕翻译的讨论中,是否提到了与账户关闭有关的共产党?
    答:没有。
    默里女士:我们可以继续播放。
    (播放媒体)
    默里女士:请暂停,Loftus女士。
    问:Khaled先生,您理解这些对话中提到的基金是指什么?
    答:是喜马拉雅基金。
    问:这个基金是谁的,如果是的话?
    答:喜马拉雅基金是由William Je控制的。
    默里女士:请继续,Loftus女士。
    (播放媒体)
    默里女士:请暂停,Loftus女士。
    问:Khaled先生,您认得这个被添加至通话中的人所指的声音吗,名为Yu?
    答:那是William Je。
    默里女士:谢谢,Loftus女士。请继续。
    (播放媒体)
    默里女士:暂停,Loftus女士,如果您可以跳转到26分17秒。这在笔录的第21页。
    (播放媒体)
    默里女士:请暂停。如果我们可以稍微回到提到Alex的部分。
    (播放媒体)。暂停。
    问:Khaled先生,您认为Alex指的是谁,如果有的话?
    答:Alex Hadjicharalambous。
    问:您是否了解Alex是否是G/Club的正式员工?
    答:他是G Fashion的员工,但是在G/Club工作。
    问:Alex在G/Club方面负责什么职责和责任?
    答:他的职称是财务主管,负责会员ID与入账金额的对账。
    问:之前提到了一个Mr. He,您听到了吗或者读到了吗?
    答:是的。
    问:您认为他是谁?
    答:G/Club和其母公司Jovial的最终受益人。
    问:他的全名是什么?
    答:郝然·何。
    问:我们可以继续,Loftus女士。
    (播放媒体)
    问:请暂停。
    Khaled先生,在我们刚刚听到的那部分内容中,Yvette在关于调查转账的问题上提到了谁,如果有的话?
    答:抱歉,您能回放吗?
    问:如果我们可以稍微回到一下,Loftus女士。
    (播放媒体)
    问:请在那里暂停。
    答:监管机构正在调查。
    问:在这段对话中是否提到了中共?
    答:没有,女士。
    问:我们可以继续,Loftus女士。
    (播放媒体)
    问:请暂停,Loftus女士。
    洛夫图斯。
    (媒体播放)
    问:请暂停一下。
    哈立德先生,在我们刚刚听到的部分中,伊维特提到了谁,如果有的话,她是在提及与转账有关的潜在调查中的谁?
    筛选区法院记录员公司 (212) 805-0300
    2046
    O6BBGUO1 哈立德-直接
    对不起,你能回放一下吗?
    如果可以请稍候一下,洛夫图斯女士。
    (媒体播放)
    请在那里暂停一下。
    监管机构进行调查。
    在这段对话中是否提到中国共产党(CCP)?
    没有,女士。
    洛夫图斯女士,我们可以继续。
    (媒体播放)
    请暂停一下,洛夫图斯女士。再回放一下一刻钟。
    哈立德先生,在讨论到在Crane账户中有一亿美元时,是否涉及G/Club为其会员提供的服务?
    没有。
    法官:哈立德先生,请提醒我,谁是于先生?
    筛选区法院记录员公司 (212) 805-0300
    2047
    O6BBGUO1 哈立德-直接
    证人:威廉·杰。
    洛夫图斯女士,我们可以继续。
    (媒体播放)
    问:哈立德先生,您是通过视频参加这次会议的,对吗?
    答:是的。
    问:在我们刚刚听到的会议部分之后发生了什么事情?
    答:伊维特把遥控器扔到了电视上,Guo就在那里。
    问:你怎么知道的?
    答:我看到了并听到了碎裂声。第二天我来办公室时,看到了电视机破裂的情况。
    问:洛夫图斯女士,请翻到政府展品404和404-T。
    穆雷女士:尊敬的法官,如果可以,我可以给哈立德先生带来实体的成文记录册。
    法官:可以。
    问:哈立德先生,404-T显示在屏幕上。您可以在记录册中跟着看。
    这里录制的对话是哪一天?
    答:2021年5月4日。
    问:时间是?
    答:下午5点13分,对,5点13分。
    问:下午5点13分?
    答:是的。
    问:我们可以翻到下一页。
    洛夫图斯女士,请开始播放——对不起。
    请返回上去一下。这通话的参与者是谁?
    答:我自己和威廉·杰。
    问:我们可以翻到下一页并开始播放录音,请。
    (媒体播放)
    问:请暂停一下,洛夫图斯女士。
    哈立德先生,这通话是在我们刚刚听过的那通电话约一周之后进行的,对吗?
    答:是的。
    问:在这通电话中您和威廉·杰讨论的资金是不是那通早期通话中讨论的同一笔资金?
    答:不是。
    问:有何不同?
    答:在早期的那笔资金是G/Club在摩根斯坦利账户中的资金,直接通过G/Club收集并存放在摩根斯坦利账户中。而这部分资金是从11月到4月转入的,从5月转入了Crane的账户。
    问:在与杰先生讨论中,为什么购买订单号或会员编号与Crane的工作有关(如果有的话)?
    答:因为为了确认这笔资金确实是为G/Club的,必须有会员编号和会员协议由会员签署。
    问:洛夫图斯女士,我们可以继续播放。
    A. 不是。
    问:有何区别?
    答:另外谈论的资金是直接通过 G/Club 集资并存放在摩根士丹利账户的资金。这些资金是从11月到4月转移的,5月转到 Crane 的账户。
    问:在与 Je 先生的讨论中,如果适用,购买订单编号或会员编号与 Crane 的工作有何关联?
    南区记录员,电话 (212) 805-0300
    2049
    O6BBGUO1 Khaled-直接
    答:因为为了核对这笔资金实际是给 G/Club 的,必须有会员编号和会员协议由会员签署。
    问:Loftus 女士,我们可以继续播放。
    (媒体播放)
    问:Loftus 女士,你可以暂停。
    Khaled 先生,对于未来 GTV 股份的提及,你理解的是什么意思?
    答:他们将获得 GTV 的股权,类似私募的股份。
    MURRAY 女士:好的,Loftus 女士,我们可以继续。
    (媒体播放)
    问:Loftus 女士,你可以暂停。
    Khaled 先生,在你刚刚进行的对话中,提到了上周不同的解释,你在这通电话之前,是否已经与谁讨论过这些资金?
    答:伊维特、迈尔斯和迈尔森。
    2050
    O6B1GUO2 Khaled-直接
    由 MURRAY 女士提问:
    问:在2021年5月4日的通话时,你对这些资金代表的理解是什么?
    答:我还是感到困惑。我不知道。
    MS. SHROFF:抱歉,我没有听清。
    证人:那时我仍然感到困惑。那时我不知道。
    MURRAY女士:Loftus女士,如果可以,请看政府展示的405号和405-T号。
    问:如果你要找的话,这在你的文件夹中也有。
    这就是了。这通电话的日期是什么?
    答:2021年5月4日。
    问:与我们刚刚听到的那通电话同一天吗?
    答:是的。
    问:时间是?
    答:下午5:42。
    问:这通电话的参与者是谁?
    答:William Je、我自己,和来自 Long Island 的 David。
    MURRAY女士:Loftus女士,如果可以,请跳到6:53分,那是转录文本的第10页。
    我们可以播放录音,Loftus女士。
    (播放录音)
    MURRAY女士:对不起,Loftus女士。是第5页。
    (重新播放录音)
    南区记录员,电话 (212) 805-0300
    2051
    O6B1GUO2 Khaled-直接
    MURRAY女士:请暂停,Loftus女士。
    由 MURRAY女士提问:
    问:Khaled 先生,Long Island David 在 G Club 中扮演什么角色?
    答:没有任何角色。
    问:为何他涉及讨论移动 G Club 资金?
    答:这是为了促成 Crane 请求的农场付款便利包。
    问:特别来自哪些农场?
    答:没有具体说明是哪家。
    问:如果有人的话,是谁把 Long Island David 引入到关于存放在 Crane 账户的资金的讨论中?
    答:伊维特·王。
    MURRAY女士:好的。Loftus女士,请转到政府展示的406和406-T。
    问:Khaled 先生,这通录音通话的日期是什么?
    答:2021年5月6日。
    问:时间呢?
    答:上午9:43。
    问:那是在我们刚刚听到的电话的两天后,对吧?
    答:是的,女士。
    问:参与者是谁?
    答:迈尔森·郭和我。
    MURRAY女士:好的。Loftus女士,请继续。
    问:具体是哪些农场?
    答:没有具体指明是哪一个。
    问:是谁,在这些关于Crane账户中持有的资金的谈话中介绍了Long Island David?
    答:Yvette Wang。
    MURRAY女士:好的,Loftus女士,现在请打开政府展品406和406-T。
    问:Khaled先生,这通电话的日期是多少?
    答:2021年5月6日。
    问:时间是?
    答:上午9:43。
    问:这是在我们刚刚听过的通话两天后,对吧?
    答:是的,女士。
    问:参与者是谁?
    答:Mileson Guo和我自己。
    MURRAY女士:好了,Loftus女士,请开始看第8:35分。这是转录的第8页,在该页的底部附近。
    (播放录音)
    问:这里提到的Ana指的是谁?
    答:Puerto Rico的G Club运营内部律师Ana。
    MURRAY女士:好的,Loftus女士,我们可以继续。
    (继续播放录音)
    MURRAY女士:可以暂停一下,Loftus女士。
    问:Khaled先生,当你说“它一直在变化”时,你指的是什么?
    答:资金的用途一直在变化。
    MURRAY女士:我们可以继续,Loftus女士。
    (继续播放录音)
    MURRAY女士:可以暂停一下,Loftus女士。
    问:Khaled先生,提到你收到1300是什么意思?
    答:1300笔转账。
    MURRAY女士:好的,我们可以继续。
    (继续播放录音)
    MURRAY女士:可以暂停一下,Loftus女士。
    问:Khaled先生,提到Hamilton核对其框, 是什么意思?
    答:所以Hamilton为了从Crane那里收到钱,他们需要对Crane进行KYC,这就是所谓的核对框框。
    法庭程序记录
    | 问题 | 回答 |
    法庭课程证词
    问题 回答 1 无 2 问: 关于我们看到的这个基金的各种规定目的,Hamilton扮演了什么角色,如果有的话? 3 答: Hamilton是为H Dollar基金收取资金的实体。 4 MURRAY女士: 好的,继续吧,洛夫图斯女士。 5 (录音继续) 6 MURRAY女士: 洛夫图斯女士,请暂停。 7 问: 在Mileson刚刚说的那部分中,他是如何提到那些向Crane发送资金的人的,如果有的话? 8 答: 他们根本不在乎流程吗? 9 问: 他是如何描述他们,那些人的? 10 答: 投资者。 11 问: 那个管理Hamilton的Khaled先生是谁? 12 答: William Je. 13 SHROFF女士: 抗议。 14 法庭: 驳回。你可以继续。 15 问: 谁管理了Hamilton? 16 答: William Je. 17 MURRAY女士: 我们可以继续,洛夫图斯女士。 18 (录音继续) 19 MURRAY女士: 洛夫图斯女士,请暂停,并跳到12:06。在下一页的一半处。 20 (录音播放) 21 MURRAY女士: 洛夫图斯女士,请在那里暂停。 南区记录员有限公司(212)805-0300
    2054
    O6B1GUO2 卡勒德 - 直问
    问:卡勒德先生,您在提到监狱时是什么意思?
    答:我的意思是我可能会被送进监狱。
    问:在与这笔资金转移有关时,您为什么会担心自己可能会被送进监狱?
    答:因为存在洗钱、欺诈等风险,我的名字是唯一出现在Crane上的,一切都是通过我进行的转账请求和电汇。
    默里女士:洛夫特斯女士,请我们看政府展示408和408-T。我们会播放整个片段。我们可以从第2页开始。
    问:卡勒德先生,在您面前的转录文件夹中看着这个通话的参与者,408 是谁?
    答:请给我一秒钟。这里有迈尔森和我自己。
    默里女士:好的。我们可以播放这段视频,洛夫特斯女士。
    (播放录音)
    默里女士:洛夫特斯女士,请暂停。
    问:卡勒德先生,为了澄清一下,当您提到50时,这是指多少金额?
    答:5000万美元。
    默里女士:好的。让我们继续。
    (录音继续)
    南区记录员有限公司(212)805-0300
    2055
    O6B1GUO2 卡勒德 - 直问
    问:卡勒德先生,在我们到目前为止听到和看到的对话中,G 俱乐部有没有考虑使用这笔资金?
    斜申女士:反对。
    法官:驳回。
    答:用于投资。
    问:在我们听到的通话中,是否讨论过将 G 俱乐部的资金用于为会员提供服务?
    答:没有。
    默里女士:洛夫特斯女士,请我们看政府展示409和409-T。
    问:卡勒德先生,这通话仍然是2021年5月6日的。这是什么时间?
    答:下午1:14。
    问:参与者是谁?
    答:迈尔斯·郭,我和威廉·杰。
    默里女士:洛夫特斯女士,请我们从开头开始播放。
    默里女士:洛夫特斯女士,请直接跳到4:36,稍微往下走一点。
    默里女士:
    南区记录员有限公司(212)805-0300
    2056
    O6B1GUO2 卡勒德 - 直问
    问:卡勒德先生,提到了格拉迪斯。你知道格拉迪斯是谁吗?
    答:格拉迪斯是迈尔斯·郭的助理。
    默里女士:洛夫特斯女士,请直接跳到6:24。
    法官:那是第几页?
    默里女士:同一页,法官。只是把有关卡勒德先生宠物的一段空白对话删掉。
    (播放录音)
    默里女士:
    问:卡勒德先生,你有看到关于联盟委员会的提及吗?
    答:是的。
    问:你知道那是什么吗?
    答:不知道。
    默里女士:好的。让我们继续。
    (录音继续)
    默里女士:我们可以暂停,洛夫特斯女士。
    问:卡勒德先生,这里讨论的资金作为与大卫公司可能的投资,当这些资金进入Crane的账户时,你对这些资金的来源有什么理解?
    答:这些资金的来源是个人、会员,也是投资者。
    南区记录员有限公司(212)805-0300
    2057
    O6B1GUO2 卡勒德 - 直问
    问:属于什么会员?
    斜申女士:反对。已问过并回答。
    答:G 俱乐部的会员。
    法官:驳回。
    答:G 俱乐部的会员。
    问:投资什么?
    答:投资BVI的私人发行以及H Dollar。
    默里女士:好的。
    继续。
    (录音继续)
    默里女士:我们可以暂停一下,洛夫特斯女士。
    问:哈立德先生,在这里讨论的作为与大卫公司潜在投资的资金,当这些资金进入Crane公司账户时,您对这些资金来源的理解是什么?
    答:这些资金的来源是,这些都是个人,成员;同时也是投资者。
    南区报告员,电话:(212) 805-0300
    2057
    O6B1GUO2 哈立德 - 直接询问
    问:成员来自哪里?
    沙罗夫女士:反对。已经问过并且回答过了。
    答:G俱乐部的成员。
    法官:驳回。
    答:G俱乐部的成员。
    问:投资什么?
    答:投资BVI的私人募资以及H Dollar。
    默里女士:好的。洛夫特斯女士,请打开政府展品411和411-T。
    问:哈立德先生,再次看日期,同一天,2021年5月6日。这通电话是什么时候?
    答:下午4:53。
    问:参与者是谁?
    答:Ana Izquierdo、Mileson Guo、Miles Guo、我自己、第三人——另一个人。
    默里女士:洛夫特斯女士,请从5:30开始,应该是转录第5页的底部,进入第6页。
    (播放录音)
    默里女士:洛夫特斯女士,如果你可以暂停。
    问:哈立德先生,Ana Izquierdo是如何描述那句关于5600万的评论的?开头是“它是”。
    答:“它只是。”“它只是。”
    默里女士:好的。洛夫特斯女士,我们可以继续。
    南区报告员,电话:(212) 805-0300
    O6B1GUO2 哈立德 - 直接询问
    (录音继续)
    默里女士:洛夫特斯女士,如果你可以暂停。
    问:哈立德先生,在Miles Guo所说的翻译部分中,你看到有提到瑞士银行账户吗?
    答:是的。
    问:Crane是否在瑞士有任何银行账户?
    答:没有。
    问:您是否知道有关G俱乐部的瑞士银行账户,要求您从Crane转账到那里的?
    答:没有。
    默里女士:好的。我们可以继续。
    (录音继续)
    默里女士:可以暂停。
    问:哈立德先生,你刚刚说的那个评论的开始,“所以,Crane为G俱乐部有132”,首先,132是什么意思?
    答:1.32亿。
    问:通过“Crane为G俱乐部”,你指的是什么?
    答:为G俱乐部持有。
    问:那么在你的评论中,Crane账户中的资金金额中,Crane为G俱乐部持有多少?
    答:是的,1.32亿。
    默里女士:好的。我们可以继续。
    (录音继续)
    南区报告员,电话:(212) 805-0300
    2059
    O6B1GUO2 哈立德 - 直接询问
    默里女士:请暂停。
    问:哈立德先生,你看到“人买卡”的提及吗?
    答:是的。
    问:这是指什么?
    答:会员卡。
    问:会员卡为什么?
    答:G俱乐部。
    默里女士:好的,让我们继续。
    (录音继续)
    默里女士:请暂停。
    可以前进,请移动至17:02的地方。这是转录的第13页底部。
    然后我们可以从17:02开始播放。
    (播放录音)
    默里女士:抱歉,洛夫特斯女士。在转录第13页。如果我们可以回到那个17:02的地方。
    (重新播放录音)
    默里女士:请暂停。
    由默里女士提问:
    问:哈立德先生,关于Miles Guo对中共的提及,你认为他是在说他为什么想要将这笔资金转移到海外?
    答:“因为中共将会试图阻止在美国的资金。”
    问:会员卡是用来做什么的?
    答:G俱乐部。
    默里女士:好的,让我们继续。
    (录音继续播放)
    默里女士:您可以停一下。
    请继续往前移动,到17:02的时间点。那在笔录第13页的底部。
    然后我们可以从17:02开始播放。
    (录音播放)
    默里女士:抱歉,洛夫图斯女士。这是笔录的第13页。如果我们可以回到那个17:02的时间点。
    (录音重新播放)
    默里女士:您可以停一下。
    由默里女士提问:
    问:哈里德先生,郭文贵提到中共时,您理解他为什么希望将这笔资金转移到海外?
    答:因为中共将试图阻止这笔资金在美国的流通。
    问:在2021年5月的这次通话时,您是否相信这一点?
    答:不。
    默里女士:洛夫图斯女士,请带我们看政府展示412和412-T。
    问:再次问,哈里德先生,这通话是在什么时间进行的?
    答:下午5:25。
    问:参与者是谁?
    答:郭文贵,安娜·伊兹基埃多,迈尔森·郭,亚伦·米切尔,我自己和维克多·塞尔达。
    问:在2021年5月时,安娜·伊兹基埃多是为哪家实体工作的?
    答:G俱乐部波多黎各。
    问:亚伦·米切尔为哪家实体工作?
    答:没有具体说明,但在联排别墅里,是为这个家庭工作的。
    问:抱歉,您能否——
    答:是为这个家庭工作。
    问:是为哪个家庭工作?
    答:郭家。
    问:在当时,您为哪家实体工作?
    答:Saraca,我的合同。
    问:维克多·塞尔达为哪家实体工作?
    答:没有特定的。
    默里女士:好的。洛夫图斯女士,请移动到2:22的时间点。那在笔录第3页的底部。
    (录音播放)
    默里女士:在那里暂停,洛夫图斯女士。
    问:哈里德先生,在此时,您对郭文贵提及的这些退款的目的了解有多少?
    答:这是指——您能——您能再问一遍问题吗?
    问:当然。
    默里女士:实际上,洛夫图斯女士,请回到政府展示411和411-T。这是之前的通话。如果我们从笔录第20页的26:21开始。
    (录音播放)
    默里女士:如果我们滚动到“好吧”开始的部分。郭文贵的评论。
    由默里女士提问:
    问:哈里德先生,在通话中的这部分,是否有与会员要求退款有关的内容?
    答:我不——我不知道您在哪里。
    问:在您屏幕上显示的这个段落中,有提到退款。您看到了吗?
    答:是。“持有卡片权力的战友们。”
    问:在这句话的上方几行,提到“我们将所有卡片退还”。您看到了吗?
    答:看到了。
    问:关于这些要求退款的卡片退还,是否有涉及到会员是谁提出退款要求?
    答:没有。
    问:任何实体提出要回购所有G俱乐部卡片吗?
    答:联盟委员会。
    默里女士:好的,我们可以继续,洛夫图斯女士。
    你看见了吗?
    A. 看见了。“持有权力牌的战友们。”
    Q. 再往上几行,那里写着,“我们将退还所有的牌。”你看见了吗?
    南区记录员公司,电话(212) 805-0300
    O6B1GUO2 哈立德 - 直接询问
    1 A. 看见了。
    2 Q. 关于这里讨论的退还或退款事宜,是否有提到请求退款的会员?
    3 A. 没有。
    4 Q. 在退还后打算买回所有 G 俱乐部卡的实体,如果有的话,是哪个机构?
    5 A. 联盟委员会。
    穆雷女士:好的。我们可以继续,洛夫特斯女士。
    (录音继续)
    穆雷女士:停下来,洛夫特斯女士。
    Q. 哈立德先生,在涉及可能关闭 G 俱乐部的谈话中——
    夏洛夫女士:对引导性问题提出异议,法官。
    目前没有问题。
    穆雷女士:没问题,法官。
    Q. 哈立德先生,在那段关于潜在关闭 G 俱乐部的谈话中,是否讨论了为 G 俱乐部会员提供的服务?
    A. 没有。
    Q. 在那个谈话中,是否讨论了关闭波多黎各 G 俱乐部可能对会员福利的潜在影响?
    A. 没有。
    穆雷女士:好的。洛夫特斯女士,我们可以转到412
    南区记录员公司
    电话(212) 805-0300
    O6B1GUO2 哈立德 - 直接询问
    1 再次,请转到412,然后412-T。我们将从录音中的12:09处开始,那是转录本第10页的顶部。
    2 实际上,首先,请放大顶部部分,以便我们回想参与这次通话的人员是谁。
    3 谢谢。现在我们可以去转录本的第10页。
    4 12:09 处。谢谢。
    (播放录音)
    穆雷女士:好的。我们可以停一下,洛夫特斯女士。如果可以继续到14:49 处。我想那就是我们目前的位置。我们在这里继续。
    (播放录音)
    穆雷女士:这里可以暂停,洛夫特斯女士。
    穆雷女士提问:
    Q. 哈立德先生,您为何建议开设银行账户的人通知银行有关预期转账活动,是否有特定原因?
    A. 因为这就是摩根斯坦利的情况。资金进来,然后出去,当时任何开设那个账户的人,整个谈话之中都在谈如何将资金转到最终目的地,即汉密尔顿,所以他们只是把钱从一个账户转到另一个账户,然后可能在那里停留一周再出去。所以我只是告诉当时的任何人,那时是 Ana 和 Aaron 正在开设 BVI 。我之后停止与那些银行或任何银行的沟通。所以我只是想提醒一下。
    Q. 回到我们刚才听到的通话的早期部分,您对 Mileson 说起 G 俱乐部的定居者时,理解了他在谈论什么?
    A. 在控制和实际上是其最终受益者。
    Q. 在那次谈话中,Mileson 是否确定了 G 俱乐部的法定最终受益所有者?对吗?
    穆雷女士:请向上滚动,洛夫特斯女士。
    A. 是的,在文件上看是最终受益人所有者是何先生。
    穆雷女士:如果可以继续,洛夫特斯女士。
    法官,这段录音还有大约一分钟,然后如果可以的话,我们可以休息。
    法官:好的,继续吧。
    穆雷女士:谢谢。
    (播放录音)
    穆雷女士:在那里暂停,洛夫特斯女士。
    穆雷女士提问:
    6 A. 控制并且实际上是最终受益人。
    7 Q. 在那次谈话中,Mileson确定了G俱乐部的法律最终受益所有者,是吗?
    8 MS. MURRAY: 请向上滚动,Loftus女士。
    10 A. 是的,在文件上是最终受益所有者,是赫先生。
    12 法庭:好的,请继续。
    14 法庭:好的,继续吧。
    16 (播放音频)
    18 MS. MURRAY: 在那里暂停,Loftus女士。
    20 Q. Khaled先生,回到之前的问题,你和Mileson是如何描述那些即将被开立的账户的预期用途或目的的?
    22 A. 作为一个通道。
    24 法庭:好的,现在我们可以休息一下,如果有必要的话,尊敬的法官。
    26 法庭:好的,那么。
    2065
    陪审团成员们,现在是11:30,所以我们将有半小时的休息时间。请记住,你们不允许在彼此之间讨论案件。不要让任何人在你们面前讨论案件。不要听取、阅读或观看任何与此审判案件有关的任何来源的信息。
    (陪审团不在场)
    法庭:先生,你可以离开。不要讨论你的证词。
    (证人不在场)
    法庭:在我们中午恢复之前还有什么事吗?
    MS. MURRAY: 政府方面没有。
    MS. SHROFF: 尊敬的法官,实际上我有一件事要提出。有人问证人关于Mileson和他如何描述账户用途的问题。在证人回答之前,我之前强调了,在第13页上,两个词“通道”。如果政府没有说停下来,如果法庭没有回应,我会提出异议。我看不到法庭了,但是我要提出异议,尊敬的法官。在证人回答之前,突出回应,甚至指导证人政府希望其专注的地方,这是非常不恰当的。如果政府
    南区记录员办公室(212)805-0300
    1 想要重新提问,那没问题。如果政府
    2 想要大声说页码,那没问题。但是突出某事而且在记录中没有反映是
    3 我的异议。谢谢。
    5 法庭:这是不是无意的?
    6 MS. MURRAY: 是的,尊敬的法官,这是无意的,
    7 并且已经理解了。我们很乐意重新提问,不
    8 突出。我很乐意指引Khaled先生到已经介绍到
    9 证据中的通话部分,并要求他引述那一部分并解释
    10 “通道”指的是什么。
    11 MS. SHROFF: 那将是我们第十次询问同一个问题。我只想要求政府
    12 不要再这样做了。
    14 法庭:尊敬的法官,我们对此有不同意见,
    15 但——
    16 法庭:我不同意。我记不得之前问过这个问
    17 题。
    18 那我们中午回来。
    19 所有律师:谢谢,尊敬的法官。
    20 (午餐休息)
    下午会议
    12:00 p.m.
    (陪审团不在场)
    MS. SHROFF: 尊敬的法官,我只想记录一件事。
    法庭:说吧。
    MS. SHROFF: 我在休息期间意识到Ms. Murray显然不可能进行突出显示,所以我道歉。我认为她不是故意的,所以我只是想说明一下。我意识到这种突出显示不可能是从我们这边来的,所以抱歉。
    法庭:让我们叫陪审团进来。
    法庭助理:陪审团进入。
    (接下页继续)
    (陪审团在座)
    法庭:请坐。请记住,先生,你仍然在宣誓之下。你可以继续你的问询。
    MS.
    上午12点
    所有律师:谢谢,法官大人。
    (午餐休息)
    下午场次
    12:00 下午
    (陪审团不在场)
    莎洛夫女士:法官大人,我可以在记录上加上一件事吗。
    法官:请讲。
    莎洛夫女士:我意识到在休息期间,穆雷女士显然不可能会做这件事,所以我道歉。我觉得她不是故意的,我只是想提一下。我意识到荧光笔不可能是从我们这边弄来的,对此我很抱歉。
    法官:让我们把陪审员召回。
    法庭助理:陪审团进入。
    (接下一页继续)
    (陪审员在座)
    法官:请就坐。记住,先生,你仍然受誓言束缚。你可以继续你的询问。
    穆雷女士:谢谢,法官大人。
    由穆雷女士提问:
    问:洛夫特斯女士,请展示政府展品412-T。我们会继续上次停下的地方,也就是第13页。
    哈立德先生,什么是“过户”?
    答:那是一个资金立即进出的实体或账户。除此之外没有其他活动。
    问:账户作为过户的原因,如果有的话是什么?
    莎洛夫女士:我要提出异议。
    法官:如果你知道,你可以回答。
    答:只是为了防止两个当事方涉及到交易。
    问:哈立德先生,你提到了--或者说,洛夫特斯女士,请我们翻到这份记录的第12页,并关注屏幕上显示的内容,哈立德先生。请阅读一下这通话部分迈尔森说了什么。
    答:但是我并没有积极地,嗯,但我是终极受益所有人,但终极受益所有人是赫先生。我只是委托人。根据荷兰法律,我有一些发言权,但我没有实践它。
    问:哈立德先生,你说赫先生是什么时候,你指的是什么?
    对话记录
    参与者 对话内容 马克 我们需要建立一个私募股权结构来为Crane进行资金调拨。 莉莲 是的,这样可以帮助我们更有效地管理公司的资金。 詹姆斯 我同意,私募股权结构可以为我们提供更多投资和运营的灵活性。 马克 我们可以从哪些‘筒子’里轮调资金到这个私募结构中? 莉莲 我们可以考虑从子公司和其他关联实体中调拨资金到私募结构中。 詹姆斯 但是在进行资金调拨时,一定要符合相关的法律法规。 马克 明白了,我们需要确保一切都是合法合规的。 对话记录
    参与者 对话 A 他只是在法律文件上作为UBO,但并没有积极管理或处理员工或产品。 Q 您记录了在2021年4月至5月期间关于G/Clubs基金的这些对话中有没有包括He先生? A 不,没有。 Q Loftus女士,请查看政府413-A和413A-T展品。 A 这次通话的日期是什么? Q 2021年5月12日。 A 时间是? Q 上午7:58。 A 参与者是谁? A Mileson Guo 和我自己。 Q Loftus女士,请播放政府413A展品。 (播放录音)   Q Loftus女士,请暂停。 A BVI是什么意思? A 英属维尔京群岛。 Q 你关于Crane BVI提出了什么建议? A 我们建议为Crane创建一个类似的私募股权结构,然后将资金从Crane转移到该实体,然后将资金在媒体公司创建时再转回去。当时该实体尚未创建,所以他们正在努力创建。 南区记录员,专业有限公司(212)805-0300
    2070
    1 家公司,资金将被转移至那里。
    2 问:如果有必要的话,为什么要把Crane在美国的账户中的资金转移到Crane名下的BVI账户中?
    答:为了满足他们的要求,移出资金——Miles Guo和Mileson给出的原因是,资金需要离开美国。通过创建一个BVI实体,资金将不在美国公司内部。
    4 问:您认为Miles Guo和Mileson想要将资金移出美国的真正原因是什么?
    MS. SHROFF:反对。
    法官:维持反对。
    问:Khaled先生,在我们听取有关中共的电话录音时,您是否记得那段话?
    答:是的。
    问:在2021年5月的这些对话中,您是否理解Miles Guo指示您将资金移出美国的原因?
    MS. SHROFF:反对。
    法官:你可以回答。
    答:是的,当时是要在H Dollar上进行投资。
    问:那时,您是否理解要求将资金移出美国的原因?
    MS. SHROFF:同样的反对。
    法官:你可以回答。
    答:为了在H Dollar上投资。
    南区记录员,专业有限公司(212)805-0300
    问:Loftus女士,我们继续。
    (播放媒体)
    问:Khaled先生,关于Crane账户中的资金转移的讨论发生在什么时候?
    答:那是需要紧急进行的,时间至关重要。
    问:您与谁讨论了这些转账的紧急性?
    答:所有人,Miles Guo,Mileson,来自长岛的David,Yvette。
    问:Khaled先生,在我们听取的电话录音中提到了Mercantile,什么是Mercantile?
    答:Mercantile也是一家银行,是在波多黎各获得许可的国际金融机构,作为一家银行,他们是Medici在那里开设账户的银行。
    问:Medici在Mercantile有什么类型的账户?
    答:是一个对应银行账户。
    问:Loftus女士,我们可以看一下政府413A-T证据的顶部。
    Khaled先生,这通话的日期是什么?
    答:2021年5月12日。
    问:Loftus女士,我们可以把这个放下,展示作为政府GC-502证据的部分。如果可以往下滚动,然后聚焦在正文部分。
    Khaled先生,这是什么类型的文件?
    答:这是一封电子邮件。
    2072
    电子邮件通讯详细信息, 以下是表格标题: 电子邮件通讯记录, 以下是列标题:
    问题:在电子邮件通讯中提出的问题
    答案:在电子邮件通讯中提供的回答
    邮件通信详情, 包含以下表格标题: 邮件通信记录, 包含以下列:
    问题:在邮件通信期间提出的问题
    回答:在邮件通信期间提供的回答
    1 从谁到谁? 2 A. Alex Hadjicharalambous发给G/Club。 3 Q. 那他发送这封电子邮件给谁? 4 A. Elizabeth Berstler在摩根士丹利。 5 Q. 这封电子邮件的日期是多少? 6 A. 2021年5月11日。 7 Q. 从电子邮件正文看,你能读出所引用的电汇金额是多少吗? 8 A. 1500万。 9 Q. 账户名称是什么? 10 A. Deltec银行和信托有限公司。 11 Q. 在与Deltec相关的地址的地理位置是什么? 12 A. 巴哈马。 13 Q. 然后看下去,能读出参考备忘录上写的是什么吗? 14 A. 100179601 Hamilton数字资产基金SP。 15 Q. 再往下两行是内部参考? 16 A. 贷款。 17 Q. 洛夫特斯女士,请继续往上一级。再往上一级。 18 关注顶部的电子邮件,哈立德先生,这封电子邮件是哪天发送的? 19 A. 2021年5月13日。 20 Q. 从谁到谁? 21 A. Alex Hadjicharalambous发给G/Club。 南区记录员有限公司(212)805-0300
    2073
    A. 从亚历克斯·哈基查拉伯斯发给莉玛丽·雷耶斯·安娜·伊兹基尔多和我。
    Q. 这封电子邮件附件的标题是什么?
    A. 摩根士丹利银行 051321 1500万美元。
    Q. 最后看一下这封电子邮件的主体部分,第二句话是什么?
    A. 授权的第一笔1500万美元将于2021年5月13日今天发送出去。
    Q. 谢谢,洛夫图斯女士。我们记录完毕。
    哈利德先生,在您昨天和今天的证词中,我们有听取您在2021年4月和5月制作的所有录音吗?
    A. 是的。
    Q. 我们在法庭上听取了您制作的每一段录音的全部内容吗?
    沙夫女士:反对。
    法官:抗辩驳回。你可以继续。
    A. 不是。
    沙夫女士:反对。
    A. 那是——
    法官:你可以回答。
    A. 部分录音。
    Q. 如果您记得,在那段时间内您大约制作了多少录音?
    南区记录员有限公司(212)805-0300
    2074
    对话记录
    问题 回答 关于录音、笔录和仲裁程序之间的对话记录 无 序号 问题 答案 1 A. 我没有确切的数额。   2 Q. 您是否记录了您在2021年4月和5月与这些个人的每一次对话?   3 A. 不是每一次对话。有些对话没有记录。   4 Q. 您是否将您手中关于这些对话的每段录音都提供给了政府?   5 A. 是的。   6 Q. 在您作证时,是谁选择了要听哪些录音?   7 A. 政府、你。   8 Q. 在您作证时,是谁选择了要听不同录音片段?   9 A. 你。   10 Q. 谁准备了您记录并提供给政府的对话文本?   11 A. 你们。   12 Q. Khaled先生,请您注意一下2021年7月。G/Club对Crane采取对抗性程序的时间到了吗?   13 A. 是的。   14 Q. 那些是什么类型的程序?   15 A. 仲裁。   16 Q. 仲裁的主题是什么?   17 A. 仍在Crane手中的资金。   南区记录员有限公司(212)805-0300
    2075
    问:什么钱? 答:这些转账是从11月开始的,一部分尚未转入G/Club。 问:在仲裁中争议的款项大致是多少? 答:我记得大约是5000万。 法院:在你问下一个问题之前,你是如何录音的? 证人:通过我手机上的一个应用程序。 法院:请继续。 问:你录音是接受任何人的指示吗? 答:没有。 问:回到2021年的仲裁程序,是哪一方提起了诉讼? 答:G/Club Operations Puerto Rico。 问:对什么实体或实体提起了诉讼? 答:Crane Advisory Group, LLC。 问:那场仲裁的结果是什么? 答:有立即禁令,并将款项转移给G/Club的律师。 问:你能解释一下你所说的立即禁令是什么意思吗? 答:所以款项被冻结了。 问:而禁令是对谁或对什么实体发出的? 答:Crane Advisory Group。 问:在禁令颁布后,是否发生了什么事情?
    转账与Crane账户向Aaron Mitchell律所转账相关的对话摘要,包括涉及的各方、程序和结果的细节。
    对话内容 问题 回答 转账相关对话 在对话中提出的问题 在对话中提供的回答 资金转移相关对话摘要
    问题 回答 1. 你对Crane账户中的资金做了什么? A. 转出。 2. A. 转出了。 Q. 你将其转移到了哪里? 4. A. 我将其转给了Aaron Mitchell律师事务所。 Q. 为什么要将其转给那家特定的律师事务所? 6. A. 因为G/Club没有其他账户开启。 Q. 如果有的话,谁提供了你用于接收这些资金的Aaron Mitchell账户的账户信息? 9. A. 是通过律师完成的。 Q. Crane是否参与过与G/Clubs的其他对抗程序? 12. A. 是的。 Q. 是何种类型的程序? 14. A. 这是类似第二次仲裁,是要拿回费用,以及—Crane收到的费用。 Q. 在这第二次仲裁中,谁是仲裁方? 16. A. G/Club Operation, LLC和Crane Advisory Group。 Q. 谁提起了这个仲裁? 18. A. G/Club。 Q. 在这第二次仲裁过程中,是否有任何法庭程序或法律程序? 22. A. 它被驳回了。 Q. 在被驳回之前,是否有任何与仲裁小组相关的官方程序? 2077
    本院经审理认为,被告因过错致人死亡,构成过失致人死亡罪。依照《中华人民共和国刑法》第一百三十三条,判决如下:
    被告犯过失致人死亡罪,判处有期徒刑七年,并处罚金人民币五万元。
    宣判日期: 2077年3月15日
    审判长: (签名)
    审判员: (签名)
    书记员: (签名)
    法庭听证会记录
    问题 回答 法庭听证会记录
    序号 问题 回答 1 A. 是的,进行了全面听证。 无 2 Q. 在那次听证中,谁作为G/Club的代表出庭作证了? 无 3 A. Ana、Limarie和一名法务会计师。 无 4 Q. 您是否参与了那次听证? 无 5 A. 是的。 无 6 Q. 您是否听到Ana Izquierdo向小组作证的内容? 无 7 A. 是的。 无 8 Q. 您是否听到Limarie向小组作证的内容? 无 9 A. 是的。 无 10 SHROFF女士:法官阁下,我们可以接近一下吗? 无 11 法官:好的。 无 12 (接下页续) 无 南区记录员公司(212)805-0300
    (在边栏)
    SHROFF女士:法官,我只是想向法庭提出关于Khaled先生参与情况的问题。我假设政府知道他主张第五修正案,所以我不确定他们所谓的“参与”是指什么。但无论政府是否打算询问他关于阿娜或利玛丽在仲裁过程中是否说谎的看法,我都请求法庭不要允许这些问题。就他是否相信她们说的是否属实而言,这些问题是不恰当的。
    法官:我想了解第二次仲裁发生了什么。
    SHROFF女士:第二次仲裁是为了返还费用。进行了一次全面的听证会,有三个人作证。律师作证,阿娜·伊兹基埃尔多作证。Khaled先生的3500材料表明,他被要求发表意见,说她说谎,他多次暗示她说谎。利玛丽·雷耶斯也作证,并且我认为他们试图引出他的意见,即她在仲裁中说谎。
    法官:关于什么事情他们说谎了?
    KAMARAJU先生:我想他们会说,根据莫林纳莱斯女士的3500证词,他们会认为是关于王女士在G/Club的角色。
    法官:他们对王女士有何说法?
    KAMARAJU先生:莫林纳莱斯女士证词实质上是说王女士与G/Club有联系,并承认有一定程度的控制权。我相信政府会详细说明。因此,在莫林纳莱斯女士的3500材料中,他们似乎暗示这是王女士角色的误传。我认为根据规则608(b),对于在提取外部证据时为了抹黑其他证人的可信度,你不可以询问某个特定不诚实情节的证据。
    法官:是的。请继续。
    MURRAY女士:法官,关于Khaled先生对阿娜·伊兹基埃尔多和利玛丽·雷耶斯在仲裁过程中提供的虚假证词的观点,不仅仅限于王女士的角色。他的看法是在那时刻,G/Club的资金转移后,至少在阿娜·伊兹基埃尔多离开G/Clubs后,他不相信她们在讲述G/Club提供的服务,关于他们声称提供给会员的会员福利等方面时是真实的。
    从他与她们的对话中得出的印象,包括我们已经听过的这些通话内容,他认为她们很清楚地知道没有这样的福利和服务。此外,他会作证说,他相信她们两人谎称在仲裁小组面前说Crane是完全独立公司;它与G/Clubs没有任何联系。他们试图代表它是一家真正的独立顾问公司,尽管他们清楚地知道它与G/Club公司密切相关。
    法官:你如何让他来抨击那些在仲裁中作证的证人?
    MURRAY女士:这不是针对那些特定个人的抨击。只是在 Rico 企业背景下引入由 Guo 的代理人在企业内不同实体中所做的陈述。
    法官:继续。
    KAMARAJU先生:首先,我认为他对另一个人的陈述是真实还是虚假,尤其是对于不是郭先生的人的陈述是无关紧要的。我认为这与您之前做出的裁决是一致的。但是,这恰恰就是规则608所谈论的内容。这是询问关于其他不诚实行为的具体例子,这些例子不包括刑事定罪,所以我不明白这究竟怎么样会违反608(b)。
    法官:他们的理论是伊兹基埃尔多女士和另一个人,都是郭先生的代理人。
    KAMARAJU先生:是的,但我认为他们必须证明这一点。我认为他们还没有。我们还没有听到Ms.【此处原文似乎有遗漏】。
    法庭:请讲。
    KAMARAJU先生:首先,我认为他对另一个人的陈述真实性或虚假性的信仰,特别是那些不是郭先生的人的陈述,是无关的。我认为这与法官之前所作的裁决是一致的。但是,第二,这正是第608条所讨论的内容。这是在调查其他不当行为的具体实例,这些不当行为超出了刑事定罪,所以我不明白为什么这与608(b)无关。
    法庭:他们的理论是伊兹基耶多女士和另一个人都是郭的代理人。
    KAMARAJU先生:对,我仍然认为他们必须证实这一点。我认为他们还没有证实。除了莫利纳里斯女士是G/Club的总CEO外,我们没有听到莫利纳里斯女士的角色的任何证词。他们还没有将这两件事联系在一起。但无论如何,代理论克服了传闻问题。这并不改变608(b)的问题。坦率地说,他们将传唤莫利纳里斯女士。莫利纳里斯女士可以就他们认为她所做的任何虚假陈述作证。我不明白这位证人对这些陈述的真实性或虚假性的信仰与任何问题有关。
    SHROFF女士:这只是以迂回的方式支持雷斯女士的证词。雷斯女士将作证。他们试图反转伊兹基耶多女士,但她没有反转,所以她被排除在外。
    MURRAY女士:我们拒绝这种描述。所涉及的仲裁,第二仲裁涉及诈骗所得的释放。克瑞恩持有的诈骗所得,目的是将这些诈骗所得释放给G/Clubs,以便将它们返还到里科企业。一旦哈立德先生与里科企业脱离关系,这两个人就向仲裁小组撒谎。
    法庭:你有针对我展示的法律依据吗?
    MURRAY女士:关于具体证词?
    法庭:这个证词的可证明性。
    FINKEL先生:法官,我认为这与任何其他共犯陈述一样。这非常符合这一点。他的观点基于他当时的个人观察。他并没有对他们的具体证词的信誉进行挑战。我认为这才是608(b)着重考虑的内容。我的看法可能是错误的。我不确定。
    法庭:为什么这不是挑战?
    FINKEL先生:这和雅丽作证的方式是一样的,她表示她收到郭的刑事律师张永兵的声明是虚假的,因为她有可以反驳那份声明的经历。哈立德先生的情况也类似。他有可以反驳所陈述内容的经历。我认为对陪审团特别重要的是要了解,尤其是考虑到交叉审讯的方向,仲裁裁决为何出现了这种结局——G/Clubs在推动里科企业的过程中歪曲了事实。G/Clubs明确是里科企业的一部分。
    我认为,法官,哈立德先生当然可以——我认为对此不会有反对意见——披露他所观察到的利马里和伊兹基耶多女士为了G/Clubs试图获取资金而做出的陈述。这些明显是代理人的陈述。那么问题就变成了他是否可以,他对这些陈述的真实性或虚假性的看法或理解。任何共犯都可以这样做,因为他参与了阴谋,这是标准701标准。
    KAMARAJU先生:抱歉,不。
    FINKEL先生:是的,这与本次审判的进行方式一致。
    法庭:我不知道答案是什么,我会让我的助手查看这个问题。我们需要转到另一个主题。
    伊斯基埃尔多是G/俱乐部为获取资金所做出的进一步努力。这些显然是代理人的声明。那么问题就变成了,他是否可以,他的观点或理解是否认为这些声明是真实的还是虚假的。任何共谋者都可以这样做,因为他在共谋中有经验,这是标准701标准。
    KAMARAJU先生:抱歉,不行。
    FINKEL先生:可以,这符合目前审判进行的方式。
    法官:我不知道答案是什么,我会让我的助手们看看这个问题。我们需要转到另一个话题。
    FINKEL先生:我只是想确保一切都澄清了。我认为政府可以询问 - 我不想触犯法官刚刚说的话 - 他对伊斯基埃尔多和雷耶斯女士的声明作出的观察。
    法官:我现在想跳过整个话题。
    MURRAY女士:这是这位证人直接询问的尾声。我想问一下,如果我们研究了这个问题并且出现了疑问,我们是否可以在追问环节进行质询。
    法官:当然,绝对可以。即使我没有答案,你们也可以重新传唤他。好的。
    法庭:你可以继续。
    由MURRAY女士:
    问:哈利德先生,关于第二次仲裁,你提到进行了听证会,你有作证吗?
    答:是的,我有。
    问:在听证会上有人问你问题吗?
    答:有。
    问:你如何回答这些问题?
    答:我行使第五修正案权利。
    问:对不起,我没有听清楚?
    答:我行使第五修正案权利。
    问:是或否,Ana Izquierdo在那次听证会上作证了吗?
    答:是。
    问:Limarie Reyes在那次听证会上作证了吗?
    答:是。
    问:关于第二次仲裁,涉及的费用有什么结果?
    答:被驳回。
    问:那次仲裁的钱款有什么进展吗?
    答:可以详细说明吗?
    问:第二次仲裁之后,这笔钱发生了什么?
    答:我认为它留在我购买的资产中,但后来通过不起诉协议被没收。
    问:这就是我们之前讨论的270万吗?
    答:是。
    问:关于第一次仲裁,指挥Crane转账到Aaron Mitchell的银行账户的总金额约为多少?
    答:我相信大约5000万。
    问:这笔钱从Crane转账到Aaron Mitchell的律师事务所账户后发生了什么?
    答:不知道。
    MURRAY女士:法官,我可以稍等一下吗。没有进一步问题。
    法官:交叉审问。
    交叉审问
    SHROFF女士:
    问:哈利德先生,你在2014年10月14日开始在花旗银行工作,对吗?
    答:我记不清确切的日期,但是是2014年10月,对。
    问:我听力有困难,所以我真的很感激 -
    答:我不知道确切的日期,但是是2014年10月。
    问:你在直接审问中作证你在花旗银行工作了大约四年,对吗?
    答:是。
    问:你在2020年10月30日停止在那里工作,对吗?
    答:是。
    问:你在2020年7月6日收到了Golden Spring的工作邀约,对吗?
    答:不是,是Saraca。
    哈立德,你是在2014年10月14日进入花旗银行工作的,是吗?
    A. 我不记得确切的日期,但是是在2014年10月,对。
    问:那么由于我听力有问题,我会非常感激 -
    A. 我不知道确切的日期,但是是在2014年10月。
    问:你在直接证词中提到你在花旗银行工作了大约四年,对吗?
    答:是的。
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    2086
    O6BBGUO3 哈立德 - 交叉
    问:你在2020年10月30日停止在那里工作,对吗?
    答:是的。
    问:你在2020年7月6日收到了金泉公司的工作邀约,对吗?
    答:不是,是萨拉卡。
    问:你收到了萨拉卡的工作邀约;这是你的证言吗?
    答:是的。
    问:那也是在2020年7月6日,对吗?
    答:我想是的。
    问:你需要一些东西来帮助你恢复记忆吗?
    默里女士:反对,法官。他没有表示自己记不得。
    法官:维持。
    问:你记得是哪个日期吗?
    答:我不记得确切的日期。
    问:你不记得确切的日期。
    法官:他说他不记得日期,所以,是的,你可以试着帮助他恢复记忆。
    施罗夫女士:谢谢,法官。
    问:那么如果我把它放大一点,能帮助你恢复记忆吗?
    答:可以。
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    问:你在2020年7月6日收到了工作邀约,对吗?
    答:是的。
    问:根据 - 你知道吗,你回忆起了你的入职日期吗?
    答:这里写着待定。
    问:对。我的问题是,你记得自己的入职日期吗?
    答:8月1日。
    问:你向花旗银行通知你将在2020年10月19日离职,那是正确的吗?
    答:十月,我不记得确切的日期。
    问:你在花旗银行的最后一天是什么时候?你记得那天吗?
    答:不,我不记得确切的日期,只记得是十月。我不知道。
    问:你记得是在2020年10月30日吗?
    答:不,十月初,也许是10月1日。
    问:坐在这里,你的证词是你不记得是在10月1日还是10月30日?
    默里女士:反对,法官。已问过并作答。
    法官:维持。
    问:当你开始在花旗银行工作时,你经历了一个入职程序,对吗?
    答:是的。
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    2088
    问:入职程序的一部分包括花旗银行对你进行培训,对吗?
    答:是的。
    问:他们在内部培训了你在你担任花旗银行员工期间可能遇到的问题,对吗?
    答:是的。
    问:他们训练你如何为花旗银行开设银行账户,对吗?
    答:是的。
    问:他们给了你培训手册,对吗?
    答:是的。
    问:他们给了你一套规则,并要求你阅读这些规则,对吗?
    答:是的。
    问:他们要求你阅读这些规则,然后要求你确认你已经阅读了这些规则,对吗?
    答:是的。
    问:他们要求你签署文件确认你已经阅读并了解这些规则,对吗?
    答:是的。
    问:你这样做了,对吗,先生?
    答:我这样做了。
    问:花旗银行给了你一份阅读的行为准则,对吗?
    答:是的。
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    2089
    O6BBGUO3 哈立德 - 交叉
    问:你阅读了那份行为准则,对吗?
    答:是的。
    问:他们要求你确认那份行为准则,对吗?
    答:正确。
    问:你同意遵守花旗银行的行为准则,对吗?
    答:正确。
    A. 是的。 Q. 他们要求您阅读公司规定,然后要求您确认您已经阅读了公司规定,对吗? A. 是的。 Q. 他们要求您确认签署文件,证明您已经阅读并了解了规定,对吗? A. 是的。 Q. 您确实这样做了,是吗,先生? A. 是的。 Q. 您被花旗银行要求阅读一份行为准则,对吗? A. 是的。
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    2089
    O6BBGUO3 哈立德 - 盘问
    Q. 您阅读了那份行为准则,对吗?
    A. 是的。
    Q. 您被要求确认那份行为准则,对吗?
    A. 对。
    Q. 您同意遵守花旗银行的行为准则,对吗?
    A. 对。
    Q. 您同意并确认遵守花旗银行对其雇员制定的所有规定,对吗?
    A. 是的。
    Q. 花旗银行还给您一份员工手册的副本,是吗?
    A. 是的。
    Q. 那份员工手册明确规定,在您担任花旗银行员工期间,您不得接受外部工作,这正确吗?
    A. 我记不得确切的术语。
    Q. 大致上是否如我所说,即在您领取花旗银行薪水的同时,您不能为别人工作?
    A. 需要得到适当的事先批准。
    Q. 我没有问您那个问题。
    我的问题是,您是否知道花旗银行不允许您在受雇于花旗银行期间为其他人工作?
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    2090
    O6BBGUO3 哈立德 - 盘问
    1 A. 是的。
    2 Q. 您知道如果在受雇于花旗银行期间为其他实体工作,可能会产生利益冲突的情况,对吗?
    3 A. 对。
    4 Q. 您可能会危害银行,对吗?
    5 A. 你能解释一下吗。
    6 Q. 如果你与银行的客户做生意,可能会危害银行的保险政策,对吗?
    7 A. 我不清楚。
    8 Q. 您在秘密地为其他实体工作时,可能会危害您同时为花旗银行工作的那个实体的福祉,对吗?
    9 A. 我也不清楚。
    10 Q. 花旗银行有一个合规部门,对吗?
    11 A. 有的。
    12 Q. 这可能会对他们提出合规问题,对吗?
    13 A. 可能。
    14 Q. 在您接受Saraca的工作并开始工作后,您仍然继续为花旗银行工作时,您知道这一切,对吗?
    15 A. 我知道我不能得到那份工作,不行。
    16 Q. 但是您还是这样做了,对吗?
    17 A. 是的。
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    2091
    O6BBGUO3 哈立德 - 盘问
    Q. 现在,我让您看一下被标记为辩护展示60524的文件。先生,您是否认出这份文件,如果您需要帮助翻页,请随时告诉我们。
    默默: 法官先生,我想要指出这份文件尚未呈现给陪审团。文件中包含一些未打马赛克的个人身份信息。因此,在呈现给陪审团或观众之前,请先打马赛克。
    默默: 我并不打算公开任何包含个人信息的页面。
    法院: 好的。
    Q. 先生,您认出那份文件吗?
    A. 是的。
    Q. 您能告诉我们这是什么文件吗?
    A. 城市就业申请表。
    Q. 这是谁的城市就业申请表?
    A. 我的。
    默默: 尊敬的法官,恳请现在接纳DX-60524作为证据。
    默默: 法官先生,我之前提出的反对意见依然有效。
    法院: 她刚才说她目前并不打算公开。.
    默默: 我不打算公开包含任何此类信息的任何页面。如果我可以前往
    南区记录员公司(212) 805-0300
    2092
    O6BBGUO3 哈立德 - 盘问
    1 本展品的第12页。
    默默: 简短地,法官先生。我们明白它将被接纳。
    A. 是的。
    Q. 你能告诉我们这是什么吗?
    A. 城市就业申请。
    Q. 这是谁的城市就业申请?
    A. 我的。
    SHROFF女士:阁下,我恳请呈上DX-60524作为证据。
    MURRAY女士:法官阁下,我刚刚提出的异议仍然有效。
    法官:她刚刚说她现在不寻求公开它。
    SHROFF女士:我不寻求公开任何可能揭示此类信息的页面。我是否可以继续到……
    南区记录员公司(212)805-0300
    2092
    O6BBGUO3 卡莱德 - 盘问
    证据的12页。
    MURRAY女士:简要提一下,法官大人。我们明白它会被接纳。我们只是要求进入证据的版本有所删除,以便在证据中的版本被删除。
    SHROFF女士:当然。没问题。我是否可以查看文件的第12页,并附近方便证人阅读。
    法官大人,我假设法庭已经批准我提交证据。
    法官:已接纳。
    (被告展示的证据DX-60524已收到)
    SHROFF女士提问:
    问:请您读A部分。您看到标题是监管信息,对吗?
    答:是的。
    问:您回答了每一个问题,对吗,从A到G,对吗?
    答:是的。
    问:现在,请您看一下第一个问题。您看到问题中有关任何国内或外国法院的问题吗?
    答:是的。
    问:在这个问题下面有子问题,对吧?
    答:我有什么?
    南区记录员公司(212)805-0300
    2093
    问:在那个问题下面有次级问题,对吗?
    答:是的。
    问:如果您看F,您看到F吗?
    答:是的。
    问:问题是,您曾经或有人曾经 -- 在任何与金融服务相关的活动中,有人曾经为您发出禁令,或者下达命令,或者采取任何行动,对吗?
    答:对。
    问:您回答是否定的,对吗?
    答:是的。
    问:可以这样说,先生,那个时候或之前您拥有一家名为Auto Box的公司,对吗?
    答:是的。
    问:事实上,您曾经拖欠一笔与Auto Box相关的商业贷款,对吗?
    答:对。
    问:Auto Box曾经起诉过您,对吗?
    答:没有。
    问:对不起。客户曾经起诉过您,对吗?
    答:没有。
    问:2013年11月21日客户曾经起诉过您吗?
    答:我不记得。
    南区记录员公司(212)805-0300
    2094
    O6BBGUO3 卡莱德 - 盘问
    问:借款人是否曾经起诉过您?
    答:是的。
    问:加利福尼亚的一家法院曾经对您做出判决,对吗?
    答:对。
    问:判决是在2014年4月22日作出的,对吗?
    答:不知道确切的日期。
    问:您在这份提交给花旗银行的申请表上没有说明这一点,对吗?
    答:对。
    现在,让我们转到第10段,请看到那段?
    答:看到了。
    问:那是承认部分,对吗?
    答:是的。
    问:在承认部分有一些数字。您看到其中有一段提到就业和行为准则的内容吗?
    答:可以放大到那里吗。
    问:当然。我们会尝试为您突出显示。就在“我理解”上面,对吗?
    答:嗯。
    问:花旗银行告诉您它将做的所有事情,对吗?
    答:是的。
    南区记录员公司
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    2095
    问:然后它要求您向花旗银行陈述某些事情,对吗? 第一件事情是,您向花旗银行承诺某些事情,因为您必须承认 -- 我不知道承认是什么 -- 您有法律上的自由与花旗银行建立就业关系,对吗? 那句话对您意味着什么,先生? 不知道这个法律术语的含义。 我听不清您说的。
    你看见那段写着“就业和行为准则”的地方吗?
    A. 你可以放大到那里吗?
    Q. 当然。我们可以尝试为您突出显示那一部分。就在上面,我了解,对吧?
    A. 嗯。
    Q. 花旗银行在告诉你它将会做的所有事情,是吗?
    A. 是的。
    南区记录员有限公司
    (212)805-0300
    2095
    Q. 然后请你代表某些要求花旗银行,对吧? 首先一个要求是你代表花旗银行的,是因为你必须承认它 - 我不知道所谓承认的是什么 - 你是合法自由地与花旗城建立就业关系,对吧? 先生,对你来说,“承认”是什么意思? 不知道是法律术语。 我听不清你说话。 我不知道所谓的法律术语,“合法自由”。 你告诉我。你承认了。 那你了解他让你做什么或者是什么吗? 让我能成为花旗银行的员工。 你说什么? 我有机会成为花旗银行的员工。 但你代表承认,对吧?它写着我代表承认。 好的。 所以你告诉城市,你有自由成为他们的员工,对吧? 对。 第二条告诉你什么?告诉你没有义务对其他的人或实体造成影响或者与你在花旗银行就业有冲突,对吧?
    A. 是的。
    Q. 如果我跳到接下来的 “我进一步代表”。
    4 请你为陪审团读一遍那段,好吗?
    5 A. 我进一步代表,如果我被雇佣,我将向花旗银行披露任何当前或未来的外部业务利益,目的是确定是否符合监管标准和花旗银行政策。
    6 Q. 继续。
    7 A. 我了解根据这些标准和/或政策,某些隶属关系或活动可能是不允许的。你要我继续吗?
    8 Q. 不用了。你没有遵守这两项义务,对吧?
    9 A. 没有。
    10 Q. 你可以停下来。
    11 先生,有一段时间,你辞职了离开花旗银行,对吧?
    12 A. 是的。
    13 Q. 当你辞职离开花旗银行时,花旗银行暂停了你的就业,进行了调查,对吧?
    14 A. 我不清楚。
    15 Q. 你在对庭审的证言中说过 - 我收回。我现在转到另一个话题。 接下来我要和你谈王女士。您在庭审中对她作了很长时间的证词,对吧?
    2 A. 是的。
    3 Q. 您说您是通过一家律师事务所认识王女士的,是这样吗?
    4 A. 是的。
    5 Q. 是哪家律师事务所?
    6 A. Rutkin Ross, LLC。
    7 Q. 在那家律师事务所是谁介绍您认识王女士的?
    8 A. 瓦莱丽·史蒂文斯,哈钦森和罗斯。就是这样。
    9 Q. 您说的情况是,您与王女士讨论为Golden Spring开立银行账户,是这样的吗,先生?
    10 A. 是的。
    11 Q. 当您询问王女士关于Golden Spring时,她告诉您这是一个家族基金,对吗?
    12 A. 家族办公室。
    13 Q. 她告诉您Golden Spring是一个家族办公室?
    14 A. 是的。
    15 Q. 她告诉您这个办公室包括什么,对吗?
    16 A. 你能详细解释一下吗?
    17 Q. 她告诉过您Golden Spring是什么,对吗?
    18 A. 是的。
    19 Q. 她描述了公司的情况吗,对吗?
    20 A. 她描述了,是的。
    21 你们之间有一场对话,来回沟通
    对话记录
    问题 回答 Citibank 员工:你好,请问您是来咨询银行业务的吗? 潜在客户:是的,我想了解一下贷款申请的流程。 Citibank 员工:好的,我们可以帮助您填写贷款申请表格。您需要准备一些个人资料。 潜在客户:好的,我会提供所需的文件。 Citibank 员工:您要借多少钱?还款方式是一次性还清还是分期付款? 潜在客户:我想借款 10 万,考虑分期付款。 Citibank 员工:明白了,我们会进行信用评估,然后与您确认贷款金额和利率。 潜在客户:好的,谢谢您的帮助。 Citibank 员工:不客气,如果您有任何疑问,随时与我们联系。 潜在客户:好的,谢谢再见。 Citibank 员工:再见。祝您一天愉快! - 对话转录
    问题 答案 Q. 那时您是花旗银行的员工,是吗? A. 是的。 Q. 您想要与她建立融洽关系,对吗? A. 并非想要建立融洽关系。 Q. 您并不想要与潜在顾客建立融洽关系? A. 我向她询问了关于公司业务的信息。这是开立账户的一部分。 Q. 那次是友好的对话,对吗?您想要与顾客建立融洽关系,对吗? MS. MURRAY: 异议,法官阁下,问题已经回答过了。 法官:持续。 Q. 您想要培养业务关系,是吗? A. 是的。 Q. 王女士回答了您的问题,对吗? A. 她回答了。 Q. 在任何时候,她没有告诉您某个问题不应该回答,对吗? A. 不,我不认为是的。 Q. 在您进行了最初的交谈后,您继续与王女士交谈,是吗? A. 您能更具体一点吗? 南区记录员有限公司(212)805-0300
    2099
    问:当然。你有跟她提出后续问题的打算,对吗? 答:你能更具体一点吗? 问:不行。 法官:你们之间有关于工作的讨论吗? 证人:关于账户,是的。 问:她给了你她的电话号码,对吗? 答:是的。 问:她给了你她的座机和手机,对吗? 答:我不认为她有座机。 问:她给了你一个电子邮件地址吗? 答:是的。 问:她有一个 Proton 的电子邮件地址。你还记得吗? 答:记得。 问:花旗银行没有规定禁止人们拥有 Proton 的电子邮件地址,对吗? 答:我觉得不会。 问:你用 iPhone 与王女士通讯,对吗? 答:可能是。 问:你用短信向她提问?她通过短信回复你,对吗? 答:可能,是的。 问:你向王女士要资料了,对吗? 答:是的。
    问:你需要信息来开设账户,对吗?
    2100
    O6BBGUO3 Khaled - 交叉审问
    对于王女士提供的文件请求和信息,以下是提问者和回答者之间的对话记录:
    提问 回答 请问王女士提供的文件是否包含最新的财务报表? 是的,王女士提供的文件包含了最新的财务报表。 王女士是否提供了关于公司业务合作伙伴的名单? 是的,王女士提供了与公司业务合作伙伴的名单。 请问王女士是否提供了关于公司在华销售业绩的数据? 是的,王女士提供了公司在华销售业绩的数据。 王女士是否提供了关于公司员工的培训记录? 是的,王女士提供了公司员工的培训记录。 对话记录
    问题 回答 她给您寄送了文件。您复印了这些文件并将其发送给后勤办公室,是这样吗? 正确。 您要求王女士提供文件,是吗? 正确。 您要求王女士提供信息,是吗? 正确。 您要求的其中一个信息是一个EIN号码,对吗? 账户开设的一部分是EIN号码。我不确定我是否直接向她提出要求,或者她是提供了带有这个信息的文件。 您能告诉陪审团EIN号码是什么吗? 雇员识别号码。 您是否要求她提供Golden Spring的公司章程? 是的。 她向您提供了这些文件,是吗? 是的。 您要求她提供一份运营协议,对吗? 正确。 她向您提供了那份文件,对吗? 是的。 南区记录人员有限公司(212)805-0300
    2101
    问:你要求她提供身份证明,对吗?
    答:对。
    问:她向你提供了身份证明,对吗?
    答:是的。
    问:花旗银行有一个会计部门,对吗?
    答:一个什么?
    问:会计部门。
    答:我想是的。
    问:还有一个合规部门,对吗?
    答:对。
    问:你把所有这些信息都发送给了相关部门,对吗?
    答:是的。
    问:等待相关部门验证后再发送回给你,是吗?
    答:你能更具体一点吗?
    问:你必须等到相关部门批准申请才能继续,对吗?
    答:我不确定是否有像那样需要获得批准的政策。
    问:那么,在收到所有信息后,你批准了申请,对吗?
    答:那不是一个明确的批准过程。
    问:那么,如果没有批准,银行账户怎么会开通呢?
    答:我们开通并通过合规部门检验文件。
    南区记录人员有限公司(212)805-0300
    2102
    问:你获得了完全的批准,对吧?
    答:是的。
    问:在获得完全批准后,账户完全开通了,对吗?
    答:对。
    问:王女士告诉你会有初始存款,正确吗?
    答:是的。
    问:实际上,她告诉你存款将是一百万,但结果是大约60万美元,对吗?
    答:我不知道确切的数额。
    问:这不是你和穆雷女士一起查看的文件之一吗,你们见了19次?
    答:我不记得了。
    问:当你为王女士或金泰春开设账户时,你确保符合花旗银行的政策,对吗?
    答:是的。
    问:你为她开设了一个以上的账户,对吗?
    答:正确。
    问:这绝对不是花旗银行政策的义务,对吗?
    答:什么?
    问:这与花旗银行的政策不矛盾,对吗?
    答:不。
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    2103
    问:事实上,花旗银行鼓励你开设多个账户,对吧?
    答:正确。
    问:金泰春每个账户至少有两个签字人,对吗?
    答:我记不清确切的签字人数。
    问:你记得王女士是其中一个签字人吗?
    答:记得。
    问:你记得梅利莎·门德斯是签字人吗?
    答:记得。
    问:坐在这里,你知道梅丽莎在金泰春的工作是什么吗?
    答:她是一名会计,也是办公室经理。
    问:坐在这里,你知道她仍然在金泰春工作吗?
    答:不知道。
    问:作为花旗银行的银行家,你能看到并了解账户的情况,对吗?
    答:我按照他们提供给我的信息。
    问:你可以查看银行账户的交易情况,对吗?
    答:好的,是的,正确。
    问:因为你在花旗银行工作,所以你看到金泰春账户收到了款项。
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    2104
    06BBGUO3 卡里德 - 交叉质询
    1来自金泰春香港的款项,对吗?
    2答:可能是。
    3穆雷女士:反对,传闻。
    4法官:如果你有直接的知识,你可以回答这个问题。
    5答:我不记得所有进账交易。
    6沙洛夫女士:那让我给你看DX-10339,这份文件只是给证人,请。根据花旗银行的协议。法官,基于协议的约定,我请求DX-10339作为证据提交。
    7法官:没有反对意见吗?
    8穆雷女士:没有反对,法官。谢谢。我们只是确认一下。
    9法官:证据被接受。
    10(被告的展示DX-10339作为证据)
    11沙洛夫女士:我可以向陪审团展示吗?
    12法官:可以。
    13问:告诉我们,卡里德先生,这是什么文件?
    MURRAY:反对,传闻。
    法官:如果您拥有直接的知识,您可以回答这个问题。
    A:我记不得所有的交易了。
    SHROFF女士:好的,让我给您看DX-10339,请这只是给证人。这是根据花旗银行的协议。阁下,根据协议,我要求DX-10339作为证据提交。
    法官:没有异议?
    MURRAY女士:没有异议,法官阁下。谢谢。我们只是确认。
    法官:它被接受。
    (被告证据DX-10339收到)
    SHROFF女士:如果我可以向陪审团展示。
    法官:可以。
    问:Khaled先生,这是什么文件?
    答:这是一份银行对账单。
    问:是哪家银行的?
    答:花旗银行。
    问:是哪个账户的?
    答:Golden Spring New York LTD的账户。
    问:时间跨度是多久?
    答:3月30日至4月25日。
    请转到PDF的第三页,请看一下那三笔交易。
    答:好的。
    问:这些钱是进账的吗?
    答:是的。
    问:来自谁?
    答:ACA Capital Group Limited。
    问:日期是?
    答:5月2日。
    问:每笔存款的金额是多少?
    答:10万。
    问:那么加在一起,总共是300,000对吗?
    答:正确。
    问:让我们看看PDF文件的第51页,如果您能看一下2019年2月12日的转账。
    先生,您能告诉我们那是哪笔交易吗?
    答:那是支出交易。
    问:什么是支出交易?
    答:钱要流出。
    问:从哪个账户流出的钱?
    答:Golden Spring。
    问:这笔钱去了哪里?
    答:Rule of Law Foundation。
    问:那Rule of Law Foundation是什么,先生?
    问:不,先生。我在问你。
    答:那时我不知道。
    问:在那个时候。
    答:在2019年2月12日,我不知道。
    问:你不知道?
    答:在2019年2月12日,我不知道。
    问:那之后,作为一个了解更多的人,您了解了Rule of Law Foundation吗,Khaled先生?
    答:这是另一份银行对账单。
    问:我不是在问你银行对账单,先生。我只是在问你Rule of Law Foundation是什么。
    答:好的。您的问题是什么?
    问:我的问题是,您对Rule of Law Foundation有什么理解?
    答:这是一个非营利基金会。
    问:谢谢。如果我可以转到第52页。如果我能请您关注一下,2月15日那天,如果可以的话,您能向陪审团解释一下那笔交易吗?
    答:那是一个ACH支出交易。
    问:什么是ACH支出交易?
    答:这是一个ACH,钱要流出。
    问:在那下面写了什么?
    答:ADP工资支付。
    问:作为一名银行家,这会告诉您什么?
    答:工资单。
    问:这会告诉你这家银行的帐户正在发放工资吗;这是正确的吗?
    答:正确。
    问:您看到了来自IMMA的50万美元存款吗?
    答:是的。
    问:IMMA是什么,先生?
    答:一个货币市场账户。
    问:货币市场账户向Golden Spring存入了50万美元;我读得对吗?
    答:您能重复问题吗?
    问:当然。我会简化问题。请告诉我这显示了什么?
    答:它写着从IMMA转账,存入转账。
    问:所以这是进账的钱?
    答:正确。
    问:50万美元?
    答:是的。
    A. ADP工资支付。
    Q:那么作为银行家,Pat会告诉你什么?
    A:工资单。
    Q:那会告诉你Pat的银行账户正在支付工资;Pat是正确的吗?
    A:正确。
    Q:你是否看到一个来自IMMA标注为$500,000的存款?
    A:是的。
    Q:那么IMMA是什么,先生?
    A:是一个货币市场账户。
    Q:而这个货币市场账户向Golden Spring转入了$500,000;Pat是对的。我理解Pat的说法是正确的吗?
    A:你可以重复一下问题吗?
    Q:当然。我会简化一下。你告诉我这展示了什么?
    A:显示了从IMMA进行的转账,从IMMA收到的信用转账。
    Q:所以这是资金的进账?
    A:正确。
    Q:$500,000?
    A:是的。
    Q:现在,让我们看看122页,一笔1月31日的交易,$24,236.41。有人正在收到支付吗?
    A:是的。
    南区记录员公司(212)805-0300 —- 2108
    O6BBGUO3 Khaled - 交叉审问
    1 Q. ADP工资支付,正确吗?
    2 A. 正确。
    3 Q. 第123页,有一笔$10,000的支付,对吗?
    4 A. 正确。
    5 Q. 付款是给一家律师事务所的,对吗?
    6 MS. MURRAY: 拒绝回答,法官。
    7 Q. 那笔付款去了哪里?
    8 MS. MURRAY: 根据法院先前的裁决提出异议。
    9 法官:请你过来。
    (接下页继续)
    南区记录员公司(212)805-0300 —- 2109
    O6BBGUO3 Khaled - 交叉审问
    (在边栏)
    法官:在我的裁决中,我说你不能提及律师。
    MS. SHROFF: 这是2018年。这里没有律师建议的辩护。我会继续,但这不是我理解的情况。我只是想展示资金的进出。我很乐意继续,但我们对这家律师事务所没有依赖。
    MS. MURRAY: 法官,几点。第一,这份文件的表面并没有表明Wachtel Missry是一家律师事务所。Shroff女士作证并将其放在陪审团面前。其次,法官是正确的。我们认为这与之前的裁决完全一致,在那里我们在两三天前澄清了一个类似的问题,辩护方公开了律师事务所的存在,导致我们未能提出适当的论据。我还要指出,2018年在指控的阴谋中。
    MS. SHROFF: 对。但在2018年没有律师建议问题,第一。第二,这是基本的刑事法律。律师提出的问题不构成证据。唯一的证据是回答。而回答是,他不知道。所以我的问题没有作用,因为它不是证据。
    法官:你在注意律师的关系。 —- 2110
    O6BBGUO3 Khaled - 交叉审问
    MS. SHROFF:不,我只是展示从账户中支付的账单,包括给律师的。这不是在注意律师。这只是支付账单。
    法官:这正是你在做的。你想说些什么,Kamaraju先生?
    MR. KAMARAJU:我相信将会有另一位名叫Daniel Podhaskie的证人在某个时候作证。根据他的3500材料和以前的SEC证词,他作证说,Golden Springs支付的很多账单用于支付诉讼费用,这些诉讼导致了对政府的抗议。我只是想理解这两件事情如何互相关联,如果我们不被允许,在将Podhaskie先生带到证人席并出示银行记录时,说,你是在为所有这些诉讼支付费用,但 -
    法官:如果他在证人席上是一回事,但你挑出了从一个账户支付的账单,特别是引起注意的一些账单,其中之一是这家律师事务所。
    MR. KAMARAJU:我理解法官的裁决。我只是想确保做好未来的准备,我不希望再次出现这个问题。
    根据他的3500材料和之前在证券交易委员会作证的情况,他作证说,Golden Springs的很多账单主要用于支付诉讼费用,这些诉讼导致了对政府突出问题的抗议。我只是想弄清楚这两件事情是如何互相关联的,如果我们不允许,在调查官拿着银行记录让Podhaskie先生作证说,你是在处理所有这些诉讼方面支付费用,但是--
    法官:如果他在证人席上是一回事,但你挑选出了从一个特定账户支付的账单,其中之一是这家律所。
    卡马拉朱先生:我理解法官的裁决。我只是想确保未来不会再次出现这个问题。
    法官:我很高兴。好了,我们结束了。
    (接下页继续)
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    O6BBGUO3 Khaled - 交叉审讯
    (在法庭上)
    法官:你可以继续。
    由Shroff女士提问:
    问:这是在花旗银行维护的账户,对吗?
    答:您能重复那个问题吗?
    问:我给你看的文件是在花旗银行维护的账户,对吗?
    答:是的。
    问:截至2020年,Golden Springs的账户已经开立,对吗,到2020年1月?
    答:是的。
    问:你已经不再负责开立银行账户了,对吧?你已经调到花旗银行内的另一个部门了,这样说是公平的吗?
    答:正确。
    问:你转到了医疗部门,对吧?
    答:是的。
    问:那也正是大流行病的开始,对吧?
    答:我想是的,是的。
    问:花旗银行在大流行病期间有远程办公政策吗?
    答:有的。
    问:政策是什么?
    答:在家工作。
    南区记录员公司(212)805-0300
    2112
    O6BBGUO3 卡利德 - 交叉审讯
    问:你在直接审讯中被问及这些问题,但在2020年你又再次听到Wang女士的声音了,对吗?
    答:不,不是在一月。
    问:好的。在2020年的哪个月?
    答:我想是五月。
    问:在2020年五月。她是怎么联系你的?
    答:WhatsApp或短信。我不确定。
    问:你不确定?
    答:短信。
    问:她发短信问你什么?
    答:她需要我的帮助开立一个银行账户。
    问:她想要开一个银行账户,对吗?
    答:是的。
    问:你回复她的短信并回答了她的问题吗?
    答:我肯定回复了,是的。
    问:你记得告诉她你已经调到医疗领域了,无法为她开立账户,对吧?
    答:是的。
    问:那么你是继续和她谈论她想开立什么样的账户了吗?
    答:可能会的,是的。
    打扰一下。
    2113
    O6BBGUO3 卡利德 - 交叉审讯
    答:可能会的,是的,继续。
    问:你并没有第一时间告诉她,我已经在医疗领域了,对吧?
    你继续和她讨论她想开立什么样的账户了,对吧?
    答:是的。
    问:对。你问她要开立什么账户,账户是用来做什么的,对吧?
    答:对。
    问:你问她公司的名称,对吧?
    答:可能会的,是的。
    问:打扰一下。
    答:可能会的,是的。
    问:她告诉你公司的名称,对吧?
    答:是的。
    问:她告诉你是一家媒体公司,对吧?
    答:对。
    问:她告诉你公司的名称,对吧?
    答:是的。
    问:她告诉你是GTV,对吧?
    答:是的。
    这段时间你知道你不能为她开立账户,但你还在继续和她交谈,对吧?
    答:对。
    问:你查找了这家媒体公司,对吧?
    2114
    对话内容,包含有关Citi银行商业账户和推荐的信息
    问题/回答 对话内容 顾客:您好,请问我可以在Citi银行开设一个商业账户吗? 服务员:是的,我们可以帮助您办理商业账户。 顾客:我有朋友想要开设商业账户,我可以向他们推荐Citi银行吗? 服务员:当然可以,您可以填写推荐表格并告诉您朋友我们的服务。 顾客:这样做有什么好处吗? 服务员:如果您成功推荐朋友开设商业账户,您和您的朋友都将获得奖励。 这是关于在Citi银行开设商业账户和推荐奖励的对话内容。
    对花旗银行业务账户和推荐事宜进行的交谈记录
    对话记录 A. 是的。 Q. 你访问了那个网站查看情况,对吗? A. 是的。 Q. 你知道你不能开设账户,但还是去调查了这家公司,对吗? A. 是的。 Q. 好的。你知道那个公司与另一家银行有一个更大的账户,对吗? A. 她告诉我,是的。 Q. 虽然你不再在那个部门工作,但你还继续和她谈论那个账户,对吗? A. 我已经推荐过了。 Q. 你已经进行了推荐,但你还继续和她谈话? A. 是的。 Q. 那么你是向花旗银行的其他某人推荐了这个账户,对吗? A. 是的。 Q. 所以花旗银行的另外一个人正在和王女士处理这个账户,对吗? A. 是的。 Q. 他试图与她建立自己的联系,对吗? MS. MURRAY:拒绝,荣誉法官。 法官:他怎么会知道另一个人会做什么 2115
    O6BBGUO3 哈立德 - 盘问
    1 试图做什么。
    2 问:作为花旗银行的员工,与客户建立关系不就是您接受的培训吗?
    3 答:是的,但我不知道他做了什么。
    4 默里女士:抗议,法官。
    5 法官:对于相关性。请继续。
    6 问:您从与王女士交谈中得知这是一个大账户,对吧?
    7 答:是的。
    8 问:您问过她这是多大的账户,对吧?
    9 答:不,是她告诉我的。
    10 问:她告诉您账户的规模,但前提是您仍然打算开设该账户,对吧?
    11 默里女士:抗议,法官。
    12 法官:他不可能知道她心里在想什么。
    13 问:在这段时间里,您一直在和王女士交谈,对吧?
    14 答:是的。
    15 问:您是从事医疗保健工作的吗?
    16 答:是的。
    17 问:为了开立这个账户,您让她把文件发送给您还是发送给花旗银行的另一位员工?
    18 答:是另一位员工。
    19 问:您的证词是,王女士将文件发送给了
    20 南区记录员,专责南区记录员报告,电话(212) 805-0300
    2116
    O6BBGUO3 哈立德 - 盘问
    对话记录
    问题 回答 对话记录
    问题 回答 其他人在花旗银行,对吗? 可能是复印的,但肯定是另一位与她一起工作的人。 你被抄送了,是吗,哈立德先生? 我可能被抄送了。我不记得了。 你记得那位另一位的名字吗? 詹姆斯·宋。 对。宋先生和你在同一封电子邮件链中从王女士那里获取文件,对吗? 我不记得了。 这个账户是在2020年6月3日开设的,对吗? 我不记得确切的日期,但是在六月。 你保持与宋先生联系,并询问他账户的进展情况,对吗? 是的。 你询问宋先生账户中的余额是多少,对吗? 是的。 宋先生告诉你那个账户里有2亿美元,对吗? 是的。 你想知道这个是因为你想为该账户得到信用,对吗? 是的。 O6BBGUO3 卡利德 - 交叉审问
    花旗银行评分卡和账户转介对话
    问题 回答 无 无 花旗银行评分卡与账户转介对话
    序号 问题 答复 1 A. 嗯   2 Q. 转介账户有一个30天余额,对吧? A. 是的 4 Q. 花旗银行有一个评分卡,对吧? A. 是的 6 Q. 每个员工都有一个评分卡吗? A. 我不确定 8 Q. 你有一个评分卡,对吧? A. 有 10 Q. 你想确保该账户出现在你的评分卡上,对吧? A. 是的 12 Q. 你希望它出现在你的评分卡上是因为这是一个大账户,对吧? A. 是的 14 Q. 你想确保你和王女士的关系保持良好,对吧? A. 是的 16 Q. 然后你把那个账户转介给了外部财务顾问,对吧? A. 你能具体指出吗 18 Q. Eric Mark是谁? A. Eric Mark是同一分行的一位财务顾问 南区记录员公司报告,电话:(212)805-0300
    2118
    O6BBGUO3 卡立德 - 盘问
    对话:商务情景与信任
    问题 回答 无 无 序号 问题 回答 1 工作地点。 无 2 问:你跟Mark先生和Wang女士在Golden Spring账户上有什么合作?我指的是GTV账户。 无 3 答:我请他联系James,为了一个大客户的机会。 无 4 问:你要求他联系James,而不是Wang女士;这是你的证词吗? 无 5 答:是的。 无 6 问:一旦你把他们联系起来,你不是从他那里了解到了有某种调查吗,对吗? 无 7 答:是的。 无 8 问:你知道这项调查是来自你信任的Citibank的某人,对吗? 无 9 答:是Eric Mark。 无 10 问:你信任Mark先生,对吗? 无 11 答:在什么方面? 无 12 问:他是你的同事,对吗? 无 13 答:是的。 无 14 问:你相信他给你的信息,对吗? 无 15 答:你是什么意思? 无 16 问:他给了你一个信息,说这些公司可能正在接受调查,你相信那个信息,对吗? 无 17 答:他给了我这个信息。 无 18 问:对不起,请继续。 无 南区记录员有限公司(212)805-0300
    2119
    O6BBGUO3 哈立德 - 交叉审问 A. 他给了我这个信息,但你所谓的信任是什么意思?
    Q. 你认为这个信息是正确的,对吧?
    A. 我只是获得了这个信息。
    Q. 所以有人告诉你,你正在接触的这个人正在接受调查,那些公司,你只是把这个信息作为一名银行家而没有采取任何进一步的行动吗?
    穆雷女士:反对,法官,歪曲证词。
    法官:被驳回。
    Q. 你对此采取了什么行动?
    A. 只是审阅了一下,看了看那篇文章。
    Q. 你审阅了文章?
    A. 是的。
    Q. 然后你继续和王女士打交道?
    A. 是的,那时正在调查。
    Q. 你没有向花旗银行合规部门报告,对吧?
    A. 没有。
    Q. 即使你转向了医疗行业,你还继续与王女士交谈,对吧?
    穆雷女士:已问过并已回答。
    法官:被驳回。
    Q. 哈立德先生,2020年,您自己是否确实遇到了一些财务问题?
    A. 是的。
    Q. 请大声点说。
    南区记录员有限公司(212)805-0300
    2120
    破产相关问题与回答,
    下面是表格标题: 破产证词,
    下面是列名:
    问题:与破产和财务问题相关的问题
    回答:关于破产、破产驳回和律师参与的回答
    破产相关问题与回答,
    表格标题:破产证词,
    列名:
    问题:与破产和财务问题相关的问题
    回答:关于破产、破产驳回以及律师参与的回答
    Q. 可以说您曾经遇到财务问题吗? A. 是的。 Q. 您在2018年申请了破产,是吗? A. 是的。 Q. 而且那是在纽约东区的布鲁克林,对吗? A. 不是。 Q. 那是在哪里? A. 长岛的伊斯利普。 Q. 仍然在东区的监督之下,对吗? A. 我认为是的。 Q. 那个破产,破产托管人于2018年2月16日提议要撤销了破产,对吗? A. 是的。 Q. 他们撤销了,是因为您没有继续支付与破产相关的款项,对吗? A. 那是因为文件有错,所以他们撤销了。 Q. 是您提交了错误的文件还是其他人? A. 是我的律师。 Q. 您的律师提交了错误的文件,所以破产被撤销了。这是您的证词吗? A. 我想是的。 南区记录员有限公司(212)805-0300
    Q:您是这样认为还是确定?
    A:我认为我当时申请破产是因为文件不规范,对,是因为文件不规范。
    Q:好的。法院在2018年11月21日撤销了一起破产案,对吗?
    A:对。
    Q:而您申请破产的原因也是因为您未能按约向您需要偿还债务的人支付款项,对吗?
    穆雷女士:对此前一次撤销理由进行曲解,你尊贵的法官。
    法官:维持异议。
    Q:先生,为什么您的破产案被撤销呢?
    A:因为相同的原因。
    Q:哦,您的律师再次犯错了?
    A:对,是的,就在两起案件之间的某个月份,对吧。
    Q:所以您第一次犯错是因为律师的错?现在是同一个律师还是您保留了当初犯错的那位律师?
    A:我认为我保留了他。 Q:所以您第二次犯错是您自己的责任? A:我认为是的,对。
    Q:之后第二次破产案被于2019年2月再次撤销,对吗?
    南区记录员有限公司(212)805-0300
    1 A:这一切都在同一个破产案下进行,所以并不是分开的
    2 三个。这是一个保持有效的破产案件。
    3 Q:对。它一直保持有效是因为您没有按照破产计划向您欠钱的人付款,对吗?
    4 A:不,它一直保持有效到现在。就是,一直有效。
    5 这三个是一个。您刚才提到的那三个 - -
    Q:您欠别人钱吗?
    6 A:是的。
    Q:您没有付款,是吧?
    7 A:现在我已经付了。
    Q:是什么时候付的?
    8 A:是通过破产案。
    Q:2024年?
    9 A:还剩两笔款。
    Q:好。所以您还没有付清,对吧?
    10 A:还剩两笔款。
    Q:所以还有两笔款未付,这意味着您还没有付清,对吧?帮帮我。
    11 A:是的,100%的款项还剩两笔款没付,对。
    Q:所以您还没有付清,对吧?
    穆雷女士:异议。
    法官:维持异议。
    谢罗夫女士:我还没有得到答案。
    南区记录员有限公司(212)805-0300
    1 问题。 法官:维持异议。他已经回答了这个问题。
    Q:就在今天在座的您证明破产托管人并没有在2023年12月21日试图取消这些破产案件?
    A:2023年12月,是的,最后两笔款项还没有付清。
    Q:那么在2024年3月25日,您还记得破产托管人在这样最近的日期,即2024年3月25日因未支付款项而取消了破产案吗?
    A:是的,我没有支付那最后两笔款项。
    Q:在您就职的整个时间里,至少从2018年到2020年,您都在花旗银行工作,对吗?
    A:对。
    Q:您没有告诉花旗银行您正在破产,对吗?
    A:没有。
    Q:您告诉破产托管人您拥有270万美元的判决吗? 穆雷女士:您尊贵的法官,对270万美元是什么进行了曲解。
    法官:你可以问他是否告诉了
    南区记录员有限公司(212)805-0300
    O6BBGUO3 Khaled - Cro...
    1 个破产托管人关于270万美元的债务。
    谢罗夫女士:谢谢您,尊贵的法官。
    Q:您可以回答这个问题。谢谢。
    A:没有。
    Q:您是否有义务这样做?
    A:我不知道。
    Q:您不知道?
    A:不知道。
    Q:您仍然保留着之前的律师吗?
    A:是的。
    Q:您是否向他确认过您有这些债务?
    穆雷女士:您尊贵的法官。
    谢罗夫女士:我会继续。
    穆雷女士:法官,我要提出异议,这并不准确描述那270万美元的情况。
    法官:你可以询问他是否告诉了破产托管人这270万美元的债务。
    司法区记录员,P.C.(212)805-0300
    六月份2020年,花旗银行本身对GTV和Saraca账户采取了不利行动,对吗?
    回答:是的。
    你自己在2020年也在寻求离开花旗银行,对吗?
    回答:是的。
    接下来向王女士求职机会是你自己提出来的,是吗?
    回答:不是。
    你向她询问过可能开设咨询公司的可能性,对吗?
    回答:我们讨论了这个问题,不是我提出的。
    她怎么知道你想开设咨询公司的愿望,如果你没有告诉她呢?
    穆雷女士:法官,我要提出异议。
    法官:异议成立。
    你告诉她你想开设咨询公司,对吗?
    回答:我们讨论过这个事情。
    你之前经营过自己的生意,对吗?
    回答:是的。
    那不曾成功,对吗?
    回答:正确。
    你想再试试,对吗?
    回答:是的。
    你希望有国际客户群,对吗?
    回答:是的。
    王女士及其公司给提供了这些,对吗?
    回答:是的。
    你提出了计划,她拒绝了,对吗?
    回答:不是。
    你说,我们能否成立一个国际咨询公司,她说不行,对吗?
    回答:不是。
    对不起,你说了,我们能否成立一个国际咨询公司,她说不行,对吗?
    回答:不是。
    你后来问过她,GT提是否需要像你这样的人,对吗?
    回答:我记不清了。
    你说过她,我可以帮你开设银行账户,对吗?
    回答:我记不得具体的措辞。
    你和她通过短信联系,对吗?
    回答:是的。
    你通过iPhone给她发过短信,对吗?
    回答:是的。
    你通过Signal给她发过短信,对吗?
    回答:是的。
    你在接受直接审讯时说,你认为王女士对她的员工很关心,对吗?
    回答:她表现得很关心,是的。
    你自己这么认为,至少在过去是这样,对吗?
    穆雷女士:法官,提出异议,争辩性言论。
    我会继续。
    那至少当时是你的印象,对吗?
    回答:印象是指什么?
    她是一个关心他人的人,对吗?
    回答:当时是的。
    你曾经问她是否可以为你在GT提安排一个面试机会,对吗?
    回答:不是问,是讨论,她问我。
    讨论了,但她问你,这是你的说法。
    回答:是的,这是一场讨论,来回的。
    总之,你接受了一次面试,是吗?
    回答:非常随意的,是的。
    和谁有的面试?
    回答:和Yvette。
    和王女士?
    回答:是的。
    面试在哪里进行的?
    回答:在东64街162镇房。
    在你与穆雷女士见面的19次中,你有没有称东64街大楼为别墅?
    问:好的。您当时问她是否可以帮您安排在GTV的面试,是吗?
    答:不是问的,是讨论的,她问我的。
    问:是讨论的,但她问你;这是您的证词。
    答:是的,那是——来回讨论的。
    问:好的。无论如何,您进行了面试,对吗?
    答:非常不正式,是的。
    问:非常不正式的面试,与谁进行的?
    答:与Yvette进行的。
    问:与王女士进行的?
    答:是的。
    问:先生,面试是在哪里进行的?
    答:在联排别墅,东64街162号。
    问:现在我问您这个问题。在您与默里女士见面的19次中,您有没有称东64街的建筑为联排别墅?
    答:有。
    问:真的。
    默里女士:反对,法官。
    问:在所有您与王女士谈话的时间里,她有没有提到东64街的建筑是联排别墅?
    答:我相信有,是的。
    问:您相信有?
    答:是的。
    问:好的。当您进入建筑时,您看到的大标志是什么?
    默士:请给他看一下。
    答:大标志?什么意思?在哪里?
    问:我要——让我给您看一张照片,可以吗?
    答:可以。
    默士:法官,我没有展品号码,但我将使用7001辩方展品7001。
    法官:好的。
    问:您看到了吗?
    答:是的。
    问:识别出来了吗?
    答:是的。
    问:先生,那是什么?
    答:是一个非常小的标志,叫喜马拉雅大使馆。
    问:您在哪里看到这个标志?
    答:就在这里。
    问:不,不。在现实生活中,您在哪里看到这个标志?
    答:您是什么意思?
    问:您在哪里还见过这个标志?
    答:在那栋建筑上。
    问:在那栋建筑上,对吧?
    答:是的,在门旁边。
    默士:好。请将7001提交作为证据。
    默里女士:没有异议。
    法官:准许。
    (展辩方展品7001作为证据收到)
    问:这就是他们称这座建筑的方式,对吗?
    默士:如果我能向陪审团展示。
    答:您在问我吗?
    问:对不起?
    答:您在问我吗?
    问:是的。
    答:他们称这座建筑?
    问:是的。
    答:不。
    问:那么在进入建筑时,您看到这个标志,对吧?
    答:“他们”是指谁?
    问:东64街是一座建筑,对吧?
    对话记录
    问题 回答 关于位于东64街的喜马拉雅大使馆的法律程序中的对话记录 无 对话记录,有关东64街上被称为喜马拉雅大使馆的建筑。
    问题 回答 Q. Murray女士向您展示了建筑物的照片,是吗? A. 是的。 Q. 当您与她准备时,她给您展示了那些照片19次,是吗? A. 是的。 Q. 她从未向您展示过这张照片,是吗? A. 没有,我没有看到。 Q. 对的。那座建筑,喜马拉雅大使馆,出现在那座建筑上,是吗? A. 在门旁边。 Q. 那栋建筑的门旁边。 A. 是的。 Q. 对的。东64街,对吗? A. 东64街162号。 Q. 对的。当有人想要在那里见面时,他们会说,我们在大使馆见面,对吗? 法官: 拒绝质询。 Q. 那座建筑被称为使馆而非有人称之为别墅,是吗? A. 不是。 SHROFF女士: 好的。你可以把这个记下来。   Q. 这是你进行面试的那栋建筑,东64街? 南区记录员公司(212)805-0300 抱歉,由于提供的文本过于简洁,我无法准确理解您的意图。您是否可以提供更多上下文或详细信息,以便我能够更好地帮助您完成翻译工作呢?
    法庭对话
    问题 答复 法律对话
    编号 对话 1 A. 是的。 2 Q. 王女士,伊薇特也在场,对吗? 3 A. 是的。 4 Q. 她穿得正式去参加面试了,对吗? 5 A. 她穿得很普通。 6 Q. 你穿了西装,是吧? 7 A. 是的。 8 Q. 这是一个工作面试,对吗? 9 A. 不是。就像我说的,这是一次非正式的会面。 10 Q. 这是一次你给她发过简历的非正式会面,对吗? 11 A. 她要求了,是的。 12 Q. 于是你发给了她,是吧? 13 A. 我发了。 14 Q. 在你发送之前,你更新了简历,对吗? 15 A. 是的。 16 Q. 她在面试的时候和你一起查看了你的简历,对吗? 17 A. 不记得了。 18 Q. 她问你关于你的经历的问题,对吗? 19 A. 没有。 20 Q. 没有。 21 穆雷女士:法官大人,有问题待解决吗? 22 法庭:什么问题? 2132
    O6B1GUO4 卡利德 - 盘问
    问:这次采访是在哪个月份,先生,您记得吗?
    答:我想是六月。
    问:2020年的六月,对吗?
    答:是的。
    问:疫情仍在肆虐,对吗?
    答:是的。
    问:您是去参加了面对面的采访,对吗?
    答:不好意思,这是个会议。我去参加了一个会议。
    问:您是去参加了面对面的会议,对吗?
    答:是的。
    问:然后有后续?你称之为会议,我称之为采访,但是有后续,对吗?
    答:后续是指什么?
    问:针对那个采访。
    答:从哪个角度来说?
    问:嗯,您在第一次非正式讨论中就得到了这份工作吗?
    答:是的,我收到了一份工作邀约。
    问:您当场就收到了工作邀约。
    答:不是。
    问:是还是否定?
    答:不,不是。
    问:不是。
    答:不是。
    问:好的。所以他们——你刚才说是,然后又说不是,所以我
    南区记录员报告,P.C. (212) 805-0300
    2133
    O6B1GUO4 卡利德 - 盘问
    1 要确保是哪一个。
    2 MURRAY女士:法官,我要提出异议。这样歪曲了证人的回答。
    3 法官:那么您在第一次会议中得到了工作邀约吗?
    6 证人:没有。
    7 问:好的。所以他们叫你回来了,对吗?
    8 答:没有。
    9 问:他们安排了第二次会议吗?
    10 答:是的。
    11 问:第二次会议在哪里进行?
    12 答:是在Zoom,一个Zoom或WhatsApp或——一个Zoom,一个视频通话。
    13 问:一个视频会议?
    14 答:一个视频通话,是的。
    15 问:好的。无论他们是让你亲自回来还是通过WhatsApp,他们叫你回来进行了第二次采访,对吗?
    18 MURRAY女士:法官,我要提出异议。这样歪曲——
    19 法官:维持异议。
    21 问:好的。那次Zoom会议是关于什么的?
    22 答:伊芙特想让我见见郭文贵。
    23 问:会议中还有谁?
    24 答:在通话中,只有伊芙特、郭文贵和我。
    25 问:好的。您见到了郭先生吗?
    南区记录员报告,P.C. (212) 805-0300
    2134
    O6B1GUO4 卡利德 - 盘问
    工作报盘谈判对话记录
    问题 回答 职位工作谈判对话记录
    问题 回答 A. 是的,通话时。   Q. 你能看到他的脸吗?   A. 是的。   Q. 那不是个电话,是一个视频通话,对吗?   A. 我的意思是视频通话。   Q. 所以在这个视频通话中郭先生问了你问题;是这样的吗?   A. 我记不得他是否问了问题。   Q. 根据你的说法,多少天之后你收到了一个工作OFFER?   A. 我不知道——我不记得具体的天数。   Q. 好的。你还记得与王女士谈过关于你的薪水吗?   A. 有一点,是的。   Q. 嗯,谈判来回不断,对吗?   A. 我不确定来回是否很多。我不知道具体的来回次数。   Q. 你通过短信与她交谈,对吗?   A. 是的。   Q. 你和她谈过你的薪水金额,对吗?   A. 是的。   Q. 你想要一定数额,她一开始就不给你,对吗?   A. 我想是的,是的。   南区记录员股份有限公司(212)805-0300
    2135
    问:是的。实际上,您给她发了短信,告诉她您被认为是花旗银行顶尖的银行家之一,并且她应该给您所要求的薪水;记得这件事吗?
    答:不是用这些确切的词。我不记得了。
    问:抱歉? 答:我不记得确切的词。
    问:但基本意思是这样的,对吗?
    答:什么是基本意思?你是什么意思?
    问:您告诉她您被认为是花旗银行顶尖的银行家,是这样吗?
    答:再次强调,我不记得确切的词语。
    施罗夫女士:法官,我可以吗?
    法官:可以。
    问:这有助于您回忆起来了吗,哈立德先生?
    答:有。
    问:我可以。 您向她说明为什么应该给您所要求的薪水,对吗?
    答:我不会称之为说明。
    问:好的。那你怎么称呼?
    答:我只是问如果我在他们提供给我的工作方面有安全性。
    问:好的。那我们谈谈这个。您问了她那个问题,对吗?
    答:对。
    南区记录员股份有限公司(212)805-0300
    2136
    问:她告诉您什么了?您记得吗?
    答:她说,如果你想要安全性,就留在花旗银行。
    问:确切。她告诉您如果您想要安全性,您应该留在花旗银行,对吗?
    答:是的。
    问:然后您继续与她谈判,对吗?
    答:我继续与她交谈,是的。
    问:我没听清楚。
    答:我继续与她交谈。
    问:但您不仅仅与她交谈,您也跟她讨论了薪水数额,对吗?
    答:数额被讨论了。
    问:对。您告诉她您将放弃在花旗银行的奖金,所以她应该给您7万美元作为您失去奖金的补偿,但她拒绝了,对吗?
    答:我告诉她关于奖金的事情,是的。
    问:您告诉她您想要两个月的签约奖金;您对王女士说了这件事,对吗?
    答:可能是,是的。
    问:她拒绝了,对吗?
    答:我不记得她确切的回复,但我没得到那个,没有。
    问:您没有得到那个,对吗?
    答:是的。
    问:她告诉您如果想要工作稳定,您应该留在花旗银行,对吗?
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    2137
    哈立德-交叉
    1 MS. MURRAY:反对,法官。
    2 法官:维持。问题已经提问并回答。
    3 问:她对您所有的问题都如实回答了,对吗?
    4 法官:维持。
    5 问:您认为她对那个问题如实回答了吗,留在花旗银行?
    6 答:我不知道她是否如实回答了。
    7 问:好的。尽管她的告诫,您决定接受这份工作,对吗?
    8 答:尽管什么?
    9 问:来自她的告诫,您决定接受这份工作,对吗?
    10 答:你能解释一下“告诫”是什么意思吗。
    11 问:没关系,我会继续。
    12 您告诉王女士,某个时候您将接受这份工作,对吗?
    13 答:是的。
    14 问:她把您介绍给了Grace Yong女士;是这样吗?
    15 答:正确。
    16 问:这是因为您还有更多问题,对吗?
    17 答:不是。她只是把我介绍给她。
    18 问:您问了她关于您在GTV的角色的问题,她告诉您,找Grace Yong,对吗?您记得吗?
    南区记录员股份有限公司(212)805-0300
    2138
    哈立德-交叉
    法庭证词记录
    问题 答案 询问:请问你何时收到这份工作提议? 答:我收到这份工作提议是在上个月的第一周。 询问:你对这份提议有何回应? 答:我向公司提出了一些建议性的变动。 询问:公司对你的提议有何反应? 答:公司表示他们需要时间来考虑我的提议。 询问:在你与公司的沟通中是否提到薪资待遇? 答:是的,薪资待遇是我们讨论的焦点之一。 询问:你对公司关于薪资的提议有何回应? 答:我认为他们的薪资提议并不符合我的期望。 询问:你是否愿意继续就薪资待遇进行谈判? 答:是的,我愿意就薪资待遇进行进一步的讨论。 询问:除了薪资待遇外,还有其他方面需要商讨吗? 答:是的,我希望能够就福利待遇和工作时间灵活性再进行商议。 询问:你对公司对于其他方面的提议有何看法? 答:我认为公司在其他方面的提议还有改进的空间。 询问:你是否愿意继续就其他方面的提议进行谈判? 答:是的,我愿意就其他方面的提议进行进一步讨论。 法庭证词翻译
    编号 问题 回答 1 A. 不。 无 2 Q. 好的。Yong女士在人力资源部门工作,是吗? A. 是的。 3 Q. 她回答了你的问题,对吗? A. 她给了我一个工作范围。 4 Q. 你描述你和她的谈话是一次很棒的对话,对吗? A. 我告诉她,我和她有一次很棒的谈话。 5 Q. 你接受了工作提议,对吗? A. 对。 6 Q. 你没有得到你要求的工资,对吗? A. 不。 7 Q. 你没有得到它,对吗?我只是想确保语法是正确的。你要求更多,你最后答应了35万,对吗? A. 我同意了35万,正确。 8 Q. 是的。但你要求的更多,对吗?你要求了45万,最后拿到了35万。 A. 我不记得具体数字,但肯定是超过35万的,是为了奖金,是的。 9 Q. 你接受了这份工作,对吗? A. 引用:拒绝。 10 MS. MURRAY: 异议,法官。问了答案已经好几次了。 无 11 THE COURT: 有理。 无 南区记录员,有限责任公司(212)805-0300
    06B1GUO4 哈立德 - 审讯
    夏洛夫女士:我没听清楚答案,但我很乐意继续。
    问:2020年7月7日至7月10日,王女士联系您询问您是否已经从花旗银行辞职,是吗?
    答:她可能有。我不记得了。
    问:这是否使您回想起什么了,哈立德先生?
    答:是的。
    问:她问您是否提交了辞呈,对吗?
    答:对。
    问:您说,还没有,对吗?
    答:是的。
    问:您从未对她说过,我现在不打算辞职,我打算保留花旗银行的工作,把投资结算一下,对吧?
    答:没有。
    问:事实上,您回答她说,您还需要解决一些事情,对吗?
    答:对。
    问:您在打保险,对吗?
    答:我在做什么?
    问:没关系,我接着问。
    您在东64街开始工作了,对吧,您昨天说的?
    答:是的。
    问:默里女士让您描述在那里的头几天,对吗?
    南区记录员,有限责任公司(212)805-0300
    06B1GUO4 哈立德 - 审讯
    1 正确吗?
    2 答:正确。
    3 问:您描述那几天是混乱或者奇怪的,对吗?
    4 答:我说是奇怪的,不太有条理。
    5 问:好的。让我们谈谈这个。
    6 在2020年10月30日之前的那几周在东64街工作期间,您同时在做两份工作,对吗?
    7 答:对。
    8 问:花旗银行给您提供了工作手机吗?
    9 答:我想不是的。那个时候不是。
    10 问:2020年7月,花旗银行没有给您提供工作手机,对吧?我只是想确定我理解的是否正确。
    11 答:我不记得了。
    12 问:好的。所以您在花旗银行有一个朝九晚五的工作,对吧,还有一个在东64街也是朝九晚五,对吗?
    13 答:是的,朝九晚五。但那个时候是疫情期间。
    14 问:好的。但是您仍然应该为一家工作七个小时,另一家也是七个小时,对吧?
    15 答:那不是一份按时计薪的工作。
    16 问:如果您没有为一家公司工作,您就不会领取工资,对吗?因为那样就是偷窃。
    17 答:我在工作,但同样,这不是一个每天七个小时七个小时的按时计薪工作。
    18 问:所以大约三个月的时间,您一天工作14个小时;
    南区记录员,有限责任公司 (212)805-0300
    06B1GUO4 哈立德 - 审讯
    1 这是您的证词吗?
    2 答:不是。是两个月,对。
    3 问:所以您两个月每天工作14个小时。
    4 让我这样问:如果您某一天在东64街工作,花旗银行的员工或客户给您打电话,您会如何安排优先顺序?
    5 法官:请律师们过来。
    (接下页继续)
    06B1GUO4 哈立德 - 审讯
    (在边栏处)
    法官:所以您在询问他工资的偷盗问题,他有权拒绝自证有罪,所以我需要告知他他的权利。
    夏洛夫女士:您可以告诉他。我没有异议。我是说,但他确实偷了。
    法官:嗯,这是一个州的指控层面。我不认为这涉及到豁免权的——
    默里女士:法官,我们不反对这个方向的讯问。他已经向我们披露了。在他的直接证词中已经提及。我们相信这件事应该被他的非起诉协议所覆盖,该协议涵盖了他在为郭、伊维特·王工作期间的所有行为。
    法官:但不是一个州的犯罪。
    夏洛夫女士:我认为他应该被告知,因为这是一个州的违法行为。
    夏洛夫女士:跟据利益冲突查涉及到盗取工资,他应当享有拒绝证明的权利,我建议提醒他。
    夏罗夫女士:可以,我没有异议。但是,他确实偷了。
    法官:这是一个州级指控。我不指望免责权能够覆盖到——
    默里女士:法官,我们对这个问题没有异议。他向我们坦白了。这是在他的直接证词中揭露的。我们认为这被包含在他的不起诉协议范围内,该协议覆盖了他在为郭(Guo)、王伊维特(Yvette Wang)工作的整个时间段内的任何行为。
    法官:但不包括州法案。
    夏罗夫女士:我认为他应该被告知,因为这是一项州级罪行。
    默里女士:通常,法官,就我们达成的不起诉协议或任何协议而言,州罪、时效已过的罪行等是不涵盖在内的。他在签署不起诉协议时得到了律师的建议。我们不清楚谈话的内容,但他在签署不起诉协议前曾咨询过律师,而且他向我们坦白了。
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    2143
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    再次,我们在直接讯问中揭露了这件事。
    卡马拉朱先生:我只想指出,我认为他的不起诉协议,就像每个人的不起诉协议一样,明确规定不能保护免受其他联邦部门或州当局的刑事起诉,所以我认为很明显它不包括在内,法官。
    法官:好的。那么我必须要告知他他的权利,并为他提供辩护律师。
    芬克尔先生:法官,如果我可以的话,他就当前这里的证词有律师。
    法官:但他有律师在场吗?
    芬克尔先生:我不清楚。
    默里女士:我不这么认为。
    芬克尔先生:一般而言,这种情况经常发生。当我们的办公室提供不起诉协议时,他们也会面临州罪的风险。这种情况发生得很常见,无论是家庭暴力、争吵或其他任何事情。他已决定签署不起诉协议,并理解他需要诚实地回答关于他所有行为的交叉质询和直接质询的问题,我们不认为应该发生任何这样的指示,如果发生——我们会对此提出异议,以备记录——应该在陪审团不在场的情况下进行。
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    法官:这一部分我明白了。
    芬克尔先生:坦率地讲,法官,这种情况经常发生,人们面临风险并签署不起诉协议。虽然我感谢辩护律师替证人着想,但我认为在这里并不需要,这是很标准的做法。
    费尔根森先生:如果我可以补充一点卡马拉朱先生关于协议内容的说法。就像芬克尔先生说的,几乎每个协议都涵盖了联邦罪行,但难以想象有什么联邦罪行不也是州或地方罪行,对吧?因此,协议说,我们不能正式为您提供对此的保护,但在您要求时,我们将向任何其他起诉机构提请您已与我们办公室达成不起诉协议的事实。
    卡马拉朱先生:法官,我很抱歉。我认为这整个问题已经在Kastigar中得到解决,就像,归根结底,Kastigar已经对此问题作出明确规定,即他在涉及州罪行时仍享有第五修正案权利,尽管签订了不起诉协议。所以我认为法官完全可以——坦率地说,这也很合理——在陪审团不在场的情况下告知他。但是——他们无法使他免受州罪的起诉,并显然这牵涉到——
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    MR.
    卡马拉朱先生:法官大人,很抱歉。我认为整个问题已在卡斯蒂加案中得到解决,我认为卡斯蒂加案已经对这个问题做出了明确规定,即尽管签署了不起诉协议,他在涉及州罪行方面仍然保留第五修正案权利。我认为法官完全可以——事实上,这样做很有道理——在陪审团不在场的情况下向他提供建议。但他们无法豁免他涉及州罪行,而这显然已经牵涉到——
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    费根森先生:每一个合作者——
    卡马拉朱先生:对每一个合作者来说都是如此。
    费根森先生:对每一个合作者来说,这是不可能的。
    卡马拉朱先生:但这是法律规定的。
    法官:你们面前是一位过去曾担任过州法官的人坐在这里。那么我的问题是:除了这个工资盗窃的问题,你们还打算提起其他任何州罪行吗?
    夏若夫女士:不,我想没有——实际上,等等。
    卡马拉朱先生:我认为,恐怕目前还没有,法官。如果我可以看一眼她的大纲以确保没有遗漏,但我认为答案是否定的。
    夏若夫女士:我记得还有一大堆空头支票的事,但我不认为还有其他州罪行。我想那些都是联邦的。所以我想没有。但我很乐意再次核实。
    芬克尔先生:我甚至不确定这是否属于工资盗窃,但我理解。
    卡马拉朱先生:我认为法官对此很了解,所以——
    芬克尔先生:显然,我不会——我不会参与那场比赛,所以这一点应该在记录上明确。
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    夏若夫女士:我不知道。我有点怀念在州法院的时光。我告诉你,与这相比,100 Centre Street要有趣得多。
    卡马拉朱先生:法官,您是否打算此时让陪审团退出或——
    所有律师:嗯,她要查看她的大纲。这是我理解她要做的事情。
    卡马拉朱先生:哦,我误解了你要做的事情。我会快速查看一下,以确保一切顺利。
    法官:对。
    (停顿)
    夏若夫女士:我不打算就他的酒后驾车或大麻吸食交叉盘问他,所以我想这就是了。
    法官:那我们可以休息一下。
    夏若夫女士:好的。我需要休息。
    法官:我会考虑找一个CJA人员,我们继续,你们继续下一个话题。
    芬克尔先生:他有律师,为他辩护。我们可以让他打电话给他的律师,而不是CJA。我相信他会配合。他知道他正在作证。
    默里女士:我了解他知道他在作证。只是他昨天和今天不在州内,无法到场。
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    法庭对话
    发言人 对话 辩护律师 很高兴见到您们。我将为被告提供法律代表。 被告 谢谢您的帮助,先生。 法官 我们需要安排下一次开庭日期。你们对时间有什么建议吗? 检察官 我们下周三如何? 辩护律师 对我来说那天没问题。 法官 好的,那就定在下周三。 被告 我们会在那天准时出席的。 法庭会话
    发言人 对话 法庭 他的律师是谁? MS. MURRAY 詹姆斯·帕斯卡雷拉。 MS. SHROFF 他还有埃兹拉·斯皮尔克,对吧,作为律师? MS. MURRAY 以前是。 MS. SHROFF 他在CJA小组中。也许他可以叫他们两个。我们对他叫谁没有异议。 MS. MURRAY 我认为,首先我们建议他联系帕斯卡雷拉先生,但我们很乐意这样做。 MS. SHROFF 那你们就换个话题吧。看起来他明天会回来。 MS. MURRAY 你们有多长时间? MS. SHROFF 哦,我有—— MR. KAMARAJU 我觉得可以说他明天回来。 MS. MURRAY 我们可以处理这个—— 法庭 我会在下午3点之前停止,因为我必须在3点之前完全结束,所以—— MS. SHROFF 嗯,我以为明天我们会到3点,不是今天。 法庭 抱歉。我是说在下午2点45分之前。 MR. FINKEL 那我们可以释放我们今天一直在这里等候的另一位证人? MS. SHROFF 当然。 南区记录员办公室,电话:(212) 805-0300
    2148
    O6B1GUO4 卡莱德 - 交叉审问
    卡马拉朱先生:好的。
    (在开庭审理中)
    夏罗夫女士:尊敬的法官,我可以继续吗?
    法官:可以。
    夏罗夫女士:谢谢。
    如果我可以展示标记为政府证据BR399的文件。
    夏罗夫女士询问:
    问:卡莱德先生,您记得昨天有关这份文件的证词吗?
    答:记得。
    问:默里女士询问您关于第5段的问题,对吗?
    答:对。
    问:好。第5段,您能读给我听吗,“这笔股权将。”
    答:“这笔股权将受到限制条件限制。”
    问:对。您昨天在证词中说您实际上没有得到这份合同中提供给您的股权或股份,对吗?这是您说的吗?
    答:是的。
    问:您是否满足了这份合同中的限制条件?
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    2149
    O6B1GUO4 卡莱德 - 交叉审问
    1 答:不清楚限制条件是什么。
    2 问:您在那里工作多久了?
    3 答:将近一年。
    4 问:将近一年?多少个月?
    5 答:11个月,大约如此。
    6 问:不到一年。您是在宣誓下说您不知道限制条件是什么,对吗?
    7 答:不是。
    8 问:您知道限制条件是什么吗?
    9 答:不知道。
    10 问:好。所以当您昨天告诉陪审团您没有得到任何股份时,实际上您并无权利获得任何股份,对吗?
    11 默里女士:法官,我要提出异议。
    12 法官:维持异议。
    13 问:根据第5段,您有权获得任何股份吗?
    14 默里女士:法官,我要提出异议。他说他不知道。
    15 法官:维持异议。
    16 问:您对限制条件的理解是什么?
    17 答:有权利。
    18 问:请问?
    19 答:有权利。这就是我对于限制条件的理解。
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    2150
    O6B1GUO4 卡莱德 - 交叉审问
    这是我对限制条件,即有权利的理解。
    问:对。所以在您获得股份前,您什么也得不到,对吗?
    默里女士:法官,我要提出异议。问题已经回答过。
    法官:维持异议。
    问:顺便问一下,您离开时有离职面谈吗?
    法官:离开哪里?
    问:您的雇佣关系?
    法官:在哪里?
    问:GTV处。您离职时有离职面谈吗?
    答:我没离开。
    问:您没离开?发生了什么事?
    答:他们——他们让我走。
    问:他们解雇了您?
    答:他们说公司要关闭,不是真的——不需要我。
    问:只有您被告知了,对吗?
    默里女士:法官,我要提出异议。
    法官:维持异议。
    问:格拉迪丝还在那里工作,对吗?
    答:我不知道格拉迪丝在哪里工作。
    问:杨女士还在那里工作,对吗?
    答:我不知道谁还在那里工作。
    问:亚历克斯——现在不是。我是在说您被解雇时。他们还在那里工作,对吗?
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    O6B1GUO4 卡莱德 - 交叉审问
    默里女士:法官,对表述提出异议。
    法官:维持异议。
    问:好。当您被解雇时——这是您用的词,对吗?被解雇,对吗?
    答:正确。
    问:好。杨女士仍然在HR部门工作,对吗?
    答:可能。
    问:可能?好。亚伦·米切尔还在那里工作吗?
    答:在哪里工作?
    问:东64街。
    答:在建筑里?
    问:是的。
    答:在联排别墅里?
    Q. 亚历克斯——现在不是时候。我在和你谈话时,你离开工作的那段时间。他们当时还在那里工作,对吗?
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    2151
    O6B1GUO4 卡莱德 - 盘问
    默里女士:对这种描述,我提出异议,法官。
    法官:异议成立。
    问:好的。当你被解雇时——这是你用的词语,对吧?被解雇,对吧?
    答:正确。
    问:好的。当时,Yong女士还在人力资源部门工作,对吗?
    答:可能。
    问:可能?好的。那Aaron Mitchell,他还在那里工作吗?
    答:在哪里工作呢?
    问:东64街。
    答:在大楼里?
    问:是的。
    答:在联排别墅?
    问:嗯,你是这么称呼的,但我只是问你关于东64街。
    默里女士:对此提出异议,法官。
    法官:异议成立。
    问:Aaron Mitchell还在那里工作,对吧?
    答:他仍然在为家族办公室工作。
    问:顺便问一下,丹·波达斯基是谁?
    答:丹·波达斯基?
    问:是的。
    答:我加入萨拉卡时,他是一名内部律师。
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    2152
    问:在哪个内部工作,为谁工作?
    答:他为Rule of Law工作。
    问:据你说,在东64街工作,对吧?
    答:是的。
    问:在你被解雇后,他仍然在那里工作,对吧?
    答:不。
    问:当你被解雇时,他并没有在那里工作?
    答:不。
    问:好的。亚历克斯·H又如何呢?
    答:同样,我和他失去了联系,所以我不知道他们是否继续在那里工作。
    问:好的。但是在你被解雇的那一天,亚历克斯·H还在那里,对吗?
    答:我不知道。
    现在在直接证词中,你被问及许多实体,包括列克星顿物业,对吗?
    答:是的。
    问:然后你被问及Lamp,对吗?
    答:对。
    问:你被问及Jovial,对吗?
    答:对。 您认为把这些实体都描述为家庭基金实体是公平的吗?
    问:当您作证提到家庭基金时,您是什么意思?
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    2153
    O6B1GUO4 卡莱德 - 盘问
    家庭基金?
    答:你是什么意思?你是什么意思?你是什么意思?你为什么提到家庭基金?你能——
    问:昨天在庭上,默里女士问你关于家庭基金的问题,你回答了这些问题,对吗?
    答:你的问题不清楚。
    问:你昨天在这个法庭作证了?
    答:是的。
    问:你谈到了家庭基金,对吗?
    再试一次。您谈到了家族办公室,对吗?您至少还记得那一点吗?
    答:家族办公室?
    问:是的。
    答:是的。
    问:好的。您对家族办公室的理解是什么?
    答:一个负责处理家庭开支、投资的实体。
    问:哪个家庭?
    答:就——你再问我家族办公室?在这里,是郭家。
    问:郭家,对吧?
    答:正确。
    问:那列克星顿物业是负责支付郭家开支的实体,对吗?
    答:不是。
    对于Lexington Properties和Lamp.的财务责任和缺乏对交易和财务细节的了解进行讨论, 带有以下表格标题: 财务责任和缺乏了解, 具有以下列:
    问题:无
    答案:无
    对于莱克星敦物业和Lamp公司的财务责任和对交易及财务细节缺乏了解的讨论,
    表格标题为:财务责任和缺乏了解
    问题 答案 Q. 它没有支付费用吗? A. 没有。莱克星敦物业应支付员工和租金。 Q. 好的。那其中包括了谁的租金? A. 我不知道。我没有具体管理—— Q. 所以你不知道吗? A. ——这些交易。 Q. 抱歉? A. 这些交易。我不了解。 Q. 好的。所以你不知道具体的交易对吧? A. 没有关于具体交易的了解。 Q. 你不知道——你了解一般的交易吗?不知道,对吧? A. 一般的,工作在联排别墅的员工。 Q. 你有看过莱克星敦物业的任何文件吗? A. 成立文件,有。 Q. 你有检查过他们的日常工资条吗? A. 没有。 Q. 你有查看过他们的银行账户吗? A. 没有特别查看。 Q. 你不知道有多少钱进账,对吧?你也不知道有多少钱出账,对吧? A. 对。 Q. 让我们谈谈 Lamp 公司。 lamp 公司做了什么? A. 同样的。告诉我,Lamp 公司在支付。 2155
    Khaled - 交叉质询
    1 为独立实体——为独立实体支出。
    2 问。对于独立实体还是对于郭家庭?
    3 回答。由郭家庭拥有的实体。
    4 问。Lamp为郭家庭拥有的哪些实体付款?
    5 回答。有很多实体。我不——
    6 问。说出一个。
    7 回答。我不记得。你可以给我看。
    8 问。请问?
    9 回答。我不记得。
    10 问。你不记得对吗?
    11 回答。是的。
    12 问。好的。你提到了一个名为Regus的公司,是吗,
    13 R-E-G-U-S?还记得吗?
    14 回答。Regus,对。
    15 问。你证言说他们是你租用虚拟办公空间的公司;是这样吗?
    16 回答。正确。
    17 问。租用虚拟办公空间没有违法,对吧?
    18 MS. MURRAY:反对,法官。他不能对法律结论发表意见。
    19 法官:持有。
    20 问。你租用了虚拟办公室吗?
    21 回答。是的。
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    2156
    问。你签订了租约吗?
    回答。他们不称其为租约。这是一份协议。
    问。对不起?
    回答。不是租约,是协议。
    问。好的。
    回答。就像,你知道——
    问。谢谢。所以你签署了协议,对吗?
    回答。是的。
    问。好的。你签署了虚拟——如果不是租约——我猜应该是虚拟空间的协议给经营实体?
    回答。给经营实体,是的。是的。
    问。是吗?
    回答。是的。
    问。好的。你昨天在直接询问中证明你确实支付了以展示Saraca、GTV和Golden Spring之间的分离,是吗?
    回答。不同地址,是的。
    问。对。你选择了地址,还是其他人?
    回答。对于Lexington,Anpony想要一个靠近的地址以便他们可以取信件。
    问。我的问题是:你选择了地址,还是其他人? MS. MURRAY:提问者问过并得到了回答,法官。
     
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    2157
    O6B1GUO4 Khaled - 交叉质询
    法官:持有。
    MS. SHROFF:抱歉。能有人为我重复读一下那个答案吗?
    (记录读取)
    由MS. SHROFF提问:
    问。所以Anthony Dibatista想要靠近以便取信件对吗?
    回答。是的。
    问。所以您和Anthony Dibatista讨论了要选择什么地址,对吗?
    回答。对。
    问。并且您与他一起选择了这个地址,对吗?
    回答。他要求我找一个靠近的地址,而那个位置是最靠近联排别墅的。
    问。您遵守了,对吗?
    我继续。
    在您进入那里工作之前,没有虚拟办公室,对吗?
    MS. MURRAY:请澄清“那里”是指哪里。
    MS. SHROFF:哦。在东64街。
    法官:但在美国或其他地方没有虚拟办公室——
    MS. SHROFF:不,没有。在他到达之前,没有任何G实体的虚拟办公室。对不起,法官。那个问题不好。抱歉。
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    2158
    O6B1GUO4 Khaled - 交叉质询
    虚拟办公室空间询问
    发言者 对话 Q 你好,请问您的公司提供虚拟办公室空间吗? A 是的,我们提供虚拟办公室空间,可以为您的公司提供商务地址和邮件转发服务。 Q 这些虚拟办公室空间是否包括电话接听或会议室预订等服务? A 是的,我们可以提供电话接听和转接服务,也可以帮助您预订会议室。此外,我们还有虚拟办公室的其他定制服务可供选择。 Q 非常感谢您的信息,我将与我的公司讨论后再决定。 A 感谢您的垂询,如果有任何进一步问题或需要帮助,请随时与我们联系。 虚拟办公室空间查询
    发言者 对话 Q 但是如果他们已经拥有虚拟办公空间,你就不必去找了,是吗? A 是的。他们是新实体,莱克星顿是一个新的,所以—— Q 兰普呢? A 记不清了。 Q 乔维尔呢? A 你是什么意思? Q 一个你为其获取了虚拟办公空间的实体。 A 我想我们没有为乔维尔申请虚拟办公。 Q 好的。那么你的证词是你只为兰普和莱克星顿申请了虚拟办公空间。 Q 你为哪些其他公司申请了虚拟办公? A G 音乐。 Q 在你为 G 音乐申请虚拟办公之前,它在哪里? A 我不知道。 Q 在东64街,是吧? 南区记录员有限公司(212)805-0300
    O6B1GUO4 哈立德 - 交叉审问
    A. 不是。
    Q. 你刚刚说你不知道,但你知道不是在东64号。
    A. 我知道不是在64号,但我不知道他们拥有什么其他地址。
    Q. G时尚怎么样?
    A. 哪个G时尚?有好几个。
    Q. 你是否为G时尚开设了多个虚拟办公室?
    A. 我知道,但你问的是哪个G时尚?
    Q. 我只是问你为哪个G时尚开设了虚拟办公室。
    A. G时尚在美国有办公室,在加利福尼亚,但我不知道它是虚拟的还是实体的。
    Q. G时尚是从加利福尼亚搬到纽约的,对吗?
    A. 再次问,哪个G时尚?
    Q. 然后它是从纽约搬到意大利的,对吗?
    A. 我不知道。
    Q. 谁签署了虚拟办公室的协议?
    A. 我记不清了。可能是我或葉薇特。我不确定。
    Q. 现在你作证称存在一个名为Crane的实体,对吗?
    A. 对。
    Q. 在庭审中,你作证说你在与王女士和公司内律师讨论后创立了这个实体,对吗?这是你的证词?
    A. 对。
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    2160
    Q. 哈立德先生,可以说,您选择了Crane这个名字,对吗?
    A. 这是建议给葉薇特,她批准了。
    Q. 哈立德先生,事实是您选择了这个名字,因为您认为它是一个幸运的鸟名字来命名您的公司,对吗?
    A. 是的,中国的鸟名字。
    Q. 对。王女士与选择这个名字无关,对吗?
    A. 这与中国有关系。
    Q. 这不是我问你的。我问的是:王女士与您选择这个名字无关,这是正确的吗? MURRAY女士:反对,法官。误述证词。
    法官:你可以回答这个问题。
    A. 你可以重复一下问题。 SHROFF女士:请你把问题念给他听,谢谢。
    法官:请说。 (记录念出)
    A. 她批准了这个名字。
    Q. 您认为选择和批准之间有区别吗?
    MURRAY女士:反对,法官。
    法官:那么是你选择了这个名字,然后她批准了;是这发生的方式吗?
    证人:是的,我建议了,然后她批准了。
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    2161
    O6B1GUO4 哈立德 - 交叉审问
    1.
    Q. 您有没有给她发过关于这个名字的电子邮件?没有,对吗?
    A. 我不记得。
    Q. 您从未发过关于这个名字的短信,对吗?
    A. 我再次不记得。
    Q. 当你注册公司时,她没有和你一起去过,对吗?
    A. 我——我是在线注册的。
    Q. 当你在线注册公司时,她不在你身边,对吗?
    A. 不在。
    Q. 她与您支付公司费用无关,对吗?
    A. 你说无关是什么意思?
    Q. 事实上,哈立德先生,她无论您是否开设Crane公司都无所谓,这是公平的说法,对吗?
    MURRAY女士:反对,法官。 法官:维持。他不能作证她对此如何感受。
    Q. 谁控制了Crane公司?
    A. 在哪种情况下?
    Q. 在哪种情况下?
    A. 是的。你是什么意思?
    Q. 谁拥有Crane公司?
    A. 实体上我持有所有权。
    2162 Q. 有没有其他方式拥有Crane公司的所有权? A. 实体上,没有。 Q. 除了在文件上拥有Crane公司的所有权,还有其他方式吗? A. 没有。
    13 问: 你所指的“一无所有”是什么意思?
    14 问: 实际上,哈立德先生,可以说,在您是否开启或不开启Crane这件事上,她并不在乎,对吗?
    15 弗雷泽女士:抗议,法官。
    18 法官:维持抗议。他不能作证对方的感受。
    20 问: 谁控制了Crane?
    21 回答:在什么情况下?
    22 问: 在什么情况下?
    23 回答:是的。你是什么意思?
    24 问: 谁拥有Crane?
    25 回答:我在文件上拥有所有权。
    问: 有没有其他方式拥有Crane的所有权?
    回答:在文件上,没有。
    问: 有没有其他方式拥有Crane的所有权,而不是纸面上的所有权?
    回答:没有。
    问: 昨天在直接询问中,你作证称你打算申请一个银行许可证,是吗?
    回答: 是的。 问: 你的想法是你将获得一个真正的银行许可证,对吗?
    回答: 是的。
    问: 你还考虑过你可能想要申请一个在线数字银行的许可证,对吗?
    回答: 你能重复一遍吗?
    问: 当然。您还希望或打算建立一个在线数字银行吗?
    回答: 是的。
    问: 作为至少有十年经验的银行家,您是否知道一个宣布破产的人是被取消资格获得这样的许可证的?
    回答:不这么认为。
    问: 您不相信——您认为一个正在个人破产中的人,在申请许可证经营银行时,不会自动被取消资格。
    披露个人破产情况申请银行许可证的问题与答案。
    问题 答案 暂无 暂无 银行牌照申请过程中个人破产披露的一系列问题和回答
    问题 答案 您是否调查过您目前仍处于的个人破产情况是否会使您无法拥有银行? 我们当时咨询的律师看不出会有问题。 您是否告诉律师您正在破产? 是的。 您告诉了哪些律师?您是否告诉 Victor Cerda 您正在破产? 是的。 您在申请银行牌照时告诉 Victor Cerda 您正在破产? 是的,他知道。 在申请银行牌照时,您告诉了王小姐,Yvette Wang,您正在破产。 是的。 您的证词——您是否也与 Miles Guo 分享了这些信息?   2164
    问:您是在接受工作之前还是之后与Yvette Wang分享了有关破产的信息?
    答:之后。
    问:所以您接受了工作,没有告诉她您正在破产,然后在之后透露给她。
    问:何时?
    答:2020年10月。
    问:2020年的哪个时间?
    答:10月。
    问:2020年10月?
    答:对的。
    问:您在2020年10月告诉王女士,您宣布个人破产了。
    MURRAY女士:反对,法官。已经问过并回答了。
    法官:认可。
    问:她有要求您提供有关破产的文件吗?
    答:没有。
    问:她有询问您宣布破产多久了吗?
    答:没有。
    问:她有询问您欠破产托管人多少钱吗?
    答:没有。
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    2165
    问:所以您告诉您的雇主Yvette Wang您正在破产,她没有询问您任何后续问题。
    答:是的。她说要把某人添加到公司中。
    问:她要把某人添加到谁的公司?
    答:Crane公司。
    问:但Crane是您的公司,对吗?
    答:正确。
    问:她根本无法向您的公司添加任何人,对吗?
    答:如果她要求我,我会的。
    问:但她并没有要求您,对吗?
    答:一开始她确实要求了。
    问:哦,她向您要求了。您说如果她要求您,您会这样做,为什么您没有这样做呢?
    答:我应该与Victor Cerda一起创建它。
    问:您的证词是Victor Cerda将与您一起创建公司吗?
    答:是的。
    问:先生,真的是您和Cerda先生完全不能相处吗?事实上,您不是——
    答:我们——
    问:对不起?
    法官:让他回答。
    答:我们一起去了波多黎各。
    问:您之所以这样说是因为您与Victor Cerda一同去了波多黎各,所以您相处融洽?
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    2166
    马里姆女士:反对,法官。这不是他的证词。
    夏罗夫女士:我相信那是——
    法官:您与Cerda先生相处如何?
    证人:是的,我们相处得很好。
    问:Cerda先生在开会中叫您白痴了吗?
    答:我不记得有这种情况。
    问:他是否公开嘲笑您想要购买银行却不知道需要许可证?
    答:您是什么意思?可以重复问题吗?
    问:当然。Cerda先生是否公开嘲笑您认为您可以在美国购买银行的想法?
    答:我不记得有这种情况。
    问:Khaled先生,可以说除了您与Cerda先生一起去的那次旅行外,您从未与他一起旅行过,对吗?
    答:正确。
    问:您从未去过Cerda先生的家,对吗?
    答:是的。
    问:他从未邀请您与他社交,对吗?
    马里姆女士:反对,关联性。
    夏罗夫女士:他说他们是朋友。
    法官:不,他说他们相处融洽。
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    2167
    夏罗夫女士:好的。
    法官:所以——
    问:Cerda先生从未邀请您参加任何社交活动,对吗?
    马里姆女士:同样反对,法官。
    法官:认可。
    问:Cerda先生从未要求加入Crane公司,对吗?
    答:他原本是要的。
    问:他要向您提出这个要求吗?
    答:计划是这样的。不,计划是他要加入。
    问:他要加入——
    答:并成为Crane公司的部分所有者,对。
    问:Khaled 先生
    法庭:不是。他说他们相处很好。
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    2167
    O6B1GUO4 Khaled - 交叉审讯
    SHROFF女士:好的。
    法庭:所以——
    问:Cerda先生从未邀请您参加过任何社交活动,对吗?
    MURRAY女士:同样的异议,法官阁下。
    法庭:维持异议。
    问:Cerda先生从未表示要加入Crane公司,对吗?
    答:他本来是打算的。
    问:他打算要问您?
    答:那是计划。不,计划是他要加入。
    问:他打算要加入——
    答:并成为Crane的一部分,对。
    问:对不起?
    答:他计划成为Crane的合伙人,对。
    问:Cerda先生打算成为Crane的合伙人。
    答:是的。
    问:您曾和Cerda先生通过电子邮件联系,对吗?
    答:对。
    问:您也和他通过电话交谈?
    答:是的。
    问:您还和他通过短信联系?
    答:是的。
    问:您把所有这些文件都提供给了政府,对吗?
    答:这些都在调查过程中,我提供了我拥有的。
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    2168
    O6B1GUO4 Khaled - 交叉审讯
    问:没有一个电子邮件、短信或对话记录能够证实您今天口头所说的内容,对吗?
    MURRAY女士:异议,法官阁下。
    法庭:维持异议。
    问:您从未向Cerda先生发送过加入Crane的提议,对吗?
    答:提议?
    问:是的。这是一个商业计划,对吗?有人要加入Crane公司。
    答:不是,但我曾要求他提供文件以加入。
    问:请听着,好吗。您能听完我的问题吗?
    答:好的,说吧。
    问:我的问题是:您是否向Cerda先生发送过邀请他在Crane公司加入的提议?
    答:按您这么说的话,没有。
    问:您是否曾向Yvette Wang发送邀请她加入Crane公司的提议?
    答:按您这么说的话,没有。
    问:您有所有那些录音电话,对吗?
    答:有的,对。
    问:在这些电话中,您从未对Yvette说过,你可以加入Crane,对吗?
    答:您是什么意思?
    问:在您录制的电话中,您从未对Cerda先生说过,你知道吗,Yvette,你可以加入Crane,对吗?
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    1 答:没有。
    2 问:您从未在录制的电话中告诉那些和您通话的Cerda先生,您决定录制的电话中从未邀请这两个人加入Crane公司,对吗?
    MURRAY女士:异议。问题已经回答过了。
    法庭:维持异议。问题已经回答过了。
    SHROFF女士:法官阁下,是时候停下来了吗,还是应该继续?
    法庭:是的,现在停下来是很合适的。现在是下午2:36。
    陪审团成员们,今天我们稍微提早结束工作。明天请回到法庭,准备好在上午9:30进入法庭。请记住,不要在互相之间或与任何其他人讨论案件。不要允许任何人在您面前讨论案件。不要阅读、观看或听任何与本案相关主题的任何来源的内容。
    (陪审团不在场)
    法庭:请坐。
    KAMARAJU先生:法官阁下,抱歉。在您
    还没有询问证人之前,我可以简短地和您商量一下吗?
    法庭:好的。
    (在庭外商议)
    KAMARAJU先生:法官阁下之前曾问过是否可能涉及其他州的罪行。
    请记住,
    你不允许在彼此之间讨论案件,也不允许与其他人讨论。不要允许任何人在你的面前讨论此案。不要阅读、观看或听任何涉及本审判主题的任何来源的内容。
    (陪审团不在场)
    法庭:请就座。
    卡马拉朱先生:法官,我很抱歉。在您
    2170
    O6B1GUO4
    1 对证人发言之前,我能请一个非常简短的庭外会议吗?我
    2 只想分享一件事情。
    3 法庭:好的。
    4 卡马拉朱先生:谢谢。
    5 (在庭外)
    6 卡马拉朱先生:法官之前询问是否有可能涉及其他州法律犯罪。我们团队的一名律师提醒我,他曾在Pax诉讼中提交过一份声明,我们可能会询问他。我想,如果他否认这里的某一陈述是不真实的,理论上可能会引发这个问题,但我不希望法官在发出指示时没有这个信息。就是这样。
    13 法庭:好的。
    14 穆瑞女士:我确认帕斯卡雷拉先生可以与哈立德先生进行磋商。
    15 法庭:好的。很好。
    16 (在庭内)
    17 法庭:哈立德先生,我想告诉你一个我关心的问题。
    18 你被问及在你既为花旗银行工作且收到莱克星敦支付时的工作时间段。你记得吗?
    19 证人:记得。
    20 法庭:乔夫女士开始询问你是否为每个工作了七个小时,合计 14 小时。你与检察部门达成的协议,那份非起诉协议,涵盖联邦犯罪,但不涵盖州犯罪。如果一个人接受他们未做的工作的报酬,比如他们接受了薪水但一天没有工作,这可能被视为一种偷窃行为。
    " 提出这个问题的原因是你有一项重要的反对自证罪名的宪法权利,这意味着你不能被强迫承认犯罪。所以我要求你与你的律师帕斯卡雷拉先生交谈,并提出这个问题,即你是否应该回答关于同时为花旗银行和莱克星敦工作的问题。
    另外,你可能会被问及你签署的一份声明,其中涉及你是否真实。再次弄虚作假可能构成州犯罪,你没有受到保护。所以我也希望你问问他。明白吗?
    这是一个是或否的问题。
    证人:不明白。
    法庭:你可能回忆起在电视或法庭审判中看到或听说人们宣誓作证或听说人们选择第五修正案权利。因此,当你选择第五修正案时,你是在说,我主张不自证罪名的权利。我在说我不会承认犯罪。这就是它的含义。因为你没有义务这样做。你有权保持对此的沉默。所以由于你接受了你在一段时间内没有完成的工作的报酬这个问题,以及你在一份声明中可能不真实这个问题,因为这些事情可能构成州犯罪,我要求你与帕斯卡雷拉先生交谈,并征询他对于如何回答可能涉及这两个主题的问题的建议。
    证人:明白。
    法庭:你明白吗?
    证人:明白。
    法庭:好的。那么你会在明天继续作证之前与他交谈。
    证人:好的。
    法庭:很好。谢谢你。你可以离开。不要讨论你的证词。
    穆瑞女士:(未完)
    您并不需要这样做。您有权对此保持沉默。因此,由于你是否接受了一段时间内未完成的工作而接受报酬以及你在宣誓书上是否不诚实的问题,因为这些事情可能构成州罪行,我想让你与Pascarella先生交谈,并请教他如何回答可能涉及这两个问题的问题。
    证人:好的。
    法官:你理解吗?
    证人:明白。
    法官:好的。所以明天继续作证前你会与他交谈。
    证人:好的。
    法官:谢谢。你可以出去了。不要讨论你的证词。
    穆雷女士:为了明确,法官,除了今晚在法庭指示下与Pascarella先生讨论证词外。
    法官:哦,当然。我指示你与Pascarella先生讨论你的证词。
    证人:明白。谢谢。
    法官:是的。
    法庭对话摘要, 以下是表格标题: 法庭对话, 以下是列名:
    行号:法庭对话中的对话行的顺序编号
    对话:法庭中个人之间的对话和交流
    法庭对话总结
    行号 对话 1 (证人不在场) 2 法官:还有其他事情需要补充吗? 3 卡马拉朱先生:辩方没有其他要补充的,阁下。 4 默里女士:是的,阁下。简短地说一下。 5 政府也希望与帕斯卡雷拉先生交谈。我们不会讨论哈立德先生的证词内容。我们只是想确保他了解问题所在——也就是帕斯卡雷拉先生——这样他才能正确地指导哈立德先生。 6 卡马拉朱先生:我认为通过向帕斯卡雷拉先生提供传译稿本就可以实现这一点。他只需要获取这份传译稿本,对吧?他们可以把传译稿本寄给他。 7 法官:如果有的话。我不确定它会多快可获得。 8 芬克尔先生:阁下,我们提出这个问题是因为我们不想冒犯。显然我们不会与证人交谈,但我们当然有权与他的律师讨论他与我们之间的协议。 9 法官:是的。 10 芬克尔先生:简要地说,我们需要知道明天需要准备多少证人,同时也与各方就下周的日程持续讨论有关,可以让舒罗夫女士给我们估计一下交叉审问还需要多长时间。 11 法官:舒罗夫女士。 12 舒罗夫女士:还剩下两个半小时。 南区记录员事务所(212)805-0300
    法官:你说他花了两个半小时?
    Shroff女士:是的。他整整坐了一天半。我是说——他也经常停顿很久。他停顿得太久,以至于我不得不打断,然后她提出异议说我在打断他。
    法官:嗯,而且也有很多重复的问题,你在交叉审问上可以更高效一些。
    Shroff女士:我会尽力,法官,但我真的认为这是重复问答——我真的不认为我得到了答案,但我会试着不重复自己。
    法官:好的。
    Shroff女士:谢谢。
    法官:晚安。
    所有律师:谢谢,法官。
    (休庭至2024年6月12日上午9:00)
    检验指标详细信息如下,包括 Haitham Khaled 的检验、进行检验的个人以及收到的被告证据,下面是表格标题: 检验指标, 表格包括以下列:
    检验人员:被检验或参与检验的个人姓名。
    页码:与检验详情相关联的页码。
    审核指数 审核者: HAITHAM KHALED 由Murray女士直接审核 由Shroff女士交叉审核 被告证据 展品编号 7001 DX-10339 DX-60524 南区记录员公司(电话:212-805-0300)
  22. Roger
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    美利坚合众国地方法院
    纽约南区
    美利坚合众国

    郭江涛
    被告
    审判
    纽约市
    2024年6月10日
    上午9:02
    出庭人员:
    阿娜丽萨·托雷斯法官
    和陪审团 -
    涉及纽约南区法庭法律案件的律师名单, 具有以下表格标题: 案件中涉及的律师, 有以下列:
    姓名:案件中律师的姓名及所属机构。
    案件中涉及的律师名单-纽约南区法院,
    姓名 在案中的所属单位 达米安·威廉姆斯(DAMIAN WILLIAMS) 美国纽约南区联邦检察官   麦卡·F·费根森(MICAH F. FERGENSON)   瑞安·B·芬克尔(RYAN B. FINKEL)   贾斯汀·霍顿(JUSTIN HORTON)   朱莉安娜·N·默里(JULIANA N. MURRAY)   美国副检察官 萨布丽娜·P·肖夫(SABRINA P. SHROFF) 被告的辩护律师 普赛尔卡什曼律师事务所(PRYOR CASHMAN LLP) 被告的律师   悉达尔达·卡马拉朱(SIDHARDHA KAMARAJU)   马修·巴肯(MATTHEW BARKAN) 奥尔斯顿律师事务所(ALSTON & BIRD LLP) 被告的律师   E·斯科特·谢里克(E. SCOTT SCHIRICK) 南区记录员有限公司
    (212)805-0300
    现场也有:
    该表列出了法律和调查领域的个人及其各自的角色,包括法律助理专家、特工、辩护律师助理和口译员(普通话), 具有以下表标题: 法律和调查人员, 具有以下列:
    姓名: 无
    角色: 无
    姓名 角色 Isabel Loftus 美国检察官办公室法律助理专员 Michael Gartland 美国检察官办公室法律助理专员 Geoffrey Mearns 美国检察官办公室法律助理专员 Robert Stout 联邦调查局特工 Ruben Montilla 辩护律师助理 Tuo Huang 翻译员(普通话) Shi Feng 翻译员(普通话) Yu Mark Tang 翻译员(普通话) 南区记录员办公室(212)805-0300
    1855
    O6A1GUO1
    (庭审恢复进行;陪审团不在场)
    法官:早上好。
    所有律师:早上好,法官大人。
    法官:请出示你们的身份。
    芬克尔先生:早上好,法官大人。Ryan Finkel, Juliana Murray, Micah Fergenson 和 Justin Horton 很快就会和我们一起出现,我们的办公室还有一名法律助理 Isabel Loftus 也一同在场。
    卡马拉朱先生:早上好,法官大人。Sidhardha Kamaraju 和 Sabrina Shroff 和陪同我们的郭先生都在辩护律师席上。
    法官:请坐。
    在继续证人出庭之前有什么需要解决的问题吗?
    卡马拉朱先生:辩方没有任何问题。
    芬克尔先生:有一个后勤问题;我们只是在等待辩方是否认为这是一个问题。除此之外——如果不是问题,我们不想打扰法官。除此之外,政府方面没有任何事项。
    法官:好的。那么,请在9:29将证人带到证人席。谢谢。
    所有律师:谢谢。
    (休庭)
    法官:请坐,然后请带陪审团进来。
    1856
    O6A1GUO1 Murphy - 交叉质询
    法官:请坐。
    陪审团早上好。
    陪审员们:早上好。
    法官:欢迎回来。
    我们将继续对证人进行交叉质询。
    请记住你现在还在宣誓之下。
    证人:是的,法官大人。
    法官:你可以提问了。
    卡马拉朱先生:谢谢,法官大人。
    玛格丽特·墨菲,恢复证言。
    继续交叉质询
    卡马拉朱先生提问:
    Q:早上好,特工墨菲。
    A:早上好。
    Q:上周五我们谈到了雪利-尼亚兰酒店,对吧?
    A:对。
    Q:那么雪利-尼亚兰酒店是一家豪华酒店,对吧?
    A:是的。
    Q:非常豪华,对吧?
    A:是的。
    Q:那天你们要搜查的是18楼的房间,是吗?
    A:对。
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    1857
    Q:18楼是整个楼层占据的一个公寓,是吧?
    A:对。
    Q:那个——那是郭先生和他的家人居住的地方,对吗?
    A:我不知道这是真的。
    Q:好的。那是郭先生当天所在的地方,是吧?
    A:是的。
    卡马拉朱先生:好的。现在可以展示政府证据SH207吗?
    我想这是作为证据提交的,所以我们可以为所有人展示。
    Q:这是公寓的布局图,对吧?
    A:对。
    Q:每个房间上都标有字母,对吗?
    A:是的。
    Q:因此,每个房间都被分配了特定的字母组合,对吗?
    A:是的。
    Q:请纠正我,但我所看到的最高的是BB,在北侧的书房上方。你看到了吗?
    A:是的。
    Q:好的。所以无论我是否错过了一个,可以确定这个公寓里有将近30个房间,对吧?
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    1858
    Q:几乎是的。 Q:他们都是配备家具的,对吧? A:一些房间是壁橱,我不会把它们归类为配备家具的,但总体来说这个地方是有家具的,是的。 Q:好的。可以提供家具的房间都有家具,对吧? A:是的。 Q:明白了。现在我相信你在直接询问时提到你是从一个电梯厅进入公寓的,对吧? A:是的。 Q:在图表上,你能告诉我们那个电梯厅在哪里吗。 A:所以电梯厅在公寓的中心,显示为服务电梯大堂的地方。 Q:好的,那是你挤上来的那一部分? A:我不记得我具体从哪个电梯厅上来的。
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    1858
    问:几乎是的,对吗? 问:全部都配备好了,对吗? 答:有些房间只是储藏室,我不会把它们归类为配备好了的,但总的来说这个地方是配备好了的,对。 问:好的。那些可以配备的房间都配备好了,是吗? 答:是的。 问:好的。现在我相信您在直接询问中作证说您是从电梯厅进入公寓的,对吗? 答:是的。 问:好的。在图表上,您能告诉我们那个电梯厅在哪里吗? 答:电梯厅在公寓的中心,也就是写着服务电梯大堂的地方。 问:好的。那是您一直都在上升的那个? 答:我不太清楚我是坐哪个电梯上来的。 问:好的。有多个电梯可以进入公寓吗? 答:我记不清了。 问:好的。您在周五直接询问时好像说从公寓的一端走到另一端需要好几分钟,对吗? 答:是的。 卡马拉朱先生: 我们能展示政府展品SH28吗,这也是证据之一。请发布。
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    1859
    问:您回忆起在直接询问中有关这张照片的证词了吗? 答:是的。 问:这是床垫下手机的照片,对吗? 答:正确。 问:现在您不知道手机是何时放在床垫下的,对吗? 答:抱歉,我没听清楚。 问:您不知道手机是何时放在床垫下的,对吗? 答:是的,我不知道。 问:好的。您不知道它是如何被放在床垫下的,对吗? 答:嗯,我知道在逮捕时它被发现并从住所清除。 问:明白。您知道它被发现时,对吗? 答:对。 问:您不知道是谁把它放在那里的,例如,对吗? 答:我——我不知道它是怎么到那里去的。
    卡马拉朱先生: 好的。我们再看一下政府展品SH207。
    问:我记得您在直接询问中提到了这张照片上的手机? 答:对。
    问:那是我们刚才看到的手机是在P房间发现的,对吗?
    1860
    6 答:正确。
    7 问:明白。我想在直接询问中您还谈到了一种叫做“敲门并宣布”搜查,对吗?
    8 答:是的。
    9 问:您能提醒我们这是什么吗。
    10 答:“敲门并宣布”是FBI通常会在进入我们正在执行逮捕或搜查令的地方之前宣布我们的存在的一种做法。
    11 问:明白。所以会有一个时间段,让被告来开门,是吗?
    12 答:在“敲门并宣布”期间,是的。
    13 问:好的。那个时间段通常有多长?
    14 答:这取决于情况,但可能是15到20秒。
    15 问:好的。在FBI进入之前会等15到20秒,是这样的吗——
    16 答:正确,是的。
    17 问:好的。那么在您到达之前,您直到在进入公寓之前格里先生被逮捕并公寓被清除,对吗?
    18 答:正确。
    19 问:所以如果有敲门并宣布,那是在您到达之前发生的,对吗?
    20 答:正确。
    卡马拉朱先生: 好的。现在可以展示政府展品SH135。
    20 好的。我想这也是证据之一,我们可以公布一下。
    1861
    问:这是您在搜查期间拍摄的另一张照片?
    答:是的。
    卡马拉朱先生: 好的。也许我们可以把顶部的便利贴放大一些。
    问:好的。您能读一下上面的内容吗。
    答:当然。上面写着,“Y房间。多个手机。床下。”然后还有两个我看不清的名字。
    问:不用担心名字。好的。顶部写着Y房间,是吗?
    答:是的。
    卡马拉朱先生: 好的。现在我们回到207。
    16卡马拉朱先生:好的。现在能请将政府提供的展示品SH135展示出来吗。
    17好的。我想这个也是呈堂证物,所以我们可以公布它。
    问1861
    问:这是你在搜查时拍摄的照片之一吗?
    答:是的。
    卡马拉朱先生:好的。也许我们可以把顶部的便签放大一下。
    问:好的。你能读一下上面写的内容吗?
    答:当然。上面写着:“Y房间。多台手机。床底下。”然后还有两个名字我没看清。
    问:不用担心名字。好的。它上面写着房间Y,对吧?
    答:是的。
    卡马拉朱先生:好的。那让我们回到207。
    问:现在你能在示意图上找到Y房间吗?
    答:能。那是衣帽间。
    问:好的。现在当它说到衣帽间,基本上就像一个步入式衣柜,对吧?
    答:就我记得的来说,是的,看起来像一个步入式衣柜。
    卡马拉朱先生:好的。现在请展示政府展示品SH156。
    问:好的。这是你拍摄的另一张照片,对吗?
    答:是的。
    问:你看到顶部的文件了吗?
    问1862
    答:看到了。
    问:那是一本香港国际驾驶执照,对吗?
    答:是的。
    问:这是2015年的,对吗?
    答:是的。
    卡马拉朱先生:好的。现在请展示政府展示品SH157。
    问:好的。你看到了吗?
    答:看到了。
    卡马拉朱先生:好的。那么每个人都能在他们的屏幕上看到这个吗?
    好的。
    问:现在在这张照片的顶部,那是我们在GX SH156中看到的执照,对吧?
    答:我们刚刚看过的照片吗?
    问:对。
    答:是的。
    卡马拉朱先生:好的。我们可以——在执照的右上角部分,也许我们可以放大,超过这张照片。
    问:好的。你能读一下那上面写的内容吗?
    答:当然。写着:“郭。何婉。中国。1968年10月05日。香港湾景大庄园香港南湾路20号。”
    卡马拉朱先生:好的。我们可以缩小这个。
    请把那个再展示出来,157。
    问1863
    O6A1GUO1 伍尔弗 - 交叉审问
    1好的。如果我们可以放大这个文件,
    2请。
    3问:现在你看到下面还有另一份文件,对吧?
    4答:是的。
    5问:好的。这两份文件大概是在同一个地方找到的吗?
    6答:是的。
    7问:好的。那下面的文件是香港出入境许可证,是吗?
    8答:正确。
    9卡马拉朱先生:好的。现在能放大那个文件的右下角吗。
    10问:好的。你看到“签发日期”了吗?
    11答:是的。
    12问:那个日期是多少?
    13答:2010年4月12日。
    14问:你看到“到期日期”了吗?
    15答:是的。
    16问:那个日期是多少?
    17答:2010年10月11日。
    18问:对吗,在搜查中没有找到郭先生的美国驾照?
    19答:我记不起来有没有。
    20问:好。
    21法官:靠近麦克风。谢谢。
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    问1864
    O6A1GUO1 马蒂奥里 - 直接审问
    卡马拉朱先生:抱歉,法官。
    问:你肯定没有拍摄郭先生的美国驾照照片,对吧?
    答:我记不得了,但是,是的。
    问:好的。公寓里也没有找到郭先生的美国驾照许可证,是吗?
    答:我记不得有找到。
    卡马拉朱先生:好的。没有进一步的问题,法官。
    法官:再审问?
    22 在搜查期间,并没有找到一张驾驶执照,对吧?
    23 A. 我记不清有这样的情况了,没有。
    24 Q. 好的。
    25 法官:靠近麦克风。谢谢。
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    1864
    O6A1GUO1 马蒂奥利 - 询问
    卡玛拉朱先生:对不起,法官。
    Q. 你确实没有为郭先生拍摄美国驾驶执照的照片,对吧?
    A. 我记不清了,但是,是的。
    Q. 好的。公寓里没有找到郭先生的美国驾驶许可证,对吧?
    A. 我记不清有这样的情况。
    卡玛拉朱先生:好的。法官,没有更多问题。
    法官:再问一次?
    芬克尔先生:没有更多问题。谢谢。
    法官:你可以离开了。谢谢。
    证人:谢谢。谢谢您,法官。
    (证人被允许离开)
    法官:控方可以传唤下一位证人。
    霍顿先生:政府传唤贾科莫·马蒂奥利。
    法院助理:请将麦克风拉近你的脸部,并举起右手。
    (证人宣誓就职)
    法院助理:谢谢。
    法官:请坐下。请说出你的姓名并拼写出来。同时请将麦克风放在你附近。
    证人:我的名字是贾科莫·马蒂奥利,拼写为G,A,C,O,M,O,姓氏为
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    (212)805-0300
    1865
    O6A1GUO1 马蒂奥利 - 询问
    M-A-T-T-I-O-L-I。
    法官:你可以询问了。
    霍顿先生:谢谢,法官。
    贾科莫·马蒂奥利,
    作为政府传唤的证人,
    在得到妥善宣誓后,作证如下:
    直接询问
    霍顿先生:
    Q. 早上好,马蒂奥利先生。
    A. 早上好。
    Q. 你是做什么工作的?
    A. 我在一家法拉利经销商工作。
    Q. 你有多少家法拉利经销商?
    A. 三家。
    Q. 你的法拉利经销商位于哪里?
    A. 加利福尼亚。
    Q. 在加利福尼亚的哪里?
    A. 洛杉矶,比佛利山和韦斯特雷克。
    Q. 马蒂奥利先生,Passione Rossa,LLC是什么?
    A. 这是拥有费比埃里比佛利山的法律实体。
    Q. 马蒂奥利先生,你销售法拉利有多久了?
    A. 25年。
    Q. 法拉利在意大利的总部在哪里?
    A. 马拉内洛。
    Q. 你的法拉利经销商和意大利的费拉利有什么关系,如果有的话?
    A. 我是法拉利的正式特许经销商。
    Q. 成为法拉利的正式特许经销商是什么意思?
    A. 嗯,我们有一个特许经营协议,因此我们在市场上代表工厂,所以我们有能力以折扣价格购买新车,并将其零售。
    Q. 你说“我们在市场上代表工厂”。这里的工厂指的是什么?
    A. 嗯,从技术上讲,我们代表费拉利北美公司,这是费拉利S.p.A.的全资子公司,后者是意大利的工厂。
    Q. 工厂指的是什么?
    A. 意思是费拉利S.p.A.,是这家意大利公司。
    Q. 你和意大利的费拉利S.p.A.有什么类似的交易吗?
    A. 嗯,我们有一些关于一些特别车辆的交易,我们直接从中购买。
    Q. 你所说的特别车辆是什么意思?
    A. 通常不符合街头合法标准的车辆,专门为赛道建造的车辆,比如赛车。
    Q. 一辆不符合街头合法标准的车辆是什么意思?
    A. 这意味着它不符合用于街头合法车辆需要遵守的规定和认证标准。
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    1866
    Q. 一辆不符合街头合法标准的法拉利可以在哪里驾驶?
    A. 通常在赛道上。
    Q. 马蒂奥利先生,在你的法拉利经销商店,什么是寄售服务?
    在意大利? A. 嗯,我们有一些关于一些特别的汽车的交易,我们直接通过他们购买。 Q. 你所说的特别汽车是指什么? A. 通常是非街道合法的汽车,专门为赛车场建造,所以是赛车。 Q. 什么意思是一辆汽车不符合街道合法? A. 这意味着它不符合规则和法规以及需要具备的合法街道车辆的认证。
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    1867
    Q. 一辆不合法的法拉利可以在哪里驾驶?
    A. 通常在赛车场。
    Q. Mattioli先生,在你的法拉利经销商那里,什么是寄售服务?
    A. 寄售,这是我们与卖家达成的一种协议形式,表达了他想要出售他的车辆的愿望,我们一起合作,为他提供建议,卖车的最佳营销策略和价格点。
    Q. 通过寄售来出售一辆法拉利的目的是什么?
    A. 通常是为了最大程度地增加卖家、买家的回报。
    Q. Mattioli先生,什么是Ferrari Corse Clienti?
    A. 这是法拉利工厂内的一个部门。
    Q. 你可以为法庭记录员和陪审团拼写一下Corse Clienti吗?
    A. 当然。C-O-R-S-E,然后空格,Clienti,C-L-I-E-N-T-I。
    Q. Corse Clienti是什么意思?
    A. 赛车客户。
    Q. 你说Corse Clienti是法拉利的一个部门。Corse Clienti的职责是什么?
    A. 他们负责组织和推广这个项目,管理他们控制下的几个项目,提升法拉利客户体验。他们销售专门为赛车场打造的车辆,并且他们组织世界各地的活动让车主享受他们的车辆。
    Q. 任何人都可以参与Ferrari Corse Clienti的计划吗?
    A. 不行。他们需要被法拉利工厂选中。
    Q. 有人如何被工厂选中?
    A. 嗯,我不太清楚他们的所有标准。我知道实际上,你提交名字,然后他们会进入等候名单,通常会有等候名单,然后工厂决定从这个名单中挑选谁。
    Q. Ferrari的XX项目是什么?
    A. XX项目属于Corse Clienti部门。这是一个允许客户驾驶这辆专为赛车场建造的特殊车辆的项目,它被称为FXX。
    Q. 什么是法拉利FXX?
    A. 法拉利FXX是一辆基于LaFerrari的街道车辆开发而来的汽车。Ferrari LaFerrari,这是车辆的名称。它是为赛车场开发的,他们增加了防翻架并以多种不同方式修改了车辆,再次强调,仅用于赛车场。
    Q. 一辆法拉利FXXK能开多快?
    A. 超过200英里每小时。
    Q. 驾驶法拉利FXXK需要接受什么培训,如果需要的话?
    法拉利FXXK轮胎信息
    问题 答案 关于法拉利FXXK轮胎的查询 关于轮胎更换频率和每个轮胎的成本的回应 法拉利FXXK轮胎信息
    问题 答复 Q. 法拉利FXXK上的光滑胎需要多久更换一次? A. 这要视您追求的性能水平而定,因为很显然,新轮胎会提供更高的性能,但一般来说,您会更换轮胎,这取决于您每天行驶的公里数,但通常在赛道上,每天更换一次。 Q. FXXK上的这些轮胎价格是多少? A. 20 - 我不太确定因为我不直接销售它们,但我觉得大约是2500。 1870
    问:生产了多少辆? 答:法拉利从未透露总数。我估计大约有40辆。 问:法拉利FXXK的价格大约是多少? 答:是指新车的价格还是现在的价格? 问:好的,那么法拉利FXXK的价格范围是多少呢? 答:目前是这样吗? 问:是的。 答:我认为现在大约在600万到650万之间。 问:法拉利FXXK是如何购买和出售的? 答:是指新车还是二手车? 问:好的,让我们先从新车开始。一辆新的法拉利FXXK是如何购买或出售的? 答:好的。那么对于新车,法拉利会发布新车型,揭开新车面纱,经销商会向工厂提交名单,交给法拉利工厂,他们会挑选谁将获得这辆车。 问:那么二手的法拉利FXXK是如何购买和出售的? 答:二手车有些不同。有些车辆会在市场上出售,进行广告宣传,但法拉利更偏向于通过法拉利自己出售,所以任何有车辆可供出售的人都应该通知法拉利工厂的特别部门。
    问:你认为法拉利更喜欢通过法拉利出售二手FXXK的原因是什么?
    1871
    答:他们喜欢了解谁会购买这辆车,这是一种俱乐部,所以他们支持这款车,准备这款车,储存这款车,所以他们只是想了解他们正在交易的对象。 问:Mattioli先生,您有参与过法拉利FXXK的购买或销售吗? 答:有。
    HORTON先生:Loftus女士,请您找出作为证据的被标记为GX Stip 8的认可文件。请将其公布出来。这是关于文件的一份认可文件。在相关部分,文件显示,各方已同意列在认可文件B列中的展品是政府合法获取的,属实的记录,是由A列中所列实体的具有知情的相关人士在或靠近事发时创建的,或根据信息传达而来的;这些记录是在常规活动过程中保存的;相应实体制作这些记录是其常规做法。
    Loftus女士,请您翻到该认可文件的第二页。好的,谢谢。在A列的实体一栏,倒数第二行
    1872
    O6A1GUO1 Mattioli - Direct
    审判记录
    行号 对话 无 该表包含了与Government Exhibits 802和BR440在审判中的准入相关的对话记录,以及关于FXXK EVO购买协议的讨论。 行号 对话内容 1 顶部显示 Ferrari S.p.A.,相关的证据是GX 801和GX 802。 3 Loftus女士,我们可以翻到第三页,第三段,请看。 5 它说,双方进一步同意,本协议以及列在B栏中的政府展品可以在审判中作为政府展品接收。 8 法官阁下,在此根据这一协议,政府提出GX BR440和GX 802。 10 法庭:它们被录入。 11 (政府的展品802和BR440作为证据收到) 12 HORTON先生:Loftus女士,请您发布一下GX 802。 14 法庭:协议本身是否作为证据呈现? 15 HORTON先生:是的,法官阁下。 16 法庭:好的。 17 HORTON先生:请您发布这个,并向见证人展示第1页和第2页。 19 HORTON先生询问: 20 问:Mattioli先生,这是什么文件? 21 答:购买协议。 22 问:购买协议是针对什么的? 23 答:一辆FXXK EVO。 24 问:这份购买协议的日期是? 南区报告员有限公司(212)805-0300
    1873
    O6A1GUO1 马蒂奥利 - 直接询问
    1 A. 2021年5月18日。
    2 霍顿先生:洛夫图斯女士,能翻到第二页吗?
    3 Q. 马蒂奥利先生,在卖方签名行上方签了字的是谁?
    A. 是我。
    4 Q. 马蒂奥利先生,在这次交易中您扮演了什么角色?
    A. 我促成了这次交易。当时的车主想要出售他的车,我随后通知了法拉利工厂,告知他们 Corse Clienti 计划,即我们有这辆车出售。
    5 Q. 在同一页上您的签名行下方,写着购买方是 Stichting Administratiekantoor StillWeRise。马蒂奥利先生,这个实体在交易中扮演了什么角色?
    A. 我认为是买家。
    6 Q. Stichting Administratiekantoor StillWeRise 是什么机构?
    A. 不清楚。
    霍顿先生:洛夫图斯女士,请翻到购买协议的第一页。然后请放大标号为1的段落。
    7 Q. 马蒂奥利先生,您能读一下这段话吗?
    A. 当然。“这确认了我们的协议,根据协议,我们同意出售给你,而你同意购买我们的车辆”
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    1874
    O6A1GUO1 马蒂奥利 - 直接询问
    1 法拉利 FXXK EVO 车架号 240860('车'或'FXXK'),如附表C所述。”
    Q. 马蒂奥利先生,240860 号车架是什么?
    A. 这是一个VIN。是车辆识别号码。
    Q. 车辆识别号是什么?
    A. 每辆车都有这个独特的号码。它们与生俱来。
    霍顿先生:洛夫图斯女士,请再次缩小并突出显示标号从2开始直到第3号上方。然后放大,请。
    Q. 马蒂奥利先生,这里写明约定的购买价格是 400 万美元。您看到了吗?
    A. 看到了。
    Q. 在这段文字下方写着,“约定价格将分两次支付:等于 50 万美元的不可退款定金。”您看到了吗?
    A. 看到了。
    Q. 随后写着,这笔款项将在 Ferrari Corse Clienti XX 计划团队对车辆进行技术检查后支付给买方以供他批准。XX 计划团队对车辆的技术检查是什么意思?
    A. 这是一项交付前检查,以确保车辆状况良好。
    Q. 下方写着,余额等于 350 万美元将不迟于 2021年6月15日支付。您看到了吗?
    A. 看到了。
    Q. 马蒂奥利先生,这种支付结构对这种交易是典型的吗?
    A. 是的。
    霍顿先生:请翻到第2页并放大第11段。
    Q. 马蒂奥利先生,请读一读这段文字。
    A. “按照车辆制造商法拉利 S.p.A. 的要求,您被要求在此签署附件 B,该附件规定了关于车辆保修、使用、转让等问题的一定数量问题。”
    霍顿先生:洛夫图斯女士,请带我们转到这个同一展品 GX 802 的第4页,并简要浏览第4-6页。
    好的,请带我们回到第4页。
    Q. 马蒂奥利先生,这是什么文件?
    A. 这是法拉利 S.p.A. 的声明书。
    Q. 这份文件在 FXXK 交易中扮演了什么角色?
    A. 这是他们要求的。这是一份必须签署的附件 B。
    Q. 在您与法拉利打交道的 25 年里,您有多频繁看到这样的文件?
    A. 只有在处理像这样的特殊车辆时才会遇到。
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    1876
    法律讨论记录
    行号 对话 行号 对话 1 法拉利——法拉利的声明,是的。 2 问:根据声明,上面写着,“签署人作为FXXK EVO汽车底盘240860的买方,从卖方处购买。” 3 霍顿先生:洛夫图斯女士,请放大第1段的同意书。 4 问:在她这么做的时候,马蒂奥利先生,什么是同意书? 5 答:同意书是描述汽车是否符合街道合法要求,并遵守汽车所在国家规定和法规的术语。 6 问:请您读一下第1段的第一句话。 7 答:是的。“如上所述,购买人明白FXXK EVO不符合任何国家街道合法车辆的当前安全和排放标准。” 8 霍顿先生:洛夫图斯女士,如果你去这份同一个GX 802展品的第5页,请放大写着转让的部分。 9 问:马蒂奥利先生,您可以读一下前两行。从第5开始。 10 答:“在FXXK EVO转让的情况下,购买人同意立即通知法拉利有关受让方的身份。” 11 问:马蒂奥利先生,这项条款的目的是什么? 12 答:通知工厂任何这种特定车型的所有权变更。 13 问:法拉利要求所有销售的汽车都这样吗? 南区记录员机构(电话:212-805-0300)
    1877
    法庭证词
    问题 回答 这辆法拉利Corse Clienti赛车的所有权是否发生过变更? 是的,这辆赛车的所有权在去年进行了一次变更。 这辆赛车在法拉利设施内存放了多长时间? 这辆赛车在法拉利设施内存放了大约六个月的时间。 谁在文件上签署了所有权转让的文件? 我和另一位法拉利车主签署了这份文件。 法庭文件转录
    问题 回答 1 A. 不,他们——再次,这仅针对特定建造的Corse Clienti赛车而言。 2 Q. 为什么法拉利要求Corse Clienti赛车的所有者在所有权变更时通知他们呢? 3 A. 嗯,我认为他们想知道,他们是否一直在处理那辆车,是否存放在他们的设施里。 4 Q. 为什么这些车大多数存放在法拉利的设施里? 5 A. 是的。 6 Q. 对不起,请问为什么它们大多数存放在法拉利的设施里? 7 A. 因为它们得到了法拉利的支持。所以法拉利的技术人员,他们在工作——在工厂内维护这些车辆;这些车由他们管理和维护。 8 HORTON先生:Loftus女士,请您转到同一展品GX 802的第6页,并放大签名栏、日期和签名栏。谢谢。 9 Q. Mattioli先生,签名栏下方出现了谁的名字? 10 A. 郭先生。 11 Q. 您知道他是谁吗? 12 A. 不知道。 13 HORTON先生:Loftus女士,请您将我们带到同一展品GX 802的第20页。 14 Q. 顺便问一下,Mattioli先生,我们之前看过的文件。 1878
    O6A1GUO1 Mattioli - Direct
    提到了一个FXXK EVO。FXXK EVO是什么?
    A. 这是一款专门为赛道目的而建造的,由法拉利工厂制造。
    Q. FXXK和FXXK EVO之间有什么区别,如果有的话?
    A. 是的。EVO是那个型号的第二代车型。所以首先推出了FXXK,然后工厂生产了少量额外的单位,并提供了一个升级套件,以将第一代车辆升级为EVO。
    Q. 马蒂奥利先生,在你面前的屏幕上查看GX 802第20页,标题显示为FXXK EVO底盘号24860。你看到了吗?
    A. 是的。
    Q. 这个页面上的内容是什么?
    A. 这辆车。
    Q. 这辆车是你所处理交易中的那辆车吗?
    A. 是的。
    霍顿先生:洛夫特斯女士,请显示证据为GX BR440第13页的内容。
    谢谢。
    Q. 马蒂奥利先生,这是什么文件?
    南区记者公司记录员电话:(212)805-0300
    电汇细节
    问题 答复 无 无 线转帐细节
    问题 回答 1 A. 这是款项收据。 2 问:款项由谁接收? 3 A. Ferrari Beverly Hills。 4 问:资金是由谁发送的? 5 A. Fiesta Property Developments Ltd。 6 问:这笔电汇的日期是什么? 7 A. 2021年5月26日。 8 问:这笔资金是用于支付什么的? 9 A. 这是预订FXXK EVO 24860的订金。 10 问:您了解Fiesta Property Developments是什么吗? 11 A. 不了解。 霍顿先生:洛夫特斯女士,请记录下来。
    请将证据中标记为GX 802第28页的内容展示出来。
    然后请放大显示第28页顶部下方约10%处开始的电子邮件内容。
    电子邮件详情
    收件人 发件人 日期 主题 无 无 无 无 邮件详情
    问题 答案 收件人 先生 Mattioli,这封电子邮件是发送给法拉利公司的一位高管的。 发件人 Adalberto Cattabriga,他是负责 Corse Clienti(客户赛车部门)特别销售的先生。 日期 2021年6月15日。 主题 FXXK EVO 底盘 24860。 南区记录员公司(212)805-0300
    1880
    问:这封电子邮件开头是:"亲爱的Catta,感谢您的电子邮件以及您在电话中花费的时间。虽然我们理解关闭的延迟是由工厂的检查引起的,但我们目前面临买方违约,依据协议。"马蒂奥利先生,什么是买方违约? 答:当买方未根据协议履行义务时。 问:您在6月15日发送这封电子邮件的目的是什么? 答:嗯,征求,你知道的,结束和资金以及成功完成交易。 问:请阅读您发送这封电子邮件的收件人的电子邮件地址。 答:Cattabriga,Adalberto,adalberto.cattabriga@ferrari.com。Alex Soltani,asoltani@skyviewcapital.com—— 问:对不起,马蒂奥利先生。您可以只阅读电子邮件地址旁边的姓名,除非那里没有姓名。 答:哦,好的。Balli,Francesco;Gandini,Matteo。 问:最后一个电子邮件地址是什么? 答:没有名字。 问:好的。它写着ukistruehome@gmail.com吗? 答:是的,正确的。
    HORTON先生:谢谢您,洛夫图斯女士。您能否为证人和各方展示标记为GX BR1604的文件。
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    1881
    O6A1GUO1 马蒂奥利 - 直接
    问:马蒂奥利先生,这是什么文件?
    答:这是我收到的一封电子邮件。
    问:你什么时候收到这封电子邮件?
    答:它写着2021年6月15日。
    问:这封电子邮件与我们刚才看过的你那天发送的电子邮件有什么关系吗?
    答:这是这个人对我邮件的回复。
    HORTON先生:法官,请政府提供GX BR1604。
    SHROFF女士:无异议,法官。
    法官:准许。
    (政府的展品BR1604收到证据)
    HORTON先生:洛夫图斯女士,请放大到电子邮件的顶部,请看链条中的第一封电子邮件。
    由HORTON先生:
    问:这封6月15日发给你的电子邮件来自谁,马蒂奥利先生?
    答:您能重复问题吗?
    问:6月15日谁给你发了这封电子邮件?
    答:它写着Mileson ukistruehome@gmail.com。
    问:您能读一下他那天发给你的电子邮件吗。
    答:当然。“亲爱的各位:我不明白这封电子邮件,我们正在尽最大努力保持耐心,并尽快推动交易。我们已经等待付清发票余额几周了。我了解工厂的延迟,我非常支持法拉利。然而,看到这封来自法拉利比佛利山的邮件”
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    1882
    O6A1GUO1 马蒂奥利 - 直接
    1 是非常令人不愉快的,没有人试图在这里'违约'。
    2 问:马蒂奥利先生,您收到这封电子邮件后,有什么反应吗?
    3 答:我并不太记得。
    4 问:您对发件人在交易中的角色了解多少?
    5 答:我没有。我想我收到这封邮件感到惊讶。
    6 HORTON先生:洛夫图斯女士,请放上标记为GX BR802的文件。已在证据中。然后是第27页。
    7 如果您能将从卡塔布里加先生发送给马蒂奥利和其他人的电子邮件放大。
    8 问:马蒂奥利先生,这是您同一天收到的电子邮件,2021年6月15日星期二。您看到了吗?
    9 答:看到了。
    10 HORTON先生:洛夫图斯女士,如果您能
    11 连接—抱歉—如果您能将"说到这里"和"请在这里签署该声明"的段落放大。
    12 问:马蒂。
    8A. 我没有。收到这封邮件时我感到很吃惊。
    9HORTON先生:Loftus女士,请您展示标记为GX BR802的文件。这已经作为证据。请翻到第27页。如果您能放大Cattabriga先生发给Mattioli先生和其他人的电子邮件。
    10问题:Mattioli先生,这是您于同一天收到的邮件,即2021年6月15日星期二。您看到了吗?
    11答:看到了。
    12HORTON先生:Loftus女士,如果您可以将“即将到期”和“请在此处签署声明”两段放大。
    13问题:Mattioli先生,在邮件中间的那段话说:“即将到期,我附上一份声明,确认截止日期为2021年6月18日星期五;根据合同,将于明天早上开始将FXXK跑车转移到瑞士。”
    14Mattioli先生,为什么这次交易中的FXXK跑车要转移到瑞士?
    15A:这辆车处于保税状态。
    16问题:这次交易的哪一方决定将车辆转移到瑞士?
    17A:工厂,法拉利。
    18问题:在这笔交易中,工厂代表哪一方,如果有的话?
    19A:买方。
    20HORTON先生:Loftus女士,请将这段内容收起并展示标记为GX BR440的文件,并翻到第8页。
    21然后放大一下——谢谢。
    22问题:Mattioli先生,这是什么文件?
    23答:这是一份资金收据。
    24问题:谁收到了这笔资金?
    25答:法拉利比弗利山庄。
    由HORTON先生提问:
    Q:Mattioli先生,这是您一直在作证的FXXK交易的销售单吗?
    A:是的。
    Q:在这份文件版本中,购买者一栏是空白的。这笔交易最终进行了吗?
    A:是的。
    HORTON先生:法官,请给我一点时间。
    法院:好的。
    1885
    O6ABGUO2 Mattioli - 直接提问
    由HORTON先生提问:
    Q:Loftus女士,你能突显一下第七页1601上的购买者栏吗?对不起。那个右侧有文本的购买者栏。
    对于最终的销售单,Mattioli先生,买家实体的名称是什么?
    A:Fiesta Property Development。
    Q:Mattioli先生,我们看了您在6月15日收到的来自MilesonUKIsTrueHome@gmail.com的邮件。您是否曾与Mileson面对面见过?
    A:据我所知,没有。
    Q:您是否曾与Mileson通过电话交谈?
    A:不记得曾经与他通话过。
    Q:作为这次交易的卖方代表,您进行了哪些尽职调查?
    A:在这次交易中,我们并没有进行任何尽职调查,因为买方直接来自法拉利工厂。
    Q:在寄售销售中这样做是否常规?
    A:我不会说这在寄售销售中很常见。我会说当你通过工厂并且他们选择买家时,你只是依赖法拉利工厂。
    Q:Mattioli先生,这笔交易有没有任何地方特别引起您的注意?
    A:什么意思?
    Q:那时对您来说是否有任何异常的地方?
    SOUTHERN DISTRICT REPORTERS,P.C.(212)805-0300
    1886
    A:没什么特别的感觉,没有。
    HORTON先生:如果我可以再来一点时间,
    法官。
    (停顿)
    HORTON先生:谢谢,法官。
    Q:Mattioli先生,汽车是在哪一年交付给买家的?
    A:不,车辆在交易后转到了瑞士,我不记得具体日期。
    HORTON先生:谢谢。法官,没有进一步的问题。
    法院:交叉询问。
    SHROFF女士:谢谢,法官。
    交叉询问
    由SHROFF女士提问:
    Q:早上好,Mattioli先生。
    A:早上好。
    Q:我们讨论的汽车品牌是法拉利,对吗?
    A:是的。
    Q:我们谈论的这辆法拉利FXXK非常独特,您同意吗?
    A:正确。
    Q:即使我有购买它的钱,我仍然需要经过法拉利的审核才能购买,对吗?
    对话记录
    发言者 对话内容 问话者 你好,我想了解一下法拉利的车型有哪些? 答话者 你好,法拉利目前有488系列、812系列和SF90 Stradale等经典车型。 问话者 我听说法拉利有专门针对客户的定制计划,可以介绍一下吗? 答话者 是的,法拉利提供Tailor Made和One-to-One等个性化定制服务,满足客户不同需求。 问话者 客户定制服务是否需要长时间等待? 答话者 是的,由于定制需求较高,通常需要加入等待名单,并根据情况安排生产时间。 对话记录
    发言者 对话 Q. 所以有可能有50人手里有相同数量的钱想要买这辆车,而法拉利工厂会挑选这50人中的哪位可以购买,是吗? A. 是的。我是说,有一个等待名单。我不知道是不是50人。 Q. 当然了。谁不想要一辆法拉利呢,是吧。那么,这辆车每年的价值,是趋向于增加还是减少? A. 趋向于增加。 Q. 现在,您作证提到过这个,您称之为什么来着,clienti?叫什么来着? A. 可能是Corse Clienti。 Q. 是的。那是法拉利的一个项目吗? A. 是的。 Q. 那这个项目是关于什么的? A. 这个项目是关于增强客户对赛道活动的体验。 Q. 那我要回到赛道活动。进入这个clienti项目的等待名单也很长,对吗? A. 确实有等待名单。 Q. 而政府一直在询问您关于Mileson Guo这个人,对吧,您记得在询问环节很多问题都是关于Mileson Guo先生的是吧? 南区速记员公司(212) 805-0300
    1888
    法庭证词对话 | 问题 | 回答 |
    法庭证词对话
    问题 回答 Q. 今天坐在这里,你知道Mileson Guo自从何时开始成为Ferrari的客户吗? A. 是的。 Q. 如果我告诉你他自2011年起就是一位客户,你也不知道? A. 没有头绪。 MR. HORTON: 抗议,这是纯属推测。   MS. SHROFF: 我会重新措辞。撤回问题,再试一次。   Q. 在你来作证之前,你与这位先生一起仔细过所有这些名字,是吧?指的就是这位先生,对吗? A. 什么名字,抱歉? Q. Miles Guo,Fiesta Properties,你在准备时和他一起过一遍这些名字了,对吗? A. 是的,我们看了这些名字。 Q. 你有没有偶然查看Miles Guo成为Ferrari客户的时间跨度? MR. HORTON: 抗议,误解陈述。 MS. SHROFF: 这是关于他是否查看过Mileson Guo是顾客的成为顾客的时间跨度的问题。这只是一个问题。   法庭:你可以回答。   Q. 你查过吗? A. 没有。 南区记录员,有限公司(212)805-0300
    1889
    问:检察官是否要求你查看郭明的法拉利客户资历有多久了? 答:没有。 问:然后你谈到了一个叫Curso Pilota的项目。那是什么东西? 答:我不确定我是否谈到了Curso Pilota,但是,是的,那是一个项目。 问:你能告诉陪审团那是什么吗? 答:是的。Curso Pilota是一个项目。它是法拉利开办的一个驾驶学校,旨在进一步开发法拉利客户的驾驶技能。 问:他们也参加赛道活动吗? 答:谁? 问:Curso Pilota。 答:我不明白问题是什么。 问:我再试一次。现在,让我问你这个:正确的话,有一份向法拉利工厂提出的购买请求,是为了这辆试验性车,对吗? 答:我会这么认为。我没有看到这个请求。 问:你们经销商恰好有一辆符合工厂要求的车,对吗? 答:是的。我们有一辆试验性车,并立即通知法拉利工厂部门我们有这辆车可供销售。 问:你和法拉利工厂密切合作,对吗?
    南区记录员,有限公司(212)805-0300
    1890
    对话记录
    说话人 对话内容 对话记录表
    发言者 对话 A. 嗯,我在法拉利工厂工作多年了。 Q. 确切地说,你信任他们能够完成他们的工作,对吧? A. 是的。 Q. 他们也信任你能够完成你的工作,对吧? A. 我想是的。我不确定。我希望是的。 Q. 说得对。但是法拉利工厂和你都在努力确保这次销售成交,对吧? A. 是的。 Q. 请把802号政府展示品802号还给我。 您还记得检察官问你有关这份文件的问题,对吧?   A. 是的。 Q. 这是一个非常标准的文件,对吧? A. 是的。 Q. 请把它放大一点,看到填写了日期。这是你填写的,对吧? A. 是的。 Q. 如果我可以看第二页。你被列为卖方,对吧? A. 是的。 Q. 然后下面是一个买方。我看不太清楚那个很长的名字,最后写着"Still We Rise",对吧? A. 是的。 Q. 收到这份文件时,你什么也没看到。 南区记录员公司(212) 805-0300
    1891
    汽车存储和转让的证人证词, 附表标题如下: 证人证词, 附表列如下:
    问题:无
    回答:无
    对汽车存储和转移的证人证词, 以下是表格标题: 证人证词, 以下是列:
    问题: None
    回答: None
    1 它有什么异常之处。您只是继续了销售的下一步, 2 对吧? 3 A. 正确。 4 Q. 您没有回复并说,这个购买者是哪家公司或其他信息吧。这不是您询问的部分,对吧? 5 A. 正确。 6 Q. 现在,您在直接证词中作证,关于汽车存储在法拉利设施中的某些内容,对吧?您还记得那段证词吗? 7 A. 是的。 8 Q. 那么,汽车存储在法拉利设施中是非常普遍的,不是吗,因为这辆汽车需要像一岁的孩子一样多的关注,对吧? 9 HORTON先生:形式上提出异议。 10 法官:你可以回答。 11 A. 我不知道它是否需要那么多关注,但我有三个孩子,所以我了解这个话题。是的,这辆车,通常会被留在工厂的存储处。 12 Q. 当您作证说这辆车被转移到瑞士时,您真的知道它是否到达了瑞士吗? 13 A. 不,我当时不在那里。 14 Q. 那么您不知道这辆车现在在哪里,对吧? 南区记录员公司(212)805-0300
    1892
    法庭对话记录
    | 问题/回答 | 辩方检察官和证人之间的对话 |
    请让我知道您需要翻译的具体内容,我会尽力帮助您完成翻译。
    法庭对于检察官和证人之间关于交易延迟的对话记录
    问题/回答 检察官和证人之间的对话 A. 现在,不,绝对没有。   Q. 你确定你甚至不知道它是否离开去瑞士了,对吗?   A. 是的,确实。   Q. 现在,检察官问你关于这个“违约问题”。如果我能回到第802页的第八页。你被问到这封电子邮件往来了,对吗?   A. 是的。   Q. 你看到那部分写着,“虽然我们知晓关闭的延迟是由工厂的检查引起的,对吗。你看到了吗?   A. 是的。   Q. 那么可以说并不是买方的错导致事情延迟,对吗?是检查导致了延迟。我的理解是正确的吗?   A. 嗯,我觉得是一个结合体。   Q. 在哪里写着是一个结合体?   Q. 那封电子邮件收到回复了,对吧?我可以给他看回复,也给陪审团看。   A. 你说你对这封回复感到惊讶,因为顶部写着一个叫Mileson的人的名字,对吧?   南区记录员有限公司(212)805-0300
    1893
    两个人讨论电子邮件往来和回复的对话。
    | 电子邮件往来对话 |
    问题 回答 询问 对问题的回复 对话:两人讨论电子邮件沟通和回复。
    问题 回答 1 A. 是的。 2 Q. 邮件里说,我不明白这封邮件。我们正在尽最大努力保持耐心。他告诉你,他在保持耐心,对吗,Mileson在保持耐心? 3 A. 是的,他就是这么说的。 4 Q. 你看过这封邮件,对吧? 5 A. 是的。 6 Q. 你在邮件链上,对吗? 7 A. 是的。 8 Q. 你没有回复说,嘿,伙计,是你拖延的原因,对吗? 9 A. 我不知道他是谁。 10 Q. 对,所以你没有这么说。你没有说这是多种因素的结合。你没有告诉他说,你导致了延误。你没有对他说这些中的任何一点,对吗? 11 A. 这是一个问题吗? 12 Q. 是的。 13 A. 所以问题是 - 抱歉,我是否回复了这封邮件?这是问题吗? 14 Q. 是的。 15 A. 我没有回复这封邮件。 16 Q. 你也没有回复其他人,也没有把Mileson从邮件链中去掉,并说,嘿,谁是这个回复的家伙,对吧? 17 A. 没有。 南区记录员有限公司(212)805-0300
    问:先生,您能告诉我SkyViewCapital.com是谁吗?pat是谁? 答:在这笔交易中,pat是卖方。 问:卖方,对吗? 答:是的,委托人。 问:所以卖方知道Mileson是谁,因为卖方没有回复任何关于Mileson这个人的信息,对吗? HORTON先生:抗议,法官大人。 法官:抗议驳回。你可以回答。 答:那么问题是什么,抱歉? 问:问题是,你说你收到来自某人的邮件感到惊讶。我的问题是,没有人提到“惊讶”,对吧? 答:我不知道其他人做了什么。 问:嗯,你在邮件链条上。你没有收到任何其他人的邮件,提到MilesonUKIsTrueHome这个人的名字,对吧? 答:我记得我收到Cattabriga的回复邮件。 问:内容是什么? 答:感谢我们的耐心,并给予我们更多的指示来完成这笔交易。 问:谢谢。我们可以结束这个问题。 现在,您作证说您认为Ferrari工厂代表卖方还是买方?
    南区记录员有限公司(212)805-0300
    法庭文件
    演讲者 对话 法官 本案是关于费拉利汽车销售的纠纷。请双方代表出庭并陈述你们的观点。 原告代表律师 尊敬的法官,我代表原告,我们认为费拉利工厂在销售过程中存在欺诈行为。他们销售的某些汽车并非原装配备,造成了消费者的损失。 被告代表律师 尊敬的法官,我代表被告,我们对原告的指控提出异议。费拉利工厂严格遵守法律法规,我们将提供证据证明这一点。 法官 原告和被告双方有权提供证据支持自己的观点。下次开庭将听取双方证人证词。现在休庭。 法庭文件
    演讲者 对话 霍顿先生:抗议。   法官:你可以回答。   A. 他们代表当时的买方。   问:那么法拉利工厂告诉你他们——有一位感兴趣的买家,是吗?   答:是的。   问:谁从销售中获得佣金,法拉利工厂还是你?   答:是我获得佣金。   问:法拉利工厂在销售中没有任何经济动机,是吗?   答:据我所知没有。   问:确切地说,法拉利工厂的唯一工作是确保卖方是适合法拉利的,对吧?   答:正确,是的。我会这样描述。   问:法拉利对购买其汽车的人非常挑剔,对吧?   答:是的。   问:因此,贾斯汀·比伯(Justin Bieber)例如,不能再购买法拉利,因为他对法拉利汽车型号进行了更改,是吗?   答:我不知道这样的情况。   问:现在,你知道这个项目,法拉利鼓励赛道日(track days),以便这类车的购买者可以在特定环境中享受汽车,是吗?   南区速记员股份有限公司(212)805-0300
    1896
    法拉利赛道活动与管理讨论,以下是表格标题: 法拉利赛道活动与管理, 以下是列:
    问题/回答:无
    法拉利赛道活动和组织讨论,
    序号 问题/回答 1 A. 是的。 2 问:每年有五个赛道日期,是吗? 3 答:我觉得每年都会变化。有一个时间表,可能是五个,可能是六个,七个。 4 问:在那一天,法拉利会组织类似于一个巨大活动,对吗? 5 答:法拉利在赛道上宣传这一天,是的。 6 问:他们会邀请Clienti项目的人参加,对吗? 7 答:是的。 8 问:他们有赛车教练教车主如何驾驶这些汽车,对吗? 9 答:对,是的。 10 问:人们会带着他们的朋友、家人、同事来参加这个活动,对吗? 11 答:我看到过,是的。 12 问:有很多人在这些赛道周围购买房产,这样他们就可以参加这些活动,并可以为公司或同事做宣传,对吗? 13 霍顿先生:对范围提出异议。 14 法庭:你可以回答。 15 答:我不知道。 16 问:现在,在这些赛道日期,法拉利把车辆带到赛道上,对吗? 17 答:是的。我会说大多数时间法拉利都负责运输,但并非百分之百的时间。 1897
    O6ABGUO2 Mattioli - Cross
    大多数时间是的。
    法官:车主通常把车停在哪里?
    证人:嗯,通常来说如果你活跃于这个计划,也就是说你喜欢开车,你会把车留在工厂,这样他们可以准备车辆、管理和维护。其他车主,比较偏向收藏的,他们会把车带回家。
    法官:那些想要参加赛车比赛的人必须一直去意大利吗?
    证人:不是的,他们实际上在世界各地都有活动。
    法官:请继续。
    由Shroff女士:
    Q. 先生,可以这样说吗,像您这样的某些经销商或者欧洲的经销商也为这些车举办活动吗?
    A. 不,我们不为这些特定的车举办活动。
    Q. 现在,法拉利工厂会提供存储这些车辆的服务,对吗?
    A. 是的。
    Q. 他们帮助您维护车辆,对吗?
    A. 是的。
    Q. 如果您想要被接送去或从赛道,他们确保所有这些安排都由法拉利负责,对吗?
    1898
    法庭文件讨论关于法拉利工厂的汽车与遥测程序以及赛道活动拍摄之间的问题, 表格标题如下: 关于遥测程序和赛道活动拍摄的法庭文件讨论 以下是表格列标题:
    问题/回答: 无
    法庭文件讨论有关法拉利工厂汽车的遥测程序和赛道活动录像
    问题/回答 无 1 A. 是的,法拉利提供这些服务。 2 Q. 你知道什么是遥测程序吗? 3 A. 遥测? 4 Q. 是的。 5 A. 是的。 6 Q. 你能告诉陪审团这是什么吗? 7 A. 好的。在赛车中,为了提高性能,你要分析大量数据,遥测就是一个可以帮助你收集这些数据,从而帮助你提高性能、更快地行驶的程序。 8 Q. 当举办这些赛道活动时,他们会拍摄录像,然后将这些录像交给现场观众,这是正确的吗? 9 A. 每辆车基本上都装有摄像头,例如Gopro摄像头,这只是一个示例,不是在使用该品牌,仅用于举例。所以,每一圈都被录像了,再加上遥测数据,你就可以向驾驶员展示可以改进的地方,何时刹车,弯道的路线在哪里,给出指导。 10 Q. 关于这辆特别的车 - 他们向您展示了一张照片等等。我不会再重提这点。但我只想确认我正确理解了您的证词。 11 在今天坐在这里,您不知道这辆车是否曾离开法拉利工厂,是吗? 12 HORTON先生:反对,问题已经问过并回答过了。 13 法庭:维持。 1899
    问:先生,当您审查霍顿先生的文件时,您发送给他文件了,是吗?
    答:是的。
    问:您向他发送了电子邮件,比如我们现在看到的这些?
    答:是的。
    问:可以说您没有向他发送任何文件证实这辆车被运往瑞士,是吗?
    答:我不记得是否有一份货运单,提单。肯定有些东西。
    问:只有在这辆车实际被运输时,是吗?
    霍顿先生:反对,问题已经回答过了。
    法庭:维持。
    问:您没有给他任何提单,是吗?
    霍顿先生:反对,问题已经回答过了。
    法庭:你可以回答。
    答:我不记得了。
    乎受:感谢法官。没有进一步问题。
    法庭:重新问问吗?
    霍顿先生:没有进一步问题。谢谢。
    法庭:那么购买这个特定型号的个人,通常是司机还是其他人?
    证人:我想对大多数情况是司机。
    法庭:谢谢。你可以离开了。
    南区记录员,P.C. (212) 805-0300
    1900
    O6ABGUO2 Mattioli - 交叉
    1 (证人被允许离开)
    法庭:检方可以传唤下一位证人。
    梅瑞女士:法官,政府的下一个证人是海萨姆·哈立德。我们是否可以休息五分钟。我们需要为下一个证人向陪审团分发一些材料,需要几分钟时间。
    法庭:好的。陪审团成员,我们将休息五分钟。你们不要讨论这个案件。不要阅读、观看或听任何关于这个案件的内容。
    (休息)
    法庭:请让陪审团进来。
    梅瑞女士:法官,您是否希望证人在座位上?
    法庭:是的,请让证人上座。
    (陪审团到场)
    法庭:请坐下。
    哈立姆·哈立德,作为政府传唤的证人,已经宣誓作证,作证如下:
    法庭:请坐下。请说出您的姓名,拼写并将麦克风放近你。
    证人:海萨姆·哈立德,H-A-I-T-H-A-M,
    1901
    O6ABGUO2 Khaled- 直诉
    1 K-H-A-L-E-D。
    法庭:你可以提问了。
    梅瑞女士:谢谢您,法官。
    直接询问
    梅瑞女士:早上好,哈立姆先生。
    哈立德:早上好。
    梅瑞女士:您住在哪里?
    哈立德:纽约长岛。
    梅瑞女士:您的工作是什么?
    哈立德:我是一名抵押贷款银行家,同时还有一家咨询公司。
    梅瑞女士:在您现在的工作之前,您做过什么?
    哈立德:我曾在GTV和Saraca工作过。
    梅瑞女士:您曾为Miles Guo工作过吗?
    哈立德:是的。
    梅瑞女士:您能在法庭上看到郭先生吗?
    哈立德:可以。
    梅瑞女士:您能通过他所坐的位置和他穿着的衣物来识别他吗?
    乎受:法官,我们将认定郭先生坐在辩护方的桌子旁。
    法庭:好的。
    哈立徳:就在那边,穿着灰色。
    梅瑞女士:哈立姆先生,您曾为一个个人工作过吗?
    南区记录员,P.C. (212) 805-0300
    1902
    O6ABGUO2 Khaled- 直诉
    对银行关系和与银行的诚实相关的问题和回答的对话记录, 下面是表格的标题: 对话记录, 下面是列名:
    问题: 无
    回答: 无
    法庭对话记录
    问题 回答 1 你的名字叫Yanping Wang或Yvette Wang吗? 2 是的。 3 你为郭文贵和Yvette Wang做了什么工作? 4 我负责银行关系。 5 在那个岗位上,你和银行有哪些沟通? 6 我负责为各种实体和个人开设银行账户。如果在交易过程或关闭账户时出现问题,我会与他们沟通。 7 在为郭文贵和Yvette Wang工作期间,你对银行始终如实吗? 8 不是的。 9 为什么要向银行撒谎? 10 为了确保账户被开立并继续开立。 11 这是因为这是你的工作的一部分吗? 12 莎菲女士:对引导提出异议。 13 法官认为:不要引导。 14 在你的工作过程中,这些与银行的沟通是否是履行职责的一部分? 15 是的。 16 Khaled先生,有没有一次被FBI接触过你? 17 是的。 南区记录员报告公司(212)805-0300
    1903
    问:大约是什么时候? 答:是2021年11月。 问:FBI接触你时,他们问了你什么问题吗? 答:是的。 问:你当时回答了他们的问题吗? 答:没有,我转给了他们。 问:在2021年11月FBI接触你之后,你是否咨询了一名律师? 答:是的。 问:你是否有过与美国检察官办公室见面的时候? 答:是的。 问:大约什么时候你第一次与美国检察官办公室见面? 答:是2022年5月。 问:你与美国检察官办公室见面了多少次左右? 答:十八次。 问:在这些会议中,美国检察官办公室,也就是政府,向你提问了吗? 答:是的。 问:你回答了这些问题吗? 答:是的。 问:你是否真实回答了它们?
    南区记录员报告公司(212)805-0300
    1904
    哈立德-直接
    1 答:是的。 2 问:你是否向美国检察官办公室提供了关于你个人背景的信息? 3 答:是的,我提供了。 4 问:这包括你2018年申请13号破产吗? 5 答:是的。 6 问:在那些会议中,你是否也披露了你犯过的罪行? 7 答:是的。 8 问:这些包括你在为迈尔斯·郭和叶维特·王工作时犯下的罪行吗? 9 答:是的。 10 问:这些还包括你过去犯下的其他罪行吗? 11 答:是的。 12 问:你是否向政府提供了文件和其他信息资料? 13 答:我提供了。 14 问:这些包括你录制的某些录音吗? 15 答:是的。 16 问:哈立德先生,与政府会面后,你被提出了协议吗?
    17 答:是的。
    1905
    目击证人的免起诉协议证词总结
    | 目击证人的免起诉协议证词 | | - | - | | 问题 | 无 | | 回答 | 无 |
    证人免起诉协议证词摘要
    问题:无 回答:无 Q. 您被提供了什么样的协议? A. 一份免起诉协议,NPA。 Q. 您对免起诉协议的理解是什么? A. 我必须说实话并揭露我所犯的罪行。我必须参加会议。如果被要求,我必须作证。 Q. 如果您在免起诉协议下履行这些义务,根据您的理解,政府将采取什么行动? A. 不会对我提起诉讼。 Q. 具体来说,政府承诺不会起诉您在与Miles Guo和Yvette Wang合作期间犯下的哪些罪行? A. 参与欺诈计划。 Q. 您是否了解,免起诉协议是否保护您免受其他犯下的罪行的追究? A. 是的。 Q. 那些是您向政府透露的罪行,对吗? A. 是的,女士。 Q. 您对免起诉协议是否保护您免受作伪证、妨碍司法或提供虚假陈述的起诉了解多少? A. 这样做。 南区记录员公司(212) 805-0300
    1906
    法庭审讯记录
    问题 答复 在证言中说谎的后果是什么? 无 与政府就其犯罪行为进行的互动有哪些? 无 法庭审讯记录
    问题 回答 1 如果你在今天的证词中说谎会发生什么? 2 A. 这个协议将被取消。 3 问:你是否理解政府如果在这里撒谎可以单独起诉你犯伪证罪,妨碍司法以及做出虚假陈述? 4 A. 是的。 5 问:如果你的免诉协议被取消,你是否明白你可能会因为向政府揭露的所有犯罪而被起诉? 6 A. 是的,女士。 7 问:在那种情况下,你向政府做出的陈述会被用来对付你吗? 8 A. 会。 9 问:除了不起诉协议,政府还给你做出了其他承诺吗? 10 A. 没有。 11 问:在与政府的会议期间,你是否告诉政府你犯下的所有罪行? 12 A. 是的,我告诉了。 13 问:这包括在2016年提交的用来修改房屋贷款文件中夸大自己的个人费用吗? 14 A. 是的。 15 问:这包括在2010年与房屋贷款修改有关的提交的伪造银行对账单吗? 16 A. 是的。 南区记录员办公室 (212) 805-0300
    1907
    O6ABGUO2 Khaled-直接
    问:在你从2009年到2011年左右提交给IRS的文件中,是否包括夸大报告的工作费用以减少你的税款?
    答:是的。
    问:你的不起诉协议为这些罪行提供了哪些保护?
    答:我不会因这些罪行而被起诉。
    问:Khaled先生,如果你在这个案件的证言中说实话,但没有人被定罪,你还能保留你的不起诉协议吗?
    SHROFF女士:抗议。
    法庭:驳回抗议。
    答:可以,夫人。
    问:如果你在证言中说谎,但有人被定罪,你能保留你的不起诉协议吗?
    答:不能。
    问:谁决定你在证言中是否说实话?
    答:我决定。
    问:Khaled先生,我想先讨论你是如何第一次遇到Yvette Wang的。如果我称她为Yvette,你理解我是指Yvette Wang或王燕萍吗?
    答:是的。
    问:你大约什么时候认识Yvette Wang的?
    答:2018年4月。
    问:当时你是做什么工作的?
    南区记录员办公室
    (212) 805-0300
    1908
    O6ABGUO2 Khaled-直接
    1 答:我在花旗银行担任商业关系经理。
    2 问:2018年那个时候,你在花旗银行工作了多久左右?
    3 答:四年。
    4 问:作为花旗银行的商业关系银行家,你做了什么?
    5 答:我曾开设商业账户,处理企业贷款。就这样。
    6 问:在你进入花旗银行之前,你从事什么工作?
    7 答:我在桑坦德银行工作。
    8 问:在什么职位?
    9 答:也是商业银行家。
    10 问:在桑坦德银行做了多久时间?
    11 答:大约也是四年。
    12 问:在进入桑坦德银行之前,你有过其他银行相关的工作吗?
    13 答:有,我在那之前为两家国际银行工作过。
    14 问:哪两家国际银行?
    15 答:阿拉伯银行和科威特国家银行。
    16 问:你在这两家国际银行工作了多久左右?
    17 答:总共十年。
    18 问:担任什么职位?
    19 答:私人银行,对外银行业务,不同类型的
    南区记录员办公室 (212) 805-0300
    1909
    O6ABGUO2 Khaled-直接银行。
    问:回到2018年,你能解释一下是如何遇到Yvette的吗?
    答:一个律所介绍我给她,他们告诉我她需要帮助开设一个公司的银行账户。
    问:Yvette是否联系过你关于那个银行账户?
    答:是的。
    问:Yvette想在花旗银行为哪个实体或公司开设银行账户?
    答:Golden Spring,LLC。
    问:Yvette是否告诉过你Golden Spring从事什么类型的业务?
    答:她说他们帮助在美国的有价值个人进行安全物流等需要的服务。
    问:Yvette是否告诉过你她想让你为Golden Spring开设的银行账户类型?
    答:只是一个运营账户。
    问:她是否告诉过你将会进入该账户的资金来源?
    答:她说将由客户资助该账户。
    问:在与Yvette的第一次会面时,她是否提到过任何Golden Spring的客户姓名?
    答:没有。
    问:在与Yvette的会面后,对你与Golden Spring工作相关的发生了什么
    1910
    O6ABGUO2 Khaled-直接
    1 事?
    2 答:我们继续开设账户,收集文件,收集签署者信息,当时该账户已开设。
    3 问:Khaled先生,你是否了解“KYC”这个术语?
    4 答:是的。
    5 问:它代表什么?
    6 答:了解你的客户。
    7 问:你能描述一下KYC包括什么吗?
    A. 只是一个经营账户。
    Q: 她有告诉你有关将要进入该账户的资金来源吗?
    A: 她说这将是为那些资助该账户的客户而设的。
    Q: 在你与Yvette的第一次会议期间,她是否具体提到了Golden Springs的任何客户姓名?
    A: 没有。
    Q: 与Yvette的那次会议之后,您与Golden Spring的工作有何相关事宜?
    A: 我们继续开立账户,收集文件,收集签字人信息,那时账户已经开立。
    Q: Khaled先生,您是否熟悉“KYC”这个术语?
    A: 是的。
    Q: 它是什么意思?
    A: 客户了解你。
    Q: 你能描述一下KYC包含哪些内容吗?
    A: 它是了解开设企业账户时最终受益人的身份;通过该账户将进行何种活动;资金来源;金额;签字人信息;出生日期;居住地等信息。
    Q: 银行在账户开设过程的哪个阶段进行KYC?
    A: 这是在最初阶段进行的,但也会在银行账户的整个过程或生命周期中进行。
    Q: 您是否参与了Golden Spring银行账户的KYC?
    A: 在收集信息方面参与了。
    Q: 您在收集的KYC文件方面是与Golden Spring的谁进行沟通的?
    A: 是Yvette,当时她还有另一名员工。我记不起她的名字了。
    问:Citibank是否为Golden Springs开立银行账户?
    答:是的。
    问:开了多少个账户?
    答:我相信有一个或两个活期存款账户,支票账户,然后还有几个货币市场账户以赚取利息。
    问:在Citibank为Golden Spring开立银行账户后,您对这些账户有何参与或角色?
    答:只是联系点。如果有任何问题,Yvette会给我打电话或发送电子邮件;或者如果需要额外的借记卡或需要大额汇款,或者需要支票簿的签字人,我就是联系人。就是这样。
    问:您在Citibank担任Golden Spring账户的联系人大约多长时间?
    答:一直到2019年初。
    问:2019年初发生了什么事情,导致您与Golden Spring账户的关系发生了变化?
    答:我换了职位。我成为了医疗保健银行家,负责银行的医疗保健客户;因此,Golden Spring不再是我的客户。
    问:在您转到新角色之后,您与Yvette有多经常联系?
    答:并不多。我不记得曾与她有任何联系。
    问:在2019年转型之后,Yvette是否曾请您帮助在Citibank开立额外的银行账户?
    答:是的。
    问:大约是在什么时候?
    答:2020年五月。
    问:这些是企业账户还是个人账户?
    答:企业账户。
    问:是为哪个实体或实体?
    答:GTV和Saraca。
    问:Yvette在要求您协助开立银行账户时,是否告诉过您有关GTV的任何情况?
    答:她说这将是一个大账户,将用于媒体公司的私人募股。
    问:Yvette在要求您协助开立银行账户时,是否告诉过您有关Saraca的任何情况?
    答:Saraca是GTV的母公司。
    问:您对Yvette在Saraca或GTV的任何角色有了解吗?
    答:不太清楚具体角色,但她是介绍客户的人。这是她的组织的一部分。
    问:在开立这些账户时,Yvette是否对任何现有的Saraca或GTV银行账户说了什么?
    A. GTV和Saraca。 Q. Yvette在寻求您协助开设银行账户时,她是否告诉您有关GTV的情况? A. 她说这将是一个大额账户,将用于一个传媒公司的私人供股。 Q. Yvette在寻求您协助开设银行账户时,她是否告诉您有关Saraca的情况? A. 她说Saraca是GTV的母公司。 Q. 您是否了解Yvette在Saraca或GTV中的任何角色? A. 不清楚具体角色,但她是推荐客户的人。这是她组织的一部分。 Q. 在开设这些账户过程中,Yvette是否提到了有关任何现有的Saraca或GTV银行账户?
    南区记录员公司(212)805-0300
    1913
    Khaled-直诉
    A. 她说他们在Chase银行有一个账户。 Q. 她有没有提到在Chase账户中持有的金额? A. 没有,她只说很大,但我在那个时候担任不同的角色。我没有深入了解账户的细节。 Q. 在Yvette寻求您协助开设Saraca和GTV账户后,您接下来做了什么? A. 我转介给了一位接替我旧职务的商业银行家。 Q. 您是否知道GTV或Saraca的银行账户是否实际在花旗银行开设? A. 是的,它们已经开设了。 Q. 您是如何知道的? A. 银行家通知了我并保持联系告知更新情况。 Q. 您被给予了什么样的荣誉,作为将这两家银行介绍给花旗银行的推荐人? A. 账户资金到位后,我被认可为做出了一个重要的推荐。 Q. 您是否记得这些账户的资金金额大致是多少? A. 2亿美元。 Q. Khaled先生,您是否有了解涉及GTV的美国证券交易委员会或SEC的指控? A. 是的。
    南区记录员公司(212)805-0300
    1914
    Q. 大约是什么时候? A. 2020年6月。 Q. 您了解了什么? A. 有一项不当私人供股的调查。 Q. 当您提到私人供股时,您能向陪审团解释是什么意思吗? A. 这是一种投资结构,但是针对特定个人,而不是像股票那样公开。 Q. 花旗银行是否曾在2020年6月针对GTV和Saraca账户采取不利行动? A. 是的。 Q. 大约是什么时候? A. 2020年6月底。 Q. 花旗银行在2020年6月针对这些账户采取了什么行动? A. 他们封锁了账户,然后关闭了它。 Q. 您是否亲自参与了封锁或关闭这些账户的决定? A. 没有。 Q. 您知道花旗为什么决定关闭这些账户吗? A. 那是为了声誉风险。
    南区记录员公司(212)805-0300
    1915
    Khaled-直诉
    SHROFF女士:反对,法官,无证据的传闻。
    法官:不予采纳,答案有效。
    Q. Khaled先生,您是否与Yvette就花旗银行关闭GTV和Saraca帐户进行过沟通? A. 是的。 Q. 她对这些账户关闭有无发表什么看法? A. 她说她希望——她不在乎账户是否关闭,但她希望得到账户的款项,支票。 Q. 您知道在花旗银行的Saraca和GTV账户中的资金发生了什么情况吗? A. 它以多张支票的形式给予了Yvette。 Q. 您在处理花旗银行Saraca和GTV账户中的资金方面有何作用? A. 没有,只是跟进James以确保事情得到解决。 Q. 谁是James? A. James是我介绍给花旗银行的银行家。 Q. Khaled先生,您是否知道Yvette是否曾试图聘请您?
    SHROFF女士:反对,法官,引导性。它包含了未证实的事实。
    法官:不予采纳。您可以回答。
    1916
    Khaled-直诉
    Q. 大约是什么时候?
    问:你知道原先在Saraca和GTV在城市账户中的钱发生了什么事情吗?
    答:它以多张支票的形式给了Yvette。
    问:就这些原先在Saraca和GTV在城市账户中的资金而言,你是否有任何角色?
    答:没有,只是跟随詹姆斯确保问题得到解决。
    问:詹姆斯是谁?
    答:詹姆斯是我介绍给花旗银行的银行家。
    问:哈立德先生,Yvette是否尝试过雇佣你的时候?
    谢罗夫女士:反对,法官,这是引导性问题。它假定了尚未证实的事实。
    法庭:不成立。你可以回答。
    1916
    O6ABGUO2 哈立德-直接
    问:大约是什么时候?
    答:在2020年7月之后。
    问:情况是如何发生的?
    答:在沟通过程中,她说我们正在做重要的事情,她想让我加入她们的组织和公司。
    问:与Yvette的谈话之后,接下来发生了什么?
    答:我去了她的办公室见Yvette。
    问:那个办公室位于哪里?
    答:在曼哈顿64街,东64街162号。
    洛夫特斯女士,请向证人展示被标记为政府展示132的物品。
    哈立德先生,政府展示132是什么?
    答:那是办公楼,有玻璃的那一座。
    问:这是你见过Yvette的办公楼的照片吗?
    答:是的。
    问:这是对那个办公楼的公正而准确的表述吗?
    答:是的。
    穆雷女士:法官,政府提出展示132。
    谢罗夫女士:没有异议。
    法庭:证据被接受。
    1917
    O6ABGUO2 哈立德-直接
    (政府展示162已被证据接受)
    穆雷女士:我们可以发布吗。
    问:哈立德先生,在这张即将展示给陪审团的照片中,你能解释我们看到的建筑物中哪一栋是你提到的办公室吗?
    答:是那个有玻璃的。
    问:是在中间的两个建筑物的左边还是右边?
    答:右边。
    问:我将称那栋建筑物为联排别墅。
    谢罗夫女士:反对,法官。
    法庭:不成立。你可以继续。
    穆雷女士:谢谢,法官。
    问:当我提到联排别墅时,你会理解我在指哪栋建筑物吗?
    答:是的。
    问:看着这个,哈立德先生,你访问的办公室所在的联排别墅的哪层楼?
    答:整栋楼。
    问:我们可以把照片拿掉,洛夫特斯女士。谢谢。
    当你去见Yvette关于工作的时候,哈立德先生,她告诉你关于她提供给你什么角色吗?
    答:我被提供了银行关系经理和战略经理的角色。
    南区报告记录员公司(212)805-0300
    与Yvette进行的面试过程中涉及到的互动和个人细节,包括公司关联和所遇见的人员。 以下是表格标题: 与Yvette的面试详情 以下是表格的列标题:
    问题:无
    回答:无
    与Yvette进行的面试过程中涉及到的互动细节和个人,包括公司隶属关系和遇到的人员, 以下是表的标题: 与Yvette的面试细节, 以下是表格的列:
    问题: 无
    答案: 无
    Q. 与哪家公司或哪些公司有关? 我们见面时她没有提到,但我最终被GTV公司聘用。 Q. 与Yvette面试时,她是否告诉过你她为谁工作? 她说她为大老板主任工作。那时她没有提到他的名字。 Q. 与Yvette去联排别墅面试时,你是否见到其他人? 是的。 Q. 谁? 办公室里有亚伦·米切尔,前台那里有保安。 Q. 亚伦·米切尔是谁? 他是公司内部律师。 洛夫特斯女士,请向证人展示作为政府展品128标识的物品。 哈立德先生,你认出政府展品128中所描绘的个人吗? Q. 他是谁? 那是亚伦·米切尔。 默里女士:法官,政府提出政府展品128号。
    施罗夫女士:我们没有异议。
    法庭:准许。
    (政府展品128号作为证据接收)
    默里女士:我们可以公布这个。
    问:哈立德先生,您能否再次提醒我们,根据您的理解,亚伦·米歇尔的角色是什么?
    答:内部律师。
    问:为哪个实体或实体?
    答:没有具体说明,只是一个团体。
    问:谢谢。洛夫特斯女士,我们可以收回。
    基于您在联排别墅与伊维特的访谈,您是否了解您将要承担什么样的职责和责任?
    答:只是为该团体提供银行关系,一个涉及金融机构和设立金融机构的项目。
    问:在那次访谈期间,您和伊维特是否讨论过您将获得的报酬,如果有的话?
    答:是的。
    问:您的报酬将是多少?
    答:每年35万美元。
    问:这35万美元的年薪与您当时在花旗银行的薪水相比如何?
    答:大约增加了40%。
    问:大约多出多少金额?
    答:大约多15万。
    南区记录员有限公司(212)805-0300
    哈立德-直诉
    1 问:每年?
    2 答:是的。
    3 问:在与伊维特面谈之前,您是否对GTV或Saraca进行了独立调研?
    4 答:只是YouTube,Google,那种东西。
    5 问:您找到了什么?
    6 答:我在YouTube上找到了一些关于GTV,Saraca和郭文贵的视频。
    7 问:您从研究中了解到了什么关于郭文贵?
    8 答:一个来自中国在美国寻求庇护免受中共迫害的人。
    9 问:哈立德先生,在与伊维特在联排别墅的访谈之后,您是否有一次与其他人会面或面试,涉及潜在的工作?
    10 答:是的,我进行了视频通话。
    11 问:与谁的视频通话?
    12 答:郭文贵。
    13 问:在与郭文贵的视频通话之前,伊维特告诉过您关于郭文贵的任何内容吗?
    14 答:他是老板。
    15 问:除了老板,伊维特还用其他名字称呼过郭吗?
    16 答:是的。
    17南区记录员有限公司(212)805-0300
    哈立德-直诉
    1 施罗夫女士:问过一次并回答过了。
    2 法庭:驳回。您可以回答。
    3 答:主要的。
    4 问:在与郭文贵的视频通话之前,伊维特是否对您是否会为郭文贵工作说过什么?
    5 答:是的,这取决于他是否喜欢我并批准我可以工作。
    6 问:谁参加了您与郭文贵的视频会议?
    7 答:只有我、伊维特和郭文贵。
    8 问:在那次会议中,郭用什么语言?
    9 答:说了一点英语,然后就这样了,没有很清楚的来回交流。
    10 问:据您了解,郭文贵还会说什么其他语言?
    11 答:中文、普通话。
    12 问:您会说普通话吗?
    13 答:不会。
    14 问:您能听懂普通话吗?
    15 答:不能。
    16 问:在视频会议期间,郭问了您什么?
    17 答:更多是欢迎我加入这个大家庭,表示我们将做大事,很兴奋。
    18 问:郭在潜在工作方面说了什么
    南区记录员有限公司(212)805-0300
    哈立德-直诉
    1 关于您的职责将是什么?
    2 答:主要的项目是开设一家银行。我们要开一家银行。
    问:在与郭文贵和伊维特王的视频会议之后,您是否被正式提供了一个职位?
    答:是的。
    问:是哪家公司为您提供了这个职位?
    答:我相信是Saraca或GTV。我不确定。

    16.在视频会议中,郭问了你什么,如果有的话?
    17.更多是欢迎我加入家庭,我们会做一些大事情,感到兴奋。
    18.关于潜在工作机会,郭提到了什么,如果有的话?
    南区记录员公司,电话(212) 805-0300
    O6ABGUO2 卡勒德-直接
    就你的职责而言,郭在视频会议中提到了什么,如果有的话?
    主要的项目是开设一家银行。我们打算开设一家银行。
    问:在与迈尔斯•郭和王玥茵的视频会议之后,您是否被正式提供职位?
    答:是的。
    问:是哪家公司提供给您这个职位?
    答:我相信合同是由Saraca 或 GTV提供的。我不确定。
    问:洛夫特斯女士,如果可能的话,请向证人展示被标识为政府展品BR399的文件。
    卡勒德先生,您是否认得这份文件?
    答:是的。
    问:在高层次上,这是什么文件?
    答:这是来自Saraca Media的录用信。
    问:洛夫特斯女士,请继续查看下一页。您签署了这封信吗?
    答:是的。
    默里女士:法官,政府提交政府展品BR399。
    肖夫女士:没有异议。
    法官:准许。
    (政府展品BR399收到证据)
    请翻到第一页并发布出来。如果我们可以。
    提供凯莱德先生收到的萨拉卡传媒集团有限公司的聘书细节,内容涉及他担任银行关系与战略副总裁的就业条件,包括薪水和股权组成。
    | 聘书细节 | |---|---| | 项目编号 | 无 | | 详细信息 | 无 |
    报价信细节
    问题 内容 问题: 能否放大顶部部分,看一下到第五项。 问题: Khaled先生,这封报价信的日期是? 问题: 您能否念出寄发这封报价信的公司的全称? 问题: 在第一句话开始的地方,可以先读出那句话吗? 问题: 谢谢。看一下第三项,这份工作的薪水是多少? 问题: 再看第五项,那段加粗标题是什么? 问题: 您是否理解这封报价信中会有股权作为您在Saraca工作的薪酬组成部分? 问题: 在您在Saraca工作期间,是否曾经获得过任何Saraca的股权? 南区记录员有限责任公司(212)805-0300
    1924
    哈立德先生的就业详情
    问题 哈立德先生面试时的问题 答案 哈立德先生提供的回答 问题 回答 问:您是否曾在Saraca的任何子公司中收到过股份或股权? 答:没有。 问:如果我们放大一下,洛夫图斯女士,请翻到最后一页。   问:阁下,确认这是您的签名吗? 答:是的,女士。 问:您是在什么日期签署了这份就业合同? 答:2020年7月10日。 问:您何时开始在Saraca工作? 答:2020年8月1日。 问:当您接受了2020年8月开始在Saraca工作的就业机会时,是不是辞去了在花旗银行的工作? 答:不,我没有。 问:为什么没有辞职? 答:我想确保这份工作是真实的。 问:您在Saraca和花旗银行工作了多久? 答:大约两个月。 南区记录员有限公司(212)805-0300
    1925
    问:根据您与花旗银行的就业合同条款,您被允许接受外部工作吗? 答:不行。 问:在2020年7月、8月的时候,您是否向花旗银行披露了您在Saraca的就业情况? 答:没有,我没有。 问:您是否向Yvette或Saraca的任何人披露您在开始为Saraca工作时仍然受雇于花旗银行的情况? 答:没有。 问:为什么? 答:我想再次确定这份工作是真实的。我担心这不是真的,只是我不喜欢的事情。如果发生了什么事情,我想尽可能保留我的花旗银行工作。 MS. SHROFF:抱歉,法官,我没有听清楚他回答的最后部分。 法官:如果你可以请回放他的回答。 (记录被重复) 问:Khaled先生,您什么时候停止在花旗银行工作? 答:2020年10月1日。 问:在2020年8月和9月期间,您是否正式受到两个实体的雇佣? 答:是的。 问:您是否明白,受雇于这两个实体是否违反了您的就业协议的条款? 答:是的,对花旗银行而言是的。 问:现在转向2020年8月,您开始在Saraca工作时,您对自己的雇主有什么理解? 答:我的直接主管是Yvette。 问:您工作的办公室位置在哪里? 答:64街162号。 问:那是联排别墅吗? 答:是的,联排别墅。 问:联排别墅有几层楼? 答:五层。 问:Saraca或其子公司GTV,这两家公司是唯一在联排别墅运营的公司吗? 答:不是。 问:您在2020年8月开始工作时,联排别墅还有哪些其他公司在运营? MS. SHROFF:抗议,法官。这是未经证实的假设。我们可以请到一旁交涉吗?
    法官:好的。
    1927
    建筑分类对话
    说话者 对话内容   胡须女士:请注意,贵庭,这栋建筑是一座联排别墅,而不是办公楼。   法庭:这栋建筑有什么特点使其被归类为联排别墅?   胡须女士:首先,它是一个独立的住宅单位,而不是一个商业办公空间。其次,它有一个私人入口和户外空间。   法庭:这是很有说服力的观点。那么,城市规划部门对此有什么看法吗?   胡须女士:城市规划部门也认为这是一座联排别墅,他们已经进行了详细的检查和确认。   法庭:明白了。感谢解释。诉讼双方有其他要补充的内容吗?   胡须女士:不,贵庭。我们认为这足以阐明我们的立场。   法庭:非常好。审理结束。 Speaker Dialogue MS. SHROFF 法官大人,我有两个异议。我知道法庭驳回了我关于将这座建筑称为联排别墅的异议。没有任何证人曾经提到过它是联排别墅。这个词要么来自政府,要么来自政府的检控团队,但没有一份3500文件将这座建筑称为联排别墅。它被记录为办公大楼,我持续提出异议,并请求法庭最尊重地重新考虑,因为甚至这位证人的证词也没有提到他称其为联排别墅。 MS. SHROFF 它不是。它是一座办公大楼。无论它是不是一座短小的办公大楼,它都是一座办公大楼。例如,Duane街52号就是一座短小的办公大楼。它是一座办公大楼,不是联排别墅。 THE COURT 即使它最初是作为联排别墅建造的呢? MS. SHROFF 我们没有证据表明它是作为联排别墅建造的。如果他们想展示它是作为联排别墅建造的证据,作为联排别墅出租的证据,那好。但这只是一个他们凭空造出来的词,联排别墅。它不是联排别墅。它是一座办公大楼。它被许可用于办公出租。它不是住宅。比如,我居住的建筑物, 南区记录员有限公司(212)805-0300
    1928
    法庭记录摘要
    | 摘要编号 | 摘要内容 |
    法庭记录摘录
    |1|外观可能相似,但我无法在那里开设办公室。| |2|因为它不是 - 什么词来着?| |3|卡马拉朱先生:分区。| |4|尚夏菲女士:该建筑不允许建办公大楼。| |5|更重要的是,法官阁下,无论它是不是联排别墅,单单因为政府创造了“联排别墅”这个词,就不应该称呼它。他们可以称之为办公大楼,64街,等等。那么我是否可以开始称呼它为东64街上的佛教寺庙,因为他们在那栋建筑中进行礼拜?这并不是对建筑的公平描述,这是我提出的异议。我的主要异议是,没有任何证人曾证明这是一座联排别墅。| |6|我对此有第二个异议,法官阁下,现在质询关于在该建筑中所进行的工作。我非常确定,3500份文件清楚地表明,这位先生在疫情期间从未去过那栋建筑,尤其在他进行“双聘”期间。他得逞的方式就是选择一份工作,而双方均不知情,因为在那段时间所有人都在远程办公,他并未前往那里或在那栋建筑中从事任何工作。这就是我提出异议的原因。| |7|最后,我对政府引导式提问持续提出异议。尽管我没有再次打断,但是|
    南区记录员有限公司(212)805-0300
    1929
    06ABGUO2 哈立德-直接质询
    1.我要提出持续异议。
    2.默里女士:很乐意依次解释。关于第二点。肖夫女士误解了3500材料。这位证人在疫情期间并没有去花旗银行,这就是他能够利用双重工作的原因。他确实去过别墅,这个名词是各个证人用来描述这座建筑的。我马上会谈到这一点。从2020年8月开始,他每周去别墅一两次,最开始并不是每天,直到人员逐渐回来工作。他肯定是在那里出席并从那栋建筑物开始工作的。他有关于那栋建筑发生的事情的个人知识,他还为在那栋建筑物内的除GTV和Saraca之外的各个实体做银行工作,我们将为此打下基础,并在他的证词中详细讨论。
    关于把这座建筑称为别墅的描述。首先,这是该建筑的事实性描述。它确实是一座别墅。它最初就是作为一座别墅建造的。当我们提到这座建筑时,政府试图简化。被告提到它的其他名字,比如喜马拉雅大使馆。如果他们希望我们称其为喜马拉雅大使馆,又名别墅,我们当然可以这样做。我认为出于简化目的,我们还是最好称其为别墅。
    南区记录员有限公司
    (212)805-0300
    1930
    O6ABGUO2 哈立德-直接质询
    1 当我们谈论另外几年后业务迁移到的地方,也就是哥伦布圆环,我们打算称之为哥伦布圆环3或3CC,因为这是一个简称。
    关于肖夫女士提出的引导性质,我会尽力,法官阁下。如果需要的话,我会更好地构建一些基础。我想在最后两个问题上确实有一个异议。我首先问他所工作的公司是否是唯一一家在那栋建筑物内运作的公司,他回答不是。所以我问了个跟进问题,询问其他哪些公司在那里工作。
    肖夫女士:东64街和别墅一样简短。写字楼和别墅一样简短。哥伦布圆环,我们不反对称之为3CC,因为那是一个实际的物理地址。如果你想介绍任何证据表明这座建筑最初是一座住宅和别墅,那就请随意。但在那之前,它是一座规划用途为写字楼的写字楼。一直称其为别墅是误导性的,并让陪审团错误地认为通过使用住宅作为别墅办公室,就出现了什么违法行为。如果他们愿意称之为喜马拉雅大使馆,实际上比东64街还长--另外,东64街是每个纽约人都会有关联的东西,所以实际上
    法庭审讯记录
    行号 对话内容 1 庭长:本次庭审现在开始。请双方当事人出庭。 2 律师甲:谢谢庭长。我是原告方的代理律师。我们针对政府滥用联排别墅的行为提出诉讼。 3 政府律师:我们认为政府有权使用该联排别墅作为公共用途,这是符合法律规定的行为。 4 庭长:双方可以开始陈述自己的理由和证据。 5 律师乙:根据联排别墅的产权证明,该房产属于原告所有,政府无权随意使用该房产。 6 政府律师:政府有责任确保公共资源得到充分利用,这包括利用空置房产。 7 庭长:请双方澄清产权证明和相关法律条文,并在下次开庭时提交相关证据。本次庭审到此结束。 法庭审讯记录
    行号 对话 1 政府使用这个短语并不算牵强。但政府正在以非常特定的目的使用这个联排别墅。这是我的异议。 2 法庭:所以碰巧我在纽约大学修过一门关于纽约市建筑历史的课程,那座建筑确实符合联排别墅的描述。我认为这样并不具有误导性,所以你可以称其为联排别墅。你是正确的,他之前提到了其他实体,所以这个最后的问题并不属于引导性问题。我们结束了。 南区记录员有限公司 (212)805-0300
    1932
    O6ABGUO2 卡莱德-直接询问
    (在开庭)
    法官:现在是11:29。该休息了。中午返回后,我们将继续对这位证人进行直接询问。请记住,不要讨论案件。不要阅读、听取或观看任何与案件主题相关的内容。
    (接下页)
    南区记录员有限公司 (212)805-0300
    1933
    O6ABGUO2 卡莱德-直接询问
    (陪审团不在场)
    法官:卡莱德先生,你可以出去了。不要讨论你的证词。我们将在中午继续,并在11:59让证人登台。
    默里女士:见证人离开前有一两个问题要处理。
    (证人暂时离庭)。
    法官:好的。
    默里女士:庭务上有两个事项,尊敬的法官。首先,我们在陪审团的椅子下放置了一些文件夹。其中包含我们将根据一项协议引入的某些成文记录。其次,这位证人有一些他将证实真实性的录音。为了效率起见,我们将其放在一个外接硬盘上,这位证人已经全面审阅过,并签署并日期,并且可以确认。我们已经提前与辩护律师讨论过这一点。
    因此,当我们要求他验证这些录音时,我会请求接近。他将确认他认识这个硬盘和其中包含的证据,然后我们将引入和寻求将其中某些录音作为证据接纳。但我想提醒一下,双方事先已经讨论过这一点。
    法官:你会说他在某个时间听过这些录音吗?
    默里女士:是的,尊敬的法官。正确的。
    南区记录员有限公司 (212)805-0300
    1935
    O6A1GUO3 卡莱德 - 直接询问
    下午场
    12:20 下午
    法官:请将陪审员带进来。
    (陪审团在场)
    法官:请入座。
    请记住,先生,你仍然在誓言下。
    你可以继续。
    由默里女士提出:
    问:卡莱德先生,我们上次谈到了在2020年8月你加入萨拉卡公司时在别墅中运营的其他公司。你能描述其中一些公司是什么样的吗?
    答:Golden Spring公司在那里,法治基金会,当然萨拉卡和GTV也在那里运营。
    问:Golden Spring是什么类型的公司?
    答:Golden Spring实际上是进行付款的家族办公室。
    问:请你记得,如果能将麦克风对准你的嘴巴,将有助于我们所有人。
    答:对不起。
    问:在你于2020年8月开始工作时,Golden Spring有谁(如果有)工作?
    答:我想是Max Karsenas。他还有其他几个在他管理下工作的初级会计师。
    南区记录员有限公司 (212)805-0300
    1936
    O6A1GUO3 卡莱德 - 直接询问
    问:你提到了法治基金会。你能描述一下你对法治基金会是什么的理解吗?
    答:法治是一个帮助吹哨人运动的非盈利组织。
    问:根据你当时的理解,什么是吹哨人运动?
    答:那些反对中国共产党并在被监禁或需要帮助时的个人。
    问:当你于2020年8月开始为萨拉卡工作时,你对吹哨人运动的信息来源是什么?
    答:没有。只是在那里工作的员工告诉我这是什么。
    问:在你开始工作时,你对率领吹哨人运动的人有什么了解?
    答:郭文贵。
    问:卡莱德先生,哪家公司支付你的工资?
    答:最初是GTV,但后来是莱斯顿公司。莱斯顿公司。
    问:莱斯顿公司是什么?
    答:这是一家公司,由它来负责运营、雇员和工资支付。
    问:由谁创建的一家公司?
    答:是王毅。
    A. 那些在言论中反对中共,需要帮助的个人,你知道的,在被监禁后或者需要旅行时,类似这样的情况。
    Q. 当你在2020年8月开始为Saraca工作时,你所了解的关于告密者运动的信息来源是什么,如果有的话?
    A. 没有。只是那里的员工告诉我是什么。
    Q. 你对谁领导了告密者运动有什么了解,如果有的话?
    A. 是郭文贵。
    Q. Khaled先生,哪家公司支付了你的薪水?
    A. 最初是GTV,但后来是列克星敦地产。列克星敦地产。
    Q. 列克星敦地产是什么公司?
    A. 这是一家为了运营、员工和薪水支付而创建的公司。
    Q. 由谁创建的这家公司?
    A. 王琪雅创建的。
    南区记录员公司,电话(212)805-0300
    1937
    O6A1GUO3 Khaled - 定期
    Q. 您在列克星敦地产方面扮演什么角色,如果有的话?
    A. 我想我帮助了一些基础文件的制定,以及为其开户。
    Q. Khaled先生,您在2020年8月开始为Saraca工作的第一周是如何描述的?
    A. 我对我的工作内容很困惑,没有明确的结构。那时正值疫情期间,情况很奇怪,员工不在的情况很常见。就是这样。
    Q. 当您提到“那里”的时候,您指的是哪里?
    A. 那座联排别墅。
    Q. 当您在Saraca工作的第一周或之后的一段时间内,您是否去别墅工作过?
    A. 是的,我可能去过一两次,不是每天。
    Q. 当您开始在Saraca工作时,别墅里还有谁在工作?
    A. Max几乎每天都在那里,我去的大部分时间;还有初级会计师们在,公司内部律师们也在;清洁工,保安;我在那里时Yvette也在。
    MS. MURRAY: Loftus女士,请您展示 作为政府证据110号的展示物。
    Q. Khaled先生,你认得政府展品110中的那个人吗?
    1938
    Q. 那是Max Karsenas,我记得。 Q. 请提醒我们一下,Max的角色是什么? A. 他负责财务,主要处理多个实体,主要是Golden Spring,但也包括其他业务。 MS. MURRAY: 谢谢,Loftus女士。我们可以继续。 Q. 简单来说,在您开始为Saraca工作的头几周里,您通常会花时间做什么? A. 我们正在解决与花旗银行的一些问题,尝试为Saraca和GTV开设账户,并设置列克星敦公司。 Q. 当您刚开始为Saraca工作时,您通常是与谁一起工作的? A. 主要是Yvette,公司内部律师Jessica,还有后来被引入新律师的;Yvette向我介绍了新的律师。还有Max,也和Max联系。每天都有新员工入职,所以—— Q. Khaled先生,您提到Yvette在你开始在Saraca工作时常常在联排别墅工作。您经常在那里看到她吗? A. 我会说每次我在那里的时候,她都会来。有些日子她会稍晚一些到。所以相当频繁。 Q. 您知道Yvette在哪家公司工作吗? A. 她并不是特定的——她涉及很多——很多
    南区记录员公司, 电话(212)805-0300
    1939
    O6A1GUO3 Khaled - 定期
    城市别墅内办公室布局和层级结构描述
    办公室层级结构 城市联排别墅内的办公布局和等级划分,梅尔斯·郭曾在顶层访问和工作。
    城市联排别墅中的办公等级
    详细信息 当你在2020年8月开始为Saraca工作时,是否有见到梅尔斯·郭在联排别墅的情况? 是的。 梅尔斯·郭在联排别墅时的情况是什么? 他过去会来拜访。由于疫情的原因,并不是每天,但偶尔会来访。 当梅尔斯·郭在联排别墅时,他是在某个特定的空间或位置工作吗? 是的。 在哪里? 是在顶楼。我相信是建筑物的第五层,联排别墅的第五层。 你能描述一下联排别墅内办公室的等级划分吗? 当然。前面是安全检查处;地面楼层有一个工作室;一些人力资源的工作人员会在那些办公桌前工作。接着再往下一层,有一个大会议室和一个厨房。那里是人们用餐的地方,也是一个宽敞、漂亮的大会议室。在第一层,有Golden Spring......(未完整) 南区记录员事务所(212)805-0300
    奇熹能 - 直译
    1 会计。那就是麦克斯工作的地方。
    2 我相信楼上有几张桌子和一个厨房——私人厨房,不过并不是为了——为了所有员工。那是一个私人厨房。
    3 顶层是法治办公桌和法治区域。然后在麦尔斯和伊维特的办公室之前,有一名秘书,还有一些给公司律师使用的办公室,属于管理级别。然后在上面,有麦尔斯的办公室,以及伊维特过去常坐的一个会议室。
    4 再次,专注于您在萨拉卡工作的头几个星期,您能描述一下您与郭文贵的互动是怎样的吗?
    5 不多,只是,你知道的,专注于通过伊维特向他提供一些简报,在会议中。就这样。
    6 如果有的话,您向郭文贵提供什么类型的信息呢?
    7 我正在筹备在美国设立一家银行,所以我们正在讨论帮助我们确定银行的不同公司,所以只是关于我们在流程中的进展的那些简报。他会鼓励我们。就这样。
    8 2020年秋天,在您在萨拉卡工作时,您能描述一下办公室的典型一天是什么样的吗?
    9 所以头几个星期真的是为了找到支付员工工资和支付房租的办法。所以——为此付出了努力,
    关于负面消息、为Golden Spring开设银行账户遇到的挑战、员工与Yvette之间的关系以及在联排别墅与Miles Guo的互动方面的对话。
    表格标题如下: 对话摘要
    表格列如下:
    问题:无
    回答:无
    对于关于负面新闻的讨论,开设Golden Spring的银行账户存在挑战,员工与Yvette之间的关系,以及在联排别墅与Miles Guo的互动。
    对话总结 Q. 你能描述一下你所说的负面新闻是指什么吗? Q. 关于Golden Spring呢?为什么你无法开设Golden Spring的银行账户支付工资? Q. 在2020年秋季期间,Yvette和其他员工之间的关系是怎样的? Q. 那么Miles Guo呢,Miles Guo和联排别墅的员工之间有什么关系,如果有的话? 1942年
    标题:Crane Advisory Group LLC 成立详情
    问题 Mr. Khaled 就 Crane Advisory Group LLC 提供的答案 - Crane Advisory Group LLC 是如何成立的? Craine Advisory Group LLC 是由一群经验丰富的顾问共同创立的。他们在金融和咨询领域拥有丰富的经验,并决定将他们的专业知识结合起来,为客户提供高质量的咨询服务。 - Crane Advisory Group LLC 的宗旨是什么? Crane Advisory Group LLC 的宗旨是帮助客户实现财务目标,提供全方位的财务咨询服务。他们致力于为客户制定个性化的投资策略,帮助他们在复杂的金融环境中做出明智的决策。 标题:Crane咨询集团有限责任公司成立详情
    问题:讨论中提出的问题 答复:Khaled先生就Crane咨询集团有限责任公司提供的答复 Q. Khaled先生,您是否熟悉一个名为Crane的实体? A. 是的。 Q. 它是什么? A. Crane是我与Yvette和公司律师维克托商讨后创建的一个实体,但所有权百分之百归我所有。 Q. 该实体的完整名称是什么? A. Crane咨询集团有限责任公司。 Q. 是谁提出建立Crane的想法? A. 这是Yvette、维克托和我共同的想法。 Q. 建立Crane的目的是什么? A. 那将是申请银行执照,收购银行或建立在线数字银行的实体。 Q. 您大约是什么时候建立了Crane? A. 我会说是我开始在那里工作的第一个月之内。 Q. 当您提到开始在那里工作时,您是指在Saraca工作吗? A. 是的,女士。 Q. 谁为Crane工作? A. 我实际上是Crane唯一的雇员,我有一个助理拥有Crane的电子邮件,但薪水是由莱克星顿公司支付的。 1943
    O6A1GUO3 卡莱德 - 询问
    问:您以前是否受雇于Crane公司?
    答:那是我的公司,就是一个单人有限责任公司。
    问:您是作为Crane公司被支付报酬的吗?
    答:没有。
    问:建立Crane公司后,有哪个实体支付了您的报酬?
    答:仍然是莱克星顿产业。
    问:建立Crane公司后,您与哪个实体签订了就业合同?
    答:仍然是与萨拉卡公司。
    问:维克多的全名是什么?
    答:维克多·瑟达。
    默里女士:洛夫特斯女士,请向证人展示作为政府证据109标记的展品。
    问:卡莱德先生,您是否认出政府展品109中所描绘的个人?
    答:是的。
    问:他是谁?
    答:那是维克多·瑟达。
    默里女士:法官,政府提供政府展品109。
    沙罗夫女士:法官,我没有异议。
    法官:被接受。
    (政府的展品109作为证据接收)
    默里女士:可以出示那个材料吗,洛夫特斯女士。
    南区记录员,电话(212)805-0300
    1944
    O6A1GUO3 卡莱德 - 询问
    由默里女士提问:
    问:现在陪审团看到了,卡莱德先生,您可以提醒我们,维克多·瑟达为哪个实体或哪些实体工作?
    沙罗夫女士:法官,我对问题的形式提出异议。没有迹象表明任何人忘记了任何答案。
    法官:异议不成立。您可以回答。
    答:不是特定的公司。他为家族工作。
    问:当您提到家族时,您指的是哪个家族?
    答:郭家族的私人家族。
    默里女士:谢谢,洛夫特斯女士。我们可以把材料放下。
    问:卡莱德先生,Crane公司的办公地址是什么?
    答:世界贸易中心一号。
    问:您在为Crane公司工作时,每天是否确实去到那里工作?
    答:没有。
    问:世界贸易中心一号是什么类型的办公空间,如果有的话?
    答:它是一个——像虚拟办公室一样,通过Servcorp。
    问:Servcorp提供什么类型的服务,如果有的话?
    答:他们提供类似于Regus的共享办公室,并提供虚拟办公室。他们提供地址、电话号码、邮寄服务。仅此而已。
    问:您为什么要为Crane公司建立虚拟办公室
    南区记录员,电话(212)805-0300
    问:哈立德先生,请翻阅那个文件夹,看看你是否认识那些文件。
    答:是的。
    默里女士:请稍等,法官。
    (律师商议中)
    默里女士:法官,我将向辩护方展示一个文件夹。抱歉,我原以为我们也给他们提供了一份副本。
    问:哈立德先生,你说你认识文件夹中的文件,是吗?
    答:是的。
    南区记录员公司(电话:212-805-0300)
    问:您以前见过这些文件吗?
    答:是的。
    问:这些文件是否涉及您在Saraca或Crane任职期间与Guo、Yvette和其他人一起完成的工作?
    答:是的。
    默里女士:法官,此时政府提供了文件夹中包含的证据。如果法庭记录员愿意,我可以再次宣读证据编号。
    法官:对我来说没有必要让你宣读。有任何异议吗?
    肖夫女士:没有,法官。一切顺利的话,我认为我们不需要给记录员增添麻烦。
    法官:那么它们就被接受了。
    (政府证据BR363-364,367-375,380,382,384,387,392,396-398,1506-1509,1511-1519;GC131,498,500-502,507-508;SW2002,2005,2008,2009,2021,2027,2030,2032,2035,2038,2040,2042,2045,2046,2050-2055,2057,2061,2068,2070,2076,2077,2083被证据接受)
    默里女士:谢谢。
    默里女士问:
    问:哈立德先生,回到我们刚才谈论的虚拟办公室,您为哪些其他公司建立过虚拟办公室,如果有的话?
    电子邮件对话详情
    | 文档类型 | 收件人 | 发送日期 | 公司 |
    邮件对话详情
    文档类型 无 收件人 无 发送日期 无 公司 无 A. 莱克星顿物业有一个虚拟办公室,G俱乐部也有一个虚拟办公室;G音乐也有一个虚拟办公室;G新闻也有一个虚拟办公室;G时尚也有一个虚拟办公室。
    穆雷女士:洛夫图斯女士,请问我们可以发布现在作为政府展品SW2008的内容。请放大顶部部分。
    问:哈立德先生,这是何种类型的文件?
    答:这是一封电子邮件。
    问:发送给谁了?
    答:我的名字。
    问:那是您的Crane业务邮件地址吗?
    答:是的,女士。
    问:这封邮件是什么日期发送的?
    答:2020年10月14日。
    问:来自哪家公司?
    答:Regus公司。
    问:Regus是什么类型的公司?
    答:Regus是一家提供虚拟办公室和共享空间租赁服务的公司。
    问:所以,这封邮件发送到您的邮箱,但实际的邮件正文是寄给谁的?
    答:王雅薇。
    穆雷女士:洛夫图斯女士,如果我们可以缩小视图并跳转到第二页,附件页面。关注顶部部分。
    南区记录员,专业合伙公司(212) 805-0300
    1948
    问:哈立德先生,pis虚拟办公空间的pe账户名称是什么? 答:G Fashion LLC。 问:G Fashion LLC的联系人是谁? 答:Yvette Wang。 问:G Fashion的虚拟办公空间的物理地址是什么? 答:纽约市列克星敦大道750号,邮编10065。
    默里女士:洛夫特斯女士,我们可以记录下来。请公布作为政府证据的SW2009文件的内容,放大带有文本的顶部部分。
    问:哈立德先生,这封电子邮件的日期是什么? 答:2020年10月14日。 问:这封邮件是由谁发送给谁的? 答:从Regus发送给我,在Crane Advisory Group。 问:在邮件正文中,它是寄给谁的? 答:Yvette Wang。 问:在这份文件中,Regus办公室的虚拟办公地址是什么? 答:纽约市麦迪逊大道590号。
    默里女士:我们可以记录下来,洛夫特斯女士。
    问:哈立德先生,您提到为哪些公司设置了虚拟办公室,这些公司中的所有公司都实际在联排别墅内运营吗?
    答:有几家。我认为唯一没有的是G Fashion,但是...
    南区记录员,专业合伙公司(212) 805-0300
    1949
    06A1GUO3 哈立德 - 直接问询
    1 有一些——G Fashion偶尔会有一些活动。
    2 问:所以Crane,比如说,Crane是否曾在世界贸易中心一号地址经营任何业务?
    3 答:不,女士。
    4 问:G Fashion是否曾在列克星敦大道750号的虚拟办公地址上经营业务?
    5 答:没有。
    6 问:您提到了其他几家为其设置虚拟办公室的实体。我相信G News?G News在哪里运营?
    7 答:有一两名与G News相关的IT员工。他们在列克星敦大道的联排别墅内工作。
    8 问:设置这些不同实体的虚拟办公室的原因是什么?
    9 答:这是Saraca、GTV和Golden Spring新闻之间的分离。
    10 问:哈立德先生,在您在Crane工作的开始阶段,您做了什么样的工作?
    11 答:在努力建立银行并获得许可,然后我们开始研究不同的金融机构。
    12 问:那么,这种在Crane的工作与您在Saraca受雇或者...
    南区记录员,专业合伙公司(212) 805-0300
    1950
    06A1GUO3 哈立德 - 直接问询
    1 工作的最初几周所做的工作有何不同?
    2 答:事实上是一样的。
    3 问:除了您从列克星敦物业收到的薪水之外,在您在Crane工作期间您有没有收到其他的报酬?
    4 答:没有,女士。
    5 问:除了薪水,您是否因在Crane工作而收到任何费用或其他金钱金额?
    6 答:没有。
    7 问:在2020年8月开始为郭和Yvette工作时,您在银行关系方面有何角色?
    8 答:您可以重复问题吗?
    9 问:是的。在2020年8月开始为郭和Yvette工作时,您在银行关系方面有何角色?
    10 答:我是各实体、签字人和银行关系经理之间的联络人,与银行联系的中介。
    11 问:当您提到实体时,您指的是哪些实体?
    12 答:列克星敦。还有几家由家族持有的控股公司也要关闭他们的账户。他们想要为一项信托开立账户。有一些账户,我需要与银行和银行家联系以便促成。
    南区记录员,专业合伙公司(212) 805-0300
    1951
    问:您是否与联排别墅中的同事讨论了银行账户关闭的事宜? 答:是的。通常签字人和Yvette知道。
    在2020年8月开始为Guo和Yvette工作时,您在银行关系方面担任的角色是什么,如果有的话?
    A. 我是各实体、签字人和银行关系经理以及银行之间的联络人。
    问题:当您提到实体时,您指的是哪些实体?
    A. Lexington. 家族名下的几家控股公司也关闭了它们的账户。他们想要为一项信托开设账户。有一些账户,我需要与银行和银行家联系以促成这些事宜。
    问:您是否与在联络办公室的任何人讨论过账户关闭的事宜?
    答:是的。通常签字人和Yvette知道。
    问:您和Yvette讨论过关于账户关闭的事宜吗?
    答:通常他们会给我们发电子邮件,或者他们会与我交谈告诉我他们已经决定关闭账户。我需要让Yvette知道,让熟悉这些实体的公司内律师知晓,就是这样。
    问:您被指示如何解决实体所遇到的银行问题吗?
    MS. SHROFF: 由谁指示?
    法官: 您可以回答两个问题。请继续。
    答:Yvette、Victor、公司内律师指示我们需要立即另外开设一个账户。
    问:您能具体描述一下这次谈话中您被要求做了什么吗?
    答:尽快找到另一个银行。
    问:在得到这一指示后,您做了什么反应?
    答:有两个任务:找到另一个银行;同时我需要在不同的金融机构为每个实体开设两个账户,以备一个账户关闭时有备用。
    问:您能描述一下您在Crane工作时如何开设新的银行账户的程序吗?
    答:这个程序稍微有所发展。以前是基本信息,我会发送公司文件、关于这些实体受益所有人的信息、关于签字人的信息以及签字人的身份证明。通常需要填写特定于银行的申请表。
    这就是这样了。然后当我们发现有很多账户被关闭,关联着搜索引擎和关于公司网站的文章,我们开始为每个账户开设过程附加备忘录,描述该实体是什么,它的运营范围,其客户是谁,与郭文贵、郭宝所有任何关系,以及这些公司提供的一些使命或服务。
    问:您提到您需要收集文件和信息以提交开户申请。您从谁那里收集这些信息和文件?
    答:通常是公司内律师,Yvette会指示他们给我关于实体的信息;Max有一些早前成立的公司的文件;就是这样。
    问:在您为Crane工作时,您在哪些银行开设了账户?
    答:Signature Bank、Bank of Princeton、波多黎各第一银行、First Republic Bank、以色列折扣银行、City National银行和波多黎各Medici银行。
    问:您如何选择要联系哪家银行开设账户?
    答:要么我认识业务关系经理,我会联系他们,或者我会通过某个认识关系经理的人得到引荐。
    这就是这样。
    问:您所说的“认识关系经理”是什么意思?
    答:就是某人会——举个例子,工作在以色列折扣银行的某人认识另一家银行的某人;他们会告诉他们,你知道——他们会介绍我给他们,然后我会开始对话,告诉他们我有机会为一家企业开设账户,发送给他们成立文件,告诉他们这将是什么类型的账户,这就是一次引荐。
    您是如何选择要联系哪家银行开立账户的,如果有的话?
    我要么认识关系经理,要么认识业务关系经理,我会联系他们;要么是通过某个认识关系经理的人进行热门介绍。
    大概就是这样。
    什么是您所说的“热门介绍”?
    就是某个人,比如说,假设在以色列折扣银行工作的某个人认识另一家银行的人;他们会告诉对方,我想要把我介绍给他们,然后我们开始交谈,告诉他们我有机会为一家企业开立账户,发送给他们成立文件,告诉他们账户类型是什么,就这样就完成了一次热门介绍。
    如果有的话,您为什么在不同的银行开立账户?
    因为账户被关闭了,我希望也能对抗这种账户关闭。通常情况下,比如某个实体只有一个签署人,同时在一个银行有多个实体,那么所有账户会被关闭;所以通过在不同的银行开户,基本上可以在某一时刻激活一个账户。
    谁决定每个您帮助开户的银行账户上谁能成为授权签署人?
    A. Yvette告诉我哪些公司会有签署人。一些公司在成立文件中列出了UBO或拥有者,如果他们还在且可用,他们就可能成为签署人。
    你也替你的公司Crane开立过银行账户吗?
    A. 是的,我曾经这样做过。
    在哪家银行?
    A. 仅在花旗银行。
    Khaled先生,这是什么样的文件?
    A. 这是一份花旗银行的企业存款账户申请。
    ...
    A. 金春纽约有限公司
    问:金春公司注册地址是什么?
    答:纽约纽约市东64街162号。
    问:这是联排别墅地址吗?
    答:是的,女士。
    问:看一下这里列出的业主/签署者信息,这个账户上列出了什么名字?
    答:颜萍王(又叫伊维特)。
    问:这个账户开户文件上和伊维特相关的邮寄地址是什么?
    答:纽约纽约市东64街188号10065。
    女士:劳特斯女士,我们是否可以放下这个,然后展示政府展品BR374,这是证据之一。请再次放大顶部部分。
    问:卡莱德先生,这份文件上的机构名称是什么?
    答:哈德逊钻石纽约有限责任公司。
    问:您熟悉这个实体吗?
    答:是的。
    问:这是什么,或者当时是什么?
    答:我相信它是一个资产的控股公司。
    问:这份账户协议上列出的哈德逊钻石的地址是什么?
    答:纽约纽约市东64街162号。
    问:再次确认,这是联排别墅地址吗?
    答:是的,女士。
    问:这里的业主/签署者名字是?
    答:颜萍(伊维特)王。
    问:邮寄地址,是之前文件上看到的同一个地址吗?
    答:是的,女士。
    问:谁被列为伊维特的雇主?
    答:金春纽约有限公司。
    女士:劳特斯女士,请出示政府展品BR375。请放大顶部,包括右侧的日期,如果可以的话。
    谢谢。
    问:同样的问题,卡莱德先生。这里列出的机构名称是什么?
    答:蓝灯资本有限责任公司。
    问:蓝灯资本的地址是什么?
    答:纽约纽约市麦迪逊大道667号四楼。
    问:在您在Crane工作期间,您熟悉这个地址吗?
    答:不是。这个地址是一个虚拟地址。
    问:这份账户协议上蓝灯资本的业主/签署者是谁?
    答:丹尼尔·波达斯基。
    问:在业主/签署者信息的几行下,蓝灯资本的描述是什么?
    女士:劳特斯女士,请突出显示,谢谢。
    答:不是的——
    问:您看到突出的部分了吗,卡莱德先生?
    答:看到了。那是以前的金融机构。
    问:然后在账户协议中包括了哪些描述?
    答:新成立的公司。
    问:这份账户协议的日期是?
    答:2020年9月10日。
    女士:劳特斯女士,请出示BR372。再次聚焦于上半部,请。
    问:我们从日期开始这次。这份账户协议的日期是什么?
    答:2020年9月22日。
    问:这里列出的机构是什么?
    答:格林威治土地有限责任公司。
    问:格林威治土地的地址是什么?
    答:纽约纽约市麦迪逊大道6067号四楼。
    问:这是之前与蓝灯资本相关的虚拟办公地址吗?
    答:是的。
    问:在这里的业主/签署者上,与蓝灯资本账户协议上相同的个人是谁?
    答:是的,丹尼尔·波达斯基。
    问:看着丹尼尔·波达斯基所列的雇主,这里列出的雇主是什么?
    答:蓝灯资本有限责任公司。
    女士:您可以放下,劳特斯女士。谢谢。
    问:蓝灯资本是什么类型的公司?
    答:它是一家代表所有其他控股公司支付款项的公司。
    问:当你说所有其他控股公司时,你指的是?
    问:这是我们在Lamp Capital账户中看到与之关联的同一虚拟办公室地址吗?
    答:是的。
    问:这里的所有者/签署者,与Lamp Capital账户协议上的个人是同一个人吗?
    答:是的,Daniel Podhaskie。
    问:看下面列出的Daniel Podhaskie的雇主是哪家公司?
    答:Lamp Capital LLC。
    MURRAY女士:你可以把记录拿下来,Loftus女士。谢谢。
    问:Lamp Capital是什么类型的公司?
    答:这是一家代表所有其他控股公司支付款项的公司。
    问:当你说所有其他控股公司时,你指的是哪些公司?
    答:Greenwich还支付了房地产公司的费用,也支付了游艇的费用,我记得;我不知道是否还有飞机之类的。
    问:抱歉,我没听清楚你说什么。
    答:我不知道是否有飞机,比如私人飞机,或者——它只是支付费用。
    问:你所讨论的这些控股公司支付了哪些人的费用,如果有的话?
    答:郭家。
    问:Greenwich Land是什么类型的公司?
    答:一家控股公司。
    问:Greenwich Land持有什么资产,如果有的话?
    答:我想它持有的是——是康涅狄格州格林尼治的一座住宅。
    问:那座住宅有谁住?
    答:郭文贵。
    问:Khaled先生,你提到了一个名为G/CLUBS的公司。G/CLUBS是什么?
    答:G/CLUBS是一个提供会员福利的会员公司。
    问:G/CLUBS是什么时候成立的?
    答:我想是2020年9月。那时候也成立了G Club Puerto Rico。
    问:你是如何得知G Club的?
    答:在我去波多黎各的旅行中。
    问:你什么时候去过波多黎各?
    答:2020年9月。
    问:2020年9月去波多黎各的目的是什么?
    答:所以Crane在考虑,就像我说的,要在美国成立一个金融机构,我们意识到,在与几家律师事务所、顾问交谈后,那个任务在美国土地上得到批准将是一个非常漫长的过程。有一个叫做国际金融机构的概念,这是波多黎各的金融结构概念,也就是波多黎各的银行牌照,所以我们自己和Victor去探讨在那里获得牌照的可能性。我们得到律师的建议称这是一个更简短、更宽松的流程。所以我们去了波多黎各,会面我们的,将会申请那个牌照并帮助我们设立它的律师们。
    问:在你与Victor去波多黎各之前,你进行了什么类型的对话,关于试图购买银行牌照?
    SHROFF女士:反对,法官。这假设了证据中没有的事实或从这位证人那里得到的事实,并且是引导性的。
    法官:你可以询问他是否有进行过任何对话。
    关于前往波多黎各开设银行并申请银行牌照的讨论记录
    问题/回答 关于前往波多黎各考察设立银行许可的对话记录,以下是对话记录表格:
    序号 问题/回答 1 A. 是的,我有。 2 Q. 在前往波多黎各之前,您是否与任何人讨论过这次旅行的目的? 3 A. 是的。 4 Q. 您与谁谈论了这次旅行的目的? 5 A. 事先与Yvette谈过目的;还与Victor Cerda和Miles Guo有过对话。 6 Q. 您可以描述一下与Yvette讨论前往波多黎各考察银行许可之前的对话吗? 7 A. Victor建议了那个想法,他向Yvette和我提出了这个想法,她很欢迎。她说,你们去看看能做些什么。 8 Q. 那么Miles Guo呢?在前往波多黎各之前,您与他有过哪些对话? 9 A. 我们正在努力寻求解决方案,正朝着设立银行的目标前进。 10 Q. William Je是谁? 11 A. William Je是Yvette介绍给我的一名银行家。 12 MS. MURRAY:Loftus女士,请您公布证据中的政府103号展品。 13 Q. Khaled先生,你认识这个人吗? 14 A. 是的。 15 Q. 他是谁? 16 南区报告员,P.C. (212) 805-0300 1962年
    O6A1GUO3 卡勒德 - 直接
    对话记录, 包含以下表格名称: 对话记录, 包含以下列:
    发言者: 无
    对话内容: 无
    对话记录, 以下是表格标题: 对话记录, 以下是列标题:
    发言人:无
    对话:无
    1 A. 威廉·杰 2 MURRAY女士:我们可以摘掉。 3 问:在Yvette将威廉·杰介绍给您时,她告诉过你什么? 4 答:她告诉我威廉·杰是一位银行家,在英国有一家投资公司,拥有一个庞大的团队,成功并且是家庭和使命的亲密伙伴。 5 问:当你说威廉·杰是家庭的亲密伙伴时,指的是哪个家庭? 6 答:郭家。 7 问:你所说的使命是指什么? 8 答:反中共的使命。 9 问:威廉·杰那时工作在哪家公司? 10 答:我记得是Hamilton。 11 问:威廉是否参与过你们购买银行的努力? 12 答:是的。 13 问:大约是在什么时候? 14 答:我想是在2021年的四月、五月。 15 问:在你们购买银行的努力中,他扮演了什么样的角色? 16 答:在这里,我们确定了一家银行,他在对它们进行尽职调查。我们(Miles、威廉和我)提出了一份条款清单,就购买Medici进行了谈判。 南区记录员有限公司 (212) 805-0300
    1963
    问:Khaled先生,2020年9月在您前往波多黎各期间或之后,您是否参与建立任何企业? 答:是的。 问:是哪些企业? 答:G俱乐部、G时尚、G音乐和G新闻。 问:您如何将这组企业称呼? 答:称之为G系列。 问:在G系列实体中,G代表什么意思? 答:我相信是Guo。
    默里女士:Loftus女士,您能否查找作为政府证据展示的SW2032号文件。
    我们可以从开头开始看一下。
    问:首先,Khaled先生,这是何种类型的文件? 答:这是一封邮件传达。
    默里女士:因此,Loftus女士,请关注从上到下的内容。如果可能的话,请提供标题信息,包括“原始消息”。谢谢。
    问:这封邮件是由谁发出的? 答:Debra Von Gonten。
    问:看一下发件人一栏,如果可以的话,谁发出的?
    南区记录员有限公司 (212) 805-0300
    1964
    问:哦,是由我在Crane那里发出的。 问:发送对象是谁? 答:是送给Bank of Princeton的Debra Von Gonten。 问:这封邮件的主题是什么? 答:Crane咨询集团 - 转介。 问:看一下这封邮件的第一段,内容是这样的:
    “Lamp Capital和Greenwich的账户总额应为1100万美元,我们应当收到一笔大额付款,转给Greenwich用于购买价值2800万美元的房地产组合。”
    问:您是否参与在Bank of Princeton为Lamp Capital和Greenwich建立账户? 答:是的,我起到了介绍作用。 问:您是否了解这封邮件提到的房地产组合? 答:实际上并不清楚。
    默里女士:请查看下一个段落,Loftus女士。
    问:Khaled先生,请为我们读一读这段内容。
    “我们还有另一家客户与Signature有银行关系。他们是一家提供豪华生活国际会员服务的初创公司,大约有1600名会员。目前余额为1500万美元,我们希望帮助他们在普林斯顿银行开设一个账户。请您给我发送可获得的MMA利率。”
    1965
    G/CLUBS信息
    问题 答案 员工情况 无 银行账户余额 无 提供的服务 无 会员人数 无 G/CLUBS 信息
    问题 回答 这封电子邮件的日期是什么? 2020年10月21日。 您刚刚阅读的提到拥有国际会籍服务的初创公司,指的是哪家公司? G Club operations。 在2020年10月21日这个时候,有谁在G/CLUBS工作吗? 我想我们当时可能有一到两名员工。 在2020年10月21日这个时间点,G Club的银行账户大约有多少钱? 我不确定具体数字,但绝对超过1500万。 Khaled先生,谁告诉您这是G/CLUBS提供的内容描述,即豪华生活的国际会籍服务? 是Jessica,这也出现在G/CLUBS的网站上。 这里反映的1600名会员,这个数字是从哪里获得的? 来自Jessica。 您在G/CLUBS工作过吗? 没有。 默里女士:如果我们能够翻到第2页,洛夫图斯女士,请。沿着邮件链往上看。如果我们能够集中注意开始于南区记录员行(南区记录员行,电话212-805-0300)
    1966
    O6A1GUO3 哈立德 - 直接
    1 正文有点在页面中间的电子邮件起始。
    2 问:这封电子邮件的日期是什么时候,哈立德先生?
    答:2020年10月30日。
    4 问:是谁发出的?
    答:是我。
    6 问:这是发给普林斯顿银行两位个人的?
    答:是的,女士。
    8 问:看一下这封电子邮件的正文,写着“请查看已完成的G俱乐部运营有限责任公司的新账户申请。客户需要公司的三个账户两个支票账户(订阅和运营)和一个货币市场账户,利率为0.40%,总存款将超过1000万美元。” 什么是支票账户?
    答:活期存款账户。
    10 问:你能解释一下这是什么意思吗?
    答:哦,支票账户。
    12 问:什么是货币市场账户?
    答:货币市场账户,类似于活期储蓄账户。
    14 在以下“请”开始的句子中,“请告诉我是否有遗漏的地方,因为我们需要尽快建立这些账户。”在2020年10月30日这个时间,您还记得有关于尽快建立G俱乐部银行账户的紧急情况吗?
    答:我认为Signature银行的账户即将被终止,或者
    南区记录员行(南区记录员行,电话212-805-0300)
    1967
    问:在这里您提到了一个个人,在下一行或者段落。它说公司的总务主管和签字者Alex。这里的pat指的是谁?
    答:Alex Hadjicharalambous。
    问:他的角色是什么?
    答:总务主管,但我觉得是为了G时尚。
    问:看看您发送的电子邮件的抄送行,您能读出发送给您的电子邮件地址吗?
    答:Alex Hadjicharalambous。
    问:在括号内,电子邮件地址?
    答:Alexh@gclubs.com。
    默里女士:如果我们能够继续往上翻一点,洛夫图斯女士,请。
    实际上,几乎到达邮件的顶部。从哈立德先生的提到的“今天早上的通话”这一点开始。
    电子邮件对话详情, 带有以下表标题: 电子邮件对话, 具有以下列:
    问题:无
    答案:无
    邮件对话细节, 具有以下表标题: 邮件对话, 以下是列:
    问题: 无
    回答: 无
    Q. 这封电子邮件的日期是什么,Khaled先生? A. 2020年10月30日。 邮件内容为:“关于今天早上的电话,请查看附件的第二张ID Yvette,您可以使用其中任何一张。”   这里的Yvette是指哪位? A. Yvette Wang。 Q. 如果有的话,您为什么要提供Yvette Wang的身份证明给普林斯顿银行,涉及G/CLUBS账户的开立?   南区速记员有限公司(212)805-0300
    1968
    O6A1GUO3 卡利德 - 直接问
    1 A. 她将成为签字人,因为亚历克斯是新来的。
    2 穆雷女士:洛夫图斯女士,我们可以记录下来。请展示作为证据的GX SW2005,重点放在这里的顶部至签名栏。
    3 这是什么类型的文件,卡利德先生?
    4 它是一封电子邮件。
    5 从谁那里发来的?
    6 从多米尼克·切基尔发来的。
    7 多米尼克·切基尔在哪里工作?
    8 Signature Bank。
    9 这封邮件的主题是什么?
    10 关于 G Club 的后续。
    11 什么日期发送的?
    12 2020年10月13日。
    13 那是大约在我们刚刚查看的普林斯顿银行电子邮件链几周前吗?
    14 是的,女士。
    15 总的来说,多米尼克·切基尔发给您的这封邮件提到了什么?
    16 这是 G Club 的开户电子邮件。
    17 穆雷女士:洛夫图斯女士,我们可以收起这个,并请放出作为证据的政府展品SW2021。让我们再次关注顶部部分。
    18 这封电子邮件的日期是多少,卡利德先生?
    19 2020年10月20日。
    南区速记员有限公司(212)805-0300
    1969
    20 从Signature Bank的一位个人发给您的,这正确吗?
    21 是的,女士。
    22 有一个附件。
    23 穆雷女士:如果我们可以翻到下一页,洛夫图斯女士。
    24 并聚焦于实际文字内容。
    25 这封信是写给哪个实体的?
    26 写给 G Club Operations LLC。
    27 G Club Operations LLC 的实际地址是什么?
    28 纽约麦迪逊大道590号,21楼。
    29 那是我们在政府展品SW2009中看到的同一个虚拟办公室地址吗?
    30 我认为是的。
    31 请阅读这封信的内容,从“This letter”开始。
    32 “这封信是确认为 G Club Operations LLC 开设了一个账户。目前,截至今日,他们有39208081.06美元 [错] 存入。”
    33 如果您可以再读一遍这个金额。我觉得您可能颠倒了两个数字。
    34 39208018.06美元。
    穆雷女士:洛夫图斯女士,请收起这个,然后展示政府展品SW2030。
    1970
    O6A1GUO3 卡利德 - 直接问
    1 如果我们把焦点放在顶部部分。
    2 这是哪天的?首先,卡利德先生,这是什么类型的文件?
    3 这是多米尼克·切基尔发给我的一封电子邮件。
    4 日期是多少?
    5 2020年10月28日。
    6 从切基尔先生发来的账户开设邮件后大约两周?
    7 是的,女士。
    8 这封邮件的主题是什么?
    9 G/CLUBS 成员资料请求。
    10 请阅读这封邮件的内容。
    11 “让我难过不已,不得不发出这封邮件。如讨论,附件中包含了 G Club 和 G Fashion 的信函。我发给您,您再视情况交给伊维特,因为我知道这是一个非常敏感的问题。请告诉我是否想让我给伊维特打电话讨论,或者您认为最好我不要。此外,我们有两笔要求退回的汇款。我现在会将它们退回,并将汇款信息发送给您的另一封邮件中。”
    12 穆雷女士:我们可以收起,洛夫图斯女士。
    13 卡利德先生,您在2020年秋季还协助注册纽约的企业吗?
    14 我想只有莱克星顿地产。
    15 穆雷女士:洛夫图斯女士,请打开
    根据讨论,附上了给G Club和G Fashion的信函。我发给你,让你自行决定是否交给Yvette,因为我知道这是一个非常敏感的话题。请告诉我是否需要我打电话给Yvette讨论,或者你认为最好我不要打电话。另外,我们有两笔要求退回的转账。我现在将它们退回,并会在另一封邮件中发送给你有关退款的信息。
    21 MS. MURRAY: 我们可以暂停了,Loftus女士。
    22 问:Khaled先生,您在2020年秋天是否也协助创建纽约的企业?
    23 答:我相信只有Lexington Properties。
    24 MS. MURRAY: Loftus女士,请打开SOUTHERN DISTRICT REPORTERS, P.C.的人员,我们可以看一下政府SW2002展品的内容。如果能从页面顶部放大并看到页面中间的第2项。
    问:Khaled先生,这是什么类型的文件?
    答:这是一封电子邮件。
    问:从这里中间部分开始看,从Scanlon, Courtney,这封邮件是发给谁的?
    答:是发给Daniel Podhaskie。
    问:Podhaskie的角色是什么?
    答:他是一位公司律师。
    问:您是否认识Daniel Podhaskie的电子邮件域名?
    答:是的。
    问:是什么?
    答:Golden Spring New York US,属于Golden Spring。
    问:在这封邮件中,如果看一下发送给Daniel Podhaskie的消息,表明了20个实体。看第一个,特拉华州的公司,这个实体的名称是什么,上市的唯一股东是谁?
    答:Infinity Treasury Management Inc.,唯一股东是Mileson Guo。
    问:然后列出的第二个实体?
    答:Lamp Capital LLC。(唯一成员是Infinity Treasury Management Inc.)
    问:Podhaskie在什么日期把这个发送给了您?
    答:2020年9月9日。
    问:与您的电子邮件地址相关联的电子邮件域名是什么?
    答:Gtv.org。
    MS. MURRAY: 好的,Loftus女士,我们可以暂停这个了。
    问:Khaled先生,我相信您提到过,您为不同实体准备了某些摘要,用于提交银行等方面的用途?
    SHROFF女士:抗议。抗议证词。
    法官:限制。
    问:Khaled先生,您为Crane的工作提交给银行的文件有哪些?
    答:在开户时,我们为G系列提交了公司业务摘要,然后我们为每个实体创建了一个,基本上告诉他们公司的业务情况、地址、所有权结构、与推手的任何关联、每家公司提供的一些服务以及使命。
    问:这些摘要文件中包含的信息的来源是什么?
    答:一些是由公司律师提供的,关于公司的信息;一些来自维基百科;还有一些信息是来自Yvette;一些是通过讨论获得的。
    MS. MURRAY: Loftus女士,请展示政府展品SW2040。关注顶部。
    问:Khaled先生,这是您发给电子邮件地址roman@fundingvictory.com的一封电子邮件。您知道谁在使用这个电子邮件地址吗
    答:知道。
    问:pat是谁?
    答:是Roman Yagudaev。
    问:Roman Yagudaev在2020年12月期间对您在Crane的工作有什么相关性?
    答:他只是一个我——一个我认识的联系人和朋友。
    问:这封电子邮件有一个主题,主题是什么?
    答:MG。
    问:附件的标题是什么?
    答:MG.docx。
    MS. MURRAY: 如果我们现在看附件,请放大。
    问:Khaled先生,pat主题行和pat附件标题中的MG是指什么?
    答:Miles Guo。
    MS. MURRAY: 如果我们能够关注一下,请。
    1973
    1 地址? 2 A. 知道。 3 Q. pat 是谁? 4 A. 是罗曼·亚古达耶夫。 5 Q. 在您在 Crane 公司工作期间,罗曼·亚古达耶夫与您的工作有关吗? 6 A. 他只是一个我认识的联系人和朋友。 7 Q. 这封邮件的主题是什么? 8 A. MG。 9 Q. 附件的标题是什么? 10 A. MG.docx。 11 MS. 穆雷:洛夫图斯女士,我们现在来看一下附件。 12 Q. 哈立德先生,在邮件的主题行和附件标题中,MG 是指什么? 13 A. 郭文贵。 14 MS. 穆雷:如果可以,洛夫图斯女士,让我们关注一下顶部部分,引用和第一段。 15 Q. 哈立德先生,这是什么? 16 A. 一个简介。 17 Q. 谁写的? 18 A. 我的助手玛雅。 19 Q. 这份文件的目的是什么? 20 A. 提供一份任务的预览。
    南区记录员公司
    1974
    O6A1GUO3 哈立德 - 直接
    Q. 这个任务是针对什么的?
    A. 反CCP。
    MS. 穆雷:洛夫图斯女士,如果我们可以放大一下。并重点关注从 G/CLUBS 开始直到底部的部分。
    Q. 哈立德先生,这里有一个关于 G/CLUBS 的描述。有人提供这个描述吗?
    A. 杰西卡,公司内部律师。她负责所有 G 俱乐部,并且我相信这些信息也在网站上。
    Q. 看看从提供的服务开始的部分,在这封电子邮件发出的时候,即 2020 年 12 月,列出了哪些服务?
    A. 多语言接待和翻译服务,美国奢侈消费品预订和折扣服务;为中国客户在美国提供专业服务;举办年度峰会,为在美国的中国专业人士和企业家提供主题演讲和赋能活动;为在美国接受高等教育的中国学生提供教育服务和代表;为在美国的中国高净值人士提供医疗服务;在美国国内提供临时住房和旅行安排。
    MS. 穆雷:洛夫图斯女士,请把这个放下来,展示政府证据 SW2042。将焦点放在顶部。
    Q. 哈立德先生,这封电子邮件的日期是什么?
    A. 2020 年 12 月 8 日。
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    问题 回答 主题是什么? G系列。 这封邮件是发给谁的? Miguel Santin。 抄送抄送名单中还有哪些人? Ross Heinemeyer,Alex Hadjicharalambous,Zee Liu。 (接前页)
    南区记录员,有限公司(212)805-0300
    1976
    对话记录
    问题 回答 这家公司最近有任何招聘活动吗? 是的,我们最近开始了一些招聘活动。 那么,关于郭文贵与G公司的合作情况如何? 我们目前正在与郭文贵进行商讨合作事宜,但具体细节还在商议中。 G公司对我们的招聘活动有任何影响吗? 是的,G公司与我们的招聘活动有一定关联,他们可能提供一些支持。 郭文贵是否已经参与了公司的任何推广活动? 目前尚未有郭文贵参与公司的任何推广活动,但我们正在考虑将他作为合作伙伴。 对话记录,涉及与G公司和郭文贵相关的就业和推广活动, 带有以下表标题: 对话记录, 具有以下列:
    问题:在对话过程中提出的问题。
    答案:在对话过程中提供的答案。
    O6ABGUO4 哈立德 - 直接 Q. 据您了解,2020年12月,Ross Heinemeyer是否为G/Clubs工作?   A. 不是。   Q. 他是否为哪个实体工作?   A. 法治基金会。   Q. 在这封电子邮件中,以一个承诺开头:“请查收G公司提供的详细描述和创始信息。我们还描述了品牌推广者的信息。正如我们向您提到的,他们被聘请仅用于推广和拉新订户。他们不是业主,也不在管理层职位上,完全是因为他们的追随者而被聘用的推广者。”   您在这里提到的G公司品牌推广者,如果有的话,指的是谁?   A. 郭文贵。   Q. 为什么您要指出推广者不是业主也不在管理职位上?   A. 因为那样会——那样会在开立账户时引发问题,如果这个名字被谷歌搜索,而且他们直接拥有公司中的管理职位或所有权。   Q. 您能具体解释一下,您所说的,如果名字被谷歌搜索,会引发什么问题吗?   A. 比如如果郭文贵的名字直接与G实体的所有权联系在一起,如果这个名字被谷歌搜索或被列入OFAC,那将危及开立账户的可能性。   南区记录员公司 (212)805-0300 1977
    O6ABGUO4 哈立德 - 银行直接账户。
    问:在2020年12月这个时间段,就银行关系而言,您的职责和责任通常是什么?
    答:在12月份,我的重点本应是开设一家真正的金融机构或虚拟银行,这是我当时正在进行的两个项目。
    问:在对于Promotor Miles Guo不处于管理职位的描述中,根据您在Crane工作的经验,这是一个真实的说法吗?
    答:不是的。
    问:这个说法有什么地方是不准确的?
    答:Miles Guo参与了公司的创建和日常运营。
    问:为什么您在给First Bank PR的邮件中撒谎?
    答:为了增加他们批准开设账户以及不让姓名与任何OFAC、Google或公开搜索关联的机会,这将导致合规团队或开户团队拒绝开设账户,增加他们开设账户的机会。
    问:这封特定邮件附有一个附件。如果可以,Loftus女士,请向下滚动。
    这封G系列邮件底部的日期是?
    南区记录员,有限责任公司(212)805-0300
    1978
    对话记录表
    发言人 对话内容 无 本对话记录包括涉及郭文贵法律案件的个人间讨论。对话涉及对郭文贵的描述以及信息的验证问题。 对话记录
    说话者 对话内容 O6ABGUO4(编号) Khaled - 直接 1 对于 Guo 先生,请做一个总结?   2 A. 2020年10月。   3 Q. 请具体说一下。   4 请再为我们念一遍日期,先生。   5 A. 不好意思,是2020年12月。   6 Q. 如果我们能翻到后面几页。我认为是第   7 页,如果可以在此停顿。 焦点放在 Miles Guo 是谁。   8 Khaled 先生,谁写了这份关于 Miles Guo 的描述? 可能这是从维基百科页面上得到的。 9 SHROFF女士:对可能性提出异议,并请撤销。   10 法庭:所以不要说可能性或猜测。只说你绝对知道的事情。   11 A. 你能重复问题吗。   12 Q. 当然。谁写了这份关于 Miles Guo 的描述? Maya Fawas。 13 Q. 您是否亲自核实了这份关于 Miles Guo 的描述中的任何信息? 没有。 14 Q. 请退出那个页面,Loftus 女士。如果我们能关注运动背后的顶部部分,那段   15 段落。   16 看看这里的第二句话, Khaled 先生。它说, Miles Guo/Guo Wengui 被认为是品牌   南区记者,南区报告员,PC(212)805-0300   1979年
    关于郭文贵与G系列品牌关系的证词摘录
    问题 回答 证人询问:您是否熟悉郭文贵与G系列品牌的关系? 证人回答:是的,我了解郭文贵与G系列品牌有合作关系。 证人询问:请详细描述一下郭文贵与G系列品牌的合作情况。 证人回答:根据我的了解,郭文贵曾经在推广G系列品牌上扮演了重要角色,促进了品牌的知名度和销量。 证人询问:根据您的观察,G系列品牌如何影响了郭文贵的公众形象? 证人回答:G系列品牌的合作使郭文贵在公众中的形象更加积极和正面,增加了他在商业领域的认可度。 问题 回答 根据您在Crane工作的经验,该描述是准确反映了郭文贵与G系列的关系吗? 他绝对是其中一部分。 Khaled先生,根据您在Crane的工作经验,您是否了解郭文贵与G系列品牌之间存在何种关系? 他并非被寻求。他是G系列和G实体与他的参与共同创立的。 您能解释一下您所说的“创立”是什么意思吗?   露芙托斯女士,如果我们可以暂停这个问题,展示政府证据SW-2050。   Khaled先生,这封电子邮件的日期是什么? 2021年1月6日。 谁发出的? 玛雅·法瓦斯。 当时玛雅是谁?   南区记录员公司 (电话:212-805-0300)
    1980
    O6ABGUO4 哈立德 - 直接询问
    1 A. 她是我的助手,但也为镇上大楼的其他实体做了一些工作。
    2 Q. Loftus女士,如果我们能够滚动查看关于Saraca.PDF的附件。
    3 在这里右下角看一下,哈立德先生,这份文件的日期是多少?
    4 A. 2021年1月20日。
    5 Q. 如果我们能够翻到下一页。请专注于这里的概述,Loftus女士。
    6 请您读一下这份Saraca概要中概述部分的第一句话。
    7 A. 哈德森钻石控股有限公司是一家BVI公司,是一家为Miles Guo家族持有资产的商业公司和法律实体。
    8 Q. Loftus女士,如果我们能够放大查看这个部分。我想将这份展品放在一起,SW-2050的第三页和SW-2051的第三页,请。
    9 看看右边的SW-2051,如果我们能够放大查看同样的顶部段落,请Loftus女士,在右边也是如此。
    10 哈立德先生,这是来自2051号文件,您能读一下这份Saraca概要文件中的引言段落吗?
    11 A. 萨拉卡传媒集团,有限责任公司,Saraca是一家成立的控股公司,旨在帮助管理跨境活动、商业和财务事务。成立这家公司的主要目的是
    南区记录员公司 (电话:212-805-0300)
    1981
    组织架构细节, 带有以下表标题: 组织架构图, 具有以下列:
    公司:组织架构图中公司的列表
    信息:与公司相关的详细信息和百分比
    组织结构图细节, 带有以下表格标题: 组织结构图, 具有以下列:
    公司:组织结构图中的公司列表
    信息:与公司相关的详细信息和百分比
    O6ABGUO4 Khaled - 直接 1 结构是管理房地产、信托和继承计划、跨境投资、合资企业、上市和公司集团架构。 2 谢谢。Loftus女士,我们可以放大这两个图表。 3 如果我们可以专注于每个下方的组织结构图。 4 在我们看过的第一个文件中,Khaled先生,列出了什么是列出的终极母公司? 5 Hudson Diamond, Inc.,BVI。 6 只看一个也可以,Loftus女士。这是我们正在看的2050年的情况。Hudson Diamond Holding BVI下面是哪家公司? 7 Saraca Media Group. 8 下面列出了哪些公司? 9 GTV Media Group, Inc.,G News Media Group, Inc.,G Fashion Media Group, Inc.,G Live, LLC和G Posts LLC。 10 在最左侧,从GTV Media Group开始有一条线。你看到了吗? 11 是的。 12 这个组织结构图中反映了哪些信息? 13 不到49%是外部股东。 14 然后看看进入GTV Media Group的另一条线,这里显示了来自Saraca Media Group的百分比是多少? 南区记录员有限公司 (212) 805-0300
    1982
    对话记录表
    参与者 对话内容 甲 我们需要更新一下公司的组织结构图。 乙 好的,我会联系财务部门确认一下财务细节。 丙 请确保将所有关联公司的信息都包括进去。 丁 您需要我提供任何协助吗? 甲 是的,请确认一下这些数据的准确性。 戊 我会检查所有相关数据并与其他部门协调。 乙 我们需要尽快完成这些工作,以便及时提交给管理层审批。 甲 好的,我们会尽快完成,并将更新后的组织结构图发送给所有相关人员。 对话记录表格
    参与者 对话 O6ABGUO4 哈立德 - 直接 1 A. 51%。 2 Q. 洛夫特斯女士,我们可以不看2050年的了,我们关注2051年。 3 同样,就是组织结构图一直到底部。 4 在这份萨拉卡概要版本中,哈立德先生,谁在组织架构图的顶部? 5 郭坤。 6 Q. 你知道他是谁吗? 7 那是郭麦可。 8 Q. 那么,郭麦可和郭万斯之间有何关系,如果有的话? 9 他的儿子。 10 Q. 从这里从GTV Media Group开始,向左移动的组织流程中,组织架构中反映了什么? 11 外部股东3.3亿美元私募融资,不拥有超过10%的股份。 12 Q. 洛夫特斯女士,我们现在可以停下了。你是否熟悉一个名为Fiesta Property Development的实体? 13 是的。 14 它是什么? 15 据我所知,这是一个英国的房地产控股公司。 16 Q. 你认识谁与Fiesta Property Development有关联吗? 17 何浩然。 18 何浩然是谁? 南区记录员公司报告
    电话:(212) 805-0300
    1983
    电子邮件通讯详情 表格标题: 电子邮件通讯详情 列名称:
    问题/回答:与何浩然通讯以及电子邮件详情相关的问题和回答。
    电子邮件沟通详情, 下面是表格标题: 电子邮件沟通详情, 以下是列:
    问题/回答:与与Haoran He的沟通和电子邮件详细信息相关的问题和回答。
    O6ABGUO4 Khaled - 直接 1 A. 他是 - 名字被介绍给我作为G/俱乐部运营的最终受益人持有人。 2 Q. 你曾经见过Haoran He吗? 3 A. 没有。 4 Q. 你曾经通过电话或视频聊天与Haoran He交谈吗? 5 A. 没有。 6 Q. 在你与Crane的工作中,你是否与Haoran He进行过沟通? 7 A. 可能通过电子邮件几次。 8 Q. Loftus女士,您可以查找一下政府展品GC-500。我们可以从底部开始。 9 对于这封第一封电子邮件,Khaled先生,您在抄送名单中是对的,对吗? 10 A. 是。 11 这封电子邮件的日期是什么? 12 A. 2201年1月18日。 13 谁发送了这封邮件? 14 A. 克里斯蒂娜·沙茨。 15 看一下发件人一栏,您能看到发件人是谁吗? 16 A. 发件人是Alex Hadjicharalambous。 17 这封邮件发送给了哪家金融机构的两位个人? 18 A. 克里斯蒂娜·沙茨在摩根士丹利。伊丽莎白·伯斯特勒在摩根士丹利。 南区记录员有限公司(212)805-0300
    1984
    电汇交易细节,以下是表格标题: 电汇细节 以下是列名:
    信息:包含与电汇交易相关的主题行、正文内容、账户详情和受益人信息。
    电汇交易细节, 以下是表的标题: 电汇详情, 以下是列:
    信息: 包含与电汇交易相关的主题行、正文内容、账户详情和受益人信息。
    Q. 这封电子邮件的主题是什么? 电汇 G/俱乐部运营有限责任公司。 Q. 邮件的正文表明计划于2021年1月19日从以8564结尾的账户(在括号中描述为ADP和开支)进行转账。这里的ADP代表什么? 这是一家工资支付公司。 Q. 然后在电汇的描述中,从ADP工资支付和开支账户出去的金额是多少? $1百万。 Q. 受益人账户名称是什么? Fiesta Property Developments 有限公司。 在中间有一封来自 Elizabeth Berstler 的电子邮件。这是 Elizabeth Berstler 发给 Alex H 的一封邮件。邮件正文是什么? 你能简要解释/说明这次电汇的目的吗。 于是,2021年1月20日上午9:15,Alex 转发这封邮件给你。他写了什么给你? 你能请建议如何最好回复吗? 南区记录员有限公司(212)805-0300
    1985
    法庭文档标题:法庭对话记录
    发言人 对话内容 律师 感谢各位出席今天的听证会。我们今天的第一个议题是关于卡勒德先生的一笔电汇交易和账户状态。 公证员 卡勒德先生,请您简要说明一下最近这笔电汇交易的情况。 卡勒德先生 当时我委托我的助手进行了一笔电汇交易,金额为5万美元,从我们公司账户转出到对方账户。但最近我发现这笔款项并未到达对方账户。 银行代表 经过我们的调查发现,电汇交易的过程中出现了一些技术问题,导致款项无法成功转出。我们正在全力协助解决这个问题。 律师 银行代表,请问目前卡勒德先生的账户状态如何? 银行代表 卡勒德先生的账户目前正常。我们已经冻结相关款项,一旦问题解决,款项将立即转出。 律师 卡勒德先生,您对银行的处理有何意见或要求吗? 卡勒德先生 我希望银行能够尽快解决问题,确保款项安全转出,并尽快恢复我的账户正常状态。 公证员 非常感谢各位的陈述。我们会继续跟进此事,确保问题尽快得到妥善解决。 以上为本次法庭对话记录。
    法庭对话记录
    发言者 对话内容 A 我知道了。我会准备好回复的。刚和Christina交谈过。他们只是想将其留在文件中。 Q Khaled先生,如果可能的话,为什么G/Club的财务总监Alex H要求您准备一份关于这笔G/Club汇款的回复? MS. SHROFF 异议。我认为这个问题应该问Alex H。 法官 异议有效。 Q Khaled先生,您对Alex H将这封电子邮件转发给您有何理解? A 他希望运行回复,以便向银行提供适当的回复,以免损害双方的关系和账户状态。 Q 据您了解,回复此询问可能如何危及账户状态? A 基于了解您的客户(KYC)和账户开立批准,摩根士丹利的G/Club营运账户将用于发放工资和与G/Club支出直接相关的任何事项。 Q 那么在2021年1月,您对向Fiesta Property Development的汇款目的了解吗? A 不太清楚。没有。 Q Loftus女士,请打开GC-508。 Q 焦点放在这封邮件的主题上。这封邮件是您发出的。请问,这封电子邮件的主题是什么? SOUTHERN DISTRICT REPORTERS, P.C. (212) 805-0300   这是一个年份,无法准确翻译。请提供更多上下文或内容,以便我可以给出更准确的翻译。
    电子邮件对话:关于从G/Club Operations LLC向Fiesta Property Developments Limited进行电汇的讨论
    问题 回答 无 无 Email对话关于从G/Club Operations LLC向Fiesta Property Developments Limited的电汇,可能是用来支付物业首付款的交易,具体交易和相关方的细节。
    |Email对话关于电汇| |---|---| |问题|回答|
    06ABGUO4 Khaled - Direct 1 A. 从G/Club Operations LLC发起的电汇。 2 Q. 发送对象和抄送对象是谁? 3 A. 发送给Alex Hadjicharalambous,抄送给Jessica Mastrogiovanni。 4 Q. Jessica Mastrogiovanni扮演什么角色,如果有的话? 5 A. 她是G/Club实体的公司律师。 6 Q. 查看这封电子邮件的正文,第一段中写道,“这次转账是从G/Club Operations LLC向Fiesta Property Developments Limited发起的,后者是一家位于英国由Mr. He拥有的房地产控股公司。与G/Clubs Operations, LLC相同的业主,用于可能购买总价值1000万美元的一处物业的首付款。” 7 Khaled先生,您从哪里得到这段文字中的信息? 8 A. Jessica。 9 Q. 您是否了解Fiesta Property打算购买的物业是什么? 10 A. 不清楚。 11 Q. 您是否有任何个人知识证实这些信息的准确性? 12 A. 没有。 13 查看第二段,其中写道,“此笔交易由放贷方G/Club Operation, LLC向借款方Fiesta Property, LLC提供了1000万美元的内部贷款协议,并制定了还款计划。如果它们 ...” 14 南区记录员,SOUTHERN DISTRICT REPORTERS,P.C. (212) 805-0300 抱歉,请提供完整的法庭文件,以便我可以进行翻译。
    对话记录 参与者:无 对话内容:无
    对话记录
    参与者 对话内容 O6ABGUO4 Khaled - 直接 1 需要贷款协议,我们可以在将来呈现。 2 在哪里,如果有的话,你得到了那段信息? 4 杰西卡。 5 问:在你写这封电子邮件的时候,你是否记得是否看过这里提到的贷款协议? 6 答:我不记得了。 7 问:你为什么向Alex H发送这封草稿电子邮件? 8 答:为了转发给银行。 9 问:关于Fiesta Property Development,你是否了解杰西卡·马斯特罗乔瓦尼提供这些信息的原因是什么? 10 沙赫德女士:反对。 11 法庭:保留。 12 问:你为什么要咨询杰西卡·马斯特罗乔瓦尼关于这笔电汇的信息,如果有的话? 13 答:因为我想用她了解的信息回复银行。 14 问:你是否记得是否联系过何先生关于这笔电汇? 15 答:没有。 16 问:为什么没有联系? 17 答:因为规程是杰西卡在我们之间,我和郝然·何之间,如果我们需要任何信息。 18 洛夫图斯女士,我们可以记录下来,接着继续。 南区记录员有限公司(212) 805-0300
    1988
    O6ABGUO4 哈立德 - 直接 政府展品GC-501。请往下滚动一些,这里是一封电子邮件,从底部开始,发件人是Alex H。
    哈立德先生,您看到这封来自Alex H的电子邮件的最后两段了吗?
    问:这封电子邮件的日期是多少?
    答:2021年1月25日。
    问:Alex H.将其发送给摩根士丹利的两位个人;这是正确的吗?
    答:是的。
    问:谁被抄送在这里?
    答:我。
    问:G/Club Operations, LLC的这笔电汇金额是多少?
    答:五百万。
    问:转入哪个受益人账户?
    答:Fiesta Property Developments, LTD。
    现在看最后两段,您是否认识这些段落的内容,这是Alex H.提交给银行的?
    答:是的。
    问:这些段落的文本和描述,与您在我们刚刚查看的政府展品GC-500中提供的电子邮件中相同吗?
    答:是的。
    南区记录员有限公司(212) 805-0300
    1989
    O6ABGUO4 哈立德 - 直接
    2021年1月至2月汇往Fiesta Property Development的电汇细节, 以下是表格标题: 关于向Fiesta Property Development汇款的电子邮件往来, 以下是各列内容:
    日期:无
    金额:无
    2021年1月至2月向Fiesta Property Development发送的电汇详情, 包含以下表格标题: 与Fiesta Property Development电汇相关的邮件往来, 包含以下列:
    日期:无
    金额:无
    1 问:Loftus女士,我们现在可以看一下政府展品BR-1506。请问这封邮件的日期是什么,请聚焦在顶部片刻? 2 答:2021年3月24日。 3 问:主题是什么? 4 答:“向Fiesta Property Development电汇,2021年1月至2月。” 5 问:看一下这里列出的三笔电汇,它们的日期和金额分别是什么? 6 答:2021年1月21日,734,000英镑;2021年1月27日,3,660,000英镑;2021年2月4日,2,932,000英镑。 7 问:Loftus女士,您可以记录下来。 8 Khaled先生,在为这些G系列实体开立银行账户时,您有什么角色或责任? 9 答:我在他们之间是联系人。 10 问:在与银行就这些账户的事宜沟通时,您是如何表述自己的? 11 答:您能再重复一遍吗? 12 问:当然。在与银行就这些账户的事宜沟通时,您是如何表述自己的?您是否表明与这些实体有何关联? 南区记录员公司 (212) 805-0300
    1990年
    法庭庭审记录
    证人 Khaled 被询问有关他与银行的互动以及泄露与他所为之工作实体相关信息的行为。
    问题 回答 06ABGUO4 哈立德 - 直接询问 1 A. 我向这些实体介绍自己是顾问。 2 Q. 在与银行的沟通中,你向银行透露了有关Crane与这些实体关系的什么信息? 3 A. 他们是我的客户。 4 Q. 这完全属实吗? 5 A. 不是。 6 Q. 这方面有何不实之处? 7 A. Crane与这些实体有关系,而我是为这些实体工作的。 8 Q. 在银行的沟通和你提交的文件中,你将Crane的业务地址列为哪个地址? 9 希罗夫女士:对问题进行过多次提问,提出异议。 10 法庭:你可以回答。 11 A. 纽约州纽约市世界贸易中心85楼。 12 Q. 在你向银行提交该商业地址时,你实际上在哪里工作? 13 A. 在东64街162号的联排别墅。 14 Q. 你为什么没在你提交给银行的文件和通讯中列出你实际办公地址? 15 希罗夫女士:对问题形式提出异议。 16 法庭:你可以回答。 17 A. 为了将Crane公司与Saraca和GTV以及《证券交易委员会》的负面信息区分开来。   南区记录员公司 1991年
    电子邮件对话详情
    日期 发件人 收件人 电子邮件对话细节
    日期 发件人 收件人 O6ABGUO4 哈立德 - 直接列出了Golden Spring,并提到了162东64街的地址。   Q. 除了银行关系之外,哈立德先生,在Crane期间,您是否还做过与这些实体相关的其他工作?     A. 是的。     Q. 洛夫图斯女士,如果您能找出SW-2083。我们先专注于底部的这封电子邮件,请。     哈立德先生,这封电子邮件的日期是多少? 2021年5月7日。   是谁发出的? Guo.Media的Joe W.   Joe W是谁? 我们在那栋楼里一起工作的技术人员之一。   当您说这栋楼时,您指的是哪栋楼? 162东64街的联排别墅。   Guo Media是什么? 媒体公司。   这是谁的媒体公司? 郭氏。   这封电子邮件是寄给谁的? 寄给我和安东尼·迪巴蒂斯塔。   安东尼·迪巴蒂斯塔是谁?     南区记录员有限公司(电话:212-805-0300)
    1992年
    以下是一份关于有关Gettr项目的启动以及其他业务事项的电子邮件交流记录表:
    邮件交流记录表
    发言人 对话 无 无 06ABGUO4 哈利德 - 直接 1 A. 他也是莱克星顿物业的首席控制人员。 2 他负责薪资支出和其他财务事务。 3 Q. 关注这封电子邮件的第一句话,写着我们即将推出Gettr项目,类似于Twitter。我们想在这个平台上构建一个筹款功能。 4 在2021年5月,这个时候,你听说过Gettr吗? 5 A. 实际上不太清楚,没有。 6 Q. 洛夫图斯女士,如果我们可以把注意力移到这封电子邮件链的顶部部分。从迪巴蒂斯塔先生那里得到一个回复。 7 MS. SHROFF: 抗议作证。如果有问题,她可以提问。 8 法官: 如果你只是告诉他你想让他评论哪封电子邮件。 9 MS. MURRAY: 好的,法官。 10 Q. 如果你能专注于最顶部的那封电子邮件,哈利德先生,从乔W发送的。那是什么日期发送的? 11 A. 2021年5月7日。 12 Q. 发给了谁? 13 A. 安东尼·迪巴蒂斯塔和我自己。 14 Q. 与安东尼·迪巴蒂斯塔关联的电子邮件地址的域名是什么? 15 A. GTV.org。 16 Q. 这封电子邮件发送给你的哪个电子邮件地址? 这是一个日期,暂时无法翻译成中文。如果您有其他需要翻译的内容,请随时告诉我。
    法庭审讯记录
    问题 答复 法官:在这封电子邮件中提到的人是谁? 证人:在这封电子邮件中提到的人包括李先生、王女士和张先生。 律师:请您解释这封电子邮件中涉及的事件的详细情况。 证人:这封电子邮件详细描述了公司内部会议上发生的讨论及决定。 法官:你能解释一下这封电子邮件中涉及到的争议吗? 证人:这封电子邮件引发争议的主要问题是关于项目分配的公平性和透明度。 律师:根据您的了解,这封电子邮件是否准确反映了当时的情况? 证人:是的,我相信这封电子邮件准确记录了当时发生的讨论和决定。 法官:有没有其他相关证据可以支持这封电子邮件中的内容? 律师:我计划提供其他参与当时会议的人员作为证人,以进一步证实这封电子邮件的准确性。 法庭审讯记录
    问题 回答 1 A. 鹤脑国际咨询集团。 2 Q. 您能读一下这封电子邮件的内容吗? 3 A. 这是一个与金融科技相关的问题。迈尔斯想知道我们是否能做到。我被标记在内。你从你那边认为怎么样?最好的乔。 6 Q. 在这封电子邮件中,您认为迈尔斯是指谁? 7 A. 迈尔斯·郭。 8 Q. 感谢您,洛夫图斯女士。请记录下这个。 9 法官:你能解释一下 — 如果你愿意的话 — 10 默里女士:洛夫图斯女士,再把它放上去。那是SW-2083。 11 法官:如果你能强调一下上面那一部分。 12 你能解释一下 @-Khaled 这里是什么意思吗? 13 证人:这封邮件里提到了两个人。他希望我回答这个问题。 14 法官:换句话说,高亮显示的蓝色部分仅仅是在提到你。它并不是在提到其他网站或通信方式,对吗? 15 证人:是的。 16 法官:好的。请继续。 21 默里女士提问: 22 Q. 就这一点澄清一下,卡利德先生。根据查看这封电子邮件,您是否了解那个法官所问到的 @ 中是否嵌入了超链接? 南区法院记录员有限公司 (212) 805-0300
    1994
    对话记录
    发言人 对话内容 面试官 你能否解释一下这封电子邮件链和其中涉及的个人和组织? Khaled 当然,这封电子邮件链涉及我们与合作伙伴公司之间的项目进展。第一封电子邮件是我写给合作伙伴的,说明了我们的最新进展和下一步计划。 面试官 那么第二封电子邮件呢? Khaled 第二封电子邮件是合作伙伴的回复,他们对我们提出的建议表示了赞赏,并提出了一些建议来改善我们的合作。 面试官 有没有涉及到其他个人或组织? Khaled 是的,其中还提到了我们的另一位合作伙伴,他们在项目中承担着重要角色。他们向电子邮件链中添加了一封回复,分享了他们的观点和意见。 面试官 谢谢你的解释,这很有帮助。 Khaled 不客气,如果您需要我进一步解释或提供更多信息,请随时告诉我。 发言人 对话 Khaled - 直接 A. 我不这么认为。据我所知,如果你点击它,它会直接跳转到发送给我的邮件。 Khaled - 直接 Q. 那么你的理解是这个超链接会跳转到你的邮箱,是吗? Khaled - 直接 A. 是的。 Khaled - 直接 Q. Loftus女士,我们可以展示政府证据SW-2061,请看这个邮件链中的前两封邮件。 Khaled - 直接 看一下第二封邮件,请问,Khaled先生,这封邮件是2021年2月1日谁发来的? Khaled - 直接 A. Alex Hadjicharalambous。 Khaled - 直接 Q. 他发给了谁? Khaled - 直接 A. Medici银行的Edward Boyle。 Khaled - 直接 Q. 如果我们可以放大并查看下面的邮件链,请转到第一页底部。 Khaled - 直接 请读一下这封邮件的第一个段落或朗读最后一个问题,请问,Khaled先生。这是从Ed Boyle发给Alex H的邮件吗? Khaled - 直接 A. 最后一个问题,你能确认Miles/Wengui Guo, Kwok是否对G/Club BVI或其母公司Jovial或其母公司Duurzame基金会具有决定性控制权吗?对这封邮件的简单回复就行。 Khaled - 直接 Q. Loftus女士,如果我们可以放大并转到这封邮件链的最顶部。 Khaled - 直接 这封邮件链反映了什么,Khaled先生? 南区记录员,有限责任公司(212)805-0300
    1995
    对话记录
    参与者 对话内容 无 这个桌子包含了一个对话记录,其中参与者讨论了一封电子邮件链及其附件,特别是关注涉及郭文贵与G/Clubs有关的内容。对话中包括了与电子邮件链附件内容相关的问题和异议。 对话转录
    O6ABGUO4 哈立德 - 直接 1 A. 相同的事情,亚历克斯给我发了一封带着问题串的电子邮件。 2 这个问题。 3 问。然后转到这封电子邮件的附件上,在第二页,洛夫图斯女士,请关注文本。 4 请问,这封附在电子邮件链上的文件中的第一句是什么? 5 郭文贵没有对 G/Club BVI 或其母公司 jovial 或其母公司 stichting Duurzame 有任何决定性控制权。 6 他仅以 G/Club品牌大使郭文贵的身份出现在网站和社交媒体上。您看到了吗? 7 根据您在Crane工作的经验,您认为这是对郭文贵与G/Clubs参与的准确陈述吗? 8 施洛夫女士:法官,我对这个问题没有异议,没有内在联系,没有关于Crane雇佣与问题其余部分之间的关系,这是我对形式的异议。 9 法庭:您想要上来吗? 南区记录员有限公司(212)805-0300
    1996
    O6ABGUO4 哈立德 - 直接询问
    法官:我理解你是在询问证人是否准确地表明郭先生没有决定性控制权?
    默里女士:是的,法官。
    肖夫女士:我对此没有异议,因为她一直在说,当你在克兰工作时。
    法官:请继续。
    肖夫女士:他没有在克兰工作。他多次作证说,克兰就像他建立的一个实体。他并没有从克兰领取薪水,也没有从克兰赚钱,这与问题无关。如果她有一个文件想要询问,她可以提问。我还有一个次要的异议 -
    法官:我只想澄清第一部分内容,即在克兰工作期间。
    默里女士:我只是尝试把他放在一个时间上,法官,因为我认为时间是相关的。我只是想说在此电子邮件发送时。我只是想把时间定位好。
    肖夫女士:有一系列问题是关于在你在克兰工作期间。我提出了异议。这就是异议的原因,因为他实际上并没有在克兰工作。我不知道为什么政府一直回到克兰,所以这是我的异议。我还有一个跟进问题。
    南区记录员有限公司(212)805-0300
    1997
    法庭审讯记录
    行号 对话 法庭审讯记录
    行号 对话 1 法院:他把它确定为他创立的公司。 2 他创立的。 3 SHROFF女士:对,但他从未在那里工作过。我有一个公司。我称之为xxxxxx和家人。我不在那里工作。我也不从那里领取收入。这与我对这些诉讼有何看法相关呢? 4 法院:也许更好的问题是当你与Crane有关联时。 5 MURRAY女士:如果Shroff女士愿意,我很乐意证实Crane是一个空壳公司。 6 SHROFF女士:我认为你已经多次这样做了。 7 MURRAY女士:他有一个与Crane相关的电子邮件地址。他提交了文件。 8 SHROFF女士:你已经详细说明过为什么他有一个电子邮件地址,他使用的是哪个电子邮件地址,不止在你的问题中,还有在循环中。这个问题可以在没有任何关于Crane的参考下提出,我毫无异议。 9 MURRAY女士:很乐意这样做。 10 SHROFF女士:我第二个反对意见,法官,我不知道当她问及控制或控制程度时是什么意思。那些是技术术语。 11 法院:但有一句引号,那不是来自证人。有一个引号,他要求给出一个 12 南区记录员公司 (212) 805-0300 1998年
    法庭审讯记录
    发言人 对话 无 无 法庭审讯记录
    说话者 对话内容 Khaled - 直接 您认为郭先生是否拥有控制权和…… KAMARAJU先生 问题是引用本身,对吧,法官? 法官 是的。 KAMARAJU先生 如果问题是这样,那就是决定性的控制。 法官 好的。 SHROFF女士 我们将在2:45停下,对吗?我需要去洗手间,但我不会问你。我只会等到2:45。 法官 我们必须在2:45停下,是的。 (接下页继续)
    南区记录员有限公司(212)805-0300
    1999
    O6ABGUO4卡里德 - 直接
    (在公开法庭; 陪审团出席)
    法官:请继续。
    由默里女士:
    问:洛夫塔斯女士,如果我们可以翻到SW-2061页第二页。
    卡里德先生,重点关注第一句话,您是否认为该声明是真实的?
    答:不是。
    问:我们可以记录下来,洛夫塔斯女士。
    有没有一个时候克雷恩代表其他个人或实体接受过钱?
    答:有。
    问:第一次发生在什么时候?
    答:2021年11月23日,24日左右。
    问:那时,也就是2020年11月,克雷恩接受其他实体的钱有什么协议,如果有的话?
    答:当时没有达成任何协议。
    施罗夫女士:他说没有协议,法官。
    法官:他说没有达成协议。
    施罗夫女士:谢谢。
    问:在2020年11月,克雷恩如何接受他人的钱,如果有?
    答:伊娃问我是否有一个克雷恩的活跃账户,她可以将VIP客户的钱汇给克雷恩。
    问:伊娃要求您这样做的原因是什么(如果有的话)?
    南区记录员有限公司(212)805-0300
    2000
    以下是有关Crane的花旗银行账户、资金转账以及与Yvette讨论资金来源的对话记录:
    对话记录
    Questions(问题):无 Answers(回答):无
    对话记录
    O6ABGUO4 卡里德 - 直接 1 在Crane的账户中接受他人的资金吗?   2 A. 那个时候只是为了有一个活跃的账户,那   是要求,Crane是否有一个活跃的账户来接受   资金。   5 Q. 在她的询问中,您向Yvette提供了什么信息?   7 A. 我告诉她是的,我在花旗银行为Crane建立了一个账户,   我把花旗银行的汇款指示给了她。   10 A. 是的。我在11月收到了,然后又在12月。   13 Q. 那时进入Crane的花旗银行账户的资金大概是多少?   15 A. 最初的转账是几十万,我相信12月超过了一百万。   17 A. 是的。   18 Q. 在2020年12月之后,Crane的花旗银行账户继续接收   汇款吗?   20 A. 我想我们接收了大约3,000或4,000万美元,不是很   确定确切的金额,但大概在这个范围内。   23 Q. 2021年初,当资金进入Crane的账户时,您与Yvette   讨论过这些资金的来源吗?   南区记录员有限公司(212)805-0300
    2001年
    O6ABGUO4 哈立德 - 直接传唤
    关于将资金转入Crane账户并利用收到的资金用于费用支出和创建新实体的对话总结
    问题 答复 资金转移和开支的对话总结
    问题 回答 1 她说这是投资者为一家新媒体公司投入的资金。 2 公司,她还说也有一些是VIP的俱乐部成员在汇款。 3 问:Yvette是否曾要求你将Crane账户中的资金转移到不同的银行账户? 4 答:哪段时间? 5 问:让我们聚焦在2201年的三月和四月。 6 总体而言,在那段时间内向Crane账户转入的资金规模是多少? 7 答:大约有近千笔电汇进账。 8 问:通过这大约一千笔电汇,大约有多少资金进入Crane账户? 9 答:大约有一亿美元。 10 问:那么,进入Crane账户的一亿美元资金,你们做了些什么? 11 答:保持账户金额,支付了一些为Crane所需租金、法律服务等支出。我们还开始建立了一个新实体,也支付了部分费用。 12 问:大约这一亿美元中的什么比例被用于你描述的Crane开支? 13 答:我没有确切的数字。只是非常少量。 14 问:那么,剩下的这一亿美元怎么处理? 南区记录员有限公司(212) 805-0300
    2002
    O6ABGUO4 哈立德 - 直接询问
    这笔款项被转入G/俱乐部账户,其中一部分被转账给代表G/俱乐部的律师。
    哈立德先生,让我请您回想一下2021年春季,是否有一段时间您开始录音电话通话了?
    是的。
    为什么您开始录音电话通话?
    我有顾虑。我在一家我个人拥有的公司里有一亿美元以上的投资。我没有得到明确的信息告诉我这笔钱应该去哪里。现在有不同的人告诉我该怎么做,给我之前未曾见过的指示,只是感到担忧。
    当您说有不同的人告诉您该怎么做时,您是指哪些人?
    例如,我与威廉·杰合作建立银行的时候突然对G/俱乐部了解,并要求我转账给G/俱乐部。其他人也开始打电话告诉我我们需要立即转账,赶时间,另外一个担忧是所有这些钱直接进入G/俱乐部,以及十几亿美元是在Crane的账户里而没有关于G/俱乐部的服务或其他内容,信息不一致。
    您何时开始录音电话通话?
    我想是在四月底,三月末,四月,三月。
    是哪一年?
    南区记录员有限公司(212) 805-0300
    2003
    电话录音对话
    问题 答复 你为什么要录制电话通话? 为了保护和确保问责制 为什么不告诉别人你在录音? 以避免干扰通话正常进行 电话录音对话,
    - 问题 回答 O6ABGUO4 Khaled - 直接   1 A. 2021年。   2 Q. 你录制电话通话的动机是什么?   3 A. 我只是想要为将来保护自己,以免被追责,比如资金用途、去向等方面。   4 Q. 保护自己是什么意思?   5 A. 法律上来说,记录下来以确保这笔钱不是我个人使用的,也不是其他人知道的。   6 Q. 你是否有选择录制哪些通话?   7 A. 没有特定的科学方法。只是随机录制与转账和转账请求相关的通话,以及我们处理这笔资金的管理性通话。   8 Q. 你有告诉通话中的其他人你在录音吗?   9 A. 没有。   10 Q. 为什么没有告诉他人?   11 A. 因为我不想告诉别人。我想要那些信息是为了自己。   默里女士:法官,我可以靠近一下吗?
    法庭:可以。
    默里女士:法官,我正在递交被标记为政府展品HK-1的证据给证人。
    问:哈立德先生,您是否认识这个被标记的硬盘?
    这张表格提供了关于2021年哈立德先生制作的音频录音相关的展品的信息。其中包括政府展品401至417及其子展品的详细信息,这些展品包括电话录音的音频文件。
    表格标题为: 哈立德先生音频录音相关展品
    表格包括以下列:
    A列:无
    B列:无
    这张表格提供了关于哈立德先生在2021年制作的录音展品的信息。它包括有关政府展品401至417及其子展品的细节,这些展品包含电话录音的音频文件。
    O6ABGUO4 哈立德 - 直接 1 是否作为政府HK-1展品? 2 答:是的。 3 问:您如何识别它? 4 答:上面有我的签名。 5 问:您是否查看了那个硬盘的内容? 6 答:是的。 7 穆雷女士:法官,这个硬盘包含被标记为政府展品401至417及其子展品的展品。 8 问:哈立德先生,政府展品401至417及其子展品的音频文件是您制作的录音吗? 9 答:是的。 10 问:那些录音是我们一直在讨论您在2021年录制的电话录音吗? 11 答:是的,女士。 12 问:您查看了包含在那个硬盘上的政府展品401至417及其子部分的内容吗? 13 答:是的。 14 穆雷女士:法官,此时我想要宣读双方之间的一项约定。这是政府展品约定16。各方约定并同意,在下表中,列在A列下的展品包含英语和/或外语的音频,列在B列下的展品是真实准确的抄本和翻译。 南区记录员有限公司(212)805-0300
    2005年
    O6ABGUO4 哈立德 - 直接 1个音频包含在列出的A栏展品中。我们将提供这个展品,即政府展品Stip 16。
    法官:没有异议,对吧?
    SHROFF女士:没有,法官。这是一个协议。
    法官:被接受了。
    (政府展品Stip 16已作为证据收到)
    MURRAY女士:我们可以公布这个,洛夫塔斯女士。
    MURRAY女士:
    问:查看这个协议,A栏列出了某些政府展品,这些展品是录音和那些录音的摘录的子部分。B栏列出了那些录音的某些转录和翻译。
    法官在这个时候根据协议和哈立德先生对录音的认证,政府请求承认政府展品404、404-T、405、405-T、406、406-T、408、408-T、409、409-T、411、411-T、412、412-T、413-A、413A-T和417、417-T。
    法官:没有异议。
    SHROFF女士:法官,我们现在没有异议,但我们可能在边栏或一天结束时提出问题。我不想现在打断再次边栏。
    法官:它们已被接受。
    (政府展品404、404-T、405、405-T、406、406-T、408、408-T、409、409-T、411、411-T、412、412-T、413-A)
    南区记录员有限公司(212)805-0300
    2006
    行号 对话内容 1 律师A: 我们需要核对已经录入证据的记录和翻译。 2 律师B: 是的,这是非常重要的。我们必须确保准确无误。 3 法官: 请确保所有的翻译都经过专业人士的认可。 4 律师A: 我们已经委托了专业翻译公司来进行翻译工作。 5 律师B: 我们还需要核对原始录音和翻译文本是否一致。 6 法官: 是的,在庭审过程中请对照原始录音进行审查。 7 律师A: 我们会确保原始录音和翻译文本的一致性。 8 律师B: 谢谢,我们将密切关注这一点。 行号 对话 1 413A-T和417,417-T作为证据收到 2 穆雷女士: 谢谢,法官。洛夫图斯女士,我们可以开始了。每位陪审员椅子下面都有一本记录本,里面有刚刚作为证据被录入的录音文件的转录本,请随时拿起来跟读。 3 施罗夫女士: 为了记录清楚,这些不是转录本,对吧?只是一个抄写。通话是用英文的。这是一个混合,对吧,包含了翻译和抄写。我只是想弄清楚。 4 穆雷女士: 是的,法官。为了记录的清楚,没错。大部分通话是用英文的。那些是抄写。通话的部分是用普通话的,这些是抄写和翻译,正如在协议中指出的那样。 5 法庭: 那些仅用英文的抄写只是帮助你跟读的辅助工具,但真正作为证据的是录音,所以你应该依赖于听到的内容。但是翻译部分,你必须依赖于文本。请继续。 6 穆雷女士: 谢谢,法官。 7 问:洛夫图斯女士,请打开政府证据417-T。这是记录本的前半部分。 8 卡勒德先生,这是您录制的其中一段录音的抄写,对吗? 南区记录员(电话:212-805-0300)
    2007年
    2021年4月28日录音电话通话记录,参与者包括Khaled、Miles Guo、Yvette、William Je和Alex。参与者讨论了他们在通话中的参与以及如何在不同地点参与。
    参与者 对话 Khaled 你好,大家今天在这里讨论什么? Miles Guo 我们在讨论我们未来的合作计划以及如何提高团队效率。 Yvette 我觉得我们需要更好地沟通和协调工作步调。 William Je 是的,我们可以考虑每周固定时间的会议来同步进展。 Alex 我认为我们还需要更多的培训和资源来支持我们的工作。 记录于2021年4月28日的一次电话通话的记录,参与者包括Khaled, Miles Guo, Yvette, William Je, 和 Alex,参与者讨论了他们在通话中的介入以及如何在不同地点参与其中。
    参与者 对话 Khaled - Direct   1 回答:是的。 2 问:政府展品417记录的电话通话是在哪一天进行的? 3 回答:是在2021年4月28日。 4 问:参与这次通话的有哪些人? 5 回答:有Miles Guo, 我自己, Yvette, William Je, Alex。 6 问:那么Khaled先生,专注于记录本身,您是否回顾过发生在2021年4月28日的通话的录音? 7 回答:是的。 8 问:您是否记得那次通话或会议? 9 回答:是的。 10 问:在那次通话期间,您是否亲自在场? 11 回答:否。 12 问:能否向陪审团描述一下各个不同参与者在通话中是如何参与的? 13 回答:Yvette和Alex在联排别墅。Miles我看不到,但可能是声音或者通过Zoom。William Je在英国的声音。 14 问:那你自己呢,您是如何参与的? 15 回答:我当时在家里。我通过Zoom呼入通话。 16 以以上内容开始413。这是此次会议的音频。我们将从第4页的第3分钟25秒开始展示。 南区记录员有限公司 (212) 805-0300
    2008
    音频录音转录,
    | 行号 | 对话 |
    音频录音转录,
    O6ABGUO4 Khaled - 直播 1 洛夫特斯女士,在我们开始之前,实际上,为了 2 记录的清晰度,这个政府417号展品的版本 3 包含在音频上叠加的字幕。这与 4 在转录中反映的内容相同,即 5 417-T。我们可以开始播放。 6 (媒体播放) 7 问:您能停一下吗。 8 卡里德先生,您是否认出这个转录中与郭氏相关的声音? 9 答:是的。 10 问:那确实是郭文贵吗? 11 答:是的。 12 问:刚才说话的声音,是王一桦吗? 13 答:是的。 14 问:我们可以继续,洛夫特斯女士。谢谢。 15 (媒体播放) 16 问:卡里德先生,这个下一个音频片段,您是否听到 17 听起来不像是英语? 18 我们可以继续播放一会儿。 19 (媒体播放) 20 问:洛夫特斯女士,您能停一下吗。 21 是的,那不是英语。 22 默里女士:我只是想备注一下 23 在转录和翻译中,这在封面上标出,斜体的单词是翻译词语。 南区记录员公司,电话(212) 805-0300
    2009年
    O6ABGUO4 卡莱德 - 直接询问
    对话内容:
    甲:你有看到上个月的账单吗?我们需要核对一下。
    乙:看了,有几笔支出我觉得有点不清楚,你能帮我确认一下吗?
    甲:当然,让我看看……哦,这一笔是我们上个月买办公用品的,这笔是去年末请的客户吃饭的费用。
    乙:明白了,谢谢你的解释。我们最近的财务状况如何?
    甲:整体来说还不错,我们的流动资金还比较充裕。不过下个季度可能会有一些大额支出,需要提前做好准备。
    乙:好的,我会注意控制预算的。我觉得我们需要更频繁地跟进我们的账目和资金管理工作,以确保财务运作更加顺畅。
    甲:对,我们可以制定一个更详细的账务管理计划,把责任和角色分配清楚,这样可以更高效地管理我们的资金。
    乙:同意,我会想办法把这个计划尽快地落实起来。感谢你的建议。
    甲:不客气,我们是一个团队,共同维护好我们的财务状况才能实现更好的发展。
    对话涉及支付、账户对账和管理资金角色的讨论。
    1 从源语言翻译成英文。这里从普通话翻译成英语。 2 英语。洛夫特斯女士,如果我们能倒回几秒钟,从依维特发言的地方开始。 3 (播放媒体) 4 问:哈立德先生,在谈话的这部分中,你所指的 919 笔支付指的是什么? 5 答:向梅迪奇账户的转账。 6 问:是哪个梅迪奇账户? 7 答:与梅迪奇的 G/Club 账户。 8 问:有关这些 919 笔支付,克莱恩扮演了什么角色,如果有的话? 9 答:对于那些支付,没有扮演任何角色。 10 问:你与依维特和郭先生讨论这些支付的目的是什么,如果有的话? 11 答:因为我是从梅迪奇管理层那里获取这些信息,我在帮助亚历克斯对账入账资金。 12 问:对账入账资金意味着什么? 13 答:对我来说,只是确保每个账户的责任归属,账户余额、收到的付款数量,实际上只是核对账目和资金去向。在运营方面进行核对是将每笔转账与 G/Club 会员号匹配。 14 问:做这种对账的目的是什么? 15 答:把 G/Club 会员号与收到的转账匹配起来。 南区记录员有限公司(212)805-0300
    法庭证词记录
    | | |
    法庭证词抄本,包括关于银行账户、电汇和与G/Club相关的会员资金的讨论。
    2010年 O6ABGUO4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 2011年
    O6ABGUO4 哈立德 - 直接
    问:您理解孤立的电汇指的是什么?
    答:指的是这些电汇没有明确的接收方信息,即资金的去向。从一个对应银行到另一个对应银行时,电汇上没有列出最终受益人。
    问:那么,这是否会在资金流动方面造成问题?如果有的话,为什么会造成问题?
    答:在业务运作方面,如果有多个账户,他们不知道该把资金发送到哪里,所以资金会被阻止。除非有人发起调查,他们澄清资金应该发送给哪个最终受益人,到哪个账户。另一个问题是用途。他们无法将其与参考号或任何其他信息匹配,这也是合规问题。
    穆雷女士:我们可以继续播放,洛夫特斯女士,谢谢。
    (媒体播放)
    问:哈立德先生,您认为“农场”这个词在这里是指什么呢?
    答:不同成员的集会或联合体。
    问:特别是关于这笔款项是用于G/俱乐部会员的,那么农场在G/俱乐部会员款项中扮演什么样的角色,如果有的话?
    答:有一些大额款项是从农场转入的,这些款项是多个成员汇集在一起为一个人的。
    南区记录员有限公司
    (212)805-0300
    法庭证词笔录
    问题 回答 无 无 法庭文件翻译:
    法庭证词记录
    O6ABGUO04 哈立德 - 直接转账 1 问:你能描述一下“多名成员”是什么意思吗? 2 答:超过一个G/Club会员或个人。 3 问:如果我们继续进行,洛夫图斯女士。 4 (播放媒体) 5 问: 哈立德先生,您了解对长岛的提及是什么意思吗? 6 答:是的。 7 问:这是什么意思? 8 答:住在长岛的大卫。 9 问:对于香料山农场的提及,您是否认识这个参考? 10 答:不,只是公司的名字,没有具体信息。 11 问:您与长岛的大卫就这些G/Club会员款项有什么互动? 12 答:我和长岛大卫有过几次通话。他还监督并协助收集了我们之间的克兰和G/Club之间支付便利的KYC材料。 13 穆雷女士:我们可以继续,洛夫图斯女士。谢谢。 14 (播放媒体) 15 问:哈立德先生,在回顾2021年4月28日这次会议的时候,您能听懂伊薇特和郭在讲普通话时在讨论什么吗? 16 答:不太清楚。 17 问:有人为您进行翻译吗? 18 南区记录员公司(212)805-0300 这似乎仅是一个日期。请提供更多上下文,例如句子或段落,以便对整个文件进行翻译。
    法庭程序转录
    问题 回答 在会议讨论中提到的与个人有关的问题,包括Khaled、Yvette、Guo和Miles Guo等   翻译 无 法庭会议记录
    问题 回答 1 A. 不是。 2 Q. 在会议期间或之后,Yvette或Guo是否向您解释过他们在会议的普通话部分讨论过什么? 3 A. 没有,只是停顿和翻译。 4 Q. 我们可以继续,洛夫特斯女士。谢谢。 5 (播放媒体) 6 Q. Khaled先生,提到的校长是指谁? 7 A. 是郭先生。 8 默里女士:现在停下来应该是个好时机,法官阁下。 9 法官:是的,我们现在必须停止。现在是2:44。 10 不要在彼此之间或与任何其他人讨论这个案子。 11 不允许任何人与您讨论这个案件。不要阅读、听取或观看任何与本次审判主题有关的任何来源的内容。晚上过得愉快,明天早上9:30准备好进入法庭时见面。 12 (接下一页续) 南区记录员,有限公司(212)805-0300
    2014
    法庭对英文转录和翻译音频展品的异议和协议进行了讨论,以下是相关对话的记录表: 表格标题: 法庭关于英文转录和翻译的讨论 列标题:
    行号: 无
    对话: 无
    法庭关于英语转录和翻译相关异议和协商的对话如下:
    行号 对话 1 (陪审团不在场) 2 法官:先生,您可以离开。不要讨论您的证词。 3 (证人暂时离开) 4 法官:明天早上我们重新开庭之前有什么事吗? 5 SHROFF女士:法官,我只是想确保在记录中提到,我们不同意将英语转录稿交给陪审团。我不想在审理过程中提出这个问题。我只是想确保我保留异议。我们可以稍后处理。现在不需要处理。我只是想确保我的异议被记录下来。 6 法官:您的异议是这个辅助工具不应该交给陪审团。这就是您的异议是吗? 7 SHROFF女士:是的,法官。我不反对它作为辅助工具使用。只是这样。 8 MURRAY女士:法官,双方当事人之间的协议明确指出这些不是辅助工具,它们实际上是证据。协议中列出的B栏目展品是我们提供的已经纳入证据的T-展品,这些展品中列出的是包含在A栏中的录音的真实准确的转录和翻译。而开头的段落表明A栏包含的是英语和/或外语的音频。 南区记录员有限公司(212)805-0300
    2015年
    O6ABGUO4 Khaled - 直译
    法官:通常情况下,英文记录并不被视为证据。实际的录音被视为证据,而记录则被视为辅助。至于翻译,可以构成证据。所以如果你想明天早上重新审视这个问题,我们可以这么做。晚安。
    SHROFF女士:法官,我有一个问题要提出。在庭边我在一个假设情况中提到了一个亲戚的名字。能在记录中将其删除吗?
    法官:可以。
    FINKEL先生:法官,最后再就物流问题说一句。抱歉。考虑到下周周三我们休息,政府请求法庭考虑,在陪审团和法官同意的情况下,将周一、周二、周四和周五的时间延长30至45分钟。抱歉,周一、周二、周四、周五。
    法官:你说的是这周还是下周?
    FINKEL先生:下周,即我们周三休息的那周。有两个原因。一是我们周三休息,所以我们少了一天,我们想要弥补一些时间。二是,正如政府所指出的,由于各种原因我们在赶时间。有一些在我们的控制之下,一些不在我们的控制之下。有些不在当事人的控制之下。
    还有一个原因,就是上周增加45分钟
    南区记录员有限公司
    (212)805-0300
    2016
    哈立德和Shroff女士关于审判日程和时间限制的对话, 以下是表格标题: 哈立德和Shroff女士之间的对话, 以下列出了:
    哈立德 - 直接:无
    哈立德和 Shroff 小姐关于审判物流和时间限制的对话, 带有以下表格标题: 哈立德和 Ms. Shroff 之间的对话, 具有以下列:
    哈立德 - 直接:无
    O6ABGUO4 哈立德 - 直接 1 从政府的角度来看,我认为从法庭和陪审团的角度来看,审判进行得更高效了。那 45 分钟相当有帮助。因此我们请求法庭考虑,如果尊贵的法官和陪审团同意的话,下周延长 30,45 分钟每天。 6 SHROFF 小姐:尊贵的法官,实际上,我们对此表示反对。这对我们来说是一个巨大的困难。早上 9 点的时间绝对不行 - 更早的开始时间不可行。我们乐意在日后重新讨论这个问题。政府 -- 我想提醒法庭。最初,政府估计了时间。当确定审判日期时,我们要求再加两周时间。政府提出了反对意见,我们就没有那个时间。这个时间已经确定。我们有其他安排。我尤其还有其他安排。我认为对于我们这些独立执业律师来说,这是一个真正的困难。因此,至少代表我自己,在未咨询任何其他人的情况下,我最尊敬地请求法庭不要这样做。 19 法庭:我假设你没有其他案件或者其他安排-- 21 SHROFF 小姐:我有。 23 法庭:-- 早上就在法庭出庭? 南区记录员有限公司 (212) 805-0300
    2017年
    O6ABGUO4 卡勒德 - 直接传译
    法庭文件标题:延长法庭工作时间讨论
    参与者 讨论要点 Ms. Shroff, 法庭和 Mr. Finkel 将下午的法庭工作时间延长 30 至 45 分钟,以适应日程安排并保持诉讼程序顺利进行。 法庭审讯期间,Shroff女士、法庭和Finkel先生就是否将下午的法庭时间延长30至45分钟以适应日程安排并保持诉讼进展顺利进行进行了讨论。
    法庭延长时间讨论
    参与人员 讨论要点 1 Shroff女士:我有监狱电话要接听。我安排了会议,而且我有一个孩子只在暑假回家。因为他们不给我延长两周假期,我已经错过了和他一起度假。因此,法官阁下,基于这些原因,我非常尊敬地请求您不要这样对待我们。 2   3   4   5   6   7 法庭:我希望政府能提出更具体的提议,并与辩护律师讨论这个问题。 8   9 Finkel先生:当然。法官阁下,政府同意将下午延长30至45分钟。我们大家都有家庭。我们都有其他承诺。我们后面有三家律师事务所。我相信他们能够解决。另外,不幸的是,法庭可能会拖延 - 特别是如果辩护方有两周的辩护案例,会直到七月底。因此,政府认为将白天延长30至45分钟将会非常有帮助。坦率地说,也许有一些全天时间是有意义的 - 我们可以稍后再讨论这个问题 - 但这样做也许是有道理的,只要法官阁下和陪审团同意,这样可以帮助我们保持工作进度。 10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20   21 法庭:这是我需要考虑的事情,在正常工作日中间休息一个小时。因此,我希望您们之间讨论此事,因为我理解需要额外的时间,因为我们已经落后了。因此,请您们自行讨论。我希望您们能达成一致 南区记录员,有限公司(电话:212-805-0300)
    2018年
    该表格包含了关于一项联合提案的个人之间沟通记录。会议延期至2024年6月11日上午9:00, 表格标题如下: 沟通记录, 包含以下列:
    参与者: 无
    消息: 无
    这份表格记录了关于一项联合提案的个人间沟通日志。会议定于2024年6月11日上午9:00结束,表格标题如下: 沟通日志, 包含以下列:
    参与者:无
    消息:无
    O6ABGUO4 哈立德 - 直接回复了一份联合提案。谢谢。祝您晚安。 (会议延期至2024年6月11日上午9:00)   南区记录员有限责任公司(电话:212-805-0300)
    审讯索引
    法律审讯记录
    被审讯者 年份 张三 2018 李四 2019 王五 2020 法庭审讯记录
    审讯对象 年份 玛格丽特·墨菲   由卡马拉朱先生交叉审问 1856 贾科莫·马蒂奥利   由霍顿先生直接审问 1865 由施罗夫小姐交叉审问 1886 海珊·卡勒德   由默里小姐直接审问 1901 政府证据
    以下是展品编号和对应接收日期的表格, 表格标题为: 展品编号和接收日期, 包含以下列:
    展品编号:展品编号列表
    接收日期:展品接收日期列表
    展品编号 收到日期 802 和 BR440 1872年 BR363-364, 367-375, 380, 382, 384, 387, 392, 396-398, 1506-1509, 1511-1519; GC131, 498, 500-502, 507-508; SW2002, 2005, 2008, 2009, 2021, 2027, 2030, 2032, 2035, 2038, 2040, 2042, 2045, 2046, 2050-2055, 2057, 2061, 2068, 2070, 2076, 2077, 2083 1946年 404, 404-T, 405, 405-T, 406, 406-T, 408, 408-T, 409, 409-T, 411, 411-T, 412, 412-T, 413-A, 413A-T 和 417, 417-T 2005年 南区记录员办公室,电话:(212) 805-0300
    以下是关于不同项目或实体以及它们对应的数值和年份的信息表:
    表格标题:项目和对应数值
    列名:
    项目:表中列出的项目或实体。
    数值:与项目相关的数值。
    年份:与项目对应的年份。
    以下是关于不同物品或实体及其相应数值和年份的信息表, 表格名称如下: 物品及对应数值 表格包含以下列:
    物品:表中列出的物品或实体。
    数值:与物品相关联的数值。
    年份:与物品对应的年份。
    1 Stip 16 2005 2 109 1943 3 128 1919 4 162 1917 5 BR399 1922 6 BR1601 1884 7 BR1604 1881 南区记录员有限责任公司 (212) 805-0300
  23. Roger
    Short Link|短链接:gettr.ink/WNbRtQ
     
    Chapter 4 Efficient Cultivation Techniques for Artemisia annua
    The research and application of standardized cultivation techniques for traditional Chinese medicinal materials are the foundation and prerequisite for ensuring reliable quality, stable efficacy, and safe use of these materials. The study of cultivation techniques for medicinal materials involves systematically understanding their growth and development patterns and then artificially and reasonably controlling and managing each stage of the planting process to improve both the quality and yield of the medicinal materials.
    Over the past 30-plus years since the discovery of artemisinin, domestic experts, especially our researchers, have conducted extensive scientific research on the distribution of Artemisia annua resources, growth and development patterns, cultivation management techniques, and the selection of superior varieties, achieving significant results. These foundational systematic studies have provided strong support for the healthy development of the Artemisia annua cultivation industry in China.
    4.1 Basic Research on Artemisia annua Cultivation
    4.1.1 Growth and Development Studies
    Observations from artificial cultivation of Artemisia annua in northern Guangxi show that Artemisia annua can be sown from late October to mid-May of the following year, and its seeds do not have a dormancy period. Artemisia annua is a shallow-rooted plant. From germination to the appearance of lateral branches, its growth is relatively slow; the rapid growth period is from May to July, and growth stops at the bud stage in early September, with a total growth period of approximately 240 days. Artemisia annua is highly adaptable and has strong drought and flood resistance, though seedlings before the six-true-leaf stage have weak drought resistance. Ferreira's experiments found that Artemisia annua exhibits self-incompatibility, with self-pollination rates lower than 5% when pollen from the same plant lands on the stigma. It is also a strict short-day plant; continuous exposure to a critical day length of less than 13.5 hours for two weeks can induce bud differentiation and flowering. McVaugh's experiments concluded that Artemisia annua is a typical cross-pollinated plant, primarily pollinated by wind and insects, unlike other highland plants. Wallaart discovered that when Artemisia annua content is low, the artemisinin content increases after a single stem immersion. Genetic studies by Chen Xiaotian et al. suggest that artemisinin may be a metabolic product in the cytoplasm or stored in a specific organelle.
    4.1.2 Breeding Research on Artemisia annua Varieties
    Although the artificial and biosynthetic pathways of artemisinin were successfully developed in the 1980s, these methods are complex, yield low production rates, and are costly, making industrial-scale production challenging. Currently, extracting artemisinin from Artemisia annua remains the primary source of artemisinin-based drugs. Therefore, cultivating high-artemisinin content varieties of Artemisia annua is crucial. As of now, there are no genuinely high-artemisinin varieties. In recent years, foundational work has been done in breeding high-content Artemisia annua varieties.
    Ferreira and others analyzed the extensive genetic traits of artemisinin production under greenhouse and field conditions and found that the artemisinin content is determined by genetic traits. Using colchicine induction, Wallaart found that plant height and artemisinin content in colchicine-induced plants were 38% higher than in diploid plants, and the plants retained barley-like leaf characteristics and had lower disease susceptibility. Magalhaes reported that hybridization of Artemisia annua could increase artemisinin yield by 5 kg/ha. Indian researchers used molecular markers to discover high polymorphism among different genotypes of Artemisia annua, revealing that the chemical differences in plants are due to genetic polymorphism. Zhu Weiping from Huzhou Agricultural University's Traditional Chinese Medicine Research Laboratory conducted in-depth research on breeding and selecting high-artemisinin content varieties, finding that selective breeding could increase artemisinin content annually. The study also found a correlation between leaf morphology and artemisinin content, with narrow-lobed leaves having higher content than broad-lobed leaves. Microscopic observation and histochemical localization indicated that glandular trichomes in leaves are the storage sites of artemisinin, with a positive correlation between trichome density and artemisinin content. However, the progress in breeding and selecting Artemisia annua varieties is slow due to its complex metabolism and unclear genetic mechanisms.
    From 1991 to 1997, the Chongqing Institute of Medicinal Plant Cultivation conducted the "Artemisia annua Selection and Cultivation Technology Research," selecting Artemisia annua samples with 1.0% artemisinin content from Sichuan Province, though the yield was only 200 kg/ha. The lack of stable artemisinin extraction technology hindered the promotion of these results. In 1992, Chen Herong used colchicine to treat Artemisia annua seeds, developing a new strain called "Jingxia No. 1" with high artemisinin content, significantly increased biomass, tall and robust plants, strong growth adaptability, and good stability. The artemisinin content was 1.0%, but the content decreased annually after planting in Xiyang, and the strain did not become an industry. In 1989, India reported the cultivation of high-artemisinin content varieties using mass selection methods, with dry leaf yield of 2.9 t/ha and artemisinin yield of 31.9 kg/ha.
    In 1993, Delabays N conducted interspecific hybridization between Chinese Artemisia annua and northeastern varieties in Switzerland, obtaining hybrids with dry matter yield of 2 t/ha and artemisinin content ranging from 0.64% to 0.95%. In 1994, Delabays N studied the optimal planting density for Artemisia annua in Switzerland, finding that 3 plants/m² planted at the end of April resulted in high artemisinin yields. The hybrid variety "Chine X Yougoslavie 49" achieved an artemisinin yield of 26.64 kg/ha. In 1996, Debrunner N selected five high-artemisinin types from two groups of Vietnamese Artemisia annua and hybridized them with high-artemisinin Chinese varieties, obtaining hybrids with artemisinin yield of 38 kg/ha. In 1999, Magalhaes, P.Mde, developed a new Artemisia annua variety suitable for Brazilian cultivation, with a maximum artemisinin yield of 21.38 kg/ha.
    In 1997, Huang Zhengfang and others studied the relationship between plant morphology, stem color, leaf color, leaf shape, and artemisinin content. They cultivated Artemisia annua under different ecological conditions to observe changes in artemisinin content, but the study lacked systematic and comparative data.
    In conclusion, although there have been reports of successful breeding of new Artemisia annua varieties over the past twenty years, reports on the promotion and industrialization of these varieties are rare. This is because Artemisia annua is a cross-pollinated plant with low self-pollination rates and high genetic polymorphism between different genotypes, making it difficult to obtain genetically stable high-artemisinin varieties. Moreover, the artemisinin content in high-content varieties fluctuates significantly due to planting years, ecological environments, and cultivation techniques. Therefore, solving the issue of stable production of high-artemisinin Artemisia annua is the primary problem for the healthy and rapid development of the Artemisia annua industry. Only by combining variety selection with stable artemisinin content technology can we establish a unique artemisinin breeding system and cultivate high-quality varieties with promising industrial prospects.
    4.1.3 Seed Physiology Research
    Chen Qi conducted germination tests on seeds from the Du’an limestone area at temperatures of 8-15℃ and 28-35℃, with germination rates of 50.0%, 46.3%, and 50.0%, respectively. However, the germination periods were 11 days, 6 days, and 13 days, respectively. Sowing using water, soil, soil mixed with fertilizer, pure fertilizer, and river sand as substrates showed that the germination period was uniformly 5 days, but the germination rate was highest with the soil mixed with fertilizer substrate at 71.0%, followed by pure fertilizer at 55.0%. Water and river sand were the least effective, with germination rates of 37.5% and 26.0%, respectively. Further experiments by Qinghao et al. with seed quantities of 0.4g, 0.6g, 0.8g, and 1.0g on 6.67m² plots indicated that plants from 0.4g seeds showed the best growth in terms of plant height, stem thickness, number of branches, and yield, although the highest plot yield was achieved with 1.0g of seeds.
    4.1.4 Cultivation Technique Research
    Wei Qing et al. experimented with planting densities of 15x15cm, 20x20cm, 25x25cm, and 30x30cm, harvesting in mid-August, and measuring plant growth and yield. The results showed that the 30x30cm planting density resulted in the highest yield, significantly outperforming other densities. Different treatments using pig manure, pig pen soil, and mixed treatments showed that plant growth and yield were best with pig pen soil, achieving a chlorophyll content of 77.6%. It was noted that the application of basal fertilizer did not significantly affect artemisinin content, nor did topdressing. Simon conducted tests with planting densities of 30x30cm, 30x60cm, and 60x60cm per acre, and applied urea treatments of 0, 67, and 134 kg per acre. Results showed average fresh weights of 275g/plant, 430g/plant, and 750g/plant for the respective densities, with the highest total yield achieved at 30x30cm, and the best results with 67kg of urea per acre.
    Chen Yutai's experiments suggested that Artemisia annua germinating on the same day under controlled environments would have their artemisinin content unaffected by nutrient levels in the growing substrate. Despite significant morphological differences among plants at the same growth stage, there was no correlation with artemisinin content. High temperatures and short-day lighting could increase artemisinin content by hundreds of times. Lu Hongshun found that early planting resulted in higher artemisinin content, with March-sown plants reaching 0.68% and July-sown plants only 0.25%. It was concluded that Artemisia annua grows well in warm, sunny, frost-free, well-drained, and fertile sandy or sandy loam soils, which contribute to high artemisinin content.
    Charl measured artemisinin content in Artemisia annua cultivated for 90 days, 117 days, and 158 days (at bud emergence) at 0.06%, 0.15%, and 0.06%, respectively. Using water pressure tests of -50 kPa, -100 kPa, and -150 kPa to study the effect on artemisinin synthesis, a regression equation was derived: Y = -0.138 - 0.000143X (R²=0.9997). Zeng Youlong's field experiments demonstrated that both artemisinin yield and content gradually increased with the growth period. Srivastava reported that trace elements like boron could increase artemisinin content. Shukla's research indicated that exogenous growth regulators not only promote vegetative growth but also increase artemisinin content. Chen and Cui's measurements of artemisinin in different ecotypes of Artemisia annua suggested mutual promotion and grain formation between plants, indicating an optimal artemisinin distribution. Additionally, reports indicated that intercropping Artemisia annua with corn did not affect corn yield or artemisinin content.
    4.1.5 Harvesting and Processing
    Zhong Fenglin and others concluded through experiments that the optimal harvesting period for Artemisia annua is between the growth phase and the budding stage when artemisinin content is highest and vegetative volume is maximized. Woerdenbag and El Sohly both believe that Artemisia annua has the highest content during peak flowering. Wang Zheng et al. measured artemisinin content at different growth stages of Artemisia annua introduced to Shandong using Thin Layer Chromatography Scanning (TLCS) and found that the budding stage has the highest artemisinin content, making it the best time for harvesting. Jin Ling et al. used column chromatography to measure artemisinin content in Artemisia annua introduced from Yunnan, Guangxi, and Gaoyou, indicating the highest content during the budding stage. Singh and Laughlin also believe that artemisinin content is highest during the budding stage. Huang Li et al. conducted field experiments using Artemisia annua extracts at different stages to assess their antipyretic and heat-resistant properties, finding that the antipyretic active components are highest during the flowering and budding stages, significantly better than the budding stage. Xie Dezhi concluded that Artemisia annua should be harvested from the late growth stage to the budding stage. Fu Desen used TLCS to measure artemisinin content in different forms of Artemisia annua at harvest and found that dried products are best. Charles experimented with various drying methods, including sun drying, shade drying, indoor drying, and artificial drying at 30℃, 50℃, and 80℃ for 12h, 24h, 30h, and 48h. The results showed that indoor drying for 24h yielded the highest artemisinin content, and natural drying was superior to artificial drying. Ferreira measured artemisinin content in the upper, middle, and lower parts of Artemisia annua plants, finding variations from 0.023% to 0.046%, and discovered that indoor drying yielded 0.13% artemisinin content, while freeze drying and oven drying resulted in 0.02% and 0.10%, respectively. Charles's experiments showed that artemisinin content in one-third of Artemisia annua leaves was about 89%, with the upper and middle parts having twice the content of the lower part. Laughlin believed that artemisinin is evenly distributed throughout the Artemisia annua plant.
    4.2 Requirements for Standardized Cultivation Environment
    The National Medical Products Administration has formulated the "Good Agricultural Practices (GAP) for Medicinal Plants" and the "GAP Guidelines for Medicinal Plant Production." Artemisia annua cultivation must strictly follow these regulations and guidelines to ensure that artemisinin content meets various national and environmental standards for production, thereby achieving the goal of stable quantity and reliable quality and gaining international recognition.
    4.2.1 Soil Environment
    The soil environment of high-quality Artemisia annua planting bases must meet the secondary standards of soil quality GB15618-1995, mainly monitoring the residues of mercury, lead, cadmium, copper, zinc, hexachlorocyclohexane, and DDT.
    4.2.2 Irrigation Water Quality
    Water quality must meet the requirements of GB5084-92 for farmland irrigation water, strictly monitoring the contents of mercury, cadmium, lead, chromium, cyanide, and chloride.
    4.2.3 Atmospheric Environment
    The air quality in Artemisia annua production areas must meet or exceed the secondary standards of GB3095-82, with no harmful gases, smoke, dust, or chlorides nearby. Additionally, the production area must be free of urban waste and hospital discharge that may carry various pathogens.
    4.3 Standardized Cultivation Techniques
    4.3.1 Sowing Time
    Since Artemisia annua seeds do not have a dormancy period, they can be sown in both spring and autumn. Artemisia annua is a short-day plant, sensitive to short daylight for flowering. Autumn sowing may result in early flowering and reduced yield due to the short vegetative growth period and proximity to autumn short days. Therefore, spring sowing is preferred for better control. To stabilize artemisinin content, Artemisia annua seedlings are usually propagated through tissue culture, where light duration must be strictly controlled during the culture and acclimatization stages. If seedlings are exposed to short daylight prematurely, even spring planting under long daylight conditions will lead to early flowering. Seedlings may flower at about 10 cm in height, completing their lifecycle and resulting in low yield.
    4.3.2 Propagation Methods
    Artemisia annua is propagated by seeding and tissue culture. Different types, sowing methods, and seed selection techniques significantly affect seed germination. The highest germination rate of 93.38% is achieved with early March sowing, using a 7:7 mix of soil and fertilizer. Seeds stored in bottles under low or ambient temperatures for six months maintain a higher germination rate compared to bag storage. Seeds harvested after mid-October should be sun-dried or shade-dried, then cleaned and sieved through a 1mm sieve, and stored in a ventilated, dry place or at low temperatures (3-6℃). Seedbeds should be located in elevated, well-drained, and sunny areas, with sandy soil or peat as the substrate, and adequately fertilized with organic manure. The seedbed should be 100 cm wide and 20 cm high, leveled, and prepared with a mix of soil and fine sand. The sowing amount is 60-75 g/ha, mixed evenly with fine sand and lightly covered with soil. Straw mulch may be used to cover the seeds, which should be watered timely to keep the seedbed moist.
    In addition to seeding, tissue culture is a significant method for large-scale propagation of Artemisia annua seedlings. Various explants such as seedlings, stem segments, and flower heads can induce callus formation, with leaf explants forming callus more easily. Within 5-10 days of culture, green or light green callus appears, while stem and flower head segments take 2-4 weeks to form callus. The optimal medium for callus induction and proliferation is MS+KT 4.0 mg/L+IAA 4.0 mg/L. Transferring buds to 1/2MS medium containing NAA 0.5-2.0 mg/L induces rooting, with a rooting rate of 98% at 1.0 mg/L NAA. Rooted seedlings can be transplanted to nutrient bags with turf and soil after a 2-day acclimatization period, achieving a survival rate of 95%.
    4.3.3 Land Selection and Preparation
    Artemisia annua is highly adaptable and can be cultivated in most soils. For high-yield cultivation, choose sunny areas with loose, fertile soil, sandy loam, or clay loam with good water retention and fertility. For seedling nurseries, select well-drained, sunny locations with fertile soil. General farmland can be used for standardized Artemisia annua cultivation.
    Before seedling cultivation, plow the soil 20-30 cm deep, remove weeds, level the soil, and prepare raised beds 100 cm wide and 20 cm high with 20 cm wide furrows. Apply basal fertilizer at 37.5-52.5 t/ha of well-rotted organic manure such as plant ash or 375-525 kg/ha of potassium dihydrogen phosphate or ammonium phosphate. Chicken manure is preferable as an organic fertilizer. For field cultivation, ensure good drainage, deep plowing, weed removal, bed preparation, and fertilizer application, primarily using organic manure and plant ash with moderate amounts of superphosphate.
    4.3.4 Seedling Cultivation
     
    Prepare the Seedbed: Choose well-drained, sunny loam soil, deeply plow, apply soil manure, and prepare raised beds 120 cm wide with unlimited length, aiming for flat bed surfaces. The furrows between beds should be 40 cm wide and 20-25 cm deep.
    Select Good Seeds: Artemisia annua has a complex genotype, with significant differences in artemisinin content among different ecotypes. Select seeds tested for ecological adaptability or specifically bred for high artemisinin content.
    Determine Sowing Time: Sow when the temperature stabilizes around 12℃. In Chongqing, the optimal sowing period is late February to early March.
    Choose Sowing Method: Wet the seedbed with a watering can, spread fine soil or sand on top, and press lightly with a wooden board. Mix seeds with sand (10:1 ratio) or plant ash, and sow evenly in rows. Do not cover with soil after sowing; press the seedbed with a wooden board to ensure seeds contact the soil closely. Cover the seedbed with 5 cm of straw and water thoroughly with a watering can. Build a small plastic arch over the seedbed.
    Post-Sowing Procedures: After sowing, do not cover the seeds with soil. Instead, use a wooden board to press down the seedbed surface, ensuring the seeds are in close contact with the soil. Cover the seedbed with a 5 cm layer of straw and water thoroughly with a watering can. Finally, construct a small plastic arch over the seedbed.
    Seedling Management: Keep the seedbed moist after sowing and check frequently. After the seeds germinate, remove the straw cover and adjust the plastic cover for ventilation and light exposure based on temperature changes to reduce the air temperature inside the plastic tunnel. When seedlings reach 3-5 cm in height, apply diluted manure or 0.2% ammonium phosphate solution every 10 days. Ensure good ventilation and gradually harden the seedlings to reduce the incidence of diseases, weak seedlings, and dense growth. Transplant the seedlings when they are about 10 cm tall.
    Thinning and Transplanting: If temperature and humidity are suitable, seedlings will emerge in 10-20 days. After emergence, if the seedlings are crowded, thin them out to expand the nutritional area and improve air circulation and sunlight exposure, promoting robust growth. Otherwise, dense seedlings may lead to poor development. Thinning should be done after the cotyledon stage, but not too late, as overcrowded seedlings can lead to excessive growth, which is not conducive to cultivating strong seedlings. During thinning, keep the healthiest seedlings at the desired spacing, removing weak, diseased, overly tall, or slightly damaged seedlings. Also, remove any mixed varieties and weeds.
    Frequent Transplanting: Before transplanting, deeply plow the soil and apply 1000 kg/ha of decomposed compost and 60 kg/ha of phosphate fertilizer. Prepare raised beds 150 cm wide and plant seedlings at a spacing of 30 cm between plants and 30-40 cm between rows, with a density of 1200-1500 plants per hectare. Transplanting should be done from late March to early April. Water the seedlings thoroughly the day before transplanting to ease uprooting. Transplant on rainy or cloudy days and water the roots immediately after planting.
     
    4.3.5 Growth Period Management
    During field management, water management is crucial during the seedling stage (before the six-true-leaf stage). Both drought and excess water can affect normal growth, so timely irrigation and drainage are essential. Before the rows close, cultivate and weed to loosen the soil, usually before topdressing. When seedlings reach about 100 cm in height, pinch the tops to promote branching and increase yield.
    Cultivate and weed in time after seedling establishment. Even without weeds, cultivation after rain or irrigation can help. Cultivation should be shallow during the seedling stage and deeper as the plants grow.
    Weeding methods include manual, mechanical, and chemical. Before transplanting, chemical weeding can be chosen, but after transplanting, manual or mechanical weeding is preferred to avoid herbicide effects on Artemisia annua. Chemical weeding is efficient, timely, labor-saving, and economical. Herbicides and machinery are available for field use. The impact of previous crops on Artemisia annua growth is significant. Herbicides should be quick-acting and short-lived, applied before sowing or transplanting to kill weeds. Options include non-selective herbicides like paraquat, glyphosate, and sodium pentachlorophenate, used under expert guidance to avoid adverse effects. Choose herbicides based on weed species and apply before sowing or transplanting. Follow safety guidelines for herbicide concentration, method, and dosage.
    Apply 2-3 additional fertilizers as needed. During the seedling stage, the goal is to promote growth and increase branching. Apply more nitrogen at this stage, then gradually increase phosphorus and potassium during later growth stages. Apply 10 kg/ha of compound fertilizer (N, P, K) each time. Quick-acting fertilizers like decomposed human manure, urea, ammonium sulfate, ammonium water, and superphosphate can be used. Application methods depend on fertilizer type and plant growth. Apply chemical fertilizers in shallow furrows between rows or use human manure during irrigation. Foliar feeding with phosphorus and potassium or trace element solutions is also effective, usually during late growth stages.
    Common foliar feeding concentrations: potassium dihydrogen phosphate (0.1%-0.3%), superphosphate (1%-3%), urea (0.5%-1%). Multiple foliar feedings can increase yield by at least 30%. Pinch the tops when seedlings are about 1m tall to promote side branches and increase yield.
    Studies on Artemisia annua nutrition and fertilizer absorption show sensitivity to nitrogen and potassium. Excess nitrogen reduces artemisinin content, while too little affects leaf yield. Adequate potassium supports artemisinin synthesis and accumulation. The leaf yield and artemisinin content in cultivated Artemisia annua depend on meeting nitrogen, phosphorus, and potassium requirements. Special fertilizers for Artemisia annua, tailored to its nutritional needs, can improve leaf yield and artemisinin content.
    Currently, no special fertilizers for Artemisia annua are available on the market. Common fertilizers have unsuitable nutrient ratios, with high nitrogen and low potassium, adversely affecting artemisinin synthesis and accumulation. General organic fertilizers do not meet Artemisia annua's organic matter needs. Fertilizer type and amount directly impact leaf yield and artemisinin content, making it challenging for growers. Professor Ding Derong from Southwest University proposed a special fertilizer application plan for Artemisia annua.
    Special fertilizers for Artemisia annua include: urea (10%-20%), potassium phosphate (12%-25%), potassium sulfate (20%-30%), special organic matter (15%-32%), special additives (0.5%-2.0%), and zeolite powder (7%-18%). Special additives, containing Mg, Mo, B, Zn, and Mn, can be added based on regional deficiencies. Zeolite powder acts as a binder and filler for fertilizer granulation and slow release. The special organic matter is prepared from Artemisia annua residue or cow manure, matured with dilute H₂SO₄ at 40-60℃, mixed with lime powder, balanced for over 24h, pH adjusted to 6-8, and then dried.
    Example:
    Table 4-1 Special Fertilizer Formulation for Artemisia annua
    Component          Weight Ratio Scheme 1         Weight Ratio Scheme 2                 Weight Ratio Scheme 3 Urea          11%          20%               15% Ammonium Phosphate         12%          25%               15% Potassium Sulfate         25%          30%               30% Special Organic Matter         32%          15%               15% Special Additives           2%             1%               0.5% Zeolite Powder         18%           9%               14.5%  
    In the specific organic matter used, Artemisia annua residue or raw cow manure is treated with a dilute H₂SO₄ solution at 40-60℃ to mature it. After maturation, quicklime powder is added and mixed evenly, balanced for 24 hours, and the pH adjusted to 7, followed by drying.
    Extensive experimental results show that the application of this special fertilizer, compared to ordinary fertilizers or other compound fertilizers, can increase the yield of Artemisia annua leaves by more than 30% and the artemisinin content by more than 10%.
    4.3.6 Pest and Disease Control
    Root rot is a common disease in Artemisia annua cultivation, initially causing the fibrous and lateral roots to turn brown and rot, gradually spreading to the main root, eventually leading to the whole plant wilting and dying. This disease is associated with damage from soil nematodes and root mites. Artemisia annua thrives in warm, humid climates and well-managed environments, but it suffers severe disease in heavy soils and waterlogged fields. Control methods include soil disinfection before sowing, using insecticides to control soil pests, and applying organic fertilizers to enhance disease resistance. In the early stages of disease, use 800-1000 times diluted solutions of thiophanate-methyl or carbendazim for root irrigation and drain the field promptly after rain.
    Wild Artemisia annua has few pests and diseases, but artificial cultivation can attract pests such as aphids, cutworms, armyworms, and beet armyworm larvae. Aphids cluster on young stems and leaves, sucking sap. Control aphids with 1000 times diluted solutions of 25% dimethoate or 1500 times diluted solutions of 50% imidacloprid. Cutworm larvae feed on leaves and stems; control them in the 1st-2nd instar stages with 800-1000 times diluted solutions of 90% trichlorfon. For cutworms, armyworms, and beet armyworms, which harm stems and leaves, use 1000-1500 times diluted solutions of 90% trichlorfon or capture them using their feigning death behavior. Control methods include spraying 1000-1500 times diluted solutions of 90% trichlorfon.
    4.3.7 Harvesting and Processing
    Artemisia annua leaves are the primary harvest product, with the optimal harvest time being the early budding stage when artemisinin content reaches 0.986%-1%, ensuring the best yield and artemisinin content. Harvest Artemisia annua after July 20, depending on its growth, and select sunny days for harvesting. Cut down the main stems, sun-dry for one day, and continue drying at the field edge until the leaves are dry to the touch. Harvest must be completed by the end of September. Collect clean leaves or young branches with leaves, and dry them in the shade or sun, ensuring no impurities, mold, or decay, and a strong fragrance. The ideal harvest quality includes no withered or moldy leaves, green-brown color, and high artemisinin content. Typical yield is 1500-2000 kg of fresh Artemisia annua per hectare, with a dry matter yield of 10%-20%, resulting in 150-200 kg of dried leaves per hectare. The harvested material is processed by specialized pharmaceutical companies to extract artemisinin, which is then processed into anti-malarial drugs recognized by the World Health Organization.
    4.4 Seed Preservation Techniques
    Artemisia annua is generally harvested from August to the end of September. In standardized Artemisia annua cultivation bases, it is crucial to select superior plants during harvest and preserve them for seed production. This ensures the continuation of quality planting materials for the next season.
    Specialized breeding institutions, such as companies or research units, should adhere to specific standards for selecting seed plants. Farmers involved in Artemisia annua cultivation can follow these guidelines for selecting and preserving seed plants:
    Selection During Harvest: Choose vigorous plants with broad leaves and high economic yield for seed preservation. Mark these plants and allow them to flower and set seeds for harvest.
    Dedicated Seed Production Fields: Select fertile, sunny plots for dedicated seed production. Cultivate Artemisia annua with a row spacing of 25 cm and a plant spacing of 15-20 cm, ensuring robust growth and high seed yield. Seed yield can reach 16-50 kg per hectare.
    By following these seed preservation techniques, growers can ensure the availability of high-quality seeds for the next planting season, supporting sustainable Artemisia annua cultivation and production.
     
     
     
    第四章 黄花蒿的高效栽培技术

    中药材规范化栽培技术的研究与应用,是保证中药材质量可靠、疗效稳定、用药安全的前提与基础。所谓的中药材栽培技术研究,就是在系统掌握中药材生长发育规律的基础上,人为的、合理的对中药材种植生产的各个环节加以控制与管理,从而提高中药材的质量与产量。
    自青蒿素问世以来的30多年間,国内专家尤其是我的科研工作者在青蒿的资源分布状况、生长发育规律、栽培管理技术、优良品种筛选等方面,做了大量的科学研究,取得了显著的成果。这些基础方面的系统研究,为我国的青蒿种植业的健康发展,提供了有力的保证。
     
    4.1 青蒿栽培的基础研究
    4.1.1 生长发育性研究
    青等通过在广西北地区人工栽培青蒿的观察结果说明,青蒿10月下旬到次年5月中旬前可以播种,青蒿种子无休眠期。青蒿为浅根系植物。青蒿从发芽到侧枝出現前生长较为缓慢,5-7月为高速生长期,到9月上旬花蕾期停止生长,青蒿整个生育期约为240天。青蒿适应性强,抗旱抗涝能力较强,但6片真叶前的幼苗抗旱能力较弱。Ferreira试验发现青蒿存在自交不亲和性,同一株青蒿的花粉粒落在雌蕊柱头上,自花受精率低于5%;而且是一种严格的短日照植物,当日小于13.5h的临界日长连续处理两周,即可诱导黄花蒿花芽分化并进入花期。McVaugh试验得出青蒿是典型的异花授粉植物,主要是风媒和虫媒,与高原的其他植物不同。Wallaart发现,当青蒿含量较低时青蒿经过一次茎浸后,青蒿素含量会有所增加。陈霄天等通过遗传学表明,青蒿素可能属于细胞质中的代谢产物,也可能是储藏在某一细胞器中的代谢产物。

    4.1.2 品种选育研究
    虽然在20世纪80年代青蒿素的人工合成、生物合成就已成功,但其合成途径复杂,产率低,成本高,因而难以投入工业化生产。目前从黄花蒿中提取青蒿素仍然是当前青蒿素类药物来源的主要形式,而提取青蒿素所用的原材料,主要依靠人工栽培和野生资源。培育高青蒿素含量的优质青蒿新品种显得尤为重要。目前还没有真正意义上的高青蒿素品种。近年来,人们在高含量黄花蒿品种选育上作了一些基础性工作。Ferreira等测在温室和田间条件下对青蒿素产生的广泛遗传性状进行了分析,发现青蒿素的含量高低是受遗传性状决定的。Wallaart等利用秋水仙素诱导,叶片性格接近大麦,发现植株株高青蒿素含量比二倍体植株高38%,叶片形态仍保大麦,且植株对疾病的疑人量低。Magalhaes等报道了黄花蒿交种与青蒿素量可增加5 kg/ha。印度研究者利用分子标记,发现不同基因型黄花蒿之间存在较高的多态性,揭示了植物化学物质的差异源于遗传性状的多态性。湖州农业大学中药研究室朱卫平则对高青蒿素含量黄花蒿品种的培育和筛选育目标性状进行较深入的研究,发现通过优中选优的方法可以使青蒿素含量逐年提高,而且研究了叶的形态与青蒿素含量的相关性,发现狭裂片型叶比宽裂片型叶的含量更高,此外还对黄花蒿叶的结构进行了显微观察及青蒿素的组织化学定位,发现叶片中的毛状牙泌腺是青蒿素的储存部位,其浓度与含量呈正相关。目前,国内外改造黄花蒿的选培工作仍然进展缓慢,原因是其代谢复杂,遗传机制不甚明了。
    1991年到1997年,重庆市药物种植所进行了“青蒿选种及栽培技术研究”,在四川省青蒿类型中选育出青蒿素含量在1.0%的青蒿样本,但产量仅为200 kg/ha。由于缺乏青蒿中青蒿素稳定技术,影响了成果的推广应用。 1992年陈和荣用秋水仙碱处理青蒿种子,选育出了青蒿素含量高、青蒿养殖量显著增加,植株高大健壮,生长适应性强,稳定性好的优选逆性品的青蒿新品系“京夏1号”。青蒿素含量为1.0%,但在西阳种植后含量逐年下降,也未形成产业发展。 1989年印度报道了印度科学院及药用植物研究所采用集团选择的方法,培育高青蒿素含量的青蒿品种,该品种叶片干物质产量为2.9 t/ha,青蒿素31.9 kg/ha的新品种。 1993年Delabays N在瑞士采用中国青蒿东北陵间杂交,试管内繁殖,对意大利、南斯拉夫和西班牙的青蒿投粉,获得杂交品种,该品种干物质2 t/ha,青蒿素平均含量在0.64%-0.95%之间。 1994年Delabays N研究了在瑞士的最佳青蒿种植密度为3株/m²,最佳种植时间为四月尾,按此规定种植,可获得青蒿素高产,广种南斯拉夫与中国青蒿类型的杂交品种(Chine X Yougoslavie 49)青蒿素产量为26.64 kg/ha。 1996年Debrunner N从越南两组青蒿中选择了5种青蒿素含量较高型,同中国青蒿素含量较型杂交,获得青蒿素产量为38 kg/ha的杂交品种。 1999年Magalhaes,P.Mde.通过从中国和越南青蒿品种选择的杂交间的杂交,获得适合巴西种植的青蒿新品种,该品种青蒿素产量最高为21.38 kg/ha。 1997年黄正方等研究了青蒿植物形态、茎色、叶色、叶型与青蒿素含量的关系。并用自育杆青蒿栽培于不同生态条件下,以观察其青蒿素含量变化。该研究缺乏系统性和可比性。 综上所述,近二十年来国内外不断有青蒿新品种研究成功的报道,但青蒿良种推广应用和产业化成功的报道却少见。这是因为青蒿属于异花授粉植物,自交率低,不同基因型之间又具有较多的多态性,故很难获得遗传稳定的高青蒿素含量的品种,而且青蒿素含量高的品种受种植年度、生态环境及栽培技术的影响而波动较大。因此,解决高青蒿素青蒿生产稳定问题是青蒿产业健康、快速发展的首要问题。只有将青蒿品种选育与青蒿素含量稳定技术相结合,结合起来研究,建立独特的青蒿素育体系,才能培育出具有高产业化前景的青蒿良种。

    4.1.3 种子生理研究
    陈琦利用都安石山类型种子分别在8-15℃、28~35℃进行催芽,发芽率分别为50.0%、46.3%、50.0%。但发芽期却分别为11天、6天、13天。又分别用水、土、火土+肥泥、肥泥、河沙四种基质进行播种,发现发芽期均为5天,但发芽率以土+肥泥基质最好,达到71.0%,其次是肥泥55.0%,水土和河沙最差,分别为37.5%和26.0%。青蒿等分别采用0.4g、0.6g、0.8g、1.0g种子在6.67m²测定植株长高和产量,表明0.4g的植株长势比较好,株高、茎粗、小枝数及产量等均显著优于其他3个播种量,但小区产量以1.0g播种量最高。

    4.1.4 栽培技术研究
    韦青等分别采用15x15cm、20x20cm、25x25cm、30x30cm的密度栽种青蒿,于8月中旬采收并测定植株长势及产量,结果显示30x30cm栽培面积产量最高,显著优于其他各处理。又分别采用猪粪+猪圈土以及混合处理,应用对照处理,得出猪圈土植株长势和产量以应用鸡粪效果最好,以叶绿素含量77.6%,并指出施用基肥青蒿素含量影响不显著,施用追肥对青蒿素含量影响也不显著。Simon 分别采用每亩 30×30 cm、30×60 cm、60×60 cm,同时每亩分别施 0、 67、134 kg 尿素处理测定植株生长量和产量,表明 30×30 cm、30×60 cm、60×60 cm 的平均鲜重为 275 g/株、430 g/株、750 g/株,但总产量以 30×30 cm 最高,并且以施用尿素 67 kg 的处理最好。陈裕泰通过试验认为同一天发芽的青蒿由于生长在人工控制的环境下,只要青蒿的基本生长营养条件得到满足,生长环境中营养物质的含量和生长基质对青蒿素含量没有影响。同一生长时期的不同植株,形态上有显著差异,但这种差异和青蒿素含量无相关性。高温和短日光照可使青蒿素含量成百倍增加长。路洪顺认为早播种比晚播种有高的青蒿素含量长得多,3 月播种青蒿素含量达到 0.68%,7 月播种的含量仅为 0.25%。得出青蒿在生长期间温暖、阳光充足、无霜冻、排水良好、土壤肥沃疏松的沙质或沙质性壤土生长良好,青蒿素含量高。
    Charl 分别对栽培了 90 天、117 天、158 天(现蕾)的青蒿进行含量测定为 0.06%、0.15%、0.06%,并分别用 -50 kPa、-100 kPa、-150 kPa 的水压试验对青蒿的青蒿素合成的影响后得出回归方程: Y=-0138-000143X (R2=0.9997)。曾有龙也通过田间实验,证明青蒿随着生长时期的延长,青蒿素产量和青蒿素含量逐渐增大。Srivastava 报道了微量元素如硼能提高青蒿素的含量。Shukla 报道显示外施生长调节物质不仅促进营养生长,还能提高青蒿素含量。陈和崔等对不同生态型的青蒿测定青蒿素后,表明植株之间不仅互相通萌,心互相结粒性,青蒿素行向为佳。另外,青蒿粉有报道套种玉米不会影响玉米产量和青蒿素含量。
     
    4.15 采收与加工
    钟凤林等通过试验认为青蒿最佳采收期应在生长期至花蕾期之间,此时青蒿素含量高,营养体积积累大。Woerdenbag, El Sohly 都认为青蒿在花朵生长盛期时含量最高。但王正等用薄层扫描法(TLCS)对山东引种青蒿不同生长发育阶段青蒿素含量进行测定后表明青蒿花蕾期植株青蒿素含量最高,为最佳采收期。金玲等用柱层析分离测定引种云南、广西和高邮青蒿中青蒿素含量表明,青蒿在花蕾期含量最高。Singh、Laughlin 都认为青蒿素在青蒿花蕾期含量最高。黄黎等采用不同时期青蒿提取物对肠解热、耐高温等作田间实验结果表明青蒿的解热活性成分在花期和蕾期含量高,明显优于花蕾期。谢德志通过总结后认为青蒿的收获应该在青蒿生长末期到花蕾生长期为宜。傅德森通过正相薄层扫描法(TLCS)对不同样态、采收时对花蕾蒿中的青蒿素进行测定认为干品最好。但 Charles 分别将青蒿在室外太阳干燥、室外遮荫干燥、室内阴干、人工用 30℃、50℃、80℃的热气干燥,同时设 12h、24h、30h、48h 的处理时间后得出青蒿素含量以室内阴干 24h 最宜,自然干燥均优于人工烘干。Ferreira 分别测定青蒿植株的上、中、下各部青蒿素含量从 0.023%~0.046%变化,并且分别用冷冻干燥、烘干、室内阴干处理青蒿后发现,室内阴干青蒿素含量达到 0.13%,而冷冻干燥和烘干分别为 0.02%和 0.10%。Charles 实验表明,青蒿植株 1/3 的叶片青蒿素含量约 89%以上,上、中、下部含量上中上部含量比下部高 2 倍。Laughlin 则认为青蒿素在青蒿植株中是均匀分布的。

    4.2 规范化栽培环境要求
    国家药品监督管理局制定了《中药材生产质量管理规范》和《中药材生产质量管理规范和 GAP 指导原则》,进行青蒿栽培生产时必须严格按照规范和指导原则的内容进行,青蒿素的含量可符合各种国家、规范其生产的各种环保条件,才能达到可“量稳定、质量可靠”的目的,并能得到国际认可。

    4.2.1 土壤环境 
    优质青蒿种植基地的土壤环境要求达到土壤质量 GB15618-1995 标准中的二级标准,主要监控汞、铅、镉、铜、锌及六六六、滴滴涕等的残留量。
    4.2.2 灌溉水质 
    水质必须达到农田灌溉水质标准 GB5084-92 的要求,严格监控汞、镉、铅、铬、氰化物、氯化物含量。
    4.2.3 大气环境 
    青蒿生产地的大气环境质量要求达到 GB3095-82 标准中的二级以上标准,产区附近无有害气体、烟尘、氯化物等危害。此外,还要求青蒿生产区无带有各种病菌的城市垃圾和由医院排出的废水、废物污染。

    4.3 规范化栽培技术

    4.3.1 播种时间 
    由于青蒿种子没有休眠期,故青蒿在春、秋两季均可播种。青蒿属短日照植物,其开花对短日照非常敏感,秋季播种会因营养生长期过短,植株矮小便接近秋季短日照而开花结实,从而引起产量下降。因此,选择春季播种容易掌握。目前,为了稳定青蒿中的青蒿素含量,通常通过组织培养培育青蒿种苗,在组培及炼苗过程中,就应严格控制光照时间,如果让种植提前接受了短日照,即使是在春季长日照的情况下栽种,也会提前开花。实际栽培育的小植株仅 10 cm 左右便开花,这样的种苗在开花结果后,就完成了生命周期,根本谈不上产量。

    4.3.2 繁殖方法 
    黄花蒿的繁殖采用播种和组织培养等方法。不同时类型、播种、种植和选质及种子筛选方法对种子发芽有显著的差异,以 3 月上旬播种发芽率最高,达 93.38%;播种基质以七土七肥混合最好,种子以瓶装置于低温或常温条件下贮藏 6 个月均比袋装贮藏保持较高的发芽率。
    种子于 10 月中旬以后采收,晒干或阴干,除去茎、叶,然后用 1 mm 细筛过筛,置于通风干燥处或低温(3-6 ℃)贮藏。苗床宜在选地势较高、排水方便、背风向阳的地方,播种基质可选择用砂土或草炭灰,施足农家肥。苗床宽 100 cm,高 20 cm,要整细整平。
    黄花蒿从采收后至次年 5 月中旬都可播种,但 2 月中旬至 3 月中旬是播种最佳时期。一般采用条播,条距 15 cm,沟深约 1-2 cm。播种量为 60-75 g/h㎡。种子与细砂混匀后,均匀撒在沟内,然后盖上一层薄土,盖土不见种子为度。有条件的可覆盖上一层稻草,种子撒播后,要及时浇水,苗期注意保持苗床湿润。
    此外,组织培养法也是大规模繁殖青蒿幼苗的重要途径。黄花蒿幼苗、茎段、花序等不同外植体均能诱导形成愈伤组织,其中叶片愈伤组织更为容易,培养 5-10 天后,开始长出绿色或淡绿色的愈伤组织,而茎和花序分割需要 2 周、4 周才能形成愈伤组织。适合黄花蒿形成愈伤组织及增殖的培养基配方为 MS+KT4.0 mg/L+IAA 4.0 mg/L。芽的转入含 NAA0.5-2.0 mg/L 的 1/2MS 培养基中诱导生根,当 NAA 浓度为 1.0 mg/L 时,生根率可达 98%,生根苗再盖炼苗 2 天后移栽在草皮泥为基质的营养袋中,成活率可达 95%。
    4.3.3 选地整地
    黄花蒿适应性强,一般土壤都能栽培。高产栽培应选择阳光充足、土壤较疏松、质地疏松、保水保肥性能强的沙壤或粘壤土。
    选地应选用土壤肥沃,灌溉方便的向阳地作为青蒿育苗地。而一般耕地均可作为青蒿规范化栽培地。
    在青蒿育苗前,先将土壤翻 20-30 cm,整地,除去杂草、平沟起垄,苗床宽 100 cm,高 20 cm,沟宽 20 cm。平整苗床,施基肥,每公顷用腐熟的有机肥如草木灰 37.5-52.5 t,单用 375-525 kg 磷酸二氢钾或磷酸铵等,腐熟农家肥以鸡粪为好。
    对青蒿大田栽培地的要求是排水性好,一般要求深翻,拾掉杂
    草秆、建畦、施肥后,即可准备青蒿苗的移栽。施肥主要以农家有机肥、草木灰等为主,常施以适量的过磷酸钙。

    4.3.4 育苗
    1.    做好苗床 选择排水良好、背风向阳的壤质土,深翻,施土杂肥拌匀,做成宽 120 cm、长度不限的高厢,力求厢面平整,厢与厢之间的沟宽 40 cm,深 20-25 cm。
    2.    选择良种 青蒿基因型复杂,不同生态类型的青蒿其青蒿素含量差异较大,选择经生态适应性试验或定向培养的种子做种。
    3.    选准播种时间 春季当气温稳定在 12℃左右时,即可播种。如在重庆市都适宜播种期为 2 月下旬至 3 月上旬。
    4.    选好播种方法 播种前,用漏壶淋湿苗床,其上撒细土或细沙,用木板稍用力压平。因种子极其细小,掺沙(种子或草木灰),种子按 10:1 的比例混合均匀撒播于苗床,行稍勿密,每亩用种量 3-5 5.播后不覆,用木板将床面压实,使种子与土壤紧密结合,再在苗床上覆盖盖稻草 5 cm,用漏壶淋透水,最后搭建塑料小拱棚。
    6.苗期管理 播种后苗床要保持湿润,勤检查,种子发芽后除去覆盖的稻草,并视温度变化适时揭开塑料棚膜通气透光,降低棚内空气温度。幼苗高 3-5 cm 时,每隔 10 天施 1 次稀人畜粪水或 0.2% 磷酸铵液,并注意通风炼苗以降低病、弱、密苗,待苗高约 10 cm 时即可移栽。
    7.播种后如果温湿度适宜,10-20 天即可出苗。出苗后,如果生长拥挤,应进行间苗,以扩大幼苗的营养面积,扩大其间距,使幼苗间空气流通,日照充足,生长茁壮。否则,稠苗易生长发育。间苗时应当按株距定苗,瘦弱苗、病虫苗、徒长苗或略有损伤的苗拔除。除去混杂其间的其它品种的幼苗和杂草。间苗通常在子叶发生后进行,不可过迟,因苗株拥挤易引起徒长,不利育出壮苗。
    8.勤施移栽 移栽前需对土壤进行深翻,每亩撒施腐熟的土杂肥 1000 kg、磷肥 60 kg,起厢,做成宽 150 cm 的高厢,按株距 30 cm、行距 30-40 cm 规格栽植,亩栽 1200-1500 株。移栽时间为 3 月下旬至 4 月上旬,移栽前一天淋 1 次透水,以利起苗,并在雨后阴天移植,栽植后淋定根水。

    4.3.5 生长期管理 
    田间管理过程中,幼苗期(6 片真叶前)的水分管理尤其重要,土壤干旱或水分过多都影响正常生长,应及时灌溉和开沟排水。封行前注意中耕除草,松土工作一般在追肥前进行。当苗高为 100 cm 左右时,进行打顶摘心,一般摘去顶尖 3-4 cm 左右,以促进黄花蒿生分枝及加快分枝生长,提高产量。
    中耕除草成活后及时中耕除草。雨后或灌溉后,在没有杂草的情况下,也要进行中耕。幼苗期中耕宜浅,植株长大后可稍深。 除草方法有人工除草、机械除草与化学除草。青蒿在移栽前,可选择化学除草,移栽定植后,应选择人工除草或机械除草,避免除草剂影响青蒿的生长。化学除草具有高效、及时、省工、经济等特点。田间青蒿还配有独特的除草剂和机械。前茬对青蒿的生长影响则是相当严重的。在使用除草剂时,应选择见效快、有较短的除草剂,在播种和移栽前施用,以杀死杂草,可选用灭生性除草剂,例如百草枯、草甘膦、五氯酚钠等,但必须在有实践经验的专家或技术人员指导下进行,以免造成不良后果。最好的根据田间杂草种类、针对性地用药。药剂失效后,再播种或移栽。使用除草剂要注意安全,对使用的浓度、方法和用药量,要根据说明书使用。 可根据需要追肥 2-3 次。幼苗时期的追肥,主要目的是促进生长、增加枝生长。追施氮肥可稍多些,但在以后的生长发育期间,磷、钾肥应逐渐增加。每次每亩追施氮、磷、钾复合肥10kg左右。速效性肥料如腐熟人粪尿、尿素、硫酸铵、氨水、过磷酸钙等均可追肥。肥料的施用方法依肥料种类及植株生长情况而定。追施化肥,可在植株行间开浅沟条施。以人粪尿做追肥,可与灌水同时进行;还可采用根外追肥,一般都在生长后期进行,在植物茎、叶上喷施一定比例的磷、钾肥或微量元素的水溶液。 常用的追肥液浓度:磷酸二氢钾为0.1%-0.3%,过磷酸钙为1%-3%,尿素为0.5%-1%。对青蒿进行多次根外追肥,产量至少提高30%以上。苗高1m左右时,可进行打顶,以促进侧枝萌发,提高产量。 我们多年来对青蒿营养生理和吸肥规律的研究结果表明:青蒿对氮素和钾素较敏感,氮过多会造成青蒿素含量的下降,过少则影响青蒿叶的产量;青蒿钾素供应充足,有利于青蒿素的合成和积累。人工种植的青蒿叶产量和青蒿素含量的高低,取决于能否最大限度的满足青蒿对氮、磷、钟营养元素的需求。针对青蒿生长发育对营养元素的特殊要求配制成青蒿专用肥,可以满足青蒿对有机质和氮磷钾的特殊要求,达到提高青蒿叶产量和青蒿素含量的目的。
    目前市场上没有青蒿专用肥生产及销售,而其他复合肥养分配比和比例不符合青蒿生长发育需要,其含氮量较高,而含钾量较低,对青蒿叶青蒿素的合成与积累十分不利,一般的有机肥又不符合青蒿对有机质类的要求。普通肥料的施肥量和施肥种类又直接影响了青蒿叶的产量及青蒿叶中青蒿素的含量,种植者不易掌握。由于青蒿对氮素和钾素比较敏感,西南大学丁德蓉教授提出青蒿专用肥施用方案。
    青蒿专用肥中,按重量配比包含有:尿素10%-20%,磷钾12%-25%,硫酸钾20%-30%;专用有机质15%-32%,专用添加剂0.5%-2.0%,沸石粉7%-18%;可根据地域性缺素程度加入0.5%-2.0%的专用添加剂,其专用添加剂的主要成分为Mg、Mo、B、Zn、Mn;沸石粉起到粘结剂和填充剂的作用,用于肥料造粒和缓释肥效;其专用有机质为青蒿渣或牛粪生料经稀H₂SO₄溶液在40-60℃条件下熟化,然后添加生石灰粉混匀,平衡24h以上,并调节pH值为6-8,然后干燥处理即得。

    实施例:

    表4-1 青蒿专用肥配比方案
    成分               重量配比方案1      重量配比方案2 重量配比方案3 尿素         11% 20% 15% 磷铵         12% 25% 15% 硫酸钾         25% 30% 30% 专用有机质         32% 15% 15% 专用添加剂           2% 1% 0.5% 沸石粉         18% 9% 14.5%  
    其中,专用有机质为青蒿渣或牛粪生料经稀H₂SO₄溶液在40-60℃条件下熟化,然后添加生石灰粉混匀,平衡24h,并调节pH值为7,然后干燥处理。
    大量的实验结果表明,施用本专用肥与普通肥或其他复合肥相比,对可提高青蒿叶产量30%以上,青蒿素含量提高10%以上。

    4.3.6 病虫害防治
    根腐病是青蒿栽培中较常见的一种病,发病时,须根、支根先变褐腐烂,逐渐向主根蔓延,最后导致全根腐烂。直至地上茎叶干枯而亡植株全株枯死。该病害与地下线虫、根螨危害有关。另外,青蒿适宜在温暖湿润的气候与良好的环境中生长,土壤粘重、田间积水过多时发病严重。防治方法:播前对土壤消毒,用杀虫药防治地下害虫,同时增加降雨热有机肥,以增强抗病力。发病初期可用甲基托布津、多菌灵等800-1000倍液灌根,雨后及时排水。
    野生的青蒿病虫害较少。人工栽培后,易引起蚜虫、尺蠖、小地老虎、银纹夜蛾和斜纹夜蛾幼虫的危害:蚜虫群栖植株嫩茎、叶上,吸食液汁;发现蚜虫后,可用25%亚铵硫磷1000倍液或50%灭蚜灵1500倍液喷施防治;尺蠖(土名量步虫)幼虫咬食叶片、嫩茎、在幼虫1-2 龄期喷 90%敌百虫 800~1000 倍液防治;小地老虎、银纹夜蛾和斜纹夜蛾的幼虫,危害茎、叶,小地老虎,可用 90%敌百虫 1000~1 500 倍液浇穴毒杀;银纹夜蛾和斜纹夜蛾,利用其假死性进行捕杀;或用 90%敌百虫 1000~1500 倍液喷施防治。 
    4.3.7 采收与加工
    青蒿收获的产品为植株的叶片,青蒿的最佳采收时间为青蒿现蕾初期,因蕾期青蒿素含量甚为0.986%-1%,为适宜宜收获期,提前或延后采收可能影响青蒿叶的产量和青蒿素的含量。根据青蒿的长势,7月20日以后即可采收青蒿,收获时选择晴天,破倒主干,在太阳晒1天,第2天收,并到田头晒干,打落土于叶,子叶继续晒干到用手抓无潮湿感时可交售。9月底以前必须采收完毕,采收净叶或带叶的嫩枝,阴干或晒干,以手干,无杂质、不霉变、香气浓香,青蒿素含量普者为佳。收获质量要求无枯叶、无杂质、无枯叶、无霉叶。青蒿绿褐色。一般亩产1500-2000kg湿青蒿,折干率为10%-20%,亩干青150-200kg。收割料采收,由专业制药厂提取青蒿素,再由具有世界卫生组织认同的制剂机构加工成青蒿素类系列抗疟疾成药销售于市场。
    4.4 留种技术
    青蒿一般在8月至底月采割收获,在规范化种植的青蒿栽培基地收获时,一定要特别留意寻找一些优良植株作青蒿种株保留下来,使其开花结实收获种子,作为下一年的育源供继续生产使用。
    公司或科研单位等专门的育种机构自然不必说,进行青蒿栽培生产的农户可按以下方法进行选择种株的标准和留种。一是在收获时选择植株生长旺盛、叶型宽大的品种,经济产量较高的株系保留下来并作业标记,待其开花结实后采收;二是选择土壤肥沃、向阳的地段作以为专门的制种地,进行留种黄花蒿的栽培生产。留种的种植密度以条距25cm,株距15-20cm为好,植株长势强,开花结实多,种子产量高,每公顷可达16-50kg。
  24. Roger
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    该研究评估了使用青蒿叶粉作为预防疟疾发作的治疗方法,在25名患者中进行了评估,其中大部分是儿童,所有患者都因骨科问题接受了手术治疗。治疗持续时间为36小时的患者有11例,60小时的患者有14例。平均寄生虫数量从432个/毫升降至165个/毫升,即改善了62%,而且根据治疗持续时间的不同没有显著差异。不论患者的年龄和体重如何,疗效都是相似的。这些结果是在非常低的粉末量(每天400至500毫克)和极低的青蒿素数量(每天0.4至0.5毫克)下获得的。结论是青蒿叶粉似乎比茶制品更有效,但成本更高,可能不易获得。廉价且随处可得的茶制品仍然是大规模预防和治疗疟疾的最佳方法,在最贫困的国家应优先选择使用。除了研究寨卡病毒感染外,术前调查还包括检测消化道寄生虫(所有病例均呈阳性)和艾滋病病毒检测(除了一个成年患者外,所有病例均呈阴性)。
     
    表1 不同制备方法得到的[ART]。
    实验1:所有参数保持不变,只有温度变化。
    实验2:温度升高到沸点以上。
    实验3:材料:溶剂比例变化。
    所有结果均以[ART]表示,单位为毫克/升,并以提取效率百分比表示。

    样品1是通过在室温下用研钵和研杵粉碎植物材料制备的。 Sample: 样品编号或标识。 Temperature (°C): 实验处理的温度(摄氏度)。 Contact Time (min): 样品与溶剂接触的时间(分钟)。 Material: [ART] Solvent mg/L Ratio (g/L): 材料名称以及溶剂的浓度和比率。 Extraction Efficiency (%): 提取效率,以百分比表示,衡量了从样品中提取目标物的效率。 "5atb.p." 表示在沸点下的5分钟。这可能指样品在沸点下处理了5分钟。 "1at115" 表示在115°C下处理了1分钟。  
     
    青蒿叶粉囊的惊人功效
    摘要
    使用青蒿叶粉末作为预防疟疾发作的治疗方法,对25名患者进行了评估,其中大多数是儿童,所有患者都接受了整形外科手术。治疗持续时间为11名患者为36小时,14名患者为60小时。平均寄生虫血量从432个/毫升降至165个/毫升,即62%的改善,根据治疗持续时间没有显著差异。无论患者的年龄和体重如何,疗效都相似。这些结果是通过非常低剂量的粉末(每天400到500毫克)以及非常低量的青蒿素(每天0.4到0.5毫克)获得的。结论是,青蒿叶粉显然比茶制品更有效,但成本更高,也许不能常规使用。茶制品便宜且随处可得,仍然是预防和治疗大规模疟疾的最佳方法,应该在最贫穷的国家中优先考虑。
    介绍
    在中非共和国对残疾儿童进行的多次小儿骨科手术中,我们经常面对术后高热的情况,出现在手术后的第二天或两天后,被归因于疟疾,并用喹啉盐(喹嗪马)治疗。最近一次会诊中,我们调查了一些无症状儿童的血液中是否存在恶性疟原虫,结果发现所有调查病例均呈阳性。
    众所周知,以茶剂形式给予的青蒿叶因其青蒿素以及众多其他类黄酮和成分而自古以来就被用于抗疟疾作用。尽管易于制备,而且价格低廉,但茶制品被认为在外科手术环境中不完全适用且难以使用,因此我们转向了将青蒿叶粉末制成胶囊,用于术后立即预防儿童手术期间的疟疾发作。给予青蒿叶粉末的优点在于可提供“全部”,即植物中存在的所有分子,与青蒿素协同作用。中国研究团队[1]在1992年已经发现,青蒿叶提取物的明胶胶囊在小鼠上的药理学和临床试验中,对伯氏疟原虫和间日疟原虫感染的治愈率达到了100%。近年来,坦桑尼亚、马里、布隆迪和刚果(金)的其他医疗团队(Saint-Hillier,Klabes,Tumaini)使用青蒿叶胶囊在成人和儿童身上进行了优秀的结果和无副作用的试验。Weathers等人[2]已经注意到,青蒿植物材料中的青蒿素与纯药物相比,向血液中的转移率出人意料地高。
    这项研究的目的是评估这种预防性治疗的有效性。它于2012年11月在中非共和国的一次外科手术中进行。
    材料和方法
    本研究共有25名患者
    22名儿童,平均年龄为8岁4个月(1-16岁),3名成人,平均年龄为27岁(18-40岁)。所有患者均接受了整形手术(表1)。除了恶性疟原虫调查外,术前检查还包括消化道寄生虫检测(所有病例均为阳性)和HIV检测(所有病例均为阴性,除一个成人外)。
    协议
    使用的青蒿叶是卢森堡品种,于2009年在Walferdange地区收获,以35°C的工业设备干燥,并由植物卫生证书编号EC/LU/11773覆盖。
    恶性疟原虫血浓度检测了两次:一次是在开始预防性治疗之前,另一次是在J+2,即术后第二天早上。治疗持续时间如下:
    在14例中,治疗是在手术前一天(J-1)开始的:每位患者在2个半天内每天接受2粒胶囊(J-1日晚上2粒,J+0日晚上2粒,J+1日早晚各1粒,J+2日早上1粒)。在这些情况下,治疗持续时间为60小时。
    在11例中,由于纯粹的后勤原因(患者在分发胶囊的前一天手术时不在场),治疗从J+0开始:这11名患者在J+0日晚上接受2粒胶囊,J+1日早晚各1粒,J+2日早上1粒。在这些情况下,治疗持续时间为36小时。
    对于年龄较小的患者(3岁以下),胶囊被打开,粉末与牛奶或捣碎的木薯一起服用。体重在20公斤以下的患者使用1号胶囊;所有其他患者使用0号胶囊。
    *通讯作者:米歇尔·奥尼穆斯,法国康塔尔大学名誉小儿骨科教授,电子邮件:monimus@wanadoo.fr
    收到日期:2013年4月17日;接受日期:2013年5月22日;发表日期:2013年5月24日
    引用:Onimus M,Carteron S,Lutgen P(2013)青蒿叶粉囊的惊人功效。 Med Aromat Plants 2:125。 doi:10.4172/2167-0412.1000125
    版权:©2013年奥尼穆斯M等人。这是根据创作共享许可的开放获取文章,该许可允许在任何媒介中进行无限制的使用、分发和再生产,只要原作者和来源被列明。
     
    生物学结果
    治疗开始前的平均寄生虫数量为 Plasmodium falciparum 432个/毫升(范围:160-910)(见表1)。治疗结束时的平均寄生虫数量为165个/毫升(范围:0-320),平均改善了62%;其中一名患者(#18)的寄生虫数量没有下降。
    对于在36小时内接受治疗的11名患者,寄生虫数量从395减少到142,即改善了64%(范围:23%-100%)。对于在60小时内接受治疗的14名患者,寄生虫数量从461减少到183,即改善了60%(范围:<14%-85%)。
    临床结果

    镇痛效果
    治疗在所有病例中都完全耐受。没有观察到任何消化不耐受症状。没有观察到发热反应。所有病例的术后情况都被认为是顺利的。术后水肿,尤其是在先天性马蹄内翻后内侧释放术后,通常会频繁观察到,但此次水肿异常轻微。
    我们注意到了显著的术后镇痛效果。手术后12至18小时内镇痛剂(对乙酰氨基酚)的使用可以显著减少。这种效果在文献中[3]已经描述了对其他青蒿属植物如艾蒿(Artemisia vulgaris)的镇痛作用。因此,这与青蒿素无关。
    抗菌和抗炎效果
    在这项研究中,我们没有评估给予患者的青蒿叶粉对患者体内细菌负荷的影响。众所周知,这种植物对粪大肠埃希氏菌和链球菌具有强烈的杀菌作用。低青蒿素含量的该草药提取物能够激活淋巴细胞(个人通讯P. Lutgen),并且具有强烈的抗炎作用,可以通过减少IL-6和IL-8的分泌来证明。所有这些都可以解释手术后患者健康状况的改善[5]。
    讨论
    这些结果仅是初步结果,基于对小样本的评估,没有对照组。然而,实验室测试是在同一实验室中进行的,大多由同一技术员执行。因此,术前和术后测量中的可能误差可被认为是相似且可忽略不计的,这增加了结果的可信度,并使一些初步结论成为可能。
    所有患者术前均表现出无症状的寄生虫感染;这已经得到了充分的证明[6]。在我们的研究中,目标不是清除血液中的寄生虫,而是在术后的前几天内尽可能减少寄生虫感染,以避免发生疟疾发作,并且治疗意图上是不会延长到第二个术后日。尽管如此,在这项研究中观察到的青蒿叶粉的疗效为长期治疗疟疾提供了依据,正如茶制品已经证明的那样[7]。
    虽然已经3年,但青蒿叶粉对 Plasmodium falciparum 仍然非常有效,这表明所有成分即使经过几年仍然保持稳定。叶片存放在干燥的地方,没有特别的预防措施。
    在本研究中,使用青蒿叶粉预防疟疾在几乎所有病例中在临床和生物学上都是有效的,可以将寄生虫数量减少到初始值的三分之一。减少是迅速获得的,即使在36小时后也是如此,而且在60小时后也没有变化。只有一个病例(患者编号18)观察到寄生虫数量增加,但没有任何临床表现。在这种情况下,治疗可能允许取消初期疟疾发作。
    给予的粉末量非常低:胶囊号1中的粉末量约为200毫克,胶囊号0中的粉末量约为250毫克。这意味着每天给予大约400到500毫克的青蒿叶粉。这种粉末来自卢森堡品种,其中青蒿素含量约为0.1%,据估计每天约给予0.4-0.5毫克的青蒿素。与使用 ACT 时推荐的数量相比,这个数量更低,并且远低于茶制品中的量:在穆勒的研究中为12毫克[8],在 Räth等人的研究中为94毫克[9],在Silva等人的研究中为40-46毫克[10]。尽管如此,尽管这个数量非常低,但青蒿叶粉的治疗效果非常显著。
    另一个有趣的事实是,不论患者的年龄如何,寄生虫数量的改善效果都相同,因此无论患者的体重如何:5岁以下儿童寄生虫数量减少了60%,5至13岁的儿童寄生虫数量减少了52%,13岁以上的患者寄生虫数量减少了71%。这表明,即使在低剂量下,该粉末的疗效也非常显著。现在,增加剂量可能会增加疗效,这需要进一步评估。与茶制品相比,青蒿叶粉的优点是有利于提供植物中的所有分子,尤其是多糖、挥发油[11]和类黄酮。已经证明这些分子增加了青蒿素的作用[12],并且它们还具有直接的特异性抗疟疾作用[13-15]。Weathers小组最近进行的使用P. chabaudi感染的啮齿动物的研究表明,口服一次干燥青蒿叶粉后,30小时内寄生虫数量完全减少[16]。
    给予青蒿叶粉的治疗比茶制品更容易且显然更有效。然而,胶囊成本高昂,可能在偏远地区不易获得。在我们看来,胶囊并不完全适用于大规模使用青蒿叶粉。因此,在最贫困的国家,推广本地生产青蒿叶及其制成茶的方法仍然是预防和治疗疟疾的最佳方法,并且应该得到推广。然而,另一种可能性是,如果可以用传统的研钵将植物研磨成粉末,那么可以给予粉末。在特定条件下,如重症疟疾,胶囊作为栓剂仍然是一种选择。
    备注:在同一次手术中,另外5名未纳入研究的患者(4名成人和1名儿童)发生了疟疾发作,其中一例即使使用马拉酮预防也发生了疟疾发作,在2例中没有预防性治疗,在2例中尽管接受了ACT标准治疗超过10天,病情仍然持续。这5名患者接受了更高剂量的胶囊治疗:开始治疗时的初始剂量为3颗胶囊,然后每天4颗,持续7天。在所有5例中,观察到了功能障碍和高热症状在24小时后迅速缓解。两例病例进行了寄生虫数量的测定,包括治疗前和治疗过程中(治疗后60小时)的寄生虫数量测定:在一例病例中(成人),Plasmodium falciparum浓度从1500下降到180个/毫升。在第二例(儿童)中,在治疗前24小时内Plasmodium falciparum浓度从240增加到8400个/毫升,治疗后两天半下降到80个/毫升。
     
     
    The Surprising Efficiency of Artemisia annua Powder Capsules
    Michel Onimus1*, Sophie Carteron2 and Pierre Lutgen3
    1Honorary Professor of Pediatric Orthopaedics, Franche Comté University, France 2Pharmacien, Volontaire DCC in Central African Républic, Africa 3BELHERB-IFBV, Luxembourg, Grand Duchy

    Sample: Sample identification or label. Temperature (°C): The temperature (in degrees Celsius) of the experiment. Contact Time (min): The duration (in minutes) of contact between the sample and solvent. Material: [ART] Solvent mg/L Ratio (g/L): The material name and the concentration and ratio of the solvent in milligrams per liter and grams per liter, respectively. Extraction Efficiency (%): The percentage representing the efficiency of extracting the target substance from the sample. "5atb.p." indicates 5 minutes at the boiling point. This likely means the sample was treated for 5 minutes at its boiling point. "1at115" indicates 1 minute at 115°C. Abstract
    The administration of powdered leaves of Artemisia annua, used as preventive treatment of malaria attack, was evaluated in 25 patients, most of them children, and all of them were operated for orthopaedic disorder. The duration of the treatment was 36 hours in 11 patients and 60 hours in 14 patients. The average parasitemia was reduced from 432 parasites/ml to 165 parasites/ml, i.e. 62% improvement, without significant difference according to the duration of the treatment. The efficacy was similar whatever the age and the weight of the patient. These results were obtained with a very low amount of powder (400 to 500 mg per day), and with very low quantity of artemisinin (0.4 to 0.5 mg per day). It is concluded that the Artemisia annua powder is apparently more effective than the tea preparation, but more costly and maybe not routinely available. The tea preparation, inexpensive and available everywhere, is still the best method for prevention and treatment of malaria on a large scale and should be preferred in the poorest countries.
     
    Introduction
    During numerous surgical interventions in pediatric orthopaedics conducted with crippled children in Central African Republic, we have frequently been confronted with post-operative high temperatures, occurring the day following or two days after the surgery, which were attributed to malaria and were treated with Quinine salts administration (Quinimax). During a recent session, we investigated the presence of Plasmodium falciparum in the blood of some asymptomatic children, with a positive result in all investigated cases.
    Artemisia annua administered as tea is known since centuries for its antimalarial effect, due to artemisinin as well as numerous other flavonoids and constituents. Although easy to prepare, and moreover inexpensive, the tea preparation was considered as not perfectly adapted and difficult to use in a surgical context, and we turned towards administration of powdered leaves of Artemisia annua in capsules, which were used as preventive treatment of malaria attack during the immediate post-operative period in operated children. The administration of powdered leaves also presents the advantage to deliver the « totum », i.e. the whole set of molecules present in the plant, synergically acting with artemisinin. A Chinese research team [1] had already found in 1992 that gelatine capsules of Artemisia annua extract used in pharmacological and clinical trials on mice gave a cure rate of 100% for Plasmodium berghei and Plasmodium vivax infections. In recent years other medical teams (Saint-Hillier, Klabes, Tumaini) in Tanzania, Mali, Burundi, DRCongo have been working with Artemisia annua capsules on adults and children with excellent results and no side effects. A surprising high level of transfer of artemisinin into the bloodstream from the plant material vs. the pure drug had already been noticed by Weathers et al. [2].
    The aim of this study was to evaluate the effectiveness of this preventive treatment. It was conducted during a surgical session in Central African Republic in November 2012.
    Materials and Methods
    Twenty five patients were included in the study
    22 children with an average age of 8 years and 4 months (1-16) and 3 adults with an average age of 27 years (18-40). All patients were operated for an orthopaedic problem (Table 1). Besides the Plasmodium falciparum investigations, the preoperative investigation included detection of digestive parasites (positive in all cases) and HIV test (negative in all cases except an adult).
    Protocol
    The Artemisia annua used was the Luxembourg variety, harvested at the site of Walferdange in 2009, dried in industrial equipment at 35°C and covered by the Phytosanitary Certificate No EC/LU/11773.
    The Plasmodium falciparum blood concentration was investigated twice: once before starting the preventive treatment, and once at J+2, i.e. on the morning of the second post-operative day. The duration of the treatment was as following:
    In 14 cases the treatment was started on the day before the surgery (J-1): every patient received 2 capsules per day during 2 and half days (2 capsules on evening at J-1, 2 capsules on evening at J+0, 1 capsule on morning and evening at J+1 and 1 capsule on the morning at J+2). In these cases, the treatment was administered during 60 hours.
    In 11 cases, because of purely logistical reasons (the patient was absent the day before the surgery when the capsules were distributed), the treatment started at J+0: these 11 patients received 2 capsules on evening at J+0, 1 capsule on morning and on evening at J+1 and 1 capsule on the morning at J+2. In these cases the treatment was administered during 36 hours.
    For the younger patients (less than 3 years of age) the capsules were opened and the powder was administered with milk or mashed manioc. Capsules n°1 was used for patients with weight under 20 kg; all other patients received capsules n°0.
    *Corresponding author: Michel Onimus, Honorary Professor of Pediatric Orthopaedics, Franche Comté University, France, E-mail: monimus@wanadoo.fr
    Received April 17, 2013; Accepted May 22, 2013; Published May 24, 2013
    Citation: Onimus M, Carteron S, Lutgen P (2013) The Surprising Efficiency of Artemisia annua Powder Capsules. Med Aromat Plants 2: 125. doi:10.4172/2167- 0412.1000125
    Copyright: © 2013 Onimus M, et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.
     
    https://scholar.google.com/scholar_lookup?journal=Medicin+Aromat+Plants&title=The+surprising+efficiency+of+Artemisia+annua+powder+capsules&author=M+Onimus&author=S+Carteron&author=P+Lutgen&volume=2&publication_year=2013&pages=3&
    expérience gélules artémisia anglais publication.pdf
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