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by Diana Duarte 1,2ORCID,Armando Cardoso 3,4 andNuno Vale 1,5,* 1OncoPharma Research Group, Center for Health Technology and Services Research (CINTESIS), Rua Doutor Plácido da Costa, 4200-450 Porto, Portugal 2波尔图大学药学院，Rua Jorge Viterbo Ferreira, 228, 4050-313 Porto, Portugal 3NeuroGen 研究小组，健康技术和服务研究中心 (CINTESIS)，Rua Doutor Plácido da Costa，4200-450 Porto，葡萄牙 4解剖学单元，生物医学系，医学系，波尔图大学，阿拉米达教授 Hernâni Monteiro, 4200-319 Porto, Portugal 5阿拉米达波尔图大学医学院社区医学、健康信息和决策 (MEDCIDS) 系 Hernâni Monteiro 教授，葡萄牙波尔图 4200-319 *通讯作者。 学术编辑：Maria E. Mycielska 诠释。J.摩尔。科学。 2021 , 22 (14), 7408; https://doi.org/10.3390/ijms22147408 收稿日期：2021 年 7 月 2 日 / 修订日期：2021 年 7 月 6 日 / 接受：2021 年 7 月 8 日 / 发布时间：2021 年 7 月 10 日 （这篇文章属于特刊癌细胞代谢） 一、简介 癌症是世界范围内的一个主要健康问题，是美国 (USA) 的第二大死亡原因。2021 年，美国估计有 1,898,160 例新癌症病例和 608,570 例癌症死亡。结直肠癌 (CRC) 是美国癌症死亡的第二大原因，到 2021 年，估计有 149,500 例新诊断病例和 52,980 例死于此类癌症。其中，17,930 例新病例和 3640 例死亡发生在 50 岁以下的人群中。乳腺癌是女性癌症死亡的第二大原因，2021 年美国估计有 281,550 例新病例和 43,600 例死亡[ 1]。尽管手术和化疗在CRC的治疗中起主要作用，但有效率仍然很低。因此，开发用于癌症治疗的新药迫在眉睫，但这一过程耗时、成本高、批准率低[ 2 ]。此外，大多数新的化疗药物都存在毒性问题，导致副作用 [ 3 ]。因此，开发和探索新的药物策略以克服与开发用于癌症治疗的新药相关的障碍非常重要。 药物再利用（或重新定位）和药物组合是近年来引起许多研究小组关注的两种策略。药物再利用是一种将已经获得食品和药物管理局 (FDA) 批准的药物用于除原有治疗适应症之外的新治疗适应症的策略。该策略在新药开发方面具有优势，因为重新利用的药物已获得 FDA 批准，并且具有已知的安全性和毒性特征。这可以节省时间和金钱，增加这些药物进入临床试验的可能性 [ 4 ]。 药物组合是一种策略，包括施用两种或多种药物的混合物 [ 5 ]。这种方法可以克服肿瘤内和肿瘤间的异质性。肿瘤内异质性是由同一肿瘤的不同细胞之间的不同药物反应导致的，这有助于疾病的进展和耐药性的出现。肿瘤间异质性对应于同一类型癌症患者之间的异质性，使得难以预测不同患者对相同治疗的反应[ 6 ]。联合疗法有助于克服这些问题，多项研究表明它们确实比单一疗法更有效 [ 7 , 8, 9 , 10 , 11 , 12 ]。药物组合的功效取决于给药的时间表（例如，同时或顺序）和组合模型的设计 [ 13 , 14 ]，以充分利用药物之间的相互作用。在药理学上，两种或多种药物的组合将更有效，药物之间的协同作用越大，即与单独使用两种药物相比，其有效性的增强作用越大[ 15 ]。 已经探索了中枢神经系统 (CNS) 药物的再利用，一些研究证明了这类药物在降低肿瘤细胞活力方面的有效性 [ 16 , 17 , 18 , 19 , 20 ]。中枢神经系统药物可分为三大类：抗精神病药、抗抑郁药和抗惊厥药。抗精神病药和抗抑郁药可根据其作用机制细分为三环类抗抑郁药（TCA）、单胺氧化酶抑制剂（MAOI）、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRI）、5-羟色胺和去甲肾上腺素再摄取抑制剂（SNRI）、去甲肾上腺素和多巴胺再摄取抑制剂（NDRI） ) 和非典型抗抑郁药 [ 20]。几种 CNS 药物已显示出药物再利用的潜力，例如丙咪嗪、吩噻嗪、三氟拉嗪、匹莫齐特和丙戊酸。例如，丙咪嗪已在不同类型的癌症中进行了研究，如神经胶质瘤 [ 19 ]、乳腺癌 [ 21 ]、头颈癌 [ 22 ]、急性/慢性髓性白血病 [ 23、24 ] 等。吩噻嗪类药物是一种常规抗精神病药物家族，其成员主要用作多巴胺 D2 拮抗剂，也已在乳腺癌 [ 25 ]、小细胞肺癌 [ 18 ] 和口腔癌 [ 26 ] 中进行了研究]。三氟拉嗪是一种 FDA 批准的吩噻嗪和 D2 受体拮抗剂，已经在胶质母细胞瘤 [ 27 ] 和肺癌 [ 28 ] 等中进行了研究。匹莫齐特是另一种用于图雷特氏症的 D2 阻断剂，可对抗癌细胞，包括癌细胞的凋亡作用和Bcl-2表达降低[ 29 ]。Valproate (Valproic acid) 是一种抗癫痫药物，可阻断 Na +通道、GABA 转氨酶和 Ca 2+通道。这种药物用于癫痫、偏头痛和急性躁狂发作。几项研究表明它在对抗淋巴瘤 [ 30 ]、前列腺 [ 31 ] 和乳腺癌 [32 ] 和膀胱 [ 33 ] 和肝细胞癌 [ 34 ] 等。 在这项工作中，我们假设不同的 CNS 药物（方案 1 A 和表 1）可以在 CRC 和乳腺癌治疗中分别与 5-氟尿嘧啶 (5-FU) 和紫杉醇 (PTX) 协同作用。5-FU 是一种常用于 CRC 治疗的抗肿瘤药物，但其使用存在一些局限性，包括其半衰期短、细胞毒性高和生物利用度低 [ 35 ]。PTX 是一种化学治疗剂，是一种有丝分裂抑制剂，用于治疗晚期卵巢癌和其他各种癌症，包括乳腺癌和肺癌。PTX 的使用受到耐药性及其副作用的限制 [ 36]。这种组合模型由抗肿瘤药物和不同的再利用药物的组合组成，旨在通过使用毒理学可接受的药物来提高参考药物的活性并同时降低其治疗剂量。 图式1. 联合用药的化学结构。( A ) 中枢神经系统药物：( 1 ) 司来吉兰，( 2 ) 沙芬酰胺，( 3 ) 恩他卡朋，( 4 ) 托卡朋，( 5 ) 拉曲哌啶，( 6 ) 氟奋乃静，( 7 ) 硫利达嗪，( 8 ) 氟西汀，( 9 ) 苯托品，（10）卡比多巴，（11）溴隐亭，（12）奈匹司他，（13）东莨菪碱，（14）卡马西平，（15）舍曲林和（16）卡巴拉汀。（乙）抗疟药：（18）甲氟喹，（19）氯喹和（20）青蒿琥酯。 表 1. 本研究中使用的中枢神经系统药物及其作用机制。 最近，我们小组还开发了一种新的联合模型，在MCF-7乳腺癌细胞中使用不同的抗疟药和抗肿瘤药物[ 37 ]。几种抗疟药已与多柔比星和紫杉醇联合使用，这两种抗肿瘤药物常用于乳腺癌治疗。结果非常有希望，发现最佳组合对应于抗疟药甲氟喹、氯喹和青蒿琥酯[ 37 ]。尽管（家族性）乳腺癌与结直肠癌之间的关系是一个有争议的话题，但最近发现，最初与 CRC 相关的NTHL1基因的罕见突变也会导致乳腺癌 [ 38]。出于这个原因，我们决定在本研究中也包括这些抗疟药（方案 1 B），以确认此类药物在 HT-29 结肠癌细胞中的抗肿瘤活性。我们已经证明，5-FU 和一些抗疟药的组合也会在 HT-29 细胞中诱导抗肿瘤作用。有趣的是，对于青蒿琥酯，我们发现药物方案会影响这种组合的抗癌作用，当青蒿琥酯在 5-FU 之前给予 HT-29 细胞时效果会更大。 我们证明了一些 CNS 药物，如氟奋乃静、氟西汀和苯托品，单独使用比与 5-FU 联用更能降低 HT-29 结肠癌细胞的活力。在 MCF-7 细胞中，舍曲林在单独使用时是最有希望的再利用药物，IC 50值最低。与 HT-29 电池相比，IC 50测试的 CNS 药物在乳腺癌细胞中的含量较高，表明这些药物在 CRC 中的疗效更好。我们还发现，与这些细胞中的每种药物单独相比，5-FU 与舍曲林和硫利达嗪的组合诱导了更大的抗肿瘤作用。结合起来，MCF-7 的结果比 HT-29 细胞更有希望，PTX 与氟西汀、苯托品和氟奋乃静的组合产生了更多的协同对。 结果 2.1 HT-29 结直肠癌细胞 2.1.1 5-FU 作为单药对细胞活力的影响 我们分析了抗肿瘤药物 5-FU 在 HT-29 结直肠癌细胞系中的抗肿瘤潜力，以确认其在此类癌症中的功效。用浓度范围为 0.1-100 μM 的 5-FU 处理细胞 48 小时，并通过 MTT（一种测量线粒体活性的活力测定法）评估细胞存活率。5-FU 的 MTT 测定结果在图 1A中给出。基于这些结果，获得了剂量反应曲线并计算了 5-FU 的 IC 50值（图 1乙）。该值被进一步用于组合中。我们的结果表明，5-FU 在浓度高于 10 µM 时具有显着活性，而较高浓度的细胞活力几乎没有差异。细胞对 5-FU 的细胞毒性作用表现出轻微的反应，小于 4 µM 可杀死几乎 50% 的细胞。这些结果支持 5-FU 在治疗 CRC 中的抗癌活性，并证明其在本研究中提出的组合中的使用是合理的。 图 1. 5-FU 对 HT-29 细胞的影响。（一）细胞活力和（乙）剂量反应。在增加浓度的 5-FU 存在下培养细胞，48 小时后，进行 MTT 测定以测量细胞活力。值以对照百分比表示，代表平均值±SEM。每个实验独立进行 3 次 ( n = 3) *** 与对照组相比具有统计学显着性，p < 0.001。**** 在p < 0.0001 时与对照组相比具有统计学意义。 2.1.2. 中枢神经系统药物和抗疟药物作为单一药物对细胞活力的影响 我们接下来评估了不同中枢神经系统药物作为单一药物的可能抗肿瘤作用，即司来吉兰、恩他卡朋、托卡朋、拉曲哌啶、氟奋乃静、沙芬酰胺、卡比多巴、东莨菪碱、苯托品、硫利达嗪、氟西汀、奈匹司他和溴隐亭在 HT-29 结肠癌细胞中的抗肿瘤作用。在这项研究中，我们还根据我们之前的结果 [ 37 ] 纳入了三种抗疟疾药物（甲氟喹、氯喹和青蒿琥酯），以确认这些药物是否会在除 MCF-7 乳腺癌之外的另一种细胞系中保持其抗癌活性细胞。HT-29 细胞用增加浓度的每种药物处理，从 1 µM 到 100 µM，以评估处理 48 小时后的细胞活力。 根据 MTT 结果，我们发现拉曲吡定、氟奋乃静、氟西汀、苯托品、硫利达嗪、舍曲林、甲氟喹和青蒿琥酯在 HT-29 细胞中显示出显着的抗肿瘤活性。即使在 1 µM 的浓度下，latrepirdine（图 2 A）的细胞毒性作用也很显着，其中 7.75 µM 导致超过 50% 的细胞减少（图 2 B）。在所有单独测试的药物中，氟奋乃静的抗肿瘤作用最强，10 µM 以上的浓度几乎杀死了所有细胞（图 2 C）。事实上，氟奋乃静的 IC 50最低，小于 2 µM（图 2D)。氟西汀治疗的 MTT 测定表明，该 CNS 药物在 HT-29 细胞中对所有超过 10 µM 的浓度测试都具有强烈的细胞毒性作用（图 2 E）。氟西汀的剂量反应曲线显示 IC 50值为 6.12 µM（图 2 F）。Benztropine 在高于 10 µM 的浓度下显示出显着的抗肿瘤作用（图 2 G），获得的 IC 50值为 18.23 µM。硫利达嗪处理还显着降低了 HT-29 细胞活力，从 1 µM 降低到 100 µM，对高于 5 µM 的所有浓度（图 3 A）具有强烈影响，IC 50值为 4.26 µM（图 3乙）。以高于 1 µM 的剂量使用舍曲林处理 48 小时对细胞活力有很强的影响（图 3 C），导致 IC 50值小于 3 µM（图 3 D）。所有浓度超过 10 µM 的抗疟药甲氟喹都对 HT-29 细胞的细胞活力有很强的影响，超过 50% 的细胞无法存活（图 3 E）。剂量反应曲线导致 IC 50值为 11.49 µM （图 3 F）。青蒿琥酯是另一种抗疟疾药物，在所有浓度高于 10 µM（图 3 G）和低于 20 µM的 IC 50值（图3）下也显示出对这些细胞的良好功效H）。其他 CNS 药物和氯喹的 MTT 测定表明这些药物在降低 HT-29 细胞活力或 IC 50超过 20 µM方面缺乏功效，因此从药物组合中丢弃。这些结果表明中枢神经系统药物和抗疟疾药物都是与 5-FU 联合使用的良好候选者。表 2总结了在这项工作中单独测试的所有药物的 IC 50。 图 2. 一些中枢神经系统药物对 HT-29 细胞的影响。( A ) latrepirdine 对细胞活力的影响和 ( B ) 剂量反应曲线。( C )氟奋乃静对细胞活力的影响和( D )剂量反应曲线。（E）氟西汀对细胞活力的影响和（F）剂量反应曲线。( G ) 苯托品对细胞活力的影响和 ( H) 剂量反应曲线。在每种药物浓度增加的情况下培养细胞，48小时后，进行MTT测定以测量细胞活力。值以对照百分比表示，代表平均值±SEM。每个实验独立进行 3 次（n = 3）；** 在p < 0.01时与对照组相比具有统计学意义。*** 与p < 0.001的对照相比具有统计学意义。**** 在p < 0.0001 时与对照组相比具有统计学意义。 图 3. 一些中枢神经系统药物和抗疟药物对 HT-29 细胞的影响。( A ) 硫利达嗪对细胞活力的影响和 ( B ) 剂量反应曲线。（C）舍曲林对细胞活力的影响和（D）剂量反应曲线。( E ) 甲氟喹对细胞活力的影响和 ( F ) 剂量反应曲线。( G ) 青蒿琥酯对细胞活力的影响和 ( H) 剂量反应曲线。在每种药物浓度增加的情况下培养细胞，48小时后，进行MTT测定以测量细胞活力。值以对照百分比表示，代表平均值±SEM。每个实验独立进行 3 次（n = 3）；* 在p < 0.05时与对照组相比具有统计学意义。*** 与p < 0.001的对照相比具有统计学意义。**** 在p < 0.0001 时与对照组相比具有统计学意义。 表 2. 5-FU、几种 CNS 药物和一些抗疟药对 HT-29 结肠癌细胞的细胞毒性。IC 50值作为平均值给出。 2.1.3。5-FU与不同中枢神经系统药物和抗疟药物的各种组合的作用 在找到 CRC 治疗中药物再利用的最佳候选者及其 IC 50值后，我们使用我们之前工作中开发的组合模型评估了 5-FU 与每种药物的组合 [ 37 ]。具体而言，HT-29细胞分别用两种药物单独或以固定比例组合处理，浓度分别为0.25×IC 50、0.5×IC 50、IC 50、2×IC 50和4×IC 50，两个细胞进行了基于测试：MTT 和 SRB。还对用每种药物单独和组合处理的细胞进行了形态学评估。根据IC 50选择最有希望的药物组合药物价值。为此，评估了 5-FU 和表 2中 IC 50值低于 20 µM 的每种药物的组合：拉曲吡定、氟奋乃静、氟西汀、苯托品、硫利达嗪、舍曲林、甲氟喹和青蒿琥酯。 当与 5-FU 结合时，在任何浓度下，通过 MTT 和 SRB 测定，latrepirdine 都没有任何显着的抗癌作用（分别为图 4 A、B）。在高于 IC 50的浓度下，与硫利达嗪的组合导致细胞活力和细胞蛋白质合成的降低与单独的硫利达嗪相似。在 4 × IC 50的浓度下，5-FU 加硫利达嗪的组合表现出比硫利达嗪增强但不显着的抗癌作用（图 4 C、D）。与较高浓度的 5-FU 单独相比，与 5-FU 和舍曲林的组合在两种测定中也显示出显着的抗癌作用（图 4E,F)。在 4 × IC 50的浓度下，可以看到舍曲林和舍曲林+5-FU 之间的微小差异，但这并不显着。与甲氟喹的组合导致所有浓度都显示出比单独使用 5-FU 更大的抗癌作用（图 4 G，H）。在这些组合上看到的活性可能是单独使用甲氟喹的强抗癌活性的结果。形态学上，结果与 MTT 和 SRB 测定一致。在 4 × IC 50的浓度下，与对照细胞和 5-FU 相比，所有组合都导致细胞数量减少，细胞更小更圆，这表明细胞死亡（图 5）。在 5-FU 加氟奋乃静、氟西汀、苯托品和青蒿琥酯的组合中，我们发现在 2 × IC 50浓度下，组合药物的结果比单独的再利用药物差，证明了药物之间存在一种竞争机制。两种药物一起给药时，主要在 MTT 测定中。此外，对于较高浓度 (4 × IC 50 )，组合药物获得的结果并没有显示单独使用再利用药物的改进（图 6）。显微镜下，浓度为 4 × IC 50，仅在 5-FU、对照细胞和处理细胞之间发现细胞之间的差异；单一药物和药物组合之间的差异非常细微，两种治疗均导致细胞数量减少、聚集体形成减少和细胞变圆（图 7）。 图 4. 联合治疗 48 小时后 HT-29 的生长抑制，MTT（左）和 SRB 测定（右）。将细胞暴露于浓度为IC 50 0.25、0.5、1、2和4倍的每种药物，并通过MTT和SRB测定评估细胞活力。联合用药同时联合给药。( A ) 5-FU 加拉曲吡定对细胞活力和 ( B ) 细胞蛋白质合成的影响。( C ) 5-FU 加硫利达嗪对细胞活力和 ( D ) 细胞蛋白质合成的影响。( E ) 5-FU 加舍曲林对细胞活力和 ( F ) 细胞蛋白质合成的影响。(克) 5-FU 加甲氟喹对细胞活力和 ( H ) 细胞蛋白质合成的影响。值以对照百分比表示，代表平均值±SEM。每个实验独立进行 3 次（n = 3）；* 在p < 0.05时与对照组相比具有统计学意义。** 在p < 0.01时与对照组相比具有统计学意义。*** 与p < 0.001的对照相比具有统计学意义。**** 在p < 0.0001 时与对照组相比具有统计学意义。 图 5.与载体 ( A )、5-FU ( B )、latrepirdine ( C )、latrepirdine + 5-FU ( D )、硫利达嗪 ( E )、硫利达嗪 + 孵育 48 小时后 HT-29 细胞的显微细胞可视化5-FU ( F )、舍曲林 ( G )、舍曲林 + 5-FU ( H )、甲氟喹 ( I ) 和甲氟喹 + 5-FU ( J )，每种药物的浓度为 4 × IC 50。 图 6. 联合治疗 48 小时后 HT-29 的生长抑制，MTT（左）和 SRB 测定（右）。将细胞暴露于其IC 50的0.25、0.5、1、2和4倍浓度的每种药物，并通过MTT和SRB测定评估细胞活力。联合用药同时联合给药。( A ) 5-FU 加氟奋乃静对细胞活力和 ( B ) 细胞蛋白质合成的影响。( C ) 5-FU 加氟西汀对细胞活力和 ( D ) 细胞蛋白质合成的影响。( E ) 5-FU 加苯托品对细胞活力和 ( F ) 细胞蛋白质合成的影响。(克) 5-FU 加青蒿琥酯对细胞活力和 ( H ) 细胞蛋白质合成的影响。值以对照百分比表示，代表平均值±SEM。每个实验独立进行 3 次（n = 3）；* 在p < 0.05时与对照组相比具有统计学意义。** 在p < 0.01时与对照组相比具有统计学意义。*** 与p < 0.001的对照相比具有统计学意义。**** 在p < 0.0001 时与对照组相比具有统计学意义。 图 7.与载体 ( A )、5-FU ( B )、氟奋乃静 ( C )、氟奋乃静 + 5-FU ( D )、氟西汀 ( E )、氟西汀 + 孵育 48 小时后 HT-29 细胞的显微细胞可视化5-FU ( F )、苯托品 ( G )、苯托品 + 5-FU ( H )、青蒿琥酯 ( I ) 和青蒿琥酯 + 5-FU ( J )，每种药物的浓度为 4 × IC 50。 2.1.4。5-FU 和 CNS 药物/抗疟药的协同组合 为了研究 5-FU 与先前药物组合的效果，并在基于 MTT 和 SRB 测定找到最有希望的药物后，使用 CompuSyn 软件使用 Chou-Talalay 方法计算组合指数 (CI)。CI 绘制在y轴上，作为x轴上效果水平 (Fa) 的函数，以评估药物协同作用。分数效应是一个介于 0 和 1 之间的值，其中 0 表示药物不影响细胞活力，1 表示药物对降低细胞活力产生完全影响。5-FU 加拉曲吡定的组合显示出很少的协同作用，只有一对协同作用（图 8A），Fa 值为 0.44（表 3）。5-FU 加氟西汀和苯托品的两种组合仅对一对显示出协同作用（分别为图 8 B、C），Fa 值分别为 0.73 和 0.87（表 3）。与硫利达嗪的组合是最有希望的组合之一，具有三对协同作用（图 8 D），Fa 值达到 0.75（表 3）。对于舍曲林，所有组合均具有协同作用（图 8 E）并产生 0.85 的 Fa 值（表 3）。5-FU 和甲氟喹的组合也产生了一对协同作用（图 8 F），Fa 值为 0.848（表 3）。青蒿琥酯和氟奋乃静与 5-FU 的组合没有产生任何协同作用（分别为图 8 G、H），所有浓度对的 CI > 1（表 3）。总之，这些结果表明，一些中枢神经系统药物，如舍曲林和硫利达嗪，可能有望评估未来的组合。 图 8. Chou-Talalay 法 Fa-CI 图 5-FU 加拉曲吡定 ( A )、氟西汀 ( B )、苯托品 ( C )、硫利达嗪 ( D )、舍曲林 ( E )、甲氟喹 ( F )、青蒿琥酯 ( G )和氟奋乃静（H）。CI 绘制在y轴上，作为x轴上效果水平 (Fa) 的函数，以评估药物协同作用。CI < 1、CI = 1 和 CI > 1 分别是指协同作用、相加作用和拮抗作用。 表 3. 5-FU 加 CNS 药物和抗疟药不同组合的 CI 值和各自的分数效应。红色的 CI 表示具有协同作用的药物对的浓度。用每种药物的IC 50 (总剂量) 的0.25、0.5、1、2和4倍处理细胞。 除了 Chou-Talalay 方法外，还使用 SynergyFinder 2.0 软件通过 Bliss Independence 和 Highest Single Agent (HSA) 方法评估药物相互作用。该软件是一个网络应用程序，用于通过不同的协同作用评估方法对多药组合分析数据进行交互式分析和可视化。Bliss 独立模型假设两种药物独立产生作用的随机过程，可以根据独立事件的概率计算预期的联合作用 [ 57]。HSA 模型是协同作用评估最简单的参考模型之一，并指出预期的联合效应是相应浓度下单一药物反应的最大值。在该软件中，药物组合的协同作用得分是所有剂量组合测量值的平均值，给出正值或负值，分别对应于协同作用或拮抗作用。2D 和 3D 协同图分别以红色和绿色突出显示协同和拮抗剂量区域 [ 57 ]。 通过 Bliss 和 HSA 模型（分别为图 9 A、B）， Latrepirdine 与 5-FU 组合显示负协同作用评分，与 Chou-Talalay 结果一致，表明所有对均具有拮抗作用。硫利达嗪通过 Bliss 模型表现出协同作用，协同作用得分为 5.178（图9C ）。HSA 模型的结果显示出拮抗作用，但在某些区域有协同作用，如图 9 D 中的红色所示。与先前的结果一致，5-FU 与舍曲林的组合在 Bliss 中均产生了强烈的协同作用（图9 E) 和 HSA 模型 (图 9F)，协同效应得分分别为 22.203 和 3.042。对于甲氟喹，使用 Bliss 和 HSA 模型未观察到协同作用（分别为图 9 G、H）。通过 Bliss 模型，氟奋乃静与 5-FU 组合导致负协同评分，表明拮抗作用（图 10A）。通过 HSA 模型，一般协同评分也是负的，但 2D/3D 图中的一个区域显示了一对具有协同行为的浓度（图10B ）。氟西汀和苯托品在 Bliss 和 HSA 模型中未显示任何协同作用，表明这些药物与 5-FU 之间存在拮抗行为（图 10C-F)。与之前通过 Chou-Talalay 方法获得的结果相反，通过 Bliss 方法评估的 5-FU 加青蒿琥酯的组合产生了 0.411 的正协同得分，在 2D/3D 图上的红色区域处于最低浓度（图 10 G）。使用 HSA 模型，协同评分为负，显示拮抗作用（图10H）。这些结果表明，尽管这些参考模型在大多数情况下产生相似的结果，但协同评估模型的选择可以给出关于药物组合协同评估的略有不同的结果。 图 9. Bliss（左）和 HAS（右）5-FU 加拉曲吡定（A、B）、硫利达嗪（C、D）、舍曲林（E、F）和甲氟喹（G、H）的协同作用图。 图 10. Bliss（左）和 HAS（右）5-FU 加氟奋乃静（A、B）、氟西汀（C、D）、苯托品（E、F）和青蒿琥酯（G、H）的协同作用图。 2.1.5。5-FU与不同中枢神经系统药物和抗疟药的不同组合方案的效果 根据 MTT 测定结果（图 6），5-FU 与氟奋乃静、氟西汀、苯托品和青蒿琥酯的组合似乎证明了这两种药物之间存在某种竞争，组合的结果比改用药物的结果更差独自的。我们为这对药物设计了一个新的组合模型，并评估了药物时间表对 HT-29 的影响。我们假设如果我们在不同时间（连续）给药，结果会更好，因为两种药物之间不竞争。为此，我们测试了三个时间表（图 11)：同时给药（附表A）、药物A在先药物B（附表B）和药物B在先药物A（附表C）。我们发现，对于所有 CNS 药物，与其他方案相比，同时给药在降低细胞活力方面产生了更好的结果（图 12 A-F）。有趣的是，我们发现所有中枢神经系统药物单独表现出比联合使用更好的抗肿瘤活性，表明这些药物是药物再利用的理想候选者。对于青蒿琥酯，我们发现在 5-FU 之前给予青蒿琥酯比其他药物方案产生更好的结果（图 12 G，H）。 图 11. 用于评估 5-FU 与氟奋乃静、氟西汀、苯托品和青蒿琥酯组合的三种组合方案。附表 A 代表同时用 5-FU 和每种重新利用的药物处理 48 小时的细胞。附表 B 代表用 5-FU 预处理 24 小时的细胞，然后每种重新利用的药物再处理 24 小时。对于计划 C，细胞用每种重新利用的药物预处理 24 小时，然后用 5-FU 再处理 24 小时。 图 12.使用恒定比例的 IC 50剂量 将 HT-29 细胞暴露于连续的 5-FU 和 ( A , B ) 氟奋乃静 ( C , D ) 氟西汀 ( E , F ) 苯托品和 ( G , H ) 青蒿琥酯。值以对照百分比表示，代表平均值±SEM。每个实验独立进行 3 次（n = 3）。 2.1.6。5-FU和CNS药物/抗疟药不同组合方案的协同作用评价 基于先前的结果，我们还分析了这些组合中的药物相互作用，以评估三种给药方案之间的 CI 值是否存在差异。对于氟奋乃静，药物的同时给药和顺序给药之间没有差异，并且所有对都是拮抗剂（图13A）。对于氟西汀，同时给药中只有一对具有协同作用，而在顺序给药中，看不到协同作用，因此同时组合似乎优于顺序(图13B )。对于苯托品也观察到同样的情况，表明序贯给药缺乏疗效（图 13C）。与这些药物相反，以序贯形式与青蒿琥酯组合，在 5-FU 之前给予青蒿琥酯，与 5-FU 之前的青蒿琥酯和同时给药相比，似乎具有更好的结果，产生三对协同作用（CI < 1）（图 13 D)。表 4显示了每种组合获得的 CI 值，具体取决于药物方案。 图 13. 5-FU 加氟奋乃静 ( A )、氟西汀 ( B )、苯托品 ( C ) 和青蒿琥酯 ( D ) 的三种时间表依赖性组合的 Chou-Talalay 法 Fa-CI 图。CI 绘制在y轴上，作为x轴上效果水平 (Fa) 的函数，以评估药物协同作用。CI < 1、CI = 1 和 CI > 1 分别是指协同作用、相加作用和拮抗作用。 表 4. 5-FU 加氟奋乃静、氟西汀、苯托品和青蒿琥酯的三种不同组合方案的 CI 值和各自的分数效应。红色的 CI 表示具有协同作用的药物对的浓度。 2.2. MCF-7 乳腺癌细胞 2.2.1。中枢神经系统药物作为单一药物对细胞活力的影响 最后，我们评估了最有希望的 CNS 药物在 MCF-7 乳腺癌细胞中的细胞毒作用，包括单独和联合使用。这一次，我们将这些药物与紫杉醇 (PTX) 结合使用，这是一种用于治疗乳腺癌的抗肿瘤药物，而不是 5-FU，因为我们小组之前的结果表明这种药物对 MCF-7 乳腺癌不是很有效癌细胞。基于 HT-29 结果，我们选择了硫利达嗪、苯托品、氟西汀、氟奋乃静、舍曲林和拉曲吡定，并评估了它们对 MCF-7 活力的影响。如前所述，MCF-7 细胞用增加浓度的每种再利用药物进行处理，从 1 μM 到 100 μM 开始，以评估处理 48 小时后的细胞活力。 基于 MTT 结果，我们发现所有测试的 CNS 药物在 MCF-7 细胞中均显示出显着的抗肿瘤活性。氟西汀的细胞毒性效应（图 14 A）在浓度高于 10 µM 时显着，7.78 µM 导致超过 50% 的细胞减少（图 14 B）。在所有单独测试的药物中，舍曲林的抗肿瘤作用最强，10 µM 以上的浓度几乎杀死了所有细胞（图 14 C）。舍曲林的 IC 50值最低，即约 2.22 µM（图 14 D）。硫利达嗪的 MTT 结果表明，该 CNS 药物在 HT-29 细胞中对所有超过 10 µM 的测试浓度都具有强烈的细胞毒性作用（图 14E)。硫利达嗪的剂量反应曲线导致 IC 50值为 5.72 µM（图 14 F）。氟奋乃静在浓度高于 10 µM 时显示出与舍曲林相似的显着抗肿瘤作用（图 14 G），获得的 IC 50值为 2.68 µM（图 14 H）。Benztropine 和 latrepirdine 对 MCF-7 活力的影响是所有测试药物中最差的。对于高于 15 µM 的所有浓度（图 14 I）和 21.71 µM 的 IC 50值（图14），苄托品治疗显着降低了 MCF-7 乳腺癌细胞活力J)。只有以高于 25 µM 的剂量使用拉曲吡定处理 48 小时对细胞活力有显着影响（图 14 K），导致 IC 50值超过 70 µM（图 14 L）。 图 14. 一些 CNS 药物对 MCF-7 细胞的影响。( A ) 氟西汀对细胞活力的影响和 ( B ) 剂量反应曲线。( C )舍曲林对细胞活力和( D )剂量反应曲线的影响。（E）硫利达嗪对细胞活力的影响和（F）剂量反应曲线。（G）氟奋乃静对细胞活力的影响和（H）剂量反应曲线。( I ) 苯托品对细胞活力的影响和 ( J ) 剂量反应曲线。( K ) latrepirdine 对细胞活力的影响和 ( L) 剂量反应曲线。在每种药物浓度增加的情况下培养细胞，48小时后，进行MTT测定以测量细胞活力。值以对照百分比表示，代表平均值±SEM。每个实验独立进行 3 次（n = 3）；* 在p < 0.05时与对照组相比具有统计学意义。** 在p < 0.01时与对照组相比具有统计学意义。**** 在p < 0.0001 时与对照组相比具有统计学意义。 这些结果表明，CNS 药物，例如氟西汀、舍曲林、苯托品、氟奋乃静和硫利达嗪，是与 PTX 联合使用的良好候选者。表 5显示了这些药物在两种细胞系（MCF-7 和 HT-29）中获得的 IC 50之间的比较。与之前的结果相比，可以验证 MCF-7 乳腺癌细胞获得的所有 IC 50值均高于 HT-29 结肠癌细胞获得的 IC 50 值，舍曲林除外，这表明单独使用这些药物的效力较低在乳腺癌细胞中。 表 5.几种 CNS 药物对 HT-29 和 MCF-7 癌细胞的 IC 50 比较。IC 50值作为平均值给出。 2.2.2。PTX和不同CNS药物的各种组合的效果 接下来，我们使用我们之前工作中开发的组合模型评估了 PTX 与每种药物的组合 [ 37 ]。这些药物组合中采用的 PTX的 IC 50值是在我们之前的工作中获得的 [ 37 ]。MCF-7细胞用两种药物单独或以固定比例组合处理，浓度分别为0.25×IC 50、0.5×IC 50、IC 50、2×IC 50和4×IC 50，并进行了两种基于细胞的测定：MTT 和 SRB。还对用每种药物单独和组合处理的细胞进行了形态学评估。评估了 PTX 加氟奋乃静、氟西汀、苯托品、硫利达嗪和舍曲林的组合。当与 PTX 联合使用时，氟西汀通过 MTT 和 SRB 测定显示出显着的抗癌作用（分别为图 15 A、B），主要在 2 × IC 50的浓度下，与单独的每种药物相比，联合作用具有统计学意义. 在所有浓度下，与舍曲林的组合导致细胞活力和细胞蛋白质合成的降低与单独的 PTX 相似。在 IC 50和 2 × IC 50的浓度下与单独的舍曲林相比，PTX加舍曲林的组合显示出显着的抗癌作用（图15 C，D）。在 IC 50和 2 × IC 50的浓度下，与两种药物单独相比，与 PTX 和硫利达嗪的组合显示出显着的抗癌作用（图 15 E、F）。与氟奋乃静的组合导致所有中间浓度显示出比单独使用氟奋乃静更大的抗癌作用（图15 G，H）。这些组合的活性可能是单独使用 PTX 的强抗癌活性的结果。与苯托品的组合导致在 IC 50浓度下细胞活力在统计学上显着降低和 2 × IC 50与单独的 PTX 相比（图 15 I，J），表明这种组合的活性可能是单独重新利用药物的结果，与之前的组合相反。总之，这些结果表明 CNS 药物和 PTX 在联合作用中可以具有不同的药理作用。形态学上，结果与 MTT 和 SRB 测定一致。在 4 × IC 50的浓度下，与对照细胞和 PTX 相比，所有组合都导致细胞数量减少，细胞更小更圆，这表明细胞死亡（图 16）。 图 15. 与 PTX 联合治疗 48 小时后 MCF-7 的生长抑制，通过 MTT（左）和 SRB 测定（右）。将细胞暴露于浓度为IC 50 0.25、0.5、1、2和4倍的每种药物，并通过MTT和SRB测定评估细胞活力。联合用药同时联合给药。( A ) PTX 加氟西汀对细胞活力和 ( B ) 细胞蛋白质合成的影响。( C ) PTX 加舍曲林对细胞活力和 ( D ) 细胞蛋白质合成的影响。( E ) PTX 加硫利达嗪对细胞活力的影响和 ( F) 细胞蛋白质合成。( G ) PTX 加氟奋乃静对细胞活力和 ( H ) 细胞蛋白质合成的影响。( I ) PTX 加苯托品对细胞活力和 ( J ) 细胞蛋白质合成的影响。值以对照百分比表示，代表平均值±SEM。每个实验独立进行 3 次（n = 3）；* 在p < 0.05时与对照组相比具有统计学意义。** 在p < 0.01时与对照组相比具有统计学意义。*** 与p < 0.001的对照相比具有统计学意义。**** 在p < 0.0001 时与对照组相比具有统计学意义。 图 16.与载体 ( A )、PTX ( B )、氟西汀 ( C )、氟西汀 + PTX ( D )、舍曲林 ( E )、舍曲林 + PTX ( F ) 孵育 48 小时后 MCF-7 细胞的显微细胞可视化、硫利达嗪 ( G )、硫利达嗪 + PTX ( H )、氟奋乃静 ( I ) 氟奋乃静 + PTX ( J )、苯托品 ( K ) 和苯托品 + PTX ( L )，每种药物的浓度为 4 × IC 50。比例尺：50 µm。 2.2.3。PTX 和 CNS 药物的协同组合 接下来，我们使用 CompuSyn 软件使用 Chou-Talalay 方法计算组合指数 (CI)。PTX加氟西汀的组合在最低浓度下与三个协同对（图17A）表现出协同作用，Fa值为0.1184、0.2472和0.3621（表6）。对于最低浓度，与舍曲林的组合仅产生一对协同作用(图17B )。PTX加硫利达嗪的组合对两对表现出协同作用（图17C），Fa值为0.1895和0.5027（表6）。与氟奋乃静和苯托品组合产生三对协同作用（分别为图 17 D、E），Fa 值低于 0.60（表 6）。总之，这些结果表明，这些 CNS 药物可能是在未来组合中评估的有希望的候选者。 这些药物相互作用也通过 Bliss Independence 方法使用 SynergyFinder 2.0 软件进行了评估。用 Bliss 模型分析的氟西汀与 PTX 的组合（图 18A）证明了最高的协同作用评分，与 Chou-Talalay 结果一致，表明三对的协同作用。舍曲林组合使用 Bliss 模型显示出协同作用，协同作用得分为 2.127（图18B ）。PTX与硫利达嗪的组合也导致使用Bliss方法(图18C)的协同作用，协同作用得分为2.938。PTX 加氟奋乃静和苯托品的组合使用 Bliss 方法产生的协同作用得分最低，得分为 0.569 和 -8.262（图 18D，E，分别）。 图 18. PTX 与氟西汀 ( A )、舍曲林 ( B )、硫利达嗪 ( C )、氟奋乃静 ( D ) 和苯托品 ( E ) 的 Bliss 协同作用图。 Bliss 方法的结果表明，与 Chou-Talalay 结果相比，药物组合的协同作用评估结果略有不同，尤其是氟奋乃静和苯托品组合。尽管如此，这些参考模型在大多数情况下都会产生类似的结果。 讨论 药物再利用和药物组合是多年来越来越流行的策略，代表了一种更快、更便宜的策略来识别癌症治疗的新潜在候选者。市场上已经有针对其他疾病的再利用药物，并且具有完善的药代动力学、药效学和毒理学特征，有助于它们获得新适应症的批准。药物的组合允许减少治疗剂量，减少药物的副作用。几项研究已经探索了抗肿瘤药物与其他药物类别的组合，但很少有研究报告中枢神经系统药物对癌症治疗的益处，无论是单独的还是联合的。5-FU是治疗CRC的重要药物，但其使用受限于其短半衰期，高细胞毒性和低生物利用度限制了其益处。PTX是一种常用于治疗乳腺癌的抗肿瘤药物，但其最大治疗剂量受到耐药性和副作用的限制。为了克服这些问题，需要更高剂量和长期使用这些抗肿瘤药物，这会增加其副作用。目前的研究旨在减少化疗药物的剂量和暴露时间。最近的研究已经研究了可以与 5-FU 或 PTX 协同作用的新药，但据我们所知，没有人探索中枢神经系统药物与 5-FU 或 PTX 联合用于 CRC 或乳腺癌治疗。但其最大治疗剂量受到耐药性及其副作用的限制。为了克服这些问题，需要更高剂量和长期使用这些抗肿瘤药物，这会增加其副作用。目前的研究旨在减少化疗药物的剂量和暴露时间。最近的研究已经研究了可以与 5-FU 或 PTX 协同作用的新药，但据我们所知，没有人探索中枢神经系统药物与 5-FU 或 PTX 联合用于 CRC 或乳腺癌治疗。但其最大治疗剂量受到耐药性及其副作用的限制。为了克服这些问题，需要更高剂量和长期使用这些抗肿瘤药物，这会增加其副作用。目前的研究旨在减少化疗药物的剂量和暴露时间。最近的研究已经研究了可以与 5-FU 或 PTX 协同作用的新药，但据我们所知，没有人探索中枢神经系统药物与 5-FU 或 PTX 联合用于 CRC 或乳腺癌治疗。 我们研究了不同 CNS 药物在 HT-29 结肠和 MCF-7 乳腺癌细胞中的潜在抗癌活性，并评估了此类药物与 5-FU 或 PTX（用于 CRC 和乳腺癌治疗的抗肿瘤药物）的潜在协同作用，分别。首先，通过 MTT 法筛选了几种用于治疗 HT-29 和 MCF-7 细胞的 CNS 药物，以评估它们作为再利用药物的潜力。除了中枢神经系统药物外，我们还在本研究中根据我们之前在 MCF-7 细胞中的结果评估了三种抗疟疾药物（氯喹、青蒿琥酯和甲氟喹），以评估它们的抗癌行为是否在不同的细胞系 (HT-29) 中保持。在使用 MTT 进行评估后，确定了每种药物的IC 50以及具有 IC 50的药物根据细胞类型，选择低于 20 µM 与 5-FU 或 PTX 组合。我们采用了我们之前描述的组合模型，其中使用 MTT 和 SRB 测定法单独或联合使用每种药物的 IC 50的 0.25、0.5、1、2 和 4 倍的浓度处理细胞。我们接下来通过三种不同的方法评估协同作用：Chou-Talalay、Bliss（用于 HT-29 和 MCF-7 细胞）和 HSA（仅用于 HT-29 细胞）。Chou-Talalay 方法基于中值效应方程，源自质量作用定律原理。这个统一的理论涵盖了生物化学和生物物理学中的 Michaelis-Menten、Hill、Henderson-Hasselbalch 和 Scatchard 方程，并为药物中的加性效应 (CI = 1)、协同作用 (CI < 1) 和拮抗作用 (CI > 1) 提供了定量定义组合 [58 ]。Bliss独立模型采用两种药物独立产生作用的随机过程，可以根据独立事件发生的概率计算出预期的联合作用[ 57 ]。HSA 模型是协同作用评估最简单的参考模型之一，并指出预期的联合效应是相应浓度下单一药物反应的最大值。药物组合的协同作用得分是所有剂量组合测量值的平均值，给出正值或负值，分别对应于协同作用或拮抗作用。2D 和 3D 协同图分别以红色和绿色突出显示协同和拮抗剂量区域。 我们的研究结果表明，作为单一药物的 CNS 药物能够在两种细胞系中以浓度依赖性方式降低细胞活力。在 HT-29 结肠癌细胞中，最有希望的药物是拉曲吡定、氟奋乃静、氟西汀、苯托品、硫利达嗪、舍曲林、甲氟喹和青蒿琥酯，它们的 IC 50值均低于 20 µM，其中氟奋乃静最有效，IC 50为 1.86微米。对于 MCF-7 乳腺癌细胞，我们发现这些药物效力较低，IC 50值高于结肠癌细胞，但舍曲林除外，其 IC 50为 2.22 µM。 在同时组合中，我们发现舍曲林和硫利达嗪是提高 5-FU 在 HT-29 结肠癌细胞中抗癌活性的最有希望的候选药物。对于 MCF-7 细胞，几乎所有测试的组合都产生协同作用对，浓度最低。与使用改用药物或 PTX 进行单一治疗相比，氟西汀和硫利达嗪等药物与 PTX 联合使用会导致 MCF-7 细胞活力的降低。与 HT-29 细胞相比，CNS 药物与 PTX 在 MCF-7 中的组合显示出比 5-FU 更多的协同相互作用，除了舍曲林。奇怪的是，当单独在 MCF-7 中进行测试时，舍曲林是最有效的再利用药物，但它与 PTX 的组合只产生了一对协同作用。共， 特别是对于 HT-29 细胞中的氟奋乃静、氟西汀、苯托品和青蒿琥酯，我们发现这些药物与 5-FU 的组合导致比单独使用再利用药物的结果更差，可能是由于两种药物之间的竞争，因此我们设计了基于两种药物顺序添加的药物组合模型，间隔为24小时。对于大多数药物，我们没有发现药物时间表之间的显着差异，除了青蒿琥酯，我们发现青蒿琥酯在 5-FU 给药之前导致抗癌作用增强。对于氟奋乃静、氟西汀和苯托品，我们发现这些药物单独作用比联合作用更好，是药物再利用的理想候选者。这些结果首次表明，CNS 药物可能是结肠癌和乳腺癌治疗中药物再利用的潜在候选者。我们发现，当与 PTX 联合使用时，所有测试的 CNS 药物都可以协同降低 MCF-7 细胞活力，氟西汀、苯托品和氟奋乃静是低浓度下最有希望的药物。我们还得出结论，舍曲林和硫利达嗪与 5-FU 联合使用可以协同降低 HT-29 结肠癌细胞中的癌症活力。我们证明青蒿琥酯是一种抗疟疾药物，在这些细胞中具有抗癌潜力，并且如果在 5-FU 之前按顺序给药，则与 5-FU 的组合是有益的。苯托品和氟奋乃静是最有希望的低浓度药物。我们还得出结论，舍曲林和硫利达嗪与 5-FU 联合使用可以协同降低 HT-29 结肠癌细胞中的癌症活力。我们证明青蒿琥酯是一种抗疟疾药物，在这些细胞中具有抗癌潜力，并且如果在 5-FU 之前按顺序给药，则与 5-FU 的组合是有益的。苯托品和氟奋乃静是最有希望的低浓度药物。我们还得出结论，舍曲林和硫利达嗪与 5-FU 联合使用可以协同降低 HT-29 结肠癌细胞中的癌症活力。我们证明青蒿琥酯是一种抗疟疾药物，在这些细胞中具有抗癌潜力，并且如果在 5-FU 之前按顺序给药，则与 5-FU 的组合是有益的。 从机制上讲，几项研究表明，与 5-FU 联合治疗可协同诱导结肠癌细胞凋亡 [ 59 , 60 , 61 , 62 , 63 , 64 ]。尽管诱导细胞凋亡，但观察到的协同效应也可能是对自噬的综合影响的结果，自噬是细胞中响应压力条件（例如营养缺乏或蛋白质/DNA损伤）而发生的分解代谢过程，最终可能引发细胞死亡。事实上，在人类结肠癌细胞系和结直肠癌异种移植小鼠中，舍曲林通过丝裂原活化蛋白激酶级联激活和Bcl-2抑制表现出促凋亡活性 [ 65]。关于硫利达嗪，最近发现该药物显着抑制结肠癌干细胞的增殖和侵袭，并以浓度依赖性方式诱导细胞凋亡。发现治疗后Bax、caspase-3等凋亡基因过表达，抗凋亡基因Bcl-2下调。因此，这些细胞的线粒体电位被下调 [ 66]。基于这些文献发现，我们建议在我们的组合中同时发生细胞凋亡和自噬性细胞死亡。我们认为，5-FU 联合舍曲林和硫利达嗪主要增加了 HT-29 细胞中 caspase-3 酶和其他凋亡蛋白的浓度，导致细胞凋亡依赖性细胞死亡。在结肠细胞中 5-FU 和这些 CNS 药物联合治疗的情况下，这种自噬抑制和细胞凋亡诱导可被认为是协同作用的基础。 关于 MCF-7 结果，氟西汀、氟奋乃静和苯托品联合 PTX 是最有希望的组合。PTX 属于紫杉烷类药物，通过稳定微管来阻断细胞有丝分裂，导致细胞周期优先停滞在 G2/M 期和细胞凋亡 [ 67 ]。一些研究表明，作用于血清素 (5-HT) 信号传导的药物，包括选择性血清素再摄取抑制剂 (SSRIs)，可在体外和体内模型中抑制人乳腺肿瘤细胞中的肿瘤球形成 [ 68 ]。特别是，氟西汀被发现通过分别诱导细胞凋亡和自噬介导的细胞死亡或内质网应激和自噬来显着降低几种乳腺癌细胞系的增殖。68、69、70、71 ]。_ _ _ _ _ 在三阴性乳腺癌细胞中，氟奋乃静抑制乳腺癌细胞生长，诱导 G0/G1 细胞周期停滞，并诱导线粒体介导的乳腺癌细胞凋亡 [ 72 ]。在 MCF-7 细胞的情况下，由于它们不表达 caspase-3，它们不会发生正常的细胞凋亡，自噬可以代表主要的替代细胞死亡途径 [ 73 ]。最近的研究表明，苯托品降低了 MMP9 的致癌信号转导和反式激活因子的活性，包括 STAT3、NF- κ B 和 β-连环蛋白 [ 74]。我们认为 PTX 与 CNS 药物联合的协同作用机制可能与增强细胞周期停滞、干扰重要的致癌信号和增加自噬介导的细胞死亡有关。我们还认为，中枢神经系统药物可以通过减缓药物流出、增加药物积累来充当化学增敏剂。由于几种中枢神经系统药物是 P-糖蛋白 (P-gp) 蛋白的底物和调节剂 [ 75 , 76 , 77 ]，我们也相信它们可以抑制 P-gp 阻止药物从细胞内流出，从而增加细胞内抗癌药物的浓度PTX 等药物。 这些结果表明，中枢神经系统药物可能是有前景的化学增敏剂化合物，并分别增强 5-FU 和 PTX 在 HT-29 和 MCF-7 癌细胞中的细胞毒作用。由于这些药物已经在市场上销售，因此它们用于癌症治疗是可以实现的。由于不同的结肠癌细胞系代谢不同，具有特定的特征，因此应该对其他结肠癌细胞进行更多的研究，如HCT116、SW480、LoVo等。乳腺癌细胞也是如此，这些组合可以进一步在其他细胞系如肿瘤 MDA-MB-231 细胞或正常 MCF-10A 细胞中进行了探索。强烈建议进行更深入的机制研究来评估这些药物和这些组合的抗癌机制。这类药物也应该单独和联合用于其他类型的癌症，如胰腺癌、前列腺癌、肺癌等。这些都是有希望的结果，应该在动物模型和临床试验中进一步证实。我们的研究结果表明，单独或联合使用中枢神经系统和抗疟疾药物可能会为结肠癌和乳腺癌的治疗带来新的治疗策略。 四、材料与方法 4.1。材料 McCoy 的 5A 改良培养基、Dulbecco 改良的 Eagle 培养基 (DMEM)、胎牛血清 (FBS) 和青霉素-链霉素溶液购自 Millipore Sigma (Merck KGaA, Darmstadt, Germany)。其他细胞培养试剂购自 Gibco (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA)。5-FU（货号 F6627）、司来吉兰（货号 M003）、恩他卡朋（货号 SML0654）、托卡朋（货号 SML0150）、拉替匹定（货号 D6196）、氟奋乃静（货号. no. F4765)、safinamide (cat. no. SML0025)、carbidopa (cat. no. PHR1655)、东莨菪碱 (cat. no. S1013)、噻唑蓝四唑溴化物 (MTT, cat. no. M5655) 和 sulforhodamine B ( SRB, cat. no. S1402) 购自 Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, Germany)。苄托品（货号 16214）、硫利达嗪（货号 14400）、氟西汀（货号 14418）和青蒿琥酯（货号 11817) 购自 Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA)。Nepicastat（目录号 5037）和紫杉醇（目录号 1097）购自 Tocris Bioscience（英国布里斯托尔）。甲氟喹（货号 sc-211784）和氯喹（货号 C6628）购自 Santa Cruz Biotechnology（美国德克萨斯州达拉斯）。溴隐亭用于片剂，并在制备原液前用水稀释。 4.2. 细胞系和细胞培养 人结肠直肠癌 HT-29 和乳腺癌 MCF-7 细胞系获自美国典型培养物保藏中心（ATCC；马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国），并根据 ATCC 的建议在 37 °C 和 5% CO 2下维持在适当的培养基中添加 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素 G 和 100 µg/mL 链霉素。细胞始终保持在对数生长期。每 2 天更换一次培养基并用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 进行胰蛋白酶处理。将总共 200 µL HT-29 细胞（7500 个细胞/孔）或 MCF-7 细胞（5000 个细胞/孔）接种在 96 孔板中，并在药物暴露前使其粘附过夜。24 小时后，将细胞培养基更换为 200 µL 含药物培养基。将细胞暴露于药物 48 小时，然后进行 MTT 和 SRB 测定以评估这些细胞的细胞活力和蛋白质合成率的单一和联合药物治疗。 4.3. 药物治疗 首先在 HT-29 和 MCF-7 细胞中单独测定每种药物的半数最大抑制浓度 (IC 50 ) 值。单药治疗的药物浓度范围为 0.1 至 100 µM。通过根据每个细胞系将 5-FU 或 PTX（药物 A）与不同的再利用药物（药物 B）组合来进行组合研究。药物 A 对于 HT-29 细胞是 5-FU，对于 MCF-7 细胞是 PTX。按照时间表 A（图 11 ），仅对呈现最有希望的药理学特征（IC 50 < 20 µM）的药物与 5-FU 或 PTX 同时进行测试。药物 A 和药物 B 的浓度都是可变的，并且 IC 50的等效浓度（固定比率）的综合效应评估每种药物的值。氟西汀、氟奋乃静、苯托品和青蒿琥酯与 5-FU 的组合也在顺序给药方案中进行了测试（附表 B 和 C，图 11）。对于时间表 A，细胞同时用 5-FU 或 PTX 处理，每种重新利用的药物持续 48 小时。对于方案 B，细胞用 5-FU 预处理 24 小时，然后每种重新利用的药物 24 小时。对于计划 C，细胞用每种重新利用的药物预处理 24 小时，然后用 5-FU 再处理 24 小时。 4.4. 细胞活力测定 为了分别确定 5-FU 或 PTX 和改用药物对 HT-29 和 MCF-7 细胞活力的影响，使用了 MTT 和 SRB 测定。对于 MTT 方案，在药物处理后，去除细胞培养基并添加 100 µL/孔的 MTT 溶液（0.5 mg/mL 在 PBS 中）。将细胞孵育3小时，避光。此后，除去 MTT 溶液，加入 DMSO (100 µL/孔) 以溶解甲臜晶体。在自动酶标仪（Tecan Infinite M200，Tecan Group Ltd.，Männedorf，Switzerland）中在 570 nm 处测量吸光度。对于 SRB 测定，处理后，培养的细胞用冰冷的 10% 三氯乙酸固定 30 分钟，并在室温下用 0.4% SRB 染色 1 小时。通过用自来水冲洗数次去除多余的染料。用 200 µL 10 mM Tris 碱溶液溶解蛋白质结合染料，用滤光片波长为 540 nm 的酶标仪（Tecan Infinite M200，Tecan Group Ltd.，Männedorf，Switzerland）测定吸光度。集成电路50的治疗药物被确定为每种药物浓度与对照相比显示出 50% 的细胞生长抑制。所有条件均独立进行三次，一式三份。 4.5. 细胞形态可视化 每次处理后，在配备 Leica DFC350 FX 相机的 Leica DMI 6000B 显微镜上评估细胞形态，然后使用 Leica LAS X 成像软件 (v3.7.4) 进行分析。 4.6. 数据分析 GraphPad Prism 8 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) 用于通过非线性回归分析生成浓度响应曲线。将用每种药物处理的细胞的活力标准化为对照细胞的活力，并以对数标度绘制细胞活力分数与药物浓度的关系。 4.7. 药物相互作用分析 为了量化 5-FU 和 CNS 药物之间的药物相互作用，我们首先使用 CompuSyn 软件（ComboSyn, Inc., New York, NY, USA）。我们使用互斥模型，假设药物通过完全不同的机制发挥作用 [ 78 ]。两种药物以对应于单个IC 50值的0.25、0.5、1、2和4倍的固定剂量比例组合。CI 绘制在y轴上，作为x上效应水平 (Fa) 的函数轴来评估药物组合之间的药物协同作用。CI 是药理相互作用的定量表示。CI < 1 表示协同作用，CI = 1 表示加性相互作用，CI > 1 表示拮抗作用。我们还使用 SynergyFinder [ 57 ]基于最高单剂 (HSA) 和 Bliss 参考模型估计了预期的药物组合反应。具有正值和负值的观察到的和预期的响应之间的偏差分别表示协同作用和拮抗作用。 4.8. 统计分析 结果表示为进行的 n 次实验的平均值 ± SEM。所有数据均在三个独立的经验中进行分析，一式三份。在同一时间点，对照组和治疗组之间的统计比较采用学生t检验和单因素方差分析检验。在p值 < 0.05时接受统计显着性。 作者贡献 概念化，内华达州；方法论、DD、AC 和 NV；软件，DD；验证、AC 和 NV；形式分析、DD、AC 和 NV；调查、DD、AC 和 NV；资源、AC 和 NV；数据管理，DD；写作——原稿准备，DD；写作——评论和编辑，AC 和 NV；可视化、AC 和 NV；监督，内华达州；项目管理，内华达州；资金收购、AC 和 NV 所有作者都已阅读并同意手稿的出版版本。 资金 本研究由 FEDER- Fundo Europeu de Desenvolvimento 区域基金通过 COMPETE 2020-竞争力和国际化运营计划 (POCI) 和葡萄牙 2020 以及葡萄牙基金通过Fundação para a Ciência ea Tecnologia (FCT) 资助。项目 IF/00092/2014/CP1255/CT0004。 机构审查委员会声明 不适用。 知情同意声明 不适用。 数据可用性声明 不适用。 致谢 本文通过 FCT-Fundação para a Ciência ea Tecnologia, IP 获得国家基金的支持，隶属于 CINTESIS 研发部门（参考 UIDB/4255/2020）。DD 承认 FCT 资助她的博士奖学金 (SFRH/BD/140734/2018)。 利益冲突 作者宣称没有利益冲突。 参考 西格尔，RL；米勒，KD；福克斯，他；Jemal, A. 癌症统计，2021 年。CA Cancer J. 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by Shin-Sook Yoon 1,Hyuk-Woo Kwon 2,Jung-Hae Shin 3,Man Hee Rhee 3ORCID,Chang-Eun Park 1,4 andDong-Ha Lee 1,4,* 1.南首尔大学生物医学实验室科学系, 天安 31020, 韩国 2.远东大学生物医学实验室科学系, 阴城 27601, 韩国 3.国立庆北大学兽医学院兽医系, 大邱 41566, 韩国 4.南首尔大学分子诊断研究所, 天安 31020, 韩国 学术编辑：Ángel García 和 Alice Pollitt 诠释。J.摩尔。科学。 2022 年，23 (3)，1586；https://doi.org/10.3390/ijms23031586 收稿日期：2021 年 12 月 23 日 / 修订日期：2022 年 1 月 26 日 / 接受：2022 年 1 月 27 日 / 发布时间：2022 年 1 月 29 日 （这篇文章属于特刊血小板在人类健康和疾病中的作用） 一、简介 在世界范围内，最普遍的死亡原因是心血管疾病 (CVD)。美国报告说，七分之一的死亡是由于冠心病，九分之一的死亡是由于心力衰竭[ 1 ]。血小板的作用是在血管损伤后维持止血和防止失血的血栓形成中发挥重要作用。然而，血小板的过度活化和聚集是血栓形成的主要原因，导致心血管疾病，如冠状动脉疾病、动脉粥样硬化、心力衰竭和中风 [ 2 ]。 通过药物抑制血小板可显着降低血栓事件，而心血管疾病的治疗和预防则使用此类临床药物。不幸的是，这些药物可能会引起并发症和副作用，例如胃出血、再生障碍性贫血，甚至血小板减少症，通常会使益处最小化。因此，它们需要开发最小的预防或治疗替代方案 [ 3 ]。除了针对药物相关并发症、心血管疾病相关问题和血栓形成相关疾病的基于抗血小板药物的治疗方案外，由于天然生物活性化合物及其在医学上的应用，天然产物的使用引起了极大的兴趣治疗心血管疾病的防治[ 4]。同样，许多天然产品，例如来自地中海的传统饮食和药用植物，在预防（原发性和继发性）心血管疾病方面显示出抗血小板和心脏保护特性[ 5、6、7 ]。 抗血小板药物茶碱和维拉帕米通过增加环磷酸腺苷 (cAMP) 水平 [ 8 ] 来减少适当血小板聚集所需的 [Ca 2+ ] i量。此外，使用血管扩张剂（硝普钠和莫西多明）和 cGMP 磷酸二酯酶（PDE）抑制剂（扎普司特和 erythro-9-（2-羟基-3-壬基）腺嘌呤）会增加血小板中的环磷酸鸟苷（cGMP）水平。9 ]。前列腺素 I 2一氧化氮在正常血液循环过程中从血管内皮细胞中释放出来，导致血小板产生cAMP和cGMP。增加 cAMP 和 cGMP 水平分别导致蛋白激酶 A (PKA) 和蛋白激酶 G (PKG) 激活。已知 PKG 和 PKA 会引起底物蛋白血管扩张剂刺激的磷蛋白 (VASP) 和肌醇 1、4、5-三磷酸受体 (IP 3 R) [ 10 ] 的磷酸化。IP 3 R的磷酸化通过使 IP 3 R 失活来抑制 Ca 2+从致密管状系统募集到细胞质中[ 11]。在血小板中，VASP 是 PKG 和 PKA 的主要底物，有助于调节 αIIb/β3 活化和肌动蛋白丝的活性。当 cGMP 依赖性 VASP Ser239 和 cAMP 依赖性 VASP Ser157 被磷酸化时，αIIb/β 3的激活和肌动蛋白丝的伸长被抑制 [ 12 , 13 ]。因此，IP 3 R 一旦被磷酸化，就可以证实抑制 Ca 2+动员的抗血小板作用，而磷酸化的 VASP 通过抑制 αIIb/β 3来抑制血小板活性。 此外，通过颗粒分泌释放的 ATP 和 5-羟色胺等物质在血小板聚集中很重要，并且已知参与磷蛋白的磷酸化，例如丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 和 PI3K/Akt [ 14 ]。磷酸化酶 MAPK 称为 p38 MAPK、c-Jun N 末端激酶 (JNK) 和细胞外信号调节激酶 (ERK)。在止血和血栓形成中，MAPK 的作用已被彻底研究，并且已知它们在细胞内信号传导中起作用 [ 15 ]。据报道，MAPK 与多种激动剂发生反应并通过被磷酸化显示出活性，它通常存在于人类血小板中[ 16、17、18]。这种信号转导分子一旦被磷酸化，就被公认为在刺激血小板颗粒分泌中起着至关重要的作用 [ 19 , 20 ]。此外，已知 MAPK可使细胞膜中的cPLA 2磷酸化，然后导致 TXA 2增加，从而导致血小板进一步活化和聚集 [ 21 , 22 ]。此外，PI3K/Akt 通路已被证明有助于血小板功能调节，包括血小板中致密颗粒分泌和整体血小板聚集等行为 [ 23 ]。因此，抑制磷酸化的 PI3K/Akt 有助于评估具有抗血小板作用的物质或成分。 青蒿琥酯是青蒿素主要活性成分中青蒿素的半合成衍生物，是一种具有低毒耐受性的新型抗疟药[ 24 ]。此外，青蒿琥酯显示出抗肿瘤活性，并在临床实践中成功用于治疗转移性黑色素瘤患者[ 24 ]。早期的研究表明，青蒿琥酯可增加细胞内氧自由基的产生，并干预核因子 (NF)-κB- 和磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸 3-激酶/Akt 介导的信号通路，对 DNA 产生损伤，并且它具有据报道会干扰细胞周期调节和转移 [ 25 , 26]。据报道，青蒿琥酯可通过显着减少中风（脑梗塞）的数量和促进神经功能恢复来提高患者的生存率 [ 27 ]。据报道，青蒿琥酯降低了COX-2抑制人胃癌细胞生长和诱导细胞凋亡的能力。COX-2 是一种功能和形式与 COX-1 相似的同工酶，其作用是在血小板代谢中产生 TXA 2 。事实上，广泛用作抗血小板药物的阿司匹林等非甾体抗炎药具有抑制 COX-1 和 COX-2 的功能 [ 28 ]。此外，据报道，青蒿琥酯的类似物青蒿素可抑制炎症，同时还可抑制 MAPK 通路 [ 29]。MAPK 活性的抑制是抗血小板物质的特征，因为它与血小板分泌的抑制有关 [ 30 ]。 目前，青蒿琥酯在血小板活化和血小板聚集过程中的作用和机制仍有待发现。为了了解青蒿琥酯的抗血小板作用，我们通过通过调节 PI3K/Akt 和 MAPK 来检查循环核苷酸的调节，研究了青蒿琥酯对钙动员和颗粒分泌的影响。此外，我们探讨了青蒿琥酯是否最终参与血小板聚集和血栓形成。如果青蒿琥酯被证明是有效的抗血小板药物，则建议青蒿琥酯可用于预防血栓形成相关的 CVD。 结果 2.1。青蒿琥酯对 U46619 诱导的血小板聚集的影响 U46619（一种诱导血小板聚集的 TXA 2类似物）的最大聚集诱导浓度为0.5 µM，本实验中使用 0.5 µM U46619 诱导聚集（图1A）。将血小板与 0.5 µM U46619 和 0.1% DMSO 混合后，为了开始聚集，聚集率达到 80.5 ± 2.1%（载体对照），这与没有 0.1% DMSO 时诱导聚集的结果没有显着差异。当添加不同浓度的青蒿琥酯（50 至 200 μM）时，未观察到细胞毒性（数据未显示）。结果表明，青蒿琥酯抑制了聚集（图1B）。此时青蒿琥酯的半数最大抑制浓度（IC50）为105.26 μM（图1C)。作为阳性对照，将抗血小板物质替格瑞洛（10 μM）与血小板聚集抑制作用进行比较（图1B）。我们证实，即使在胶原蛋白和花生四烯酸诱导聚集时，青蒿琥酯也具有抑制作用（图 1B）。然而，它们对青蒿琥酯的抑制作用弱于U46619诱导的抑制作用。无论如何，这些结果表明青蒿琥酯具有有效的血小板聚集抑制作用。 图 1. 青蒿琥酯对 U46619 诱导的血小板聚集的影响。( A ) U46619 对人血小板聚集的阈值剂量。( B ) 青蒿琥酯对血小板聚集的影响。( C )青蒿琥酯对U46619诱导的血小板聚集的IC 50值。结果显示为平均值 ± SD ( n = 4)。* p < 0.05，** p < 0.001 与 U46619 诱导的车辆控制相比。 2.2. 青蒿琥酯对环状核苷酸产生的影响 确定了青蒿琥酯对 cGMP 或 cAMP 产生的影响，已知其在血小板活化中具有拮抗作用。结果，如图 2A 所示，青蒿琥酯显着增加了 cAMP 的产量，从 4.23 ± 0.16 pmoL/10 8个细胞增加到 9.38 ± 0.42 pmoL/10 8个细胞。此外，青蒿琥酯没有显着增加 cGMP 产量（图2B ）。这些结果表明青蒿琥酯通过显着增加 cAMP 的产生而不是 cGMP 的产生来抑制血小板活化。 图 2. 青蒿琥酯对环核苷酸产生的影响。（一）青蒿琥酯对 cAMP 产生的影响。( B ) 青蒿琥酯对 cGMP 生产的影响。悬浮的血小板（10 8个细胞/mL）在 37 °C 下孵育，同时加入不同浓度的青蒿琥酯，然后加入 2 mM CaCl 2和 U46619 (0.5 μM) 进行刺激，持续时间为 5 分钟。通过添加 1 M HCl 终止反应，并用 cAMP 或 cGMP EIA 试剂盒测量 cGMP/cAMP。结果显示为平均值 ± SD ( n = 4)。* p < 0.05, ** p < 0.001 与 U46619 诱导的血小板相比。 2.3. 青蒿琥酯对细胞内 Ca 2+动员和 IP3R 磷酸化的影响 由于已知细胞内 Ca 2+动员（[Ca 2+ ] i）对血小板活化很重要，因此本研究证实了青蒿琥酯对 [Ca 2+ ] i的影响。图 3 A 显示 U46619 将 [Ca 2+ ] i水平从 100.3 ± 0.5 nM 增加到 611.3 ± 29.4 nM。然而，青蒿琥酯 (50200 μM) 显着降低了由 U46619 增加的[Ca 2+ ] i (图 3 A)。然而，青蒿琥酯（50200 μM）显着降低了 U46619 增加的 [Ca 2+ ]i（图 3 A）。此外，这项研究证实了青蒿琥酯对 IP 的影响3 R 磷酸化，一种调节 [Ca 2+ ] i的蛋白质。如图3B所示，青蒿琥酯 (50200 μM) 浓度依赖性地增加U46619 诱导的血小板中的IP 3 R 磷酸化。其意义是显而易见的，并在浓度高于 100 μM 时得到证实。这表明青蒿琥酯减少细胞内Ca 2+募集是由于IP 3 R 磷酸化。 图 3. 青蒿琥酯对细胞内 Ca 2+动员和 IP 3 R 磷酸化的影响。( A )青蒿琥酯对细胞内Ca 2+动员的影响。( B ) 青蒿琥酯对 IP 3 R 磷酸化的影响。在 37 °C 下，用 Fura 2-AM (5 μM) 孵育 PRP 60 分钟，并通过上述步骤制备悬浮血小板 (10 8个细胞/mL)。洗涤的血小板在 37 °C 下用 2 mM CaCl 2和 U46619 (0.5 μM) 刺激孵育 3 分钟，持续 5 分钟。BioTeck Instrument 的分光荧光计测量了 Fura 2 荧光。结果显示为平均值 ± SD (n = 4)。a p < 0.05 与未刺激的血小板相比，* p < 0.05，** p < 0.001 与 U46619 诱导的血小板相比。 2.4. 青蒿琥酯对 VASP 磷酸化和纤维蛋白原结合的影响 由于青蒿琥酯增加了 U46619 诱导的血小板中 cAMP 的产生（图 3），我们检测了青蒿琥酯对 U46619 诱导的血小板中 cGMP 依赖性 VASP Ser239 和 cAMP 依赖性 VASP Ser157 磷酸化的影响。如图 4所示，青蒿琥酯显着增加了 VASP Ser157，但 VASP Ser239 没有。特别是，结果证实，在 100 μM 或更高时，显着性很明显，这表明青蒿琥酯增加的 cAMP 产生显着增加了 VASP Ser157 磷酸化。 图 4. 青蒿琥酯对 VASP 磷酸化的影响。使用 1× 裂解缓冲液终止反应。BCA 蛋白试剂盒测量血小板裂解物中的蛋白浓度。将来自 4-20% SDS-PAGE 的分离蛋白（20 μg）转移到 PVDF 膜上。一抗以 1:1000 的稀释倍数处理，二抗以 1:2000 的稀释倍数处理。结果显示为平均值 ± SD ( n = 4)。a p < 0.05 与未刺激的血小板相比，* p < 0.05，** p < 0.001 与 U46619 诱导的血小板相比。 由于青蒿琥酯通过增加 cAMP 的产生而增加了 VASP Ser157 磷酸化，本研究证实了青蒿琥酯对纤维蛋白原与 αIIb/β 3结合率的影响。查看图 5 A，M1 是指显示高于标准荧光的细胞部分，是指与纤维蛋白原结合的细胞。U46619 将纤维蛋白原与 αIIb/β 3的结合增加至 77.1 ± 1.1%（图 5 A(b)、B)。然而，青蒿琥酯对纤维蛋白原结合的抑制以浓度依赖性方式得到证实。此外，青蒿琥酯（200 μM）的确认抑制率为75.4%（图5 A（f），B）。 图 5. 青蒿琥酯对纤维蛋白原结合的影响。( A ) 流式细胞仪对纤维蛋白原结合的直方图。( a ) 完整的血小板（基础）；( b ) U46619 (0.5 μM)；( c ) U46619 (0.5 μM) + 青蒿琥酯 (50 μM)；( d ) U46619 (0.5 μM) + 青蒿琥酯 (100 μM)；( e ) U46619 (0.5 μM) + 青蒿琥酯 (200 μM)；( f ) U46619 (0.5 μM) + 青蒿琥酯 (300 μM)。( B ) 青蒿琥酯对 U46619 诱导的纤维蛋白原结合 (%) 的影响。通过向悬浮的血小板 ( 10 8细胞/mL)，U46619 (0.5 μM) 用于刺激持续时间为 5 分钟。加入含有 0.5% 多聚甲醛的磷酸盐缓冲盐水 (PBS, pH 7.4) 后，终止反应。在此过程中使用光阻，流式细胞仪 (FACS) 测量纤维蛋白原结合。结果显示为平均值 ± SD ( n = 4)。a p < 0.05 与未刺激的血小板相比，* p < 0.05，** p < 0.001 与 U46619 诱导的血小板相比。 2.5. 青蒿琥酯对TXA 2产生和颗粒分泌的影响 青蒿琥酯对 TXA 2产生的影响得到了证实，TXA 2 是一种放大血小板聚集的自体物质。如图 6A所示，TXA 2产量（在完整细胞中为 2.97 ± 0.81 ng/10 8个细胞）被 U46619增加到 48.93 ± 5.41 ng/10 8个细胞。然而，青蒿琥酯（50、100、150 和 200 μM）将 TXA 2产量分别显着降低至 39.44 ± 1.28、22.30 ± 6.20、13.90 ± 0.89 和 10.70 ± 2.89 ng/10 8个细胞（图 6A）。 图 6. 青蒿琥酯对 TXA 2产生和颗粒分泌的影响。( A ) 青蒿琥酯对 TXA 2产生的影响。（乙）青蒿琥酯对 ATP 释放的影响。( C ) 青蒿琥酯对血清素释放的影响。3 分钟，悬浮血小板（10 8个细胞/mL）在 37° 下以不同的青蒿琥酯浓度孵育，然后将 2 mM CaCl 2添加到 U46619（0.5 μM）中以刺激持续时间为 5 分钟。一旦反应停止，通过每个 EIA 试剂盒测量 TXA 2和颗粒分泌物。结果显示为平均值 ± SD ( n = 4)。一个 _< 0.05 与未刺激的血小板相比，* p < 0.05，** p < 0.001 与 U46619 诱导的血小板相比。 青蒿琥酯对与血小板聚集有关的 ATP 和血清素释放的影响已被证实为血小板颗粒释放的指标。结果，U46619 (0.5 μM) 将 ATP 释放从完整细胞中的 0.16 ± 0.02 μM 增加到 7.81 ± 0.15 μM（图 6 B）；然而，增加的 ATP 释放被青蒿琥酯（50、100、150 和 200 μM）显着抑制。此外，U46619 (0.5 μM) 将血清素释放量从完整细胞中的 8.65 ± 0.58 ng/10 8个细胞增加到 150.36 ± 1.30 ng/10 8个细胞。然而，青蒿琥酯（50、100、150 和 200 μM）减少了由 U46619 增加的 5-羟色胺的释放，分别为 139.70 ± 3.63、111.87 ± 12.94、95.39 ± 2.90 和 35.66 ± 3.57 ng/10 8个细胞（图 6C）。这些结果表明青蒿琥酯显着抑制颗粒分泌。由于已知 ATP 和 5-羟色胺在致密颗粒中含量丰富，因此可以预期青蒿琥酯与致密颗粒中的脱颗粒有关。然而，仅从这项研究的结果很难清楚地解释青蒿琥酯是否还参与了 α 颗粒的脱颗粒。 2.6. 青蒿琥酯对 PI3K/Akt 和 MAPK 磷酸化的影响 青蒿琥酯对 PI3K/Akt 磷酸化（一种参与血小板颗粒释放的磷蛋白）的影响已得到证实。如图 7A 所示，与完整细胞相比，U46619 显着增加了 PI3K 和 Akt 磷酸化。然而，U46619 增加的 PI3K/Akt 磷酸化被青蒿琥酯显着降低（图 7A），表明青蒿琥酯抑制了由 U46619 引起的 PI3K/Akt 磷酸化。 图 7. 青蒿琥酯对 PI3K/Akt 和 MAPK 磷酸化的影响。( A ) 青蒿琥酯对 PI3K/Akt 磷酸化的影响。( B )青蒿琥酯对MAPK磷酸化的影响。使用 1× 裂解缓冲液终止反应。BCA 蛋白试剂盒测量血小板裂解物中的蛋白浓度。通过 4-20% SDS-PAGE 分离的蛋白质（20 μg）被转移到 PVDF 膜上。一抗以 1:1000 的稀释倍数处理，二抗以 1:2000 的稀释倍数处理。结果显示为平均值 ± SD ( n = 4)。a p < 0.05 与未受刺激的血小板相比，* p < 0.05，** p< 0.001 与 U46619 诱导的血小板相比。 确定了青蒿琥酯对 MAPK (p38, ERK, JNK) 磷酸化的影响，涉及血小板中颗粒的释放和 TXA 2的产生。如图7B 所示，与完整细胞相比，U46619 显着增加了 p38 磷酸化，但 ERK 和 JNK 磷酸化未受到显着影响。此外，青蒿琥酯显着抑制 JNK 和 p38 磷酸化（图7B）。这表明，通过抑制 p38 和 JNK (MAPK) 磷酸化，血小板聚集的信号传导过程受到青蒿琥酯的调节。 2.7. 青蒿琥酯对血小板介导的纤维蛋白凝块收缩的影响 血小板活化和聚集通过血小板诱导剂发生，随着时间的推移，通过外部途径的信号转导导致纤维蛋白凝块的形成。因此，本研究调查了青蒿琥酯通过凝血酶诱导对血小板介导的纤维蛋白凝块收缩的影响。如图 8A 所示，凝血酶强烈形成纤维蛋白凝块，青蒿琥酯（50、100 和 200 μM）浓度依赖性地抑制凝血酶诱导的纤维蛋白凝块收缩。青蒿琥酯（50、100 和 200 μM）的抑制率分别确认为 11.7%、37.8% 和 58.8%（图8B ）。这些结果表明青蒿琥酯实际上可以抑制血栓形成。 图 8. 青蒿琥酯对血小板介导的纤维蛋白凝块收缩的影响。( A ) 青蒿琥酯对凝血酶收缩的纤维蛋白凝块照片的影响。( B ) 青蒿琥酯对凝血酶收缩的纤维蛋白凝块面积的影响。为避免粘连，聚乙烯管含有 PRP (500 μL)，并在 37 °C 的温度和 15 分钟的时间通过凝血酶 (0.05 U/mL) 和 2 mM CaCl 2进一步刺激。然后数码相机拍摄了血小板介导的纤维蛋白凝块的照片。结果显示为平均值 ± SD ( n = 4)。a p < 0.05 与未刺激的血小板相比，* p < 0.05，** p < 0.001 与凝血酶诱导的血小板相比。 讨论 在血小板膜上，磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸 (PIP 2 ) 被磷脂酶 C-γ 2 (PLC -γ 2 ) 水解，产生二酰基甘油 (DG) 和肌醇 1,4,5-三磷酸 (IP 3 )。来自 PIP 2降解的 IP 3导致细胞内 Ca 2+动员 ([Ca 2+ ] i ) 从致密管状系统进入胞质溶胶，并被 DG 依赖性蛋白激酶 C (PKC) [ 31 ] 激活。[Ca 2+ ] i的增加导致肌球蛋白轻链和 pleckstrin (Ca 2+/钙调蛋白依赖性蛋白）在血小板聚集过程中被磷酸化 [ 32 ]。 具有相反作用的环核苷酸（cGMP 和 CAMP）显示出通过 cGMP 依赖性蛋白激酶 (PKG) 和 cAMP 依赖性蛋白激酶 (PKA)降低 [Ca 2+ ] i和抑制血小板聚集的能力 [ 33 ]。在这项研究中，青蒿琥酯显着增加血小板中 cAMP 的产生并引起 [Ca 2+ ] i抑制。结果表明，青蒿琥酯增加的 cAMP 通过下调 [Ca 2+ ] i在血小板活化抑制中起重要作用。. 当 cAMP 增加时，通过 PKA 激活磷酸化多种底物，更具体地说，已知会影响肌醇 1,4,5-三磷酸受体 (IP 3 R) [ 10 ] 的磷酸化。如图 3 B所示，青蒿琥酯增加了 IP 3 R的浓度依赖性磷酸化。这意味着青蒿琥酯对 PKA 的激活导致了 IP 3 R 的磷酸化，从而导致抑制 Ca 2+通道开放（位于密集的管状系统），从而减少 [Ca 2+ ] i. 此外，青蒿琥酯产生的 cAMP 增加导致血管扩张剂刺激的磷蛋白 (VASP) 通过激活 PKA 被磷酸化。VASP 是 cAMP/cGMP 依赖性激酶 (PKA/PKG) 的重要底物，通过调节粘附特性和血小板分泌来帮助调节血小板活化，而 VASP 磷酸化已显示通过抑制整合素的活化来抑制血小板的聚集αIIb/β 3 [ 34 , 35 ]。 在这项研究中，青蒿琥酯强烈抑制U46619 诱导的血小板中纤维蛋白原与 αIIb/β3 的结合。据认为，青蒿琥酯增加的 cAMP 产生导致 PKA 和磷酸化 PKA 依赖性 VASP Ser157 的激活，这导致纤维蛋白原与 αIIb/β 3的结合受到抑制。未来，需要进一步研究青蒿琥酯导致 cAMP 产量增加的机制。已知 cAMP 和 cGMP 依赖于腺苷酸环化酶/鸟苷酸环化酶或环核苷酸磷酸二酯酶 (PDE) 激活 [ 36]。由于 PDE 活性抑制导致血小板聚集过程中环核苷酸水平增加，因此 PDE 抑制剂已被证明对血栓形成具有治疗作用 [ 37 ]。事实上，PDE 抑制剂（西洛他唑、双嘧达莫和三鲁沙）已作为抗血小板药物在临床上增加环核苷酸的产生 [ 9 ]。人们认为青蒿琥酯可以开发为具有类似功能的抗血小板药物。 此外，PI3K/Akt 的通路在血小板被激活时在细胞内信号传导过程中起作用的磷蛋白中被注意到，它们的磷酸化在血小板功能调节过程中起主要作用，例如血小板聚集和致密颗粒分泌 [ 23 ]。此外，丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 是众所周知的磷蛋白，包括 p38 MAPK、c-Jun N-末端激酶 (JNK) 和细胞外信号调节激酶 (ERK)，并参与活化和聚集血小板 [ 22 ]。在人血小板中发现，MAPK 在激动剂激活的血小板后通过磷酸化被激活 [ 17 , 18]。根据 Mei-Chi 等人的说法，磷酸化 MAPK（如 p38）对于花生四烯酸释放（TXA 2 的前体）和 TXA 2生成至关重要，这会导致血小板聚集 [ 38 ]。对评估参与抑制血小板活性的物质或成分很重要的一个指标是 TXA 2的生成，因为它能够充当强大的自体物质，导致额外的血小板活化和聚集。因此，抑制 TXA 2产生的物质，例如奥扎格雷或阿司匹林，是一种有用的抗血小板化合物 [ 19 , 38 ]。 在这项研究中，青蒿琥酯对某些激动剂（U46619、胶原蛋白、花生四烯酸）特别是 U46619 诱导的血小板聚集显示出显着的浓度依赖性抑制作用。特别是，在 U46619 诱导的聚集中，青蒿琥酯的 IC50 为 105.26 µM。然而，由于这是在处理洗涤过的血小板时获得的结果，因此在实际给药时需要解释多少是有限度的。此外，考虑到小鼠鼻内给予青蒿琥酯治疗疟疾的情况，可以看出 15 分钟内几乎全部被吸收并存在于血液中，但 15 分钟后减少了一半 [ 39]。事实上，当给予人类时，预计需要给予更高浓度的青蒿琥酯，考虑到青蒿琥酯的半衰期和活性都会因与血液中存在的血浆蛋白结合而降低. 然而，这项研究对于阐明青蒿琥酯发挥抗血小板作用的机制具有重要意义。测量了青蒿琥酯对 TXA 2产生和颗粒分泌（血清素和 ATP 释放）的影响，这些是血小板聚集的重要标志物。此外，我们试图阐明青蒿琥酯与 PI3K/Akt 和 MAPK 磷酸化的关系。结果，确定青蒿琥酯抑制了强烈增加的 TXA 2用 U46619 生产，并且由于青蒿琥酯，血清素和 ATP（细胞内颗粒分泌指标）的释放显着降低（图 6）。此外，结果证实 PI3K/Akt 和 MAPK 磷酸化，即用于颗粒分泌调节的信号转导磷蛋白，被青蒿琥酯显着抑制。据认为，青蒿琥酯可抑制磷蛋白（PI3K/Akt 和 MAPK）的磷酸化，从而通过减少 TXA 2的产生和颗粒的细胞内分泌（血清素和 ATP 释放）来抑制血小板的聚集。 此外，增加的整合素αIIb/β 3介导的信号转导和颗粒释放通常会改变血小板的细胞骨架，影响血小板的聚集和血栓的形成。血栓形成是修复受损血管的最重要步骤，在此期间，活化的血小板积聚并形成纤维蛋白和血小板的网状结构。当纤维蛋白凝块形成时，它开始收缩 30 到 60 分钟，最终形成血栓栓塞。纤维蛋白凝块的回缩在很大程度上依赖于纤维蛋白原和 αIIb/β3的相互作用，而 αIIb/β3 活性的抑制剂已被证明可以防止血栓的形成 [ 40]。为了增加纤维蛋白原结合αIIb/β 3的能力，凝血酶诱导凝血和血小板αIIb/β 3活化，导致凝块血栓形成。如图 9 所示，青蒿琥酯的抗血小板作用导致相对于浓度抑制凝血酶诱导的纤维蛋白凝块，这是抑制血栓形成的真正结果。这里的结果表明青蒿琥酯具有作为抑制血栓形成的强效抗血小板物质的潜力。 图 9. 青蒿琥酯对血小板细胞内信号通路的抑制作用示意图。 总之，青蒿琥酯增加人血小板中的 cAMP 以诱导 IP 3 R 和 VASP 磷酸化，从而显着抑制 Ca 2+的募集和整合素 αIIb/β 3进入细胞质的激活。此外，青蒿琥酯已被证明通过调节作用于信号转导的磷蛋白（如 PI3K/Akt 和 MAPK）的磷酸化来抑制颗粒释放，从而表现出抗血小板功能。最后，凝血酶诱导的纤维蛋白凝块的产生被显着抑制。因此，我们认为青蒿琥酯具有作为通过抗血小板机制抑制血小板聚集和血栓形成的物质的价值。 四、材料与方法 4.1。材料 Avention Corporation（韩国仁川）提供青蒿琥酯（图 9）。U46619 和凝血酶购自 Chrono-Log Corporation (Havertown, PA, USA)。TXB 2酶免疫测定 (EIA) 试剂盒、血清素 EIA 试剂盒、ATP 测定试剂盒以及 cAMP 和 cGMP EIA 试剂盒可在 Cayman Chemical Co. (Ann Arbor, MI, USA) 获得。Invitrogen Molecular Probes (Eugene, Orlando, FL, USA) 提供了 Fibrinogen Alexa Fluor 488 偶联物和 Fura 2-AM。Sigma Chemical Corporation (St. Louis, MO, USA) 提供其他试剂。蛋白质印迹裂解缓冲液和抗体由 Cell Signaling (Beverly, MA, USA) 提供。Thermo Fisher Scientific（韩国首尔）提供了增强的化学发光溶液和聚偏二氟乙烯膜。 4.2. 人洗血小板的制备 从提供知情同意的健康志愿者那里采集的人富含血小板血浆 (PRP) 从韩国红十字血液中心 (KRBC, Suwon, Korea) 获得，其实验用途得到了 KRBC 和南首尔大学机构审查委员会的批准（1041479-HR-201803-003，2015 年 4 月 23 日）。先前进行的方法用于制备悬浮血小板 [ 41 ]。10 分钟，PRP 以 1300× g离心收集血小板，然后用缓冲液（pH 6.9、2.7 mM KCl、138 mM NaCl、12 mM NaHCO 3、0.36 mM NaH 2 PO 4、1 mM Na 2 EDTA 和 5.5 mM 葡萄糖）。悬浮缓冲液（pH 7.4、2.7 mM KCl、138 mM NaCl、12 mM NaHCO 3、0.49 mM MgCl 2、0.36 mM NaH 2 PO 4、5.5 mM 葡萄糖、0.25% 明胶）悬浮血小板（最终浓度为10 8个细胞/mL）。通过在 25 °C 下执行所有程序来避免血小板聚集。 4.3. 血小板聚集测量 在 37 °C 下孵育 3 分钟，同时加入不同浓度的青蒿琥酯，培养悬浮的血小板 (10 8个细胞/mL)。然后，加入 2 mM CaCl 2和 U46619 (0.5 μM) 进行刺激，持续时间为 5 分钟。凝集计（Chrono-Log Co., Havertown, PA, USA）在 1000 rpm 的搅拌速度下测量实验，随着透光率的增加计算凝集率。以悬浮缓冲液0%的悬浮渗透率作为参考值。青蒿琥酯用浓度为0.1%的二甲基亚砜（DMSO）溶解，所有试验均加入相同剂量的DMSO。 4.4. 细胞毒性测量 确认从细胞质中释放乳酸脱氢酶 (LDH) 确定了细胞毒性。在室温下加入不同浓度的青蒿琥酯孵育悬浮的血小板（10 8个细胞/mL）两小时，然后以 12,000× g离心 2 分钟。协同 HT 多阅读器（BioTek Instruments，Winooski，VT，USA）用 LDH EIA 试剂盒测量上清液。 4.5. 环状核苷酸（cAMP 和 cGMP）生产测量 3 分钟，悬浮血小板（10 8个细胞/mL）在 37 °C 下孵育，同时加入不同浓度的青蒿琥酯，然后加入 2 mM CaCl 2和 U46619（0.5 μM）以刺激持续时间 5 分钟。通过添加 1 M HCl 终止反应，Synergy HT Multi-Reader (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA) 使用 cAMP 或 cGMP EIA 试剂盒测量 cGMP/cAMP。 4.6. 细胞内 Ca 2+动员测量 PRP 与 Fura 2-AM (5 μM) 在 37 °C 下孵育 60 分钟，根据上述步骤制备悬浮血小板 (10 8个细胞/mL)。洗涤的血小板在 37 °C 下用 2 mM CaCl 2和 U46619 (0.5 μM) 刺激孵育 3 分钟，持续 5 分钟。BioTeck Instrument (Winooski, VT, USA) 的分光荧光计 (SFM 25, USA) 测量了 Fura 2 荧光。用 340 和 380 nm 的激发波长和 510 nm 的发射波长分析荧光。使用 Grynkiewicz [ 42 ]的方法计算动员的 Ca 2+的量。 4.7. 纤维蛋白原结合测量 通过向悬浮的血小板（10 8个细胞/mL）中加入 2 mM CaCl 2用 Alexa Fluor 488-人纤维蛋白原（30 μg/mL）处理后，使用 U46619（0.5 μM）进行刺激，持续时间为 5 分钟。添加含有 0.5% 多聚甲醛的磷酸盐缓冲盐水 (PBS, pH 7.4) 终止反应。在该过程中使用了光阻，并且来自 BD Bioscience (San Jose, CA, USA) 的流式细胞仪 (FACS) 测量了纤维蛋白原的结合。软件 Cell-Quest (BD Biosciences) 用于分析。 4.8. TXB 2生产测量 3 分钟，悬浮血小板（10 8个细胞/mL）在 37 °C 下孵育，同时加入不同浓度的青蒿琥酯，然后加入 2 mM CaCl 2和 U46619（0.5 μM）以刺激持续时间 5 分钟。Synergy HT 多阅读器（BioTek Instruments，Winooski，VT，USA）使用 TXB 2 EIA 试剂盒测量了 TXB 2（一种稳定的 TXA 2代谢物）的产生。 4.9. ATP 和血清素释放测量 3 分钟，悬浮血小板（10 8个细胞/mL）在 37° 下以不同的青蒿琥酯浓度孵育，然后加入 2 mM CaCl 2和 U46619（0.5 μM）进行刺激，持续时间为 5 分钟。一旦用冰冷的 2 mM EDTA 停止反应，协同 HT 多阅读器（BioTek Instruments，Winooski，VT，USA）和血清素或 ATP EIA 试剂盒测量由于离心而在上层释放的血清素/ATP。通过在聚集反应后通过离心测量上层中的ATP或血清素来确认血小板中颗粒物质分泌到细胞外的程度。 4.10。西方免疫印迹测量 使用 1× 裂解缓冲液终止反应。使用 BCA 蛋白试剂盒（Pierce Biotechnology，Rockford，IL，USA）测量来自血小板裂解物的蛋白浓度。通过 4-20% SDS-PAGE 分离蛋白质（20 μg）并转移到 PVDF 膜上。一抗以 1:1000 的稀释倍数处理，二抗以 1:2000 的稀释倍数处理。使用 ECL 试剂 (Thermo Fisher Scientific, Gangnam-gu, Seoul, Korea) 进行可视化。 4.11。血小板介导的纤维蛋白凝块收缩测量 为了避免粘连，聚乙烯管含有 PRP (500 μL)，然后用凝血酶 (0.05 U/mL) 和 2 mM CaCl 2在 37 °C 的温度下刺激 15 分钟。然后数码相机拍摄了血小板介导的纤维蛋白凝块的照片。软件 ImageJ（1.46 版，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州，美国）计算凝血面积。 4.12。统计分析 所有数据均表示为具有不同观察次数的平均值±标准差。用来自四名正常成人的血小板进行了重复实验。进行方差分析以确定组间的主要差异，并使用 Scheffe 方法。使用SPSS 21.0.0.0软件（SPSS，Chicago，IL，USA）进行统计分析，p <0.05被认为具有统计学意义。 作者贡献 概念化，D.-HL；方法论，H.-WK；形式分析，S.-SY；调查，S.-SY 和 J.-HS；资源，H.-WK、S.-SY 和 D.-HL；撰写原始草稿准备，S.-SY 和 D.-HL；写作——审查和编辑，S.-SY 和 D.-HL；可视化，MHR；监督，MHR，C.-EP；项目管理，D.-HL；资金获取，D.-HL 所有作者均已阅读并同意已发表的手稿版本。 资金 这项研究得到了韩国国家研究基金会的支持。由韩国政府资助的赠款（赠款号 NRF-2017R1C1B5075857）。 机构审查委员会声明 本研究经南首尔国立大学机构审查委员会批准（1041479-HR-201803-003，2015 年 4 月 23 日）进行。 知情同意声明 根据赫尔辛基宣言并经韩国红十字会批准，所有为本研究提供血液样本的人类受试者均获得了书面知情同意书。 数据可用性声明 不适用。 致谢 我要感谢 Sarah Chun，她在幕后支持和服务我，使这项研究成为可能。 利益冲突 作者声明没有利益冲突。 参考 莫扎法里安，D。本杰明，EJ；去吧，作为；阿内特，丹麦；布拉哈，MJ；库什曼，M。达斯，SR；德费兰蒂，S.；德斯普雷斯，JP；富勒顿，HJ；等。心脏病和中风统计——2016 年更新了美国心脏协会的一份报告。2016 年流通 ，133，e38–e48。[谷歌学术][考研] 安德鲁斯，RK；Berndt, MC 血小板生理学和血栓形成。血栓水库。 2004 年，第114期，第 447-453 页。[谷歌学术][交叉参考] 内布拉斯加州巴雷特；霍尔布鲁克，L.；琼斯，S。凯撒，WJ；洛杉矶莫拉斯；拉纳，R。；圣人，T。斯坦利，RG；吉隆坡塔克；赖特，B。等。抗血小板疗法的未来创新。兄弟。J.药理学。 2008 年，第154页，第 918-939 页。[谷歌学术][交叉参考][考研] 巴迪蒙，L。维拉胡尔，G。Padro, T. 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经过 恩戈尼扎舍·鲁维日1,庆幸 Bethusile Maseko2,和祝福阿提姆·阿德里比贝1, 1.黑尔堡大学化学系，爱丽丝校区，爱丽丝，东开普省 5700，南非 2.Sefako Makgatho 健康科学大学科技学院化学系, Ga-Rankuwa 0208, 南非 *应向其通信的作者。 学术编辑：Ademar Alves Da Silva Filho 药剂 学 2022 , 14 (3), 504; https://doi.org/10.3390/pharmaceutics14030504 收稿日期：2021 年 12 月 31 日 / 修订日期：2022 年 2 月 2 日 / 接受：2022 年 2 月 3 日 / 发布时间：2022 年 2 月 25 日 （这篇文章属于特刊天然产物及其合成衍生物和制剂在寄生虫病化疗中的研究进展） **> 抽象的 一、简介 青蒿琥酯 (1) (ART)，也称为双氢青蒿素-12-α-琥珀酸盐，是一种半合成的过氧化物桥连的倍半萜内酯化合物（图 1）[ 1 ]，来源于青蒿素，一种叫做青蒿的中药材的生物活性成分[ 2 ]。从青蒿素生产 ART 涉及分别使用二异丁基氢化铝 (DIBAL) 和琥珀酸酐进行还原和酯化的两步反应 [ 3 ]。ART 是治疗重症疟疾的一线药物，但也可与另一种治疗非重症疟疾的药物联合使用 [ 4 ]。 图 1. 青蒿琥酯的结构。 包含内过氧化物键的 1,2,4-三恶烷核心的存在对其活性非常重要 [ 5 ]。ART比青蒿素具有更好的吸收性、溶解性和药代动力学。其给药方式可以是肌肉内、口服、直肠和静脉内 [ 3 ]。当口服给药时，ART 的半衰期很短，从 20 到 45 分钟不等，在此期间，它通过酯酶催化水解代谢成双氢青蒿素，这是负责青蒿琥酯抗疟活性的活性代谢物 [ 6 ]。 半衰期短导致稳定性降低，从而降低其生物利用度、药代动力学和药理活性。ART 的半衰期短，还需要重复给药才能完全治愈，这可能会导致耐药性 [ 7 ]。在过去的二十年中，研究表明，ART不仅对疟疾有效，而且在体外和体内对各种肿瘤细胞系也有一定的抗癌作用，[ 8 ]在治疗狼疮[ 9 ]中具有一定的作用，对多种病毒有效 [ 10 , 11 ]，并表现出抗糖尿病特性 [ 12 ]。 青蒿琥酯具有抗肿瘤活性，其对非凋亡性细胞死亡的作用包括以下机制：自噬、肿瘤和铁死亡[ 13,14,15,16 ]。青蒿琥酯还通过抑制癌细胞增殖和侵袭、诱导细胞周期停滞、破坏癌症信号通路、引起氧化损伤和诱导细胞凋亡来影响癌症发展的其他多个标志性事件。它还通过抑制血管生成和作为转移剂起作用 [ 17 , 18 ]。三聚体 ART 衍生物 TF27 表明 ART 通过输出蛋白、线粒体和 NF-κB 途径与人类巨细胞病毒 (HCMV) 相互作用 [ 19 , 20]。此外，据报道，ART 具有抗动脉粥样硬化 [ 21 ]、抗炎和免疫抑制活性 [ 22 , 23 ]。这篇综述文章着重于青蒿琥酯的治疗功效。 疟疾及其寄生虫生命周期 疟疾是一种由疟原虫引起的寄生虫病媒传播疾病。由雌性按蚊传播 [ 24 ]。尽管疟疾危及生命，但早期诊断和适当治疗使其预后良好 [ 25 ]。全球数据显示，约有 2.29 亿人受到疟疾影响，而每年约有 409,000 人死于疟疾；因此，需要努力预防和控制它[ 26 ]。5 岁以下儿童和孕妇感染疟疾的风险更高，发生并发症的可能性更大 [ 27]。早期治疗疟疾可将死亡率降低至 10-20%，而未经治疗的重症疟疾死亡率为 100% [ 28 ]。尽管为控制和根除疟疾做出了所有重大努力，但疟疾在流行地区仍然是一种毁灭性疾病 [ 29 ]。青蒿琥酯以其在治疗简单疟疾和重症疟疾方面的生物学功效而闻名 [ 4 , 30 ]。 成功开发有效的抗疟药需要了解疟原虫的生命周期（图 2）。雌性按蚊从以人类血液为食的蛋白质中发育卵子 [ 31]。当它进食时，感染性子孢子被接种到血液中并循环，直到它们侵入肝细胞，在那里它们复制 7-14 天。潜伏期落在红细胞前阶段，没有明显的症状。在前红细胞阶段之后是红细胞阶段，其中寄生虫从肝脏以裂殖子的形式出现。裂殖子对红细胞 (RBC) 的侵袭导致它们繁殖成红细胞裂殖体，裂殖子在破裂时释放出更多的裂殖子。裂殖子释放后会侵入更多的红细胞，从而延长疟疾生命周期的血液阶段 [ 32 ]。 图 2.恶性疟 原虫生命周期示意图 一些裂殖子发育成配子体，为了将这些配子体传递给宿主，它们需要被另一只蚊子吸收。当被另一只蚊子吸收时，配子体完成了它们的有性生殖阶段。这导致蚊子周期的结束，大约需要 9-14 天。最后，子孢子迁移到唾液腺，准备在蚊子再吃一次血粉时接种到另一支血液中，从而完成疟疾的生命周期[ 33 ]。P. ovale和P. vivax有不同的生命周期，因为一些子孢子在肝脏阶段没有繁殖并发育成裂殖体，而是隐藏在肝脏内成为次生子，在第一次感染后几年后引起复发[ 34 , 35 ]。 在许多疟原虫种类中，P . 恶性疟是独一无二的，因为它会侵入任何红细胞，并可能在一个红细胞上引起多次感染，从而导致快速增殖，从而迅速使疾病恶化。红细胞发生结构和功能变化，如隔离、炎症和内皮功能障碍，这些变化会导致严重的疟疾 [ 35 ]。 2.1。青蒿琥酯对疟疾的作用机制及其构效关系 在体内，ART 转化为双氢青蒿素，其半衰期较长，约为 45 分钟。ART 的作用机制（与任何其他青蒿素一样）包括抑制血红素聚合、产生 ROS、使寄生虫膜不稳定、使蛋白质烷基化和抑制 PfATP6 [ 6 ]。 青蒿琥酯的内过氧化物部分会产生 ROS，这有助于其作用机制。其他机制包括诱导细胞凋亡和细胞周期停滞以及抑制肿瘤血管生成 [ 36 ]。当暴露于青蒿琥酯时，有一系列事件会导致寄生虫的致命损害。疟原虫内部铁诱导的还原激活了内过氧化物键，进而触发了几种反应性中间体的释放。这些包括高价铁氧中间体、细胞毒性碳中心自由基和亲电子烷化剂，所有这些最终都会将寄生虫破坏至死亡 [ 37 , 38 ]。 ART 与血红素结合形成血红素-青蒿琥酯加合物。这种加合物可防止血红素形成，导致血红素积累，这对寄生虫有毒 [ 6 ]。血红素积累诱导以碳为中心的自由基生成，进而使血红素和半胱氨酸蛋白酶烷基化，例如恶性疟原虫中的 falcipain ，对寄生虫膜造成氧化损伤，并最终导致其死亡 [ 38 , 39 ]。 寄生虫在消化血红蛋白后保留血红素，这是血红素的一种储存形式。ART 对 hemozoin 具有高亲和力，这会导致药物被寄生虫选择性地积累 [ 39 ]。由于内过氧化物桥的铁依赖性激活[ 38 ]，与正常红细胞相比，ART 对寄生虫感染的红细胞具有选择性。 2.2. 基于 ART 的制剂对疟疾的疗效 肠外 ART 给药是治疗重症和脑型疟疾的首选 [ 30 ]。阿格博等人。制备用于ART鼻内递送的纳米结构脂质载体（NLC）。使用固化的基于反胶束溶液的脂质基质将疏水性 ART 封装在 NLC 中。对小鼠的体内抗疟研究表明，一种载有 ART 的 NLC 可减少感染小鼠的寄生虫血症 (54.70%)，其结果与通过肌肉注射获得的结果相当 (58.80%) [ 28 ]。 鼻内给药的载有 ART 的 NLC 的抗疟活性为 33.28%，而肌肉内给药的抗疟活性为 42.18%。NLC 制剂表现出比纯 ART 更高的抗疟活性，这表明鼻内给药的 ART 负载 NLC 可用于增强 ART 的抗疟活性，此外它们是安全、方便和有效的 [ 28 , 40 ]。 马尔科-埃尔南德斯等人。报道了对脾切除术患者进行恶性疟原虫疟疾静脉治疗的诊断挑战。该患者最初被确定患有严重疟疾（寄生虫血症 4.7%）和急性肾损伤，肌酐水平为 1.3 mg/mL。尽管诊断后立即开始静脉 ART（2.4 mg/kg），但 ART 后 24 小时的血涂片显示寄生虫血症增加高达 8.7% [ 41 ]。 怀疑青蒿素耐药导致三天后开始静脉注射奎宁（10 mg/kg，每天 3 次）加多西环素（100 mg，每天两次），但对kelch13-螺旋桨结构域的测序显示没有青蒿素耐药标记。对疟疾涂片的重新评估揭示了固缩形式，从而推断由于患者的脾切除术，无法从血液中清除无活力的疟原虫。治疗后 28 天最终获得阴性血涂片 [ 41 ]。 德里斯科利等人。报道了疟疾 ART 治疗后药物引起的自身免疫性溶血性贫血。尽管患者对 ART 反应良好，但在治疗后 16 天出现症状性贫血（Hb 为 64 g/L）和溶血。直接抗球蛋白和抗体筛选均为阳性。开始泼尼松龙 (1 mg/kg) 治疗两周后，注意到治疗成功，Hb 完全正常化，溶血迅速消退。尽管直接抗球蛋白试验阳性的病例很少见，但报告的增加引发了人们对 ART 可能导致药物性自身免疫性溶血性贫血的担忧 [ 42 ]。 马赫迪等人。据报道，ART治疗严重的恶性疟原虫疟疾可诱发晚期急性胰腺炎。患者接受了五剂 ART (2.4 mg/kg) 的静脉注射。患者的生物膜在治疗后 72 小时未发现疟原虫。入院后第 8 天（血液寄生虫检测呈阴性后 5 天），患者出现胰腺炎，尽管之前没有胰腺炎的危险因素。在使用药物不良反应概率评分后，胰腺炎被视为静脉 ART [ 43 ] 的可能不良反应。静脉输液和疼痛管理导致胰腺炎的快速反应，甚至在治疗后 2 个月内也没有复发 [ 25 ]。 严重的疟疾性贫血 (SMA) 通常会导致 Hb 水平降至危险水平，而当 ART 用作唯一治疗时，这种情况通常会恶化，因为它不会增加 Hb 水平，但实际上会轻微降低它 [ 44 , 45 ]。Siewe 和 Friedman 设计了一个数学模型，有助于提高 SMA 中的 Hb 水平，同时控制寄生虫血症。疟原虫分泌疟原虫巨噬细胞迁移抑制因子 (PMIF)，抑制红细胞募集，从而降低血液中的 Hb 水平 [ 24 ]。 使用主要减少寄生虫血症的青蒿琥酯和抗癌药物环氧氮杂二酮进行的模拟显示出互补的结果。虽然青蒿琥酯减少了寄生虫血症，但环氧氮杂二酮通过对抗 PMIF 增加了 Hb 水平。该模型还可用于治疗导致贫血的其他寄生虫病，其中 MIF 起着至关重要的作用 [ 24 ]。 伊斯梅尔等人。制备了用于治疗恶性疟原虫疟疾的新型二聚 ART-甘油磷酸胆碱 (Di-ART-GPC) 脂质体。针对恶性疟原虫i-RBCs 的体外抗疟活性评估显示 3D7 菌株具有显着的生长抑制作用，Di-ART-GPC 脂质体和偶联物的 IC 50值分别为 0.39 和 1.90 nM。这些抑制值比亲本青蒿琥酯 (IC 50 = 5.17 nm) 和载有 ART 的脂质体 (IC 50= 3.13 纳米）。体内抗疟结果表明，与游离 ART 相比，Di-ART-GPC 脂质体在 15 mg/kg 的低剂量下具有 2 至 3 倍的抗疟活性。小鼠的预期寿命延长和寄生虫病复发延迟，以及上述其他结果表明，使用 Di-ART-GPC 脂质体可以提高 ART 疗效 [ 3 ]。 感染疟疾的孕妇出生体重下降，而 5 岁以下的儿童则发育不良和智力低下 [ 46 ]。舍胡等人。评估了产前暴露于 ART 对 Wistar 大鼠胎儿大脑皮层发育的影响。ART 在妊娠第 6 天以 8 mg/kg 或 16 mg/kg（分别为 4-2-2 或 8-4-4）或三天的安全或高人体剂量灌胃给药。产后形态学评估显示，尾巴、四肢明显发育迟缓，大脑形态测量下降，而高剂量会导致严重的胚胎丢失 [ 27 ]。 组织学结果显示，与对照组相比，在安全剂量下大鼠的细胞增殖减少和锥体细胞成熟延迟。在给予高剂量的幼崽上观察到大脑发育完全迟缓。当对钙结合蛋白 calbindin D28K 特异的神经元进行免疫标记时，与对照组相比，ART 处理的幼崽中的锥体细胞显示出较少的阳性细胞和较少的染色。结果表明 ART [ 27 ] 的组织学和神经学安全范围很窄。 一些研究报告表明，其他一些抗疟原虫药物可以与 ART 协同作用。这些包括诸如吡咯那利定-ART 和 ART-阿莫地喹的组合，已发现它们显示出增强的功效 [ 47 , 48 ]。米娜等人。据报道，ART 与 4-氯丁香酚 (4CE) 协同作用，4-氯丁香酚 (4CE) 是一种有效的抗疟原虫药物，对耐药性恶性疟原虫的活性范围为 1.5 至 5 µM 。使用感染P. yoelli nigeriensis的瑞士白化病小鼠的体内抗疟原虫活性表明，ART 和 4CE 的组合具有 91.4% 的化学抑制，而 ART (9.5 mg/kg) 和 4CE (88 mg/kg) 的化学抑制分别为 55% 和 47%公斤），分别（表1）。下面描述的结果显示了剂量依赖性（表 1）[ 26 ]。 表 1. 4CE、ART 及其组合对感染尼日尔疟原虫的瑞士白化病小鼠的体内抗疟原虫活性。 与给予单独药物的小鼠相比，给予 ART + 4CE 的小鼠的平均存活时间更长（16.3 天）。通过注意到埃文在脑组织中可见的蓝色浓度，对脑疟疾研究进行了口服剂量的药物。与 4CE 可见的 20.99 µg/g 和 17.98 µg/g 埃文蓝的单个药物相比，该组合（ART + 4CE 的 2×ED50）减少了血脑完整性损失（4.73 µg/g 埃文蓝）（166 mg/kg) 和 ART (20 mg/kg)。结果表明，4CE 可以与 ART 协同作用，诱导抗药性恶性疟原虫的氧化应激[ 26 ]。 除了抗疟活性外，肝素还因其生物相容性和生物降解性而被用作纳米载体[ 49 ]。研究报告称，疟原虫使用细胞表面受体硫酸肝素进行初始结合和识别 [ 50 ]。伊斯梅尔等人。开发了基于 ART-肝素 (ART-HEP) 缀合物的纳米胶囊，用于在疟疾治疗中细胞内释放 ART。ART-HEP 纳米胶囊对恶性疟原虫3D7 菌株的体外抗疟活性表明，游离 ART (IC 50 = 6.27 nM) 比聚合物纳米胶囊 (IC 50= 10.16 纳米）。这可能是由于 ART 逐渐从纳米胶囊中释放出来。药代动力学研究表明，由于外层肝素的屏蔽，ART-HEP 纳米胶囊比游离 ART 具有更高的血液循环。与普通 ART 的 14.13 µg/mL 相比，ART-HEP 纳米胶囊的血浆峰值浓度（C max = 18.12 µg/mL）略高。较高的停留时间和消除率，加上血浆清除率下降（表 2），使 ART-HEP 纳米胶囊成为疟疾化疗中潜在的 ART 载体 [ 7 ]。 表 2. 游离 ART 和 ART-HEP 纳米胶囊的药代动力学参数。 通力等人。使用光学显微镜和定量聚合酶链反应 (qPCR) 研究了 ART 单药治疗后来自马里两个村庄的 221 名志愿者（121 名来自 Faladje 和 100 名来自 Bougoula-Hameau）的恶性疟原虫的清除时间。观察患者 28 天，收集他们的血涂片和斑点用于 qPCR 和显微镜检查。两个村庄的 ART PCR 校正治愈率均达到 100%。通过显微镜进行的寄生虫清除评估表明，清除 Faladje 中所有寄生虫血症的中位时间为 40 小时，而 Bougoula-Hemeau 则需要 32 小时 [ 29 ]。 ART 治疗后 72 小时的 qPCR 结果显示，68.5% 的患者有残留寄生虫血症，Faladje (54) 样本的平均残留寄生虫血症为 2.9。Bougoula-Hameau（50 个样本）有 40% 的患者患有残留寄生虫血症，平均残留寄生虫血症为 0.08。耐药分子标记仅在 Bougoula-Hameau 中显示了一个Pfdhfr-Pfdhps五重突变体和一个非同义PfK13突变。尽管 ART 治疗是有效的，但寄生虫清除时间延长可能是所分析个体中恶性疟原虫对 ART 耐药性发展的早期迹象 [ 29 ]。 关于 ART 治疗后严重迟发性自身免疫性溶血性贫血的报道有几篇 [ 51 ]。这通常发生在患者因严重疟疾、人类免疫缺陷病毒等导致免疫系统减弱时。 [ 52]。Rabaneda-Gutierrez 等人。报道了儿科患者（6 岁男孩、6 岁和 4 岁女孩）在 ART 治疗严重疟疾后出现溶血性贫血。这两名女孩的寄生虫血症分别为 5% 和 15%，并接受了静脉 ART（2.4 mg/kg/dose，每 12 小时两次，连续两次和 24 小时后），随后接受哌喹-青蒿素治疗 3 天。治疗开始后 48 小时寄生虫血症消失。治疗开始后 10 天的实验室检查显示可能存在溶血性贫血，血红蛋白比 5 天前记录的有所下降（6 岁儿童从 9 g/dL 降至 7.4 mg/dL，从 8.8 g/dL 降至 6.3 mg/dL） dL 在 4 岁）[ 53 ]。 乳酸脱氢酶 (LDH) 在老年人中从 674 U/L 增加到 751 U/L，在年轻女孩中从 738 U/L 增加到 1831 U/L。在给予相同治疗后，男孩表现出相同的溶血性贫血结果。他的血红蛋白下降了 2 g/dl，高胆红素血症从之前的 1.5 mg/dL 增加到 2.08 mg/dL，LDH 从 354 IU/L 升高到 1831 IU/L。泼尼松龙以 1 mg/kg/天的剂量给药 3 天，实验室测试显示良好的结果。这些发现表明，儿科患者在静脉内 ART 后存在溶血性贫血的潜在风险 [ 53 ]。 兰德尔等人。报告了一例因严重疟疾被送入重症监护室的患者，有高血压、糖尿病和肥胖病史。血涂片显示恶性疟原虫阳性（675,000 个寄生虫/µL），证实为严重疟疾，其生物学参数显示急性肾损伤、呼吸和心血管衰竭以及高寄生虫血症。静脉 ART (2.4 mg/kg) 从第一天开始到 7 天。前 3 天进行连续静脉血液透析，并使用去甲肾上腺素作为支持 10 天 [ 54 ]。 患者在入院 4 周后从 ICU 出院，病情好转，但出现咳嗽、高热和肺部混浊。他出现溶血、血小板减少和无法检测到的触珠蛋白。确认恶性疟原虫(6,240,000 寄生虫/µL) 检测呈阳性，这导致了严重疟疾复发的诊断。第二次 ART 治疗开始 3 天，随后静脉注射奎宁（780 mg/8 h）5 天，口服蒿甲醚-苯芴醇 3 天，导致治疗成功 [ 54 ]。高寄生虫血症的复发可能是由于感染了至少两种恶性疟原虫克隆或其他潜在疾病，如肥胖、糖尿病和高血压 [ 55]。 ART 和阿莫地喹的组合以其治疗单纯性疟疾的功效而闻名，并被世界卫生组织推荐 [ 56 ]。穆罕默德等人。评估了 ART-阿莫地喹 (ART + AQ) 作为厄立特里亚非复杂性恶性疟原虫疟疾一线治疗的疗效。共有 103 名被诊断患有疟疾的患者（65 名男性和 38 名女性）参加了为期 28 天的研究，招募时无性寄生虫密度的几何平均值为 7553 寄生虫/μL。第 3 天，寄生虫血症迅速清除，仅 3/102 例在血涂片中检测到无性寄生虫（表 3）。自 1 名退出和 3 名失访以来，共有 99 名患者完成了分析。所有复发性寄生虫血症都被认为是由于治疗失败，而不是再次感染，因为结果没有经过 PCR 校正。第 3 天只有 3 例发生寄生虫血症这一事实意味着 ART 成分仍然非常有效，因为它在初始寄生虫清除方面有效，并且表明对 ART 没有抵抗力 [ 57 , 58 ]。 表 3. 接受 ART + AQ 治疗的患者中未经 PCR 校正的治疗结果 佐达等人。报道了一例先前健康的 33 岁男子，他因严重疟疾和脑寄生虫血症入院。全血细胞计数的实验室结果显示血红蛋白水平为 10.2 g/dL，白细胞计数为 12 k/µL，红细胞比容为 32%，血小板计数为 13 k/µL。还注意到肝肾损害，血涂片显示 42% 的红细胞内有疟原虫。患者首先服用奎尼丁和强力霉素，之后他的 QT 恢复到基线，停止奎尼丁。6 小时后，他按照方案接受了第一次 ART 剂量（0 小时、12 小时、24 小时和 48 小时时为 2.4 mg/kg）。自 ART 开始后 2 天内，他的全身寄生虫血症从 42% 下降到 0.4%，并且代谢性酸中毒有所改善。18天后，他的神经功能完全恢复并出院[59 ]。 Thera 等人。评估了在 200 名马里学龄儿童中每隔一个月使用四剂 ART-阿莫地喹 (ART-AQ) 剂量进行季节性疟疾化学预防的影响。学生被随机分成两组，每组有 100 名参与者，要么每月接受 ART-AQ，要么作为没有干预的对照组。对照组有 20 例无并发症的疟疾病例，而接受 ART-AQ 的患者中仅报告 3 例，未记录到重症疟疾 [ 60 ]。 共有 64% 接受 ART-AQ 的儿童出现异常疼痛，44% 报告头痛，22% 报告头晕，恶心和呕吐分别有 7% 和 6%。头晕是持续时间最长的不良反应，为 3.8 天。临床疟疾风险降低 86%，感染率降低 67%，这表明季节性疟疾化学预防是消除季节性疟疾的潜在策略 [ 60 ]。 瓦罗等人。对 2003 年 1 月 1 日至 2017 年 12 月 31 日期间接受抗逆转录病毒治疗或奎宁治疗的 15 岁以下莫桑比克儿童疟疾后贫血进行了研究。在此期间共有 23,523 名儿童住院，9461 名儿童存活出院，确认62人死亡。在 62 名伤员中，55 人接受了奎宁治疗，而只有 5 人接受了抗逆转录病毒治疗。在出院的儿童中，1519 名儿童在出院后 7-28 天内知道血细胞比容值，1333 名接受奎宁治疗，154 名接受抗逆转录病毒治疗。接受奎宁治疗的患者共确认 6 例死亡和 305 例疟疾后贫血病例，而接受 ART 治疗的患者未报告死亡和 39 例疟疾后贫血病例。61 ]。 2.3. 青蒿琥酯对癌症的治疗作用 ART 以其对多种癌症的疗效而闻名，例如肝癌 [ 17 ]、白血病 [ 62 ] 和乳腺癌 [ 63 ]。除了内过氧化物部分，癌细胞产生的血红素在激活抗逆转录病毒疗法中发挥重要作用，产生大量破坏癌细胞的自由基 [ 16 ]。ART 的抗癌作用通过影响癌细胞中的各种过程和途径发挥作用，例如阻止细胞周期 [ 14 ]、抑制血管生成 [ 64 ] 和铁死亡 [ 65 ]、诱导细胞凋亡 [ 14 ]、抑制增殖 [ 66 ] 和诱导自噬[ 67 ]。 静等人。报道了 ART 提高肝细胞癌 (HCC) 对索拉非尼 (Sor) 敏感性的能力，索拉非尼 (Sor) 是一种用于治疗晚期原发性肝癌的酪氨酸激酶抑制剂 [ 68 ]。用 Sor、ART 或两者的组合 (ART-Sor) 治疗具有 SK-7721 肿瘤细胞的结节小鼠。与单独使用 ART 或 Sor 相比，ART-Sor 治疗显示出更好的肿瘤生长减少。两者的体外效应表明，2.77 µM ART-Sor 对 SK 细胞的抑制率达到 50%，而单独使用 5.23 µM Sor 则需要相同的效果。对于体外 SM 活癌细胞，11.43 µM ART–Sor 的抑制作用与单独使用 5.30 µM Sor 的效果相当。ART 被发现通过增加膜联蛋白 V +正向协同 SorSK 细胞产生和增加切割的 PARP 和 caspase-3，从而诱导促凋亡过程。体内研究表明，ART-Sor 通过抑制 P13K/AKT/mTOR 和 MAPK 通路增强 HCC 细胞凋亡 [ 17 ]。 曼库索等人。评估了 ART 在白血病细胞（U937 和 HL-60）中的体外和体内作用。用 1 mM ART 处理 U937 和 HL-60 细胞系分别在药物处理后 1 小时和 2 小时引发应激反应。在 U937 和 HL-60 细胞系中，eIF2α 在 4 小时和 6 小时的磷酸化分别激活了激活转录因子 4 (ATF4)，这是 PERK 调控的信号传导的核心。在 ART 治疗后 6 小时和 12 小时，转录因子 C/EBP 同源蛋白 (CHOP) 分别在 U937 和 HL-60 细胞系中被激活。ART 治疗后 24 小时，U937 和 HL-60 细胞系的凋亡细胞百分比分别增加 25.9% 和 19.1%。ART 治疗的肿瘤的平均肿瘤体积减少了 52% [ 62 ]。 皮拉利等人。通过抑制 HSP70 ATPase 活性，评估了 ART 在乳腺癌细胞（4TI 和 MCF-7）中的凋亡诱导作用。体外分析表明，将 HSP70 与 10、30 和 50 µM ART 一起孵育分别抑制了 9%、19% 和 38% 的碳酸酐酶去折叠。HSP70 的 ATP 水解的抑制也遵循浓度依赖性模式。与对照相比，不同 ART 浓度（1、5、10、25、50 和 100 µM）对 4TI 细胞增殖的抑制率分别为 3.66、10.73、17.53、31.84、47.56 和 67.92% [ 63 ] . 相同的 ART 浓度对 MCF-7 细胞的增殖抑制率为 3.48、8.68、13.49、24.25、39.21 和 60.48%。在 4TI 和 MCF-7 细胞中，ART 下调 Bcl-2 和 HSP70 表达，同时增强切割的 caspace-9 表达。将 MCF-7 和 4TI 细胞暴露于 ART 18 小时后，两种细胞系中的 caspase-9 活性增加；因此，这些结果表明，ART 通过抑制 HSP70 表达来诱导乳腺癌细胞凋亡 [ 63 ]。 Trimble 等人。通过进行首次人体 I 期升级研究，评估了自我管理 ART 阴道插入物在活检证实的宫颈上皮内瘤变 2/3 (CIN2/3) 患者中的疗效和安全性。该研究共纳入 28 名患者，其中包括四个治疗组，每组分别在 0、2 和 4 周接受 1、2 或 3 个为期 5 天的治疗周期。参与者报告了轻微的不良事件，例如头晕、子宫痉挛、尿路感染和头痛 [ 69 ]。 改良的意向治疗分析显示，19/28 (67.9%) 的参与者表现出组织学退化。在 19 名参与者中，其中 9 人清除了基线时检测到的 HPV 基因型，其中 9 人中有 3 人病毒清除与组织学退化同时发生。与接受两个或三个治疗周期的患者（平均 16.5 周，n = 10）相比，接受一次治疗的患者（平均 27.5 周，n = 9）的病毒清除时间更长。结果表明，自我给药阴道ART插入治疗CIN2/3具有良好的耐受性和安全性[ 69 ]。 飞等人。发现 ART 抑制食管癌细胞（KYSE-150、KYSE-410 和 TE-1）的生长，IC 50值分别为 80.2、75.7 和 55.3 µmol/L。与 IC 50相比，ART 对食道癌细胞的细胞毒性约为 3 倍对正常食管细胞系 HEY-1A 的检测值为 199.6 µmol/L。与仅暴露于辐射的细胞相比，用 5 µM ART 和 0-8 Gy X 射线辐射处理的 TE-1 细胞显示出较低的克隆形成存活率。ART 将辐射诱导的 TE-1 细胞凋亡从对照组的 4.9 ± 0.5% 提高到 34.1 ± 2.5%，并降低了 S 期 TE-1 细胞群的百分比。ART 下调 RAD51、Ku70、cyclin D1、Ku86 和 RAD54 蛋白表达，从而有助于延迟脱氧核糖核酸双链断裂 (DNA DSB) 损伤修复。体内研究表明，与单独接受放射治疗的小鼠相比，接受 ART + 放射治疗的小鼠的肿瘤体积和重量较低。因此，ART 通过抑制 DNA 损伤修复来增强食管癌细胞的放射敏感性 [ 64 ]。 王等人。研究了 ART 在治疗几种伯基特淋巴瘤 (BL) 细胞系中所起的作用。体外结果表明，ART 抑制 DAUDI (IC 50 = 2.75 ± 0.39 µM) 和 CA-46 (IC 50 = 2.73 ± 0.68 µM) 细胞增殖并诱导其死亡。用 ART 处理这两种细胞系增加了 ROS 的产生和脂质过氧化，表明铁死亡的诱导。ART 激活了 ATF4-CHOP-CHAC1 通路，这反过来又使 CHAC-1 表达不受调节，从而增强了 ART 诱导的 BL 细胞中的铁死亡。体内结果显示，对照组的平均肿瘤体积为 2.82 ± 0.33 cm 3和 1.45 ± 0.16 cm 3在 ART 治疗组中，表明 ART 抑制肿瘤生长的能力。与对照组相比，接受 ART 治疗的小鼠的平均皮下肿瘤重量也降低了 [ 15 ]。 Juengel 等人。用舒尼替尼处理肾细胞癌 (RCC) 细胞系 (KTCTL-26、A498、786-O 和 Caki-1) 以诱导舒尼替尼耐药性。与未处理的细胞相比，用 ART 处理细胞系显示出对肿瘤细胞生长和增殖的显着抑制。发现铁死亡是抑制这些抗治疗 RCC 细胞的原因。ART 治疗导致细胞周期停滞在 G 0 G 1期，并改变 Akt/mTOR 信号通路蛋白的表达 [ 66 ]。 李等人。探索了ART和顺铂组合对A549细胞的体外和体内抗癌作用。ART 和顺铂均以剂量依赖性方式抑制 A549 细胞生长。CCK-8 测定结果表明，与单独使用两种方法相比，用 ART 和顺铂的组合处理 A549 细胞导致更多的减少并诱导集落形成的明显减少。联合治疗显示凋亡细胞增加 29.7%，而 ART 增加 16.1%，顺铂增加 20.0% [ 14 ]。 G 2 /M 期的细胞周期停滞从 ART 的 16.1% 和顺铂的 17.39% 增加到 ART + 顺铂联合治疗的 35.13%。联合治疗影响 Bcl-2、Bax、p-P53、caspase-3/7、caspase-9 [ 70 ]、cyclinB1、P34 和 P21 的表达，并协同调节 P38/JNK/ERK1/2 MAPK 通路活性. 体内研究表明，ART 对顺铂具有化学增敏作用，联合治疗对肿瘤生长的抑制作用更显着（75.7%），而 ART 和顺铂分别为 19.1% 和 34.1% [ 14 ]。 熊等人。制备负载ART的PLGA多孔微球用于治疗非小细胞肺癌（NSCLC）。载有ART的PLGA微球在8天内累积ART释放率为90.09%，ART被细胞有效吸收。A549细胞株体外抗增殖作用显示，释放液第1、3、5、8天的细胞活力分别为36.92、19.19、10.00和5.33%，第8天溶液几乎杀死所有的细胞。从 PLGA 微球释放的 ART 抑制集落形成，通过抑制 Bcl-2 [ 70 ] 诱导细胞凋亡，并在 G 2停止细胞周期/M 相，ART 的比率分别为 31.52、38.17 和 40.94%，分别在第 1、3 和 5 天获取的释放溶液中包含。第 5 天收集的释放液中的 ART 完全抑制细胞迁移，最大创面面积为 97.82%，表明载有 ART 的 PLGA 微球可以阻止癌细胞的迁移和侵袭行为[ 71 ]。 魏等人。研究了 ART 对胶质瘤细胞（SK-N-SH、U87、U251 和 U138）的抗癌作用。ART 诱导 U87 细胞凋亡和运动性受损，并抑制 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A 还原酶 (HMGCR) 的表达，从而通过负甲羟戊酸通路调节抑制 U87 和 U251 细胞的贴壁非依赖性生长。体内研究表明，ART 给药改善了具有 U251 细胞的小鼠的存活率，减少了肺中形成的转移灶的数量，并导致小鼠肺中 HMGCR 表达几乎减少 [ 72 ]。 与对应细胞相比，ART 降低了 U87 和 U251 细胞中 HMGCR 的 mRNA 水平。此外，ART 抑制 SREBP2 与 HMGCR 启动子的结合，导致与未经处理的 U87 细胞相比，ART 处理的 U87 细胞中 SREBP2 的核定位较少。ART 显示出其在破坏 SREBP2-P53 相互作用、诱导 P21 表达和促进胶质瘤细胞衰老方面的能力 [ 72 ]。 库马尔等人。评估了 ART 抑制结直肠癌炎症和氧化应激的能力。ART 将组织学评分降低至 7.00 ± 0.26，与对照组的 3.67 ± 0.21 接近。ART 治疗使 GSH 和超氧化物歧化酶 (SOD) 活性等氧化应激标志物正常化，并产生剂量依赖性的炎症标志物水平降低，其效果与阿司匹林相同。ART降低了COX-2、一氧化氮（iNO）S、NF-κB（p65）和IL-1β等标志物的IR评分，ART对COX-2酶活性的IC 50值为743.34 μg/mL，与 592.54 μg/mL 的阿司匹林相比。因此，ART 具有降低结肠癌的潜力，类似于阿司匹林 [ 73 ]。 张等人。研究了 ART 自噬、CD155（一种 1 型跨膜糖蛋白，其过表达在细胞增殖和迁移中起关键作用）之间的潜在关系 [ 74 ]，以及它们在体外子宫体子宫内膜癌 (UCEC) 进展中的作用。ART 通过抑制迁移和增殖以及促进 UCEC 细胞的凋亡表现出有效的抗癌活性 [ 67 ]。 ART 被认为会触发生物过程，例如对氧化应激和类固醇激素和脂糖的反应以及阿米巴型细胞迁移。mTOR信号通路被认为是UCEC细胞自噬的关键调节轴。发现 CD155 在 UCEC 细胞中上调并与 PI3K/AKT-mTOR 和 mTORC1 信号通路相关，表明其与自噬相关。ART 对 UCEC 细胞中 CD155 的上调部分是通过 ATG5 进行的，这通过 CD155 和 CD226 及其受体 TIGIT 之间的相互作用促进了 NK92 细胞的细胞毒性 [ 67 ]。 周等人。报道了ART对人膀胱癌细胞的功效。除了抑制细胞增殖和迁移外，ART 还在 T24 和 EJ 细胞中诱导半胱天冬酶和自噬依赖性细胞凋亡。ART 激活了 AMPK-mTOR-ULK1 通路，该通路在自噬激活中起关键作用。用 ART 治疗 EJ 和 T24 细胞显示 ROS 水平以剂量依赖性方式显着上调，并且 ROS 上调启动 AMPK-mTOR-ULK1 轴 [ 16 ]。 2.4. 青蒿琥酯对病毒感染、皮肤病和糖尿病的疗效 最近的研究表明 ART 具有广泛的抗病毒效力 [ 75 ]。这些病毒包括疱疹病毒、人类巨细胞病毒 (HCMV) [ 10 ]、狂犬病 [ 76 ] 等。ART 已被证明具有一定的抗纤维化功效 [ 77 ]，并且由于其抗炎特性可以抑制皮炎 [ 78 ]。ART 的活性取决于其调节 P13K/AKT 和 P13K/AKT/mTOR 等信号通路的能力 [ 79 ]。ART 可降低血液中葡萄糖的浓度，这对于预防糖尿病的发病和进展很重要 [ 80 ]。 自 2019 年冠状病毒病 (COVID-19) 出现以来，研究人员发现自己在与时间赛跑，以寻找有效的治疗方法 [ 81 ]。Zhou 报告说，ART 是抗 SARS-CoV-2 感染 Vero E6、人肺癌和人肝癌的最有效的青蒿素，EC 50范围为 7-12 µg/mL [ 82 ]。Gendrot 等人。评估了固定 ACT 浓度对 Vero E6 细胞中临床分离的 SARS-CoV-2 毒株 (IHUMI-3) 的体外抗病毒活性。蒿甲醚-苯芴醇、ART-阿莫地喹、ART-哌喹和 ART-吡咯啶等组合表现出 27.1% 至 34.1% 的抗病毒抑制作用（表 4）。甲氟喹和 ART 的组合表现出最高的抗病毒活性，在预期的最大血浓度下复制抑制率为 72.1 ± 18.3%。这表明 ACT，尤其是甲氟喹-ART 可以成为对抗 SARS-CoV-2 的潜在干预措施 [ 83 ]。 表 4. 固定剂量 ACT 对 SARS-CoV-2 复制的抑制百分比 (%) 的估计值（1x 对应于疟疾治疗中常用剂量下每种 ACT 药物的预期最大血液浓度 (C max ) ） ART 的三聚体衍生物 TF27 因其对多种病毒的抗病毒活性而闻名 [ 84 ]。Jacquet 等人。结合三个 ART 分子形成化合物 TF27，并评估了它们对人巨细胞病毒 (HCMV) 的体外和离体抗病毒活性。与 ART 相比，TF27 对 AD169 菌株、内皮性菌株 VHL/E 和 TB40/E 以及临床菌株 S *的 HCMV 复制表现出更高的体外功效。TF27的 EC 50值在纳摩尔范围内，而 ART 的 EC 50 值在微摩尔范围内 [ 85 ]。 TF27（图 3）在 EC 50和 EC 90对 HEF 细胞、内皮细胞 (HUVEC) 和上皮细胞 (ARPE-19) 的细胞死亡有轻微影响，在 TF27 时最大细胞毒性为 11.84 ± 11.90%欧共体90。HCMV 毒株 AD169、TB40/E 和 VHL/E 感染胎盘绒毛，AD169 毒株在孵育 10 天后达到每百万细胞 2.6 × 10 6 个病毒拷贝的峰值，并在第 13 天稳定。ART 和 TF27 均显着下降早孕期胎盘外植体中的病毒载量，TF27 显示 EC 50值比 ART 低 200 倍，使其成为先天性 HCMV 治疗的潜在候选者 [ 85 ]。 图 3. TF27 的化学结构 野生等。报道了TF27对鼠和人巨细胞病毒的预防功效。TF27 显示出比 ART (EC 50 = 5.41 ± 0.61 μM)更好的 HCMV 复制 (EC 50 = 0.04 ± 0.01 μM )。通过将病毒复制减少至少 50%，ART 和 TF27 在停药后都显示出持续的疗效。体内研究表明，与缬更昔洛韦治疗的对照动物相比，用 TF27 口服治疗病毒感染的小鼠可显着降低脾脏样本中的病毒载量，其中检测到的病毒载量最高 [ 75 ]。 已知 TF27 通过改变其形态和下调线粒体蛋白与 HCMV 感染细胞中的线粒体相互作用，导致线粒体功能丧失 [ 19 ]。体内研究显示没有化合物相关的副作用。因此，TF27 是巨细胞病毒 (CMV) 复制的有效抑制剂，可用于预防 CMV 感染 [ 75 ]。 谢诺伊等人。报道了 ART 在治疗不耐受或不适合更昔洛韦治疗的同种异体造血干细胞移植 (ASCT) 受体中 CMV 再激活的疗效。该研究包括 117 名接受 ASCT 的患者，其中 68 名患者（58%）记录了 78 次 CMV 再激活。在 78 次发作中，共有 25 名患者接受了 ART，分别有 6、13 和 8 次作为一线、二线和三线药物 [ 10 ]。 在 ART 治疗开始时，CMV 病毒载量中位数为 1.6 × 10 3拷贝/mL。27 次 CMV 发作中共有 5 次 (19%) 用 ART 清除。然而，ART 有效控制了 27 次发作中的 20 次（74%）的 CMV 增殖。ART 在 27 集中的 6 集中 (22%) 失败。共有 22 名患者未表现出 ART 治疗的主要副作用，而 3 名患者出现被认为与 ART 相关的溶血。低于 25% 的失败率和 19% 的完全清除率表明 ART 对 CMV 有效，可用于细胞减少和对更昔洛韦不耐受的患者 [ 10 ]。 罗等人。确定了 ART 在用作佐剂时是否可以增强狂犬病疫苗的免疫反应。以 5 mg/kg 的剂量对小鼠进行 15 天的治疗既没有引起副作用，也没有引起体重减轻。用灭活的 CVS-11（狂犬病毒株）+ ART 免疫小鼠会导致外周血中病毒中和抗体 (VNA) 水平升高，并且 ART 显着增强了用灭活的狂犬病毒株 rHEP-dG 免疫的小鼠的 VNA 诱导。由于用 rHEP-dG + ART 治疗的小鼠与用 rHEP-dG + PBS 治疗的小鼠相比具有更高的存活率，这表明 ART 可以增强狂犬病疫苗的保护作用[ 76 ]。 库马兰等人。报道了一例新生儿在出生后 30 分钟内出现染色体整合的人类疱疹病毒 6A (ciHHV-6) 心肌炎。没有家族史可以追溯到这种情况的原因。病毒性心肌炎体征包括窦性心律伴低电压复合物和肌钙蛋白-I、脑利钠肽和肌酐磷酸激酶升高。正性肌力药（用于改善心血管系统基本功能的药物）的使用效果微乎其微 [ 86]。然后以 5 mg/kg/× 10 天的剂量对患者进行 ART，然后在第 4 天以 5 mg/kg/剂量每天两次×10 天口服剂量。这导致患者的呼吸功能减弱支持，从直接母乳喂养开始，出生后 12 天出院。ART 完成后，心肌收缩力从第 2 天的 40% 增加到第 34 天的 55%，并在第 63 天恢复正常 [ 11 ]。 黄等人。研究了ART对咪喹莫特（IMQ）诱导的小鼠银屑病样皮炎的治疗效果。与 IMQ 模型组相比，ART 延迟了皮炎的开始和进展，并显着改善了 IMQ 银屑病的严重程度。ART 减少了角质形成细胞层，尤其是表皮增生。ART 对角质形成细胞的抗增生作用研究表明，ART 将 Ki-67 阳性基底层细胞的数量从 19.1 ± 2.3 减少到 12.5 ± 1.6，这意味着 ART 可以减少银屑病病变发展过程中表皮的增殖。ART 治疗可抑制脾脏、引流淋巴结细胞的增殖，并减少引流淋巴结细胞中 γδ T 细胞的数量 [ 87 ]。 拉尔森等人。研究了 ART 对 CRL-2097 人真皮成纤维细胞肌成纤维细胞形成的影响。ART 降低了 α-SMA 基础水平，拮抗 TGF-β 介导的 α-SMA 表达，并减少胶原蛋白 I 和 III 的沉积。ART 显着下调了几种肌成纤维细胞相关基因和促纤维化基因的表达。MMP1和MMP3是与细胞外基质蛋白降解相关的两个基因，它们的转录本表达上调。负责编码细胞周期抑制剂的基因CDKN1A和CDKN2A的表达被上调。ART 诱导成纤维细胞死亡，这可能通过细胞凋亡进行 [ 88 ]。 沉等人。测试了ART对血吸虫病诱导的肝纤维化的功效及其在小鼠模型中的活性机制。比较对照组、感染组和 ART 干预组的小鼠肝脏表明，在 ART 干预组中，感染组观察到的纤维化和肉芽肿面积减少。与感染组相比，在肝脏中发现的纤维化相关基因如 Col1a1、Col3a1 和 α-SMA 在 ART 干预中显着下调。ART 在 200 µM 时使 LX-2 细胞的凋亡增加 17.2%，并以时间和剂量依赖性方式降低肝星状细胞 (HSC) 的活力。ART 通过降低 OCR、ATP 产生、基础和最大呼吸以及备用呼吸能力来抑制线粒体功能。89 ]。 万等人。研究了 ART 通过自噬介导的 p53/p21 waf1/cip1通路抑制成纤维细胞增殖的作用及其减少腰椎椎板切除术后硬膜外纤维化形成的能力。ART以剂量和时间依赖性方式抑制成纤维细胞的生长，在G2/M期阻止细胞周期的进程，并降低细胞增殖标志物PCNA和cyclin D1的表达。ART 诱导细胞自噬级联反应，如自噬通量相关蛋白表达的增加所示 [ 90 ]。用 ART 处理成纤维细胞增加了 p53/p21 waf1/cip1的表达水平蛋白质。胃内 ART 给药以剂量依赖性方式减少纤维粘连组织，并可减少硬膜外纤维化组织中的胶原蛋白合成 [ 90 ]。 白等人。研究了 ART 在减轻 2,4-二硝基三氯苯 (DNCB) 诱导的特应性皮炎 (AD) 方面的有效性。将小鼠分为四组：未处理的 AD 诱导小鼠（DNCB 组）和用 5 mg/kg ART（AS-L 组）或 10 mg/kg ART（AS-H 组）处理的 AD 诱导小鼠。DNCB 诱导小鼠出现水肿、脱屑、出血和干燥，这些症状在 ART 治疗后得到缓解 [ 78 ]。 在 DNCB 组中显着升高的脾脏和淋巴结的重量在接受 ART 治疗后显着降低。AS-L 和 AS-H 治疗减轻了 DNCB 诱导的 AD 样皮肤炎症并减少了皮肤肥大细胞的数量。ART 治疗降低了 TNF-α 水平，抑制了 IL-4 和 IL-5 mRNA 表达，并逆转了 DNCB 诱导的 Th17 相关细胞因子表达的变化，显示其能够减弱 DNCB 诱导的小鼠 AD [ 78 ]。 孔等人。探讨了 ART 对肝星状细胞 (HSC) 铁死亡的作用，并评估了其分子和细胞机制。ART显着降低了体内肝纤维化的四个指标。ART 处理的活化 HSC 增加了脂质 ROS、Fe 2+和 Ptgs2 mRNA 水平，降低了 GSH 含量，显示了 ART 诱导的铁死亡。体外研究表明，ART 诱导的 HSC 死亡并抑制了活力，并导致线粒体变小、破裂和皱缩，这是铁死亡的特征 [ 77 ]。 用 ART、铁死亡特异性抑制剂铁螯合剂去铁胺 (DFO) 或联合治疗 24 小时处理活化的 HSC 表明，阻断铁死亡在体外消除了 ART 诱导的抗纤维化功效。ART 促进了铁蛋白吞噬相关基因和标志物的自噬通量出现。ART 诱导的铁死亡和抗纤维化功能通过与溶酶体腔碱化剂氯喹共同处理 HSC 得到抑制。结果表明，ART可以通过调节铁死亡信号通路来缓解肝纤维化[ 77 ]。 万等人。探讨了 ART 如何影响膝关节手术后关节内纤维化的进展及其潜在的分子机制。ART 对成纤维细胞的治疗表明它降低了 DNA 合成，抑制了细胞周期，并降低了细胞增殖标志物（PCNA 和细胞周期蛋白 D）的表达。ART 增加了 Atg5 的蛋白质水平并降低了 LC3-II/LC3-I 比率，同时显着增加了具有 LV-Beclin-1-shRNA 的成纤维细胞中的 p62 表达水平。用 ART 处理成纤维细胞 24 小时降低了 p70S6K 和 mTOR 的磷酸化水平，同时增加了 AMPK 的磷酸化水平，表明 ART 通过抑制通过 AMPK/mTOR 和 P13K/AKT/mTOR 途径的 mTOR 信号传导诱导自噬。体内结果表明，ART 可诱导自噬激活并减少手术引起的膝关节纤维化 [ 79]。 李等人。使用 1 型糖尿病小鼠模型研究了 ART 在非肥胖糖尿病 (NOD) 小鼠中的作用和机制。接受 DMSO 治疗的小鼠中共有 62.5% 患上糖尿病，而接受 ART 治疗的小鼠中只有 25% 患上糖尿病。尽管 ART 降低了胰岛炎的程度，但它并没有逆转 NOD 小鼠的疾病。ART 给药增加了脾脏和胰腺淋巴结中 T h 2 细胞的频率并减少了 T h 1 细胞。在脾脏和胰腺淋巴结中观察到CD8 + T 细胞中细胞因子产生的变化 [ 12 ]。 ART 给药后TNF-α 和 IL-6 水平降低，分泌 IFN- γ的 T 细胞频率降低，产生 IL-4 的细胞和 T reg细胞的比例增加。体外研究表明，ART 在显着增加的 β 细胞质量中增加了 Ins1 和 Ins2 的水平，增加了负责维持 β 细胞功能成熟的分子，并降低了内分泌祖细胞标志物Ngn3的表达 [ 12 ]。 阿克曼等人。正如 Ben-Othman 等人提出的那样，确定长期用 ART 治疗小鼠是否会诱导 α-to-β 细胞转分化。和李等人。2017 年。虽然接受 ART 治疗 3 个月的小鼠比接受 DMSO 治疗的小鼠显示出更快的葡萄糖清除率，但两个研究组之间的 2 小时结束和空腹血糖水平没有差异。在空腹或腹膜内葡萄糖耐量试验期间，两组的血浆胰岛素浓度相同。ART 治疗的小鼠在 6 个月的研究结束时体重降低 [ 91 ]。 胰岛素和 YFP 共表达细胞的存在以及两组之间相同部分的胰岛素+ /YFP +细胞没有显示 ART 诱导的 α 到 β 细胞转分化的证据。ART 治疗组和对照组之间在胰岛数量、胰岛大小分布、胰岛面积、每个胰岛的 β 细胞面积或每个胰岛的 YFP +细胞数方面没有差异。研究结果表明，ART 不会在体内诱导胰腺 α-to-β 细胞转分化 [ 91 ]。 孙等人。评估了ART对糖尿病肾病（DN）的体外作用和分子机制。用 ART 处理大鼠系膜细胞系 HBZY-1 细胞可抑制高糖诱导的增殖。高糖刺激导致 IL-6、IL-1β 和 TNF-α mRNA 水平的诱导，并增加炎性细胞因子的产生，用 ART 治疗细胞减弱了诱导并抑制了高糖诱导的炎性细胞因子的产生。ART 抑制 ROS 和 MDA 水平的升高，减弱高糖抑制的 SOD 活性，并降低细胞外基质蛋白如胶原蛋白 IV、层粘连蛋白和纤连蛋白的表达。NF-κB、TLR4/MyD88 和 NLRP3 炎性体通路均参与 ART 在高糖诱导的 HBZY-1 细胞中，并形成信号轴，当被抑制时，92 ]。 阿拉格邦西等人。通过评估所涉及的酶和激素，研究了基于性别和持续时间的葡萄糖稳态 ART 效应的机制。总共 50 只白化病大鼠（25 只雄性和 25 只雌性）被分成 5 组，在第 15 天接受不同浓度的 ART。ART 降低雌性大鼠血浆葡萄糖浓度的效果优于雄性大鼠。ART 给药后肝糖原增加，但随时间恢复正常。15 天后，只有雄性大鼠的肝葡萄糖 6-磷酸浓度增加，而肝葡萄糖 6-磷酸酶浓度下降，两性之间没有差异 [ 80 ]。 只有用低 ART 治疗 5 天的雄性大鼠胰岛素增加。皮质醇浓度在男性中增加，在女性中降低。接受低剂量抗逆转录病毒治疗 5 天的雄性大鼠雌激素增加，而接受高剂量抗逆转录病毒治疗 15 天的雌性大鼠雌激素降低。结果表明，ART 通过降低胰高血糖素浓度和抑制两性中的葡萄糖 6-磷酸酶来降低血浆葡萄糖，并且只有在雄性大鼠中，胰岛素浓度的增加才有助于通过 ART 降低血浆葡萄糖 [ 80 ]。 2.5. 其他关于 ART 生物学活动的最新报告 尚等人。使用盲肠结扎和穿刺 (CLP) 诱导的小鼠模型研究 ART 对脓毒症诱导的免疫抑制的影响。ART 将带有铜绿假单胞菌的 CLP 小鼠的死亡率从 85% 降低到 50% 。ART 治疗显着提高了铜绿假单胞菌CLP 小鼠的 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平，并降低了细菌负荷。体外和体内结果表明，ART 可增强促炎细胞因子的释放并促进细菌清除，从而逆转脓毒症诱导的免疫抑制 [ 93 ]。 作用机制研究表明，ART与维生素D受体相互作用，通过阻止其核转位抑制其生物学功能，从而影响其靶基因Atg16l1的转录。ART 抑制维生素 D 受体与 LPS 耐受性巨噬细胞中的 NF-κB p65 相互作用并激活 NF-κB p65 靶基因转录。结果显示了一种使用 ART 逆转脓毒症诱导的免疫抑制的新方法 [ 93 ]。 张等人。评估了 ART 后处理在减少大鼠中脂多糖 (LPS) 诱导的脓毒症诱导的急性肺损伤 (ALI) 的能力及其所涉及的机制。LPS 组肺样本的组织病理学评估显示急性肺泡损伤，用 15 mg/kg ART 治疗。BALF中的TNF-α和IL-6和肺W/D比在LPS组升高，ART治疗显着降低。ART 治疗降低了肺髓过氧化物 (MPO) 活性和丙二醛 (MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 和超氧化物歧化酶 (SOD) 水平，这些都是氧化应激损伤的指标 [ 23 ]。 免疫荧光分析显示，相对于 LPS 组，mTOR/AKT/PI3K 轴强度增强，IL-6 和 TNF-α 水平减弱。与 LPS 组相比，ART 给药降低了 caspase-3 水平并提高了 p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR 和 PI3K/β-actin 的蛋白质水平。TUNEL 分析显示凋亡指数水平降低，而 LY294002 治疗抑制了 ART [ 23 ] 的功能。 詹等人。评估了 ART 在体内减轻干燥综合征 (SS) 样症状的生物学功效，并探索了所涉及的体外机制。与未经治疗的小鼠相比，ART 治疗的 NOD/Ltj 小鼠唾液流速更高，淋巴细胞病灶数减少，淋巴细胞浸润减轻。ART 治疗的 NOD/Ltj 小鼠的 RF 和 IgG 水平较低，病灶中的 B220 + B 淋巴细胞明显少于未治疗的小鼠。ART 通过下调 NF-κB 信号通路增加凋亡率来抑制 B 细胞激活因子 (BAFF) 诱导的 B 细胞存活。ART 影响 Raji 细胞中 TRAF6 的蛋白水平并增强 TRAF6 的泛素化水平，从而导致 TRAF6 降解和 NF-κB 抑制。94 ]。 他等人。评估了ART抑制动脉粥样硬化斑块形成的能力及其所涉及的机制。血管平滑肌细胞 (VSMCs) 与 100 µM ART 孵育 24 小时增加了脂蛋白脂肪酶 (LPL) 蛋白和 mRNA 的表达水平。ART 增加了 TCF7L2 的蛋白质和 mRNA 水平，从而增强了 LPL 启动子的活性。ART 增加了 NRF2 的核水平，上调了 KLF2 的表达，并抑制了 NRF2 核水平的降低，从而增加了 VSMC 中 LPL 的表达。ART 在 ApoE 中没有引起肝或肾损伤±用于研究的小鼠。ART 治疗导致 VSMC 中脂质沉积减少，LPL 表达增加，动脉粥样硬化斑块中 VSMC 计数增加。结果表明，ART 可通过 KLF2/NRF2/TCF7L2 通路上调 VSMCs 衍生的 LPL 表达来抑制动脉粥样硬化 [ 21 ]。 苏等人。评估了 ART 在类风湿关节炎 (RA) 进展过程中是否减轻骨侵蚀。ART显着减少了F-肌动蛋白环和TRAP阳性多核细胞的总面积和数量，并抑制了RANKL诱导的凹坑形成，表明其具有抑制骨质疏松症的能力。ART 抑制破骨细胞分化和骨质疏松过程中 ROS 的产生。ART 治疗导致细胞核中 NRF2 上调，这是由 p62 积累引起的 [ 22 ]。 在 p62 敲低细胞中发现 NRF2 活化受损，同时 CTSK、TRAP、MMP-9 和 NFATc1 表达增强，表明 p62 敲低细胞对 ART 在破骨细胞生成中的抗关节炎作用具有抗性。胶原蛋白诱导的关节炎 (CIA) 大鼠模型不仅表明 ART 可以防止氧化损伤，而且还通过增加发炎的踝关节中 SOD（一种抗氧化酶）的活性来减轻关节炎骨破坏 [ 22 ]。 曾等人。研究以验证他们的推测，即 ART 可以通过上调 miR-34 抑制 DKK1 表达，从而激活 Wnt 信号传导，导致人骨髓间充质干细胞 (hBMSCs) 的成骨分化。用 2.5–10 μM ART 处理 hBMSCs 可增加碱性磷酸酶 (ALP) 活性、茜素红 S (ARS) 染色以及骨钙素 (OCN)、Runx2 和骨桥蛋白 (OPN) 的 mRNA 和蛋白表达，表明 ART 能够在促进成骨。ART 治疗通过下调 DKK1 和上调 β-catenin、cyclin D1 和 c-myc 来激活 Wnt 通路，但 DKK1 的过表达被证明抑制了 ART 成骨促进作用 [ 95 ]。 ART 治疗增强了 miR-34a 的表达，而低水平的 miR-34a 降低了 hBMSCs 的 ALP 活性和 ARS 染色。用 miR-34a 抑制剂处理 hBMSCs 会增加 DKK1 水平并降低 β-catenin、cyclin D1 和 c-myc 的蛋白质表达。生物信息学研究表明 DKK1 和 miR-34a 模拟物之间存在直接结合位点。因此，ART 可以通过 miR-34a/DKK1/Wnt 通路促进成骨细胞分化 [ 95 ]。 党等人。研究了 ART 如何影响易患狼疮的 MRL/ lpr上的滤泡辅助 T (Tfh) 和 T 滤泡调节 (Tfr) 细胞以及所涉及的机制。系统性红斑狼疮 (SLE) 的特征是高蛋白尿、血清肌酐和尿素氮水平。用 2.5 和 5 mg/kg ART 治疗可降低小鼠死亡率，抑制蛋白尿增加并降低血清肌酐和尿素氮水平。ART 减轻了肾脏损伤并降低了肾脏中抗 dsDNA IgG 的水平，但不降低 IgM 抗体 [ 96 ]。 在 SLE 患者中升高的促炎细胞因子如 IFN-γ、IL-6 和 IL-21 在接受 ART 治疗后显着降低。ART 抑制 Tfh 产生并增加 Tfr 与 Tfh 细胞的比率。5 mg/kg ART 的量显着降低 p-Jak2/Jak2 和 p-Stat3/Stat3 的表达优于 2.5 mg/kg 处理，表明 ART 对易患狼疮的 MRL/ lpr小鼠具有治疗作用并涉及 Tfh细胞和 JAK-STAT 信号通路 [ 96 ]。 莫塔等人。验证了人外周血淋巴细胞中暴露于 ART 引发的特定染色体损伤和氧化 - 亚硝化应激标志物和细胞凋亡的变化。将培养的淋巴细胞与 ART 一起孵育 24 小时显着增加了 C + MN 和 C - MN 水平，表明其能够诱导致瘤和致畸变事件 [ 65 ]。 测定作为主要 ROS 和氮活性物质的超氧阴离子 (O 2 - ) 和一氧化氮 (NO) 水平显示，与 1 μg/mL ART 孵育 1 小时后，O 2 -和总 NO（约 16%）均增加当 ART 浓度提高到 2 μg/mL 时，只有 NO 水平发生变化。与对照相比，将培养的人淋巴细胞暴露于 2 μg/mL ART 24 小时上调了半胱天冬酶 8 和 9 以及细胞色素 c 的量。因此，ART 会引起人淋巴细胞氧化-亚硝化水平的变化，从而引起细胞凋亡以及致畸胎和致断裂作用 [ 65 ]。 王等人。研究了 ART 对氢化可的松 (HC) 诱导的免疫抑制的免疫调节作用。HC小鼠模型通过每天1次20mg/kg HC肌肉内给药5天建立。给予不同剂量大肠杆菌的 HC 小鼠显示出非常低的清除细菌的能力和更差的释放TNF-α的能力。尽管从第 6 天到第 10 天施用 20 mg/kg ART 没有发现血液清除，但 TNF-α 和 IL-6 水平增加，并且在每天两次用 ART 治疗 HC 小鼠并在之后持续 2 天后细菌负荷显着降低HC给药停止。ART (2.5 μg/mL) 增加了 TNF-α 和 IL-6 mRNA 的表达以及它们从 HC 细胞中的释放。ART 还抑制糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链 (GILZ) mRNA 表达并增加 TLR4 和 NF-κB 表达；因此，ART 具有免疫调节作用 [ 97 ]。 戈内姆等人。研究了 ART 和/或雷帕霉素 (Rapa) 对肝 I/R 损伤的潜在有益作用及其所涉及的机制。用 ART 和/或 Rapa 治疗肝 I/R 损伤的大鼠会阻碍 caspase-1/caspase-11 NLRP3 炎性体。ART 使所有细胞焦亡成分正常化，ART 和 Rapa 的组合改善了所有炎性体标志物。与单独使用 Rapa 或 ART + Rapa 相比，ART通过抑制HMGB1/RAGE和TLR4/MyD88/TRAF6信号显示出更好的抗炎能力。ART 降低了促炎细胞因子 TNF-α 和 IL-6 的水平。与 Rapa [ 98 ]相比，ART 给药增强了抗氧化防御能力并降低了中性粒细胞浸润和脂质过氧化的标志物。 治疗肝 I/R 损伤的大鼠用单独的 Rapa 或 ART + Rapa 纠正了 Bcl-2/Bax 失衡。组织病理学结果显示，ART 降低了血清天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶和乳酸脱氢酶的水平，并将肝损伤降低到 1 级（与 ART + Rapa 相同），而 Rapa 对 2 级的改善较小。因此，ART 可以减轻功能性和结构性 I/R 诱导的肝异常 [ 98 ]。 潘等人。研究了 ART 如何抑制大肠杆菌中的抗性结瘤分裂 (RND) 泵以及使用 RND 调节剂 MarA 所涉及的机制。ART (8000 μg/mL) 增强了 β-内酰胺对大肠杆菌ATCC35218 的抗菌作用。ART 下调 soxS、marA 和 rob 的 mRNA 表达水平。ART 显着下调 RND 泵的 mRNA 表达水平并增加 ATCC35218 内的抗生素积累。大肠杆菌的使用缺乏marA表明只有ART失去了抗菌增敏作用；因此，marA、soxS 和 rob 在 ART 的细菌致敏中起重要作用。删除 marA 导致 ART 失去其对 RND 泵的抑制作用。发现 ART 使用 K62 和 R59 残基与 MarA 中央腔结合，改变其电荷分布，从而中断其自转录激活 [ 99 ]。 Feng 和 Qiu 研究了 ART 如何通过 PI3K/AKT/mTOR 信号通路影响类风湿性关节炎 (RA) 大鼠模型中的软骨细胞增殖、凋亡和自噬。RA组大鼠的白细胞和血小板计数均高于ART组，显示ART减轻炎症的能力。ART 对 RA 大鼠没有肝毒性。ART组软骨组织AKT、P13K、Bcl-xl、Bcl-2、mTOR mRNA和蛋白表达低于RA组，LC3-II、Bax、LC3-I、Becline-1表达高于RA组。软骨组织和软骨细胞。软骨细胞增殖检查 (CPE) 显示 ART 通过 PI3K/AKT/mTOR 信号通路负调节 RA 大鼠的 CPE。ART 将细胞周期阻滞在 G0/G1 期，促进软骨细胞凋亡和自噬。100 ]。 张等人。检验了 ART 联合点阵 CO 2激光在肥厚性瘢痕模型中的有效性。ART的组合减少了肥厚性瘢痕样本的大小和厚度，减少了多余和不规则的成纤维细胞，并抑制了该区域成纤维细胞数值密度和该区域胶原纤维面积密度的瘢痕厚度。ART和CO 2激光联合使用可以更好地抑制I型胶原的含量和Col-I和III的比例。BMP-7 和Fas 表达均通过将ART 与点阵CO 2激光相结合而得到增强。结果表明，ART 和点阵 CO 2激光可用于治疗肥厚性瘢痕 [ 101 ]。 结论 虽然ART主要被称为抗疟药，但它还具有抗癌、抗糖尿病、抗病毒、抗炎等活性。其治疗疟疾的作用机制包括产生ROS、抑制血红素聚合和破坏寄生虫膜。ART 可单独使用或与其他治疗剂联合使用以提高生物功效。然而，据报道，溶血性贫血在接受 ART 治疗的重症疟疾患者中普遍存在，并具有其他一些免疫缺陷。 ART 对癌细胞的功效是由于铁死亡、细胞周期某些阶段的停滞以及 P13K/AKT/mTOR 和 MAPK 途径的抑制。ART 抑制 ROS 的产生，这可能对细胞的基本组成部分造成损害，包括 DNA、蛋白质和脂质。ART 显示出与阿司匹林相当的抑制作用（IC 50= ART 和阿司匹林分别为 743.34 和 592.54 μg/mL）对抗 COX-2 酶活性，因此显示出降低结肠癌的效力。ART 还显示出对 HCMV 和 ciHHV-6 等病毒的活性。据报道，ART 能够抑制动脉粥样硬化、减轻关节炎骨破坏、促进成骨细胞分化和诱导人淋巴细胞氧化-亚硝化水平的变化，从而导致细胞凋亡以及致畸和致裂作用。大多数关于 ART 的研究都是在临床前阶段进行的。ART 的生物学功效表明迫切需要更多的研究来充分了解其作用方式。 作者贡献 概念化，NR；方法学，NR；验证、BAA 和 RBM；形式分析，NR；调查，NR；资源、BAA 和 RBM；数据管理，NR；写作——原稿准备、NR、BAA 和 RBM；写作——审查和编辑、NR、BAA 和 RBM；可视化、NR、BAA 和 RBM；监督、BAA 和 RBM；项目管理、BAA 和 RBM；资金收购、BAA 和 RBM 所有作者都已阅读并同意手稿的出版版本。 资金 特此感谢南非国家研究基金会和南非南非医学研究委员会对这项研究的财政支持。 机构审查委员会声明 不适用。 知情同意声明 不适用。 数据可用性声明 不适用。 利益冲突 作者宣称没有利益冲突。 缩写 ART artesunate DIBAL diisobutylaluminum hydride RBCs red blood cells ROS reactive oxygen species NLCs nanostructured lipid carriers SMA severe malaria anaemia Hb haemoglobin PMIF plasmodium macrophage migration inhibitory factor ED50 effective dose 50 IC50 half-maximal inhibitory concentration Cmax maximum serum concentration Qpcr quantitative polymerase chain reaction AQ amodiaquine HCC hepatocellular carcinoma HPV human papillomavirus DNA deoxyribonucleic acid RCC renal cell carcinoma RNA ribonucleic acid HCMV renal cell carcinoma ACT artesunate combination therapy AD atopic dermatitis HSCs hepatic stellate cells DMSO dimethyl sulfoxide MDA 3,4-methylenedioxyamphetamine SOD superoxide dismutase LPS liposaccharide LPL lipoprotein lipase ATP adenosine triphosphate VSMCs vascular smooth muscle cells ALP alkaline phosphatase RA rheumatoid arthritis 参考 Aprioku，JS；Obianime，青蒿素对雄性豚鼠某些生物系统的 AW 构效关系 (SAR)。洞察药业。科学。 2011 年，1，1-10。[谷歌学术][交叉参考] 宋，L。得到。; 李，Z。孙，J。李，G。孙，Y。方，L。马永杰；Garred, P. 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by Hu Ma 1,2,Quan Yao 1,An-Mei Zhang 1,Sheng Lin 1,Xin-Xin Wang 1,Lei Wu 1,Jian-Guo Sun 1,* andZheng-Tang Chen 1,* 1.第三军医大学新桥医院解放军肿瘤研究所，重庆市新桥街2号 400037 2.遵义医学院附属医院肿瘤科,遵义 563000 *应向其通信的作者。 抽象的Abstract 非小细胞肺癌（NSCLC）是全球癌症死亡的主要原因。临床和实验室研究表明，针对肿瘤细胞的多靶点方法可以帮助提高患者的存活率，并可能减少对单靶点抑制剂耐药的细胞的出现。青蒿琥酯 (ART) 是已知的最有效、作用最迅速的抗疟药之一，它还对癌细胞具有深远的细胞毒活性并逆转多药耐药性。在本研究中，我们发现青蒿琥酯在 A549 细胞和小鼠异种移植模型中以剂量依赖性方式抑制 NSCLC A549 细胞生长和增殖、诱导细胞凋亡和抑制肿瘤生长。此外，青蒿琥酯下调表皮生长因子受体（EGFR）的表达，体外和体内。总之，青蒿琥酯是一种有效的抗癌药物，可以增强其他抗癌药物的疗效，并可能通过抑制ABCG2的转录来逆转多药耐药，从而抑制药物流出。 Non-small cell lung cancer (NSCLC) is the leading cause of cancer death worldwide. Clinical and laboratory studies have suggested that multi-targeting approaches against neoplastic cells could help to increase patient survival and might reduce the emergence of cells that are resistant to single-target inhibitors. Artesunate (ART) is one of the most potent and rapidly acting antimalarial agents known, and it also exerts a profound cytotoxic activity toward cancer cells and reverses multi-drug resistance. In the present study, we found that artesunate inhibited NSCLC A549 cell growth and proliferation, induced apoptosis and suppressed tumor growth in a dose-dependent manner in A549 cells and a mouse xenograft model. Furthermore, artesunate down-regulated the expression of epidermal growth factor receptor (EGFR), Akt and ATP-binding cassette subfamily G member 2 (ABCG2) at the mRNA and protein levels in vitro and in vivo. In conclusion, artesunate is an effective anti-cancer drug that may enhance the effectiveness of other anticancer drugs and may reverse multi-drug resistance by suppressing the transcription of ABCG2, which inhibits drug efflux. 一、简介 非小细胞肺癌（NSCLC）是全球癌症死亡的主要原因。尽管近年来肺癌的检测和治疗取得了进展，但中国的总体五年生存率仍低于 15%。大多数患者从标准的铂类化疗治疗中获得适度的临床益处，这与总生存期的有限增加有关 [ 1 ]。表皮生长因子受体 (EGFR) 酪氨酸激酶抑制剂 (TKI) 吉非替尼和厄洛替尼 (特罗凯) 在对化疗后的 NSCLC 患者给药时可适度增加生存率。研究表明，接受这些药物治疗的一部分 NSCLC 患者进入缓解期 [ 2 , 3]。值得注意的是，这种反应与 EGFR 激酶结构域中存在的体细胞激活突变相关 [ 4 , 5 ]。然而，尽管厄洛替尼和吉非替尼对 EGFR 突变的 NSCLC 患者有效，但所有患者最终都会对这些药物产生耐药性。 由于肿瘤的耐药性，EGFR TKI 的临床应用仍然具有挑战性，这导致患者预后不良。迫切需要了解耐药性的分子机制并开发新的治疗策略。一类 ATP 结合盒蛋白包括 P-糖蛋白、几种多药耐药蛋白和 ABCG2 蛋白（也称为 BCRP/MXR/ABCP）被怀疑赋予耐药性。这些蛋白质通过积极地从细胞中排除多种抗癌药物而导致肿瘤的多药耐药性 [ 6 , 7 , 8].这些蛋白质被认为是潜在的临床靶点，可抑制多药耐药性，并改变各种化疗药物的吸收、分布、代谢、排泄和毒性[ 9 , 10 ]。ABCG2 是米托蒽醌、拓扑替康和黄吡酮的主要活性转运蛋白，其过表达已在几种耐药细胞系和肿瘤中得到证实 [ 6 , 11 , 12 , 13 ]。ABCG2 在来自不同组织类型的各种药物选择的肿瘤细胞系中表达，包括肺癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌和胃癌、纤维肉瘤和骨髓瘤 [ 14]。ABCG2 也被证明能以高亲和力结合吉非替尼，导致 EGFR 抑制剂的主动挤出并阻止其生物活性 [ 15 ]。 新的临床和实验研究表明，针对肿瘤细胞的多靶点方法可以提高患者的存活率，并可能减少对单靶点抑制剂耐药的细胞的出现 [ 16 ]。 据报道，青蒿提取物具有多种药理活性，如免疫刺激、抗炎、抗肿瘤发生和抗血管生成。这种提取物中的主要活性成分之一青蒿琥酯 (ART)在体内显示出抗癌活性，并已成功用于治疗转移性黑色素瘤患者 [ 17 ]。先前的研究表明，ART 可在细胞内迅速转化为活性氧，从而破坏细胞功能 [ 18 ]。ART 还被证明可以改变主要的信号通路 [ 19 ]、抑制转移 [ 20 ]、诱导 DNA 损伤 [ 21 ]]，改变细胞周期和逆转多药耐药性 [ 22 , 23 ]。然而，导致细胞死亡和逆转与 ART 相关的多药耐药性的明确机制尚未阐明。 迄今为止，探索 ART 作为组合药物或治疗方案中耐药性抑制剂的功效机制的已发表数据有限，而现有研究仅检查了 ART 与其他药物的相互作用。因此，本研究旨在探索 ART 的抗癌活性，并探讨 ART 对 A549 人肺癌细胞和小鼠异种移植模型中 EGFR 和 ABCG2 表达的影响。 结果与讨论 2.1。ART 抑制 A549 细胞系的生长和增殖 为了确定 ART 对 A549 细胞生长的影响，将细胞在 96 孔板中培养并用 ART 处理 24、48、72 和 96 小时。使用 MTT 测定法确定活细胞的数量。OD值随着ART浓度和暴露时间的增加而降低（与对照组相比，p <0.05）。从 OD 值计算抑制百分比。结果表明，ART对A549细胞的生长具有浓度和时间依赖性抑制作用（图1A）。 图 1. 青蒿琥酯 (ART) 在人非小细胞肺癌细胞 A549 细胞中的细胞毒性。( A ) 描述了暴露于指定浓度 ART 24、48、72 和 96 小时的 A549 细胞的生长抑制曲线和三个独立细胞活力 MTT 测定的平均值；( B ) 用Annexin V-FITC和PI进行细胞染色后，通过流式细胞仪分析确定凋亡细胞的百分比。在 37°C 下用不同浓度的 ART 处理细胞 48 小时。显示的数据代表从三个独立实验中获得的平均值 ± SE。*与对照组相比，p < 0.05。 2.2. ART 以剂量依赖性方式诱导 A549 细胞凋亡 为了研究 ART 诱导的细胞死亡机制，对用 ART (25–100 μM) 处理 48 小时的细胞进行流式细胞术分析。凋亡 A549 细胞的百分比随着 ART 浓度的增加而增加：在 25 μM ART 处理后，8.30% ± 3.45% 的细胞发生凋亡，而在 100 μM ART 处理后为 32.3% ± 11.98%（图 1B）。 2.3. ART 对肺癌细胞 ABCG2 和 EGFR mRNA 水平的影响 A549 细胞用 25-100 μM ART 处理 48 小时，洗涤，并使用实时 RT-PCR 分析 EGFR 和 ABCG2 的 mRNA 表达。当 A549 细胞用低和中等浓度的 ART（25 和 50 μM）处理 48 小时时，EGFR 的 mRNA 表达略有下调。然而，当 ART 浓度增加到 100 μM 时，EGFR 的表达与对照组相比显着下调（p < 0.05）。相比之下，中高浓度 ART（50 和 100 μM）观察到 ABCG2 mRNA 表达下调（p < 0.05），尽管低浓度 ART（25 μM）不影响表达（图 2一种）。 图 2. ART 下调 A549 细胞中的 EGFR 和 ABCG2 mRNA 和蛋白质水平。( A ) 用不同浓度的 ART 处理细胞 48 小时，然后收获。使用实时RT-PCR检测EGFR和ABCG2 mRNA水平；( B ) EGFR、p-EGFR Akt、p-Akt 和 ABCG2 的表达通过蛋白质印迹分析测量。用不同浓度的 ART 处理 A549 细胞 48 h，然后使用 β-actin 表达作为内部对照来确定蛋白质的表达水平。观察到所有蛋白质的显着下调。印迹代表三个独立实验。数据代表一式三份进行的三个独立实验的平均值±SE。* p< 0.05 与对照组相比。 2.4. ART 对肺癌细胞 EGFR、Akt 和 ABCG2 蛋白水平的影响 为了确定细胞凋亡是否与重要的细胞生长信号通路的抑制有关，进行了蛋白质印迹分析。因为 A549 细胞表达 EGFR，我们在 ART 暴露 48 小时后确定了 EGFR 的磷酸化状态。ART 降低 EGFR、EGFR 磷酸化并阻止下游激酶 Akt 的激活。Akt 和 ABCG2 的磷酸化以浓度依赖性方式降低（图2B）。上述结果表明，细胞生长的抑制可能与A549细胞中促存活信号的抑制有关。药物的协同作用可以通过抑制 ABCG2 表达来解释，这将阻止药物通过 ABCG2 的细胞外排。 2.5. ART 抑制小鼠异种移植肿瘤模型中的肿瘤生长 为了确定 ART 是否对肺癌治疗具有潜在的治疗价值，我们在无胸腺小鼠异种移植模型中进一步测试了 ART 对 A549 细胞的抑制作用。将A549细胞（每只小鼠1×10 6 个细胞）皮下注射到三组小鼠中：蒸馏水对照组和两个ART组（60 mg·kg -1或120 mg·kg -1，n = 5）。每隔一天进行最长垂直肿瘤直径的卡尺测量以估计肿瘤体积。结果表明，120 mg·kg -1 ART显着抑制( P < 0.05)肿瘤生长(图3A )。这些发现表明，ART 可有效抑制体内肺肿瘤的生长。 图 3. ART 抑制 A549 异种移植物中的肿瘤生长以及 EGFR 和 ABCG2 mRNA 水平。( A ) 探讨了ART对A549人非小细胞肺癌异种移植小鼠平均肿瘤体积的影响。小鼠每天用0、60和120 mg·kg -1的口服ART治疗14天。每周测量肿瘤大小 3 次。呈现的体积是来自 5 只小鼠的平均值；( B ) ART 治疗小鼠的体重与生理盐水对照组相似；( C ) 在 A549 异种移植物中测量 EGFR 和 ABCG2 mRNA 的表达。小鼠每天口服 60 mg·kg -1 ART, 120 mg·kg -1ART 或蒸馏水。使用实时 RT-PCR 测量 EGFR 和 ABCG2 mRNA 表达水平。*与对照组相比， p < 0.05。 2.6. ART 抑制体内 EGFR、Akt 和 ABCG2 蛋白和基因表达 进一步的研究揭示了口服青蒿琥酯对 EGFR 和 ABCG2 蛋白和基因表达的体内抑制。与对照组相比，接受60 mg·kg -1 ART治疗的小鼠EGFR mRNA表达略有下调( p > 0.05)。然而，与对照组相比，120 mg·kg -1 ART组小鼠的EGFR mRNA表达显着下调（ p < 0.05）。相比之下，两种剂量的 ART（60 和 120 mg·kg -1）均观察到 ABCG2 mRNA 表达的下调（与对照组相比，p < 0.05）（图 3C）。在所有肿瘤组织切片中，对照细胞的细胞质和细胞膜的染色比在用 ART 处理的样品中观察到的更强烈。在每组中观察到不同的染色，但与对照异种移植物相比，在 120 mg·kg -1 ART 治疗组中观察到很少或没有观察到 p-EGFR 或 ABCG2 染色（图 4）。 图 4. ABCG2、Akt、p-Akt 和 p-EGFR 蛋白在未处理和 ART 处理（60 mg·kg -1和 120 mg·kg -1）异种移植物中的表达。显示了 ABCG2、Akt、p-Akt 和 p-EGFR (×40) 的免疫组织化学染色照片。在膜和细胞质中可以观察到明显的黄色染色。呈现的图像代表三个独立实验。数据是一式三份进行的三个独立实验的平均值±SE。*与对照组相比，p < 0.05。条形，100 μm。 2.7. 讨论 EGFR 是受体酪氨酸激酶 (TK) erbB/HER 家族的成员。在与其配体结合后，EGFR 与其他 erbB 受体同源二聚化或异二聚化，导致受体在细胞质尾部内的特定 TK 残基处发生自磷酸化。激活的受体募集信号复合物并激活 Ras/丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)、细胞外信号调节激酶 (ERK)、磷脂酰肌醇 3-激酶 (PI3K)/Akt、信号转导和转录激活因子 (STAT)，以及磷脂酶 C γ 途径。这些途径是肿瘤细胞生长、侵袭、转化和存活的有效致癌调节剂。EGFR 还与血管生成、通过基质金属蛋白酶的侵袭和肿瘤细胞运动有关，所有这些都有助于转移 [ 24, 25 , 26 ]。EGFR 经常在人类肿瘤中过度表达，例如 NSCLC、头颈部鳞状细胞癌 (HNSCC) 和胶质母细胞瘤 [ 27 ]。 本研究表明，ART以浓度和时间依赖性方式抑制A549细胞的生长和增殖，并以剂量依赖性方式诱导细胞凋亡。ART治疗后，A549细胞和异种移植肿瘤模型中EGFR的表达下调。这些发现表明 EGFR 可能参与 ART 介导的细胞毒性，并可能成为 ART 治疗肺癌的一个有希望的靶点。 癌症化疗的功效受到细胞耐药机制的限制，耐药机制导致化疗药物流出增加，从而降低细胞内药物水平。细胞获得对多种化合物的耐药性的能力，称为多药耐药性 (MDR)，通常由 ATP 结合盒 (ABC) 转运蛋白的过表达介导，该转运蛋白逆浓度梯度将底物移出细胞 [ 28]。ATP 结合盒转运蛋白家族的成员与多种恶性肿瘤（如白血病、黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌和结肠直肠癌）对化学疗法和电离辐射的抵抗力有关。评估具有 SP 表型的细胞的研究表明，干细胞过表达 ABCG2 而不是 ABCB1，这是大多数临床研究中靶向的转运蛋白 [ 29 ]，因此，开发 ABCG2 抑制剂非常重要。复方 fumitremorgin C (FTC) 是一种天然产物，可特异性抑制 ABCG2 [ 30 ]。然而，这种化合物对细胞和小鼠都有毒，因此不适合临床研究。 迄今为止，已经报道了几种具有不同结构的 BRCP/ABCG2 抑制剂，但其确切的抑制机制尚未得到充分研究 [ 30 ]。据报道，细胞因子和生长因子也会改变 ABCG2 基因的表达。当从 MCF-7 细胞中分离出 ABCG2 阳性侧群细胞并用转化生长因子-β 处理时，ABCG2 基因表达下降 [ 31 ]。用肿瘤坏死因子-α 或白细胞介素-1 β 治疗原代滋养细胞降低了 ABCG2 的 mRNA 和蛋白质水平，而用胰岛素样生长因子 II 治疗增加了表达 [ 32]。需要进一步的研究来准确描述控制 ABCG2 表达的机制。几项研究报道，蛋白激酶 Akt 参与调节 ABCG2 蛋白的表面表达。茂木等人。是第一个报告 Akt1 缺陷型小鼠的侧群细胞数量减少 [ 33 ]，这是一种独特的 Abcg2 阳性造血干细胞群，当骨髓细胞与 DNA 染料 Hoechst 33342 一起孵育时变得可见。来自正常小鼠的群体细胞与磷脂酰肌醇 3-激酶抑制剂 LY294002 一起孵育，Abcg2 从质膜转移到细胞质，尽管总蛋白表达似乎没有受到影响 [ 33]。当用 Akt1 转染骨髓细胞时，在侧群中观察到细胞数量增加 [ 34 ]。高田等人。随后报道，在 ABCG2 转染的 LLC-PK1 极化肾细胞中，磷脂酰肌醇 3-激酶抑制剂 LY294002 和渥曼青霉素均导致 ABCG2 表达从顶膜转移到细胞内空间，并且这种转移与 Akt 的磷酸化状态相关。14 ]。在本研究中，我们发现用 ART 治疗 A549 细胞和异种移植肿瘤模型可抑制 Akt 的磷酸化并显着下调 ABCG2 的 mRNA 和蛋白水平。这些结果暗示ART可能调节肺癌细胞中ABCG2的表达体外和体内。ART 可能通过 PI3K/Akt 下调 EGFR 下游信号。据报道，ART 不会抑制 ABCG2 将药物泵出细胞的功能 [ 35 ]，然而，本研究表明 ART 下调 ABCG2 的 mRNA 和蛋白质水平。因此，我们假设低浓度的 ART 不会抑制 ABCG2 功能，但高水平可能。这一理论需要在未来的研究中进行检验。 实验 3.1。试剂 ART 购自 Sigma Aldrich (CA)。针对 EGFR 和 p-EGFR（磷酸化 S1070）的兔多克隆抗体和针对 BCRP/ABCG2 的大鼠单克隆抗体 (Bxp-53) 购自 Abcam Hong Kong Ltd.（中国香港）。Akt (Ab-473) 和 p-Akt (Phospho-Ser473) 的兔多克隆抗体购自 Signalway Antibody Co., Ltd (Pearland, TX, USA)，山羊抗兔 IgG（过氧化物酶偶联物）和山羊抗大鼠 IgG（过氧化物酶偶联物）购自 Boster（中国武汉）。甲基噻唑基四唑 (MTT) 购自 Sigma Aldrich。 3.2. 细胞和治疗 A549 人肺癌细胞购自美国典型培养物保藏中心（Rockville，MD，USA）。A549 细胞在含有 5% CO 2的潮湿气氛中维持在补充有 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素（所有试剂均购自 HyClone，Thermo，China）的 RPMI-1640 培养基中在 37 °C。A549 细胞以 5 × 10 5接种在瓶中每瓶细胞培养 24 h。然后用 12.5-100 μM 的 ART 处理细胞 48 小时。将 ART 作为储备溶液 (100 mM) 溶解在二甲亚砜 (DMSO, Sigma) 中并直接添加到培养基中。处理后，使用 0.05% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA 从底物中收获细胞，并用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 洗涤两次。处理过的细胞用于 RNA 和蛋白质提取。 3.3. 增殖试验 将指数生长的细胞以 5 × 10 3 /孔的密度添加到 96 孔板中。然后将 ART (6.25–100 μM) 添加到孔中，每个孔的总体积为 200 μL。使用基于标准甲基噻唑基四唑 (MTT) 的测定法在 24、48、72 和 96 小时测量细胞数。简而言之，将 MTT 以 1 mg/mL 的工作浓度添加到每个孔中，并将板放回培养箱中 4 小时。此后，通过抽吸去除培养基，向每个孔中加入 150 μL DMSO，将板轻轻搅拌 10 分钟，然后测量 490 nm 处的光密度。处理的效果被确定为与未处理细胞相比的活力百分比。 3.4. 细胞凋亡 将A549 细胞 (2 × 10 5 ) 培养 48 小时并用 ART (25、50 和 100 μM) 一式三份处理。用膜联蛋白 V/异硫氰酸荧光素 (FITC) 和碘化丙啶 (Beyotin Biological Engineering Co. Ltd., China) 对细胞进行双色荧光染色。在黑暗中孵育3×10 4细胞15分钟后，使用EPICS XL流式细胞仪（Beckman Coulter）通过流式细胞术对凋亡细胞进行计数。 3.5. 动物实验 5周龄雄性BALB/c无胸腺裸鼠获自第三军医大学新桥医院动物研究中心。所有动物实验均符合世界卫生组织关于人道使用和照顾动物的指南。通过将1×10 6 A549细胞皮下注射到小鼠的右腋窝中来建立肿瘤。每周两次检查小鼠的肿瘤形成情况，并使用滑动卡尺测量肿瘤大小。根据经验方程V=（长×宽2）/2计算肿瘤体积（V）。当肿瘤达到约 100 mm 3的平均体积时，将小鼠随机分为三组（n = 5）并进行以下治疗：（) 蒸馏水（对照）；( b ) 60 mg·kg -1 ART 或 ( c ) 120 mg·kg -1 ART。每只动物每天一次通过强饲法接受治疗，持续两周。在切除肿瘤之前密切监测小鼠。每个肿瘤被分成三部分：一个固定在 10% 多聚甲醛中，一个储存在 RNAiso Reagent 中，在 -80 °C 下用于以后的实时 RT-PCR 分析，第三个储存在 -80 °C 下用于进一步分析。 3.6. 实时 RT-PCR 分析 实时 RT-PCR 用于使用 RNAiso 试剂和 SYBR PrimeScrip RT-PCR 试剂盒（TaKaRa Biotechnology，大连，中国）确定 A549 细胞和肺癌异种移植物中 EGFR 和 ABCG2的转录水平。目标基因的引物序列见表 1。使用循环时间 (Ct) 值表示组间表达的相对差异如下：首先将感兴趣基因的 Ct 值相对于来自同一样品的 β-肌动蛋白标准化，然后是对照组和治疗组之间的相对差异计算并表示为相对增加或减少，Applied Biosystems 7500 系统上的控制设置为 1.0。 表 1. 实时 RT-PCR 分析的引物序列 3.7. 免疫组化染色 将肿瘤样本固定在 10% 多聚甲醛中并包埋在石蜡中。用于免疫组织化学的切片被切割为 4 μm。对于 EGFR、P-EGFR 和 ABCG2 检测，通过将切片浸入 pH 6.0（DakoCytomation，Carpinteria，CA，USA）中的切片然后在微波炉中加热 20 分钟来进行抗原修复。通过在 3% H 2 O 2中孵育来淬灭内源性过氧化物酶活性15分钟。为了阻断非特异性结合位点，切片用 5% 牛血清白蛋白 (BSA) 处理 20 分钟。将切片与一抗在 4 °C 下孵育过夜（EGFR 和 P-EGFR 稀释度为 1:100，ABCG2 稀释度为 1:50）。使用针对 EGFR 和 p-EGFR 的过氧化物酶缀合的山羊抗兔 IgG 二抗以及针对 ABCG2 的过氧化物酶缀合的兔抗大鼠 IgG 二抗检测兔多克隆抗体。DAB 用于染色，BSA 用于替代对照中的一抗。工作对照组用 PBS 代替抗体。切片用苏木精复染。 3.8. 蛋白质印迹 对于蛋白质印迹分析，通过 SDS 聚丙烯酰胺凝胶 (Bio-Rad) 电泳分离 40 μg 总蛋白质，然后将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜 (Bio-Rad) 上。洗涤四次后，将膜与 Blocking 试剂盒（Boster，中国）在室温下孵育 1 小时，然后在 4 °C 下与以下一抗孵育过夜：抗 EGFR、抗磷酸化 EGFR（p-S1070 , Abcam, Hong Kong)、抗 Akt 和抗磷酸化 Akt (p-Ser473)（1:1,000 稀释度，Signalway Antibody）。蛋白质水平针对来自同一样品的 β-肌动蛋白（1:3,000 稀释度，Boster，China）进行标准化。洗涤 3 次后，将膜与物种特异性辣根过氧化物酶偶联的二抗在室温下孵育 1 小时。 3.9. 统计分析 所有测定重复 3 次，结果以平均值±标准差表示。使用学生t检验分析定量实验。使用 SPSS 17.0 统计软件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA），p < 0.05 被认为具有统计学意义。 4。结论 总之，我们的研究结果表明，ART 通过下调肺癌细胞中的 EGFR 及其下游因子 Akt 发挥抗肿瘤作用。此外，ART在体外和体内下调 ABCG2 的表达。由于其目标的多样性，ART 可以与其他互惠作用的药物联合使用 [ 36 , 37 ]。此外，ART的疗效可以通过与其他药物联合来逆转ABCG2介导的多药耐药性来增强。综上所述，这项研究的结果表明，ART 具有显着的抗肿瘤活性，代表了非小细胞肺癌的潜在治疗方法。 致谢 本研究得到国家自然科学基金81071786和81172070资助，重庆市科技攻关，CSTC，2011AB5032。军事临床高技术资助2010gxjs070和国家高技术研究发展计划2008AA02Z104资助。我们感谢西南华盛顿医学中心病理学和实验室范舟阅读手稿。 参考文献和注释 席勒，JH；大卫，H。贝拉尼，CP；科里，L。艾伦，S。詹姆斯，K。朱，JM；David, HJ 四种化疗方案治疗晚期非小细胞肺癌的比较。N.英格兰。J.医学。 2002 年，第346页，第 92-98 页。[谷歌学术][交叉参考] 福冈，M.；矢野，S。贾科内，G。田村，T。中川，K。杜拉德，JY；西胁，Y。范斯汀克斯特，J。库多，S。里辛，D。Eek, R. 吉非替尼针对既往治疗的晚期非小细胞肺癌患者的多机构随机 II 期试验（IDEAL 1 试验）[更正]。J.临床。肿瘤。 2003 年，21 日，2237-2246 年。[谷歌学术][交叉参考] Sequist，LV；贝尔，德国之声；林奇，TJ；Haber, DA 非小细胞肺癌对表皮生长因子受体拮抗剂反应的分子预测因子。J.临床。肿瘤。 2007 年，第25期，第 587-595 页。[谷歌学术][交叉参考] 林奇，TJ；贝尔，德国之声；索德拉，R.；古鲁巴加瓦图拉，S.；冲本，RA；布兰尼根，BW；哈里斯，PL；哈瑟拉特，SM；杰弗里，G。苏普科，JG；哈卢斯卡，FG；等。激活表皮生长因子受体突变是非小细胞肺癌对吉非替尼反应的基础。N.英格兰。J.医学。 2004 年，350年，2129-2139 年。[谷歌学术][交叉参考] 佩兹，JG；宾夕法尼亚州珍妮；李，JC；特蕾西，S。格鲁利希，H。加布里埃尔，S。赫尔曼，P。凯伊，FJ；林德曼，N。博根，TJ；等。肺癌中的 EGFR 突变：与吉非替尼治疗的临床反应的相关性。科学 2004，304，1497–1500。_ _ [谷歌学术][交叉参考] 利特曼，T。德鲁利，TE；斯坦因，WD；Bates, SE 从 MDR 到 MXR：对多药耐药系统、它们的特性和临床意义的新认识。细胞摩尔。生命科学。 2001，58，931-959。_ _ [谷歌学术][交叉参考] 海默尔，A。康塞尔，G。迪利，RG；Cole, SP MRP 相关蛋白和 BCRP/ABCG2 多药耐药蛋白：生物学、底物特异性和调控。当前。药物代谢物。 2004 年，第 5期，第 21-53 页。[谷歌学术][交叉参考] 萨卡迪，B。科罗拉多州拉茨卡；；内梅特，K。Varadi, A. 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发表于2021 年 10 月 9 日 更新于2022 年 1 月 26 日 这个指南是什么？ 世界卫生委员会认识到，有些人在接种 Covid-19 疫苗后身体不适。本指南描述了与注射相关的疾病类型以及医生如何管理这些疾病。 由于这些注射中使用的技术类型以前从未使用过，因此出现的一些情况是新的。因此，随着新证据的出现，这份关于在接受 Covid-19 注射后保持健康的临床指南将定期更新。 如果您感到严重不适 如果您在 Covid-19 注射后感到严重不适或被诊断出患有严重疾病，请告知您的医生您的注射日期，并提醒他们您的疾病可能与 Covid-19 注射有关。这样做很重要，因为 Covid-19 疫苗的临床试验将持续到 2023 年。您的注射经验提供了确定该技术是否安全所需的重要数据。如果您或您的医疗保健提供者担心您可能受到刺戳的影响，您应该报告您的经历 ，以便对其进行全面和独立的检查。 Covid-19 注射会让你生病吗？ mRNA Covid-19 注射剂（Moderna、Pfizer BioNTech 或 Comirnaty）以及 Covid-19 注射剂的 DNA 类型（强生公司和阿斯利康）可能会出现疫苗副作用。 两剂疫苗的副作用比单剂疫苗更常见，可分为以下几类： 即时副作用 Covid-19 类似疾病 Covid-19 后注射综合征 (pCoIS) 即时副作用 直接的副作用可以局限于注射部位或涉及整个身体。 注射部位反应非常常见，包括局部疼痛、压痛、发红和肿胀。这些局部类型的反应通常会在几天内消失。 治疗局部副作用 您可以使用以下非处方药来减轻与直接副作用相关的局部疼痛和不适： 布洛芬 阿司匹林 抗组胺药 对乙酰氨基酚（对乙酰氨基酚） 如果您没有其他医学原因阻止您正常服用这些药物，您可以服用它们来帮助缓解这些疫苗接种后的副作用。使用非处方药时，请始终遵循包装说明书的说明，如果不确定，请咨询医疗保健提供者。 什么时候应该去医院 如果您在注射后出现以下任何组合，您可能有过敏或过敏反应，您应该去医院： 呕吐和腹泻 震颤 虚弱 昏厥 胸痛 抽搐 坍塌 这些反应可能会危及生命。如出现此类不良反应，需由医生评估，并入院观察处理。必须报告这些类型的反应。 Covid-19 类似疾病 接种 Covid-19 疫苗后，Covid-19 样（或流感样）症状很常见。一些健康咨询机构报告说这是正常现象，表明您的身体正在建立保护。然而，仅仅因为这些副作用普遍发生，并不意味着它们是正常或健康的。健康预防疗法不应引起疾病。 疫苗引起的 Covid-19 样疾病通常具有以下症状的组合： 头痛 发烧 关节疼痛 发冷 这些症状可能会在 48 到 72 小时内消失。但是，有些人可能患有更严重的类似 Covid-19 的疾病，持续一周或更长时间，甚至可能检测出 Covid-19 呈阳性。为避免长期患病，接种疫苗后出现类似 Covid-19 症状的人可能会受益于遵循世界卫生委员会的 Covid-19 治疗指南，该指南可在此处找到。 Covid-19 疫苗接种后综合症 (pCoVS) Covid-19 注射后综合征或 pCoIS（也称为 Covid-19 疫苗后综合征或 pCoVS）是一种新的复杂多系统炎症综合征。综合征是可能因人而异的症状的集合。新出现的数据表明，pCoIS 与 Long Covid 或慢性疲劳综合征相似，并表现为以下症状的组合： 肌肉和关节疼痛 肠胃不适 弱点 四肢麻木和刺痛 强烈的疲劳 睡眠不好 脑雾 与 Long Covid 不同，pCoIS 似乎不一定会从类似 Covid-19 的疾病中发展，但可能在注射 Covid-19 几周后自发出现。由于 pCoIS 是一种新疾病，我们不知道这些症状的长期意义。 八类 pCoIS 疾病 世界卫生委员会专家目前认可以下八类 pCoIS 疾病： 分类及描述： 心脏并发症 (pCoIS-Car) 用于影响心脏的注射后症状，例如炎症或心肌炎、心脏病发作或心力衰竭 神经系统并发症 (pCoIS-N) 用于影响大脑和神经系统的注射后症状，例如格林巴利综合征、脑炎、帕金森病、记忆力减退和痴呆 血液学并发症 (pCoIS-H) 用于影响血细胞的注射后症状，例如血栓、血小板减少症和淋巴瘤 血管并发症 (pCoIS-V) 用于影响血管的注射后症状，如中风、血管血栓形成和肺栓塞 免疫系统并发症 (CoIS-IS) 对于影响免疫系统的注射后症状，包括自身免疫性疾病（例如糖尿病、多发性硬化症和克罗恩病）和感染（例如带状疱疹、疱疹、爱泼斯坦巴尔病毒） 生殖健康并发症 (PCoIS-RH) 用于影响妊娠和生殖器官的注射后并发症，如不良妊娠结局、月经过多、绝经后出血和不孕症 - 癌症并发症 (PCoIS-Can) 用于注射后出现的癌症，如乳腺癌、淋巴瘤、白血病和脑癌 先天性并发症 (pCoIS-Con) 用于注射后先天性并发症，例如出生时出现的疾病/异常（例如出血和凝血异常、畸形） 可能有不止一种类型的 pCoIS 并发症。随着越来越多的数据可用，这个定义很可能会被更新。 是什么导致 Covid-19 注射后综合征和其他严重的 Covid-19 注射副作用？ 处于 pCoIS 研究前沿的医生和科学家认为，Covid-19 疫苗的副作用可能是由以下原因引起的： 注入的病毒基因（核酸），为我们体内的细胞提供了制造刺突蛋白的“配方” 刺突蛋白本身，和/或 注射剂中的其他物质（佐剂、赋形剂或污染物） 在 Covid-19 感染期间，刺突蛋白会造成大部分损害，包括：对肺和心肌的伤害、炎症和凝血。疫苗指导我们的细胞制造 Covid-19 病毒刺突蛋白。在某些人中，这种制造的刺突蛋白似乎会对以前健康且无 Covid-19 的人造成类似的伤害。 刺突蛋白和一些疫苗成分，例如脂质纳米颗粒，也可能对一种或多种导致肥大细胞激活综合征 (MCAS) 的注射成分或产品引起过敏反应。肥大细胞含有在过敏反应和其他免疫反应过程中释放的化学物质，这些化学物质会对身体造成伤害。 许多医生和科学家对 Covid-19 注射剂中包含的成分存在安全问题。引起这种担忧的主要原因之一是，如果制药公司认为这样做不符合其商业利益，则不必共享此信息。因此，Covid-19 注射剂的许多成分是未知的。 来自独立科学家的新证据表明，某些疫苗溶液中也可能存在污染物，这些污染物可能会导致某些副作用。您可以在此处从欧洲医生和科学家那里了解有关这些污染物的更多信息。 如何预防和治疗 Covid-19 后注射综合征 (pCoIS)？ 预防 pCoIS 的最佳方法是避免一开始就接种 Covid-19 基因疫苗（辉瑞、Moderna、杨森或阿斯利康）。我们才刚刚开始获得识别、诊断和治疗 pCoIS 的经验，当然还需要进一步的研究。 由于 pCoIS 与 Long Covid 共享功能，一些医生使用的药物和营养补充剂与他们也用于治疗 Long Covid 的药物和营养补充剂相同。其中许多都可以在柜台购买。一般来说，建议您加强努力以保持健康的生活方式，包括健康的饮食、锻炼、体重、糖尿病和血压管理。 如果您出现 pCoIS 的症状，您的医生可以进行一些测试，这些测试可能有助于确定最佳康复途径。这些测试可能包括全血细胞计数、免疫系统标志物、炎症标志物、凝血曲线和肝功能测试。需要注意的是，我们仍处于了解如何评估和治疗 pCoIS 的早期阶段。在开始或改变任何治疗之前，请务必咨询您的医生。 许多正在使用的成熟药物和营养补充剂都可以在柜台购买。这些包括： 药物/补充剂及说明/理由 锌 每天 50 毫克以支持免疫系统。 维生素D 维生素 D（每天 5000 国际单位）平衡免疫反应。 维生素C 维生素 C（每天两次，每次 500 毫克）以支持免疫系统。 Omega-3 脂肪酸 Omega 3 脂肪酸（每天 4 克）支持免疫系统。 槲皮素 槲皮素（500mg，每天两次）是一种天然的抗炎和免疫调节剂，可减少过度活跃的免疫反应。 阿司匹林 阿司匹林（每天 325 毫克）可降低凝血风险。 抗组胺药 抗组胺药可减少过度活跃的免疫反应和肥大细胞活化。氯雷他定和西替利嗪是 H2 抗组胺药，可在柜台购买。 N-乙酰半胱氨酸 N-乙酰半胱氨酸（600mg，每天两次）通过产生在慢性炎症性疾病中耗尽的谷胱甘肽来帮助减轻炎症。 褪黑激素 睡前服用褪黑激素（2mg 至 10mg）有助于恢复昼夜节律和睡眠周期。 秋水仙碱 秋水仙碱（根据医生的处方）。 类固醇 类固醇（根据医生的处方）。 伊维菌素 伊维菌素（根据医生的处方）具有抗炎和免疫调节特性。它还可以阻止刺突蛋白并防止血细胞聚集在一起。治疗可能需要持续到症状消失。 肥大细胞稳定剂 肥大细胞稳定剂（根据医生的处方）。 低组胺饮食 低组胺饮食可能有助于抑制免疫系统对外来物质的反应。许多 pCoIS 症状与 Long Covid 相似的人会在 2 周内对治疗产生反应。 氟伏沙明 根据您医生的处方 对于特定的并发症，可能需要咨询专科医生。例如，您可能需要去看心脏病专家来治疗炎症性心脏病，如心肌炎和心包炎，或者去看神经科医生来治疗神经系统疾病。 我们什么时候才能更多地了解 Covid-19 疫苗的副作用以及如何治疗它们？ 了解更多关于 Covid-19 疫苗副作用的第一步是公共卫生官员承认并认真考虑 世界各地已经报告的数百万个不良事件。为了做到这一点，必须有透明的系统来监测和跟踪疫苗的不良反应，并且必须提供研究资金，以便医生和科学家能够探索报告的数据。这些数据将更多地揭示如何预防和治疗各种类型的 pCoIS。 科学家和医生对这些新的基因治疗疫苗提出了许多问题，包括： 我们的细胞会持续制造刺突蛋白多久？ 疫苗研究是否排除了将 Covid-19 病毒蛋白遗传密码整合到人类基因组 (DNA) 中的可能性？ 需要更多的独立研究 为了全面了解 Covid-19 注射剂的功效和安全性，国际心血管、神经和免疫学专家一致认为： 需要额外的长期安全数据（15 年） 需要对所有接种疫苗的人进行跟进 监管和研究需要由独立的科学委员会进行，而不是疫苗制造商（辉瑞-BioNtech、Moderna、阿斯利康和强生） 需要进行额外的研究以确定注射剂可能产生的毒性作用以及如何预防它们 必须有一种方法来筛查新的 Covid-19 疫苗疾病和可能的基因变化 需要为综合研究建立独立、无偏见的资助 谁有可能对 Covid-19 注射产生副作用？ 所有年龄段的人都会出现严重的副作用，目前尚不清楚为什么有些人会出现这些副作用而其他人不会。迫切需要进行研究，以了解哪些人最有可能因 Covid-19 疫苗而出现中长期并发症。然而，只有在正确进行长期研究之前，才能完全了解谁最容易出现并发症。 如果我认为我的疾病与 Covid-19 接种有关，我该怎么办？ 如果您在接种 Covid-19 疫苗后出现新发症状，请尽快咨询您的医生。他们可能能够帮助您治疗您的症状，而且您越早接受治疗越好。您也可以向您所在国家/地区的疫苗副作用报告系统报告问题。这样做有助于医生、科学家和公众更好地了解这项新技术的潜在风险。 如果您想与经历过 Covid-19 后注射综合征的其他人联系，请访问：wewanttobeheard.com 原文链接：https://worldcouncilforhealth.org/resources/a-practical-approach-to-keeping-healthy-after-your-covid-19-jab/

关于本指南 About this guide 这是一份不断发展的指南，其中包含有关如何从体内清除病毒和疫苗诱导的刺突蛋白的新信息。 草药和其他药物和补充剂的清单是由国际医生、科学家和整体医生合作编制的。 This is an evolving guide with emerging information on how to clear viral and vaccine-induced spike proteins from the body. The lists of herbal and other medicines and supplements have been compiled in a collaboration between international doctors, scientists, and holistic medical practitioners. 由于 Covid-19 感染、Covid-19 疫苗和刺突蛋白危害问题是新问题，本指南以成熟和新兴医学研究以及国际医生和整体健康从业者的临床经验为依据； 它将随着新证据的出现而发展。 As Covid-19 infections, Covid-19 vaccines, and the issue of spike protein harms are new, this guide is informed by established and emerging medical research as well as the clinical experience of international medical doctors and holistic health practitioners; it will evolve as new evidence emerges. 包括的无专利药物和补充剂可能在世界各地有不同的可用性。 The patent-free medicines and supplements included may have differing availability around the world. 重要提示：本指南仅用于教育。如果您在注射疫苗后出现疾病，请向医生或整体保健医生寻求帮助。有关Covid注射后的疾病信息，请参见WCH注射后指南。 Important Note: This guide is for education only. If you are ill after vaccination, please seek help from a medical doctor or an holistic health practitioner. For information on post Covid-injection illnesses, see the WCH post-injection guide. 在所有SARS-CoV-2变种中都可以发现刺突蛋白。当你注射Covid-19时，它也会在你体内产生。即使你没有任何症状，Covid-19检测呈阳性，或在注射后出现不良的副作用，你的身体内仍可能有残留的刺突蛋白。为了在打针或感染后清除这些东西，医生和整体医师建议采取一些简单的行动。 The spike protein can be found in all SARS-CoV-2 variants. It is also produced in your body when you get a Covid-19 injection. Even if you have not had any symptoms, tested positive for Covid-19, or experienced adverse side effects after a jab, there may still be lingering spike proteins inside your body. In order to clear these after the jab or an infection, doctors and holistic practitioners are suggesting a few simple actions. 人们认为，在感染或打针后尽快清除体内的刺突蛋白（从这里开始称为排毒），可以防止剩余的或循环的刺突蛋白的损害。 It is thought that cleansing the body of spike protein (referred to as a detox from here on) as soon as possible after an infection or jab may protect against damage from remaining or circulating spike proteins. 在本指南中，我们将讨论排毒期间可以针对的这些疾病的几个关键特征： In this guide, we will discuss several key features of these conditions that can be targeted during a detox: 刺突蛋白 The spike protein ACE2受体 ACE2 receptors 白细胞介素 6 (IL-6) Interleukin 6 (IL-6) 弗林 Furin 丝氨酸蛋白酶 Serine protease 积极和支持性措施Proactive and supportive measures 几乎所有条件在其早期阶段都更容易管理。 毕竟，完全避免健康危机肯定比对健康危机做出反应要好。 俗话说，一盎司的预防胜于一磅的治疗。 Virtually all conditions are more easily managed in their early stages. After all, it is certainly preferable to avert a health crisis entirely than it is to react to one. As the saying goes, an ounce of prevention is worth a pound of cure. 健康的饮食对于支持健康的免疫系统至关重要。A healthy diet is vital to support a healthy immune system. 提示Tips 改变你的饮食习惯，以减少食用促炎症的食物。建议采用低组胺饮食。避免加工食品和转基因生物。 Alter your diet so as to reduce consumption of pro-inflammatory food items. A low histamine diet is recommended. Avoid processed foods and GMOs. 在感染Covid-19或接受Covid-19注射前，如果你仍然选择这样做，也可将表1中的食物纳入日常饮食。 The food items found in Table 1 may also be incorporated into daily diets prior to contracting Covid-19 or receiving a Covid-19 jab, if you still choose to do so. 间歇性禁食。间歇性禁食的做法是指实施在自愿禁食和不禁食之间来回切换的用餐时间安排。通常，实行间歇性禁食的人每天在6-8小时内消耗所有的日常热量。这种节食方法被用来诱导自噬，自噬本质上是发生在人体细胞中的一个回收过程，细胞在其中降解和回收成分。自噬被身体用来消除受损的细胞蛋白质，并能在感染后消灭有害病毒和细菌。 Intermittent fasting: The practice of intermittent fasting involves implementing meal timing schedules that switch back and forth between periods of voluntary fasting and non-fasting. Commonly, those who practice intermittent fasting consume all of their daily calories within 6-8 hours each day. This method of dieting is used to induce autophagy, which is essentially a recycling process that takes place in human cells, where cells degrade and recycle components. Autophagy is used by the body to eliminate damaged cell proteins and can destroy harmful viruses and bacteria post-infection. 建议每天食用一种综合维生素。除了维生素C和维生素D3之外，它还提供维生素A、维生素E、碘、硒、微量元素等的基本供应。 Daily consumption of a multivitamin is advised. It provides a basic supply of vitamin A, vitamin E, iodine, selenium, trace elements, and more in addition to vitamin C and vitamin D3. 热疗，例如桑拿和热水浴，被认为是一种对刺突蛋白进行排毒的好方法。 Heat therapy, such as taking saunas and hot baths, are considered a good way of detoxing spike protein. 什么是刺突蛋白？What is the spike protein? SARS-CoV-2 病毒的表面含有刺突蛋白。 如果您看过冠状病毒的图像，那是病毒外部经常出现的类似太阳的突起。 The SARS-CoV-2 virus contains a spike protein on its surface. If you’ve seen images of the coronavirus, it is the sun-like protrusions often pictured on the outside of the virus. 在自然感染期间，刺突蛋白在帮助病毒进入人体细胞方面发挥着关键作用。 蛋白质的一个区域，称为 S2，将病毒包膜融合到您的细胞膜上。 S2 区域还允许冠状病毒刺突蛋白很容易被免疫系统检测到，然后免疫系统产生抗体来靶向和结合病毒。 During a natural infection, spike proteins play a key role in helping the virus enter the cells of your body. A region of the protein, known as the S2, fuses the viral envelope to your cell membrane. The S2 region also allows for the coronavirus spike protein to be easily detected by the immune system, which then makes antibodies to target and bind the virus. 刺突蛋白也是由你的身体在注射Covid-19疫苗后产生的，它们的功能相似，因为它们能够融合到细胞膜上。 此外，由于它们是在您自己的细胞中制造的，因此您的细胞会成为免疫系统的目标，以破坏刺突蛋白。 因此，您的免疫系统对刺突蛋白的反应会损害您身体的细胞。 Spike proteins are also produced by your body after taking a Covid-19 jab, and they function similarly in that they are able to fuse to cell membranes. In addition, since they are made in your own cells, your cells are then targeted by your immune system in an effort to destroy the spike protein. Thus, your immune system’s response to spike proteins can damage your body’s cells. 新出现的证据还表明，在我们细胞的细胞核中，刺突蛋白会损害我们细胞修复 DNA 的能力。 Emerging evidence is also showing that in the nucleus of our cells the spike protein impairs our cells’ ability to repair DNA. 为什么我应该考虑从刺突蛋白中解毒？ Why should I consider detoxing from the spike protein? 来自自然感染或 Covid 疫苗的刺突蛋白会对我们身体的细胞造成损害，因此采取行动尽可能地对其进行解毒是很重要的。 The spike protein from a natural infection or a Covid vaccine causes damage to our body’s cells, so it is important to take action to detoxify from it as best as we are able. 刺突蛋白是病毒的剧毒部分，研究已将疫苗诱导的刺突蛋白与毒性作用联系起来。刺突蛋白研究正在进行中。 The spike protein is a highly toxic part of the virus, and research has linked the vaccine-induced spike protein to toxic effects. Spike protein research is ongoing. 病毒刺突蛋白与不良反应有关，例如：血栓、脑雾、机化性肺炎和心肌炎。它可能是 WCH 注射后指南中讨论的许多 Covid-19 疫苗副作用的原因。 The virus spike protein has been linked to adverse effects, such as: blood clots, brain fog, organising pneumonia, and myocarditis. It is probably responsible for many of the Covid-19 vaccine side effects discussed in the WCH post-injection guide. 日本一项针对辉瑞疫苗的生物分布研究发现，在接种疫苗后的 48 小时内，疫苗颗粒已传播到全身各个组织，并没有停留在注射部位，在肝脏、骨髓和卵巢。 A Japanese biodistribution study for the Pfizer vaccine found that, in the 48 hours post-vaccination, vaccine particles had travelled to various tissues throughout the body and did not stay at the injection site, with high concentrations found at the liver, bone marrow, and ovaries. 关于棘突病的新证据表明，与炎症和凝血相关的影响可能发生在棘突蛋白积累的任何组织中。此外，经过同行评审的小鼠研究发现，刺突蛋白能够穿过血脑屏障。因此，在人类中，如果不从体内清除，它可能会导致神经损伤。 Emerging evidence on spikopathy suggests that effects related to inflammation and clotting may occur in any tissue in which the spike protein accumulates. In addition, peer-reviewed studies in mice have found that the spike protein is capable of crossing the blood-brain barrier. Thus, in humans it could potentially lead to neurological damage if it is not cleared from the body. 如何减少刺突蛋白伤害 How to reduce your spike protein load 支持长期 Covid 和疫苗后疾病患者是健康研究和实践的一个新兴领域。以下列表包含可能有用的物质。该列表由在帮助人们从 Covid-19 和注射后疾病中康复方面拥有丰富经验的国际医生和整体从业者编制。 Supporting people with Long Covid and post-vaccine illness is a new and emerging field of health research and practice. The following lists contain substances that may be useful. This list has been compiled by international doctors and holistic practitioners with diverse experiences in helping people recover from Covid-19 and post-injection illness. 幸运的是，有许多容易获得的天然解决方案可以减少身体的刺突蛋白伤害。 Luckily, there are a host of easily attainable, natural solutions to reduce your body’s spike protein load. 一些“蛋白质结合抑制剂”抑制刺突蛋白与人体细胞的结合，而另一些则中和刺突蛋白，使其不再对人体细胞造成损害。 Some “Protein Binding Inhibitors” inhibit the binding of the spike protein to human cells, while others neutralize the spike protein so that it can no longer cause damage to human cells. 刺突蛋白抑制剂：夏枯草、松针、大黄素、印楝、蒲公英叶提取物、伊维菌素 Spike Protein Inhibitors: Prunella vulgaris, pine needles, emodin, neem, dandelion leaf extract, ivermectin 刺突蛋白中和剂：N-乙酰半胱氨酸 (NAC)、谷胱甘肽、茴香茶、八角茶、松针茶、圣约翰草、紫草叶、维生素 C Spike Protein Neutralizers: N-acetylcysteine (NAC), glutathione, fennel tea, star anise tea, pine needle tea, St. John’s wort, comfrey leaf, vitamin C 伊维菌素已被证明与刺突蛋白结合，可能使其无法与细胞膜结合。 Ivermectin has been shown to bind to the spike protein, potentially rendering it ineffective in binding to the cell membrane. 自然界中发现的几种植物，包括松针、茴香、八角茴香、圣约翰草和紫草叶，都含有一种叫做莽草酸的物质，它可能有助于中和刺突蛋白。莽草酸可能有助于减少刺突蛋白的几种可能的破坏作用，并被认为可以抵消血凝块的形成。 Several plants found in nature, including pine needles, fennel, star anise, St. John’s wort, and comfrey leaf, contain a substance called shikimic acid, which may help to neutralize the spike protein. Shikimic acid may help to reduce several possible damaging effects of the spike protein, and is believed to counteract blood clot formation. 定期口服维生素 C 有助于中和任何毒素。 Regular oral doses of vitamin C are useful in neutralizing any toxin. 松针茶具有强大的抗氧化作用，并含有高浓度的维生素C。 Pine needle tea has powerful antioxidant effects and contain high concentrations of vitamin C. 纳豆激酶（见表 1）是一种源自日本大豆菜“纳豆”的酶，是一种天然物质，其特性可能有助于减少血栓的发生。 Nattokinase (see Table 1), an enzyme derived from the Japanese soybean dish ‘Natto’, is a natural substance whose properties may help to reduce the occurrence of blood clots. ACE2受体是什么？What is the ACE2 receptor? ACE2 受体位于细胞壁、肺和血管内层以及血小板中。 刺突蛋白附着在 ACE2 受体上。 The ACE2 receptor is located in the cell wall, in lung and blood vessel linings, and in platelets. Spike protein attaches to ACE2 receptors. 有人提出，高浓度的刺突蛋白可能与我们的 ACE2 受体结合并有效地“坐在那里”，从而阻断这些受体在各种组织中的正常功能。 这些受体的破坏与通过改变组织功能产生的多种不利影响有关。 It has been proposed that large concentrations of spike protein may bind to our ACE2 receptors and effectively ‘sit there’, blocking the regular functioning of these receptors in various tissues. The disruption of these receptors has been associated with a multitude of adverse effects through altered tissue functioning. 如果刺突蛋白与细胞壁结合并“保持原状”，它们可能会触发免疫系统攻击健康细胞，并可能引发自身免疫性疾病。 If spike proteins bind to the cell wall and ‘stay put’, they could trigger the immune system to attack healthy cells and possibly trigger autoimmune disease. 刺突蛋白可以附着在血小板上的 ACE2 受体和血管内皮细胞上，这可能导致异常出血或凝血，这两者都与疫苗诱导的血栓性血小板减少症 (VITT) 有关 The spike protein could attach to ACE2 receptors located on blood platelets and the endothelial cells lining the blood vessels, which may lead to abnormal bleeding or clotting, both of which are linked to Vaccine-induced Thrombotic Thrombocytopenia (VITT) 如何排毒你的 ACE2 受体 How to detox your ACE2 receptors 自然保护 ACE2 受体的物质： Substances that naturally protect the ACE2 receptors: 伊维菌素 Ivermectin 羟氯喹（含锌） Hydroxychloroquine (with zinc) 槲皮素（含锌） Quercetin (with zinc) 漆黄素（非瑟酮） Fisetin 有证据表明，伊维菌素与 ACE2 受体的结合阻止了刺突蛋白与其结合。 Evidence suggests the binding of ivermectin to the ACE2 receptor prevents the spike protein from binding with it instead. 什么是白细胞介素 6？What is Interleukin-6? 白细胞介素 6 或 IL-6 是一种主要的促炎细胞因子蛋白。这意味着它是由身体自然产生的，以响应感染或组织损伤并引发炎症反应。 Interleukin 6, or IL-6, is a primarily pro-inflammatory cytokine protein. This means it is naturally produced by the body in response to infection or tissue damage and initiates the inflammatory response. 为什么以 IL-6 为目标？ Why target IL-6? Some natural substances help the post-jab detoxification process by targeting Interleukin 6. 一些天然物质通过靶向白细胞介素 6 来帮助注射后的排毒过程。 Scientific evidence shows that cytokines such as IL-6, are found in far higher levels among those infected with Covid when compared to uninfected individuals. 科学证据表明，与未感染者相比，感染 Covid 的人中发现的细胞因子（如 IL-6）的水平要高得多。IL-6 已被用作 Covid 进展的生物标志物。已发现呼吸功能障碍患者的 IL-6 水平升高。荟萃分析揭示了 IL-6 水平与 covid 严重程度之间的可靠关系。 IL-6 水平与 ICU 患者的 T 细胞计数呈负相关。 IL-6 has been used as a biomarker for Covid progression. Increased levels of IL-6 have been found in patients with respiratory dysfunction. Meta-analysis has revealed a reliable relationship between IL-6 levels and covid severity. IL-6 levels have been inversely related with T-cell count in ICU patients. IL-6 等促炎细胞因子也在接种后表达，研究表明它们可能会到达大脑。 Pro-inflammatory cytokines such as IL-6 are also expressed post-vaccination, and studies suggest that they may reach the brain. 事实上，WHO 已推荐 IL-6 抑制剂用于严重的 Covid 病例，它们被描述为可以挽救生命。 Il-6 inhibitors have in fact been recommended by the WHO for severe Covid cases, for which they have been described as life-saving. 如何从 IL-6 中解毒 How to detox from IL-6 以下天然物质清单，包括几种基本的抗炎食品补充剂，可用于通过抑制 IL-6 的作用来预防其副作用。 The following lists of natural substances, including several basic anti-inflammatory food supplements, can be used to prevent the adverse effects of IL-6 by inhibiting its action. IL-6 抑制剂（抗炎药）：Boswellia serrata（乳香）和蒲公英叶提取物 IL-6 Inhibitors (anti-inflammatories): Boswellia serrata (frankincense) and dandelion leaf extract 其他 IL-6 抑制剂：黑孜然（Nigella sativa）、姜黄素、鱼油和其他脂肪酸、肉桂、非瑟酮（类黄酮）、芹菜素、槲皮素（类黄酮）、白藜芦醇、木犀草素、维生素 D3（含维生素 K2）、锌、 镁、茉莉花茶、香料、月桂叶、黑胡椒、肉豆蔻和鼠尾草 Other IL-6 inhibitors: Black cumin (Nigella sativa), curcumin, fish oil and other fatty acids, cinnamon, fisetin (flavonoid), apigenin, quercetin (flavonoid), resveratrol, luteolin, vitamin D3 (with vitamin K2), zinc, magnesium, jasmine tea, spices, bay leaves, black pepper, nutmeg, and sage 几种天然的植物性物质用于抗病毒治疗。 植物色素槲皮素已显示出广泛的抗炎和抗病毒作用。 Several natural, plant-based substances are used in antiviral therapy. The plant pigment quercetin has been shown to display a broad range of anti-inflammatory and antiviral effects. 锌已被证明是一种有效的抗氧化剂，可保护身体免受氧化应激，这是与 DNA 损伤、过度炎症和其他破坏性影响相关的过程。 Zinc has been shown to work as a potent antioxidant, which protects the body from oxidative stress, a process associated with DNA damage, excess inflammation, and other damaging effects. 什么是弗林？What is furin? 弗林蛋白酶是一种酶，可裂解蛋白质并使其具有生物活性。 Furin is an enzyme, which cleaves proteins and makes them biologically activate. 为什么要瞄准弗林？ Why target furin? 弗林蛋白酶已被证明可以分离刺突蛋白，从而使病毒进入人体细胞。 Furin has been shown to separate the spike protein and thus allow the virus to enter human cells. Covid 刺突蛋白上存在弗林蛋白酶切割位点，这被认为使病毒更具传染性和传播性。 A furin cleavage site is present on the Covid spike protein, which is thought to make the virus more infectious and transmissible. 弗林蛋白酶抑制剂通过阻止刺突蛋白的切割起作用。 Furin inhibitors work by preventing cleavage of the spike protein. 如何从弗林中解毒 How to detox from furin 自然抑制弗林蛋白酶的物质： Substances that naturally inhibit furin: 芦丁 Rutin 柠檬烯 Limonene 黄芩素 Baicalein 橙皮苷 Hesperidin 什么是丝氨酸蛋白酶？ What is serine protease? 丝氨酸蛋白酶是一种酶。 Serine protease is an enzyme. 为什么靶向丝氨酸蛋白酶？ Why target serine protease? 抑制丝氨酸蛋白酶可以防止刺突蛋白活化，还可以减少病毒进入细胞，从而降低感染率和严重程度。 Inhibiting serine protease can prevent spike protein activation and also reduce viral entry to cells, hence reducing infection rate as well as severity. 如何从丝氨酸蛋白酶中解毒 How to detox from serine protease 自然抑制丝氨酸蛋白酶并可能有助于降低体内刺突蛋白水平的物质： Substances that naturally inhibit serine protease and may help to reduce spike protein levels in the body: 绿茶 Green tea 土豆 Potato tubers 蓝绿藻 Blue green algae 大豆 Soybeans N-乙酰半胱氨酸 (NAC) N-Acetyl Cysteine (NAC) 乳香（乳香） Boswellia (frankincense) 服用什么？服用多少？它从哪里来？从哪里获取？ What to Take? How much to take? Where does it come from? Where to get it? 表1. 可以考虑的药物和补充剂 Table 1. Medicines and supplements that can be considered 原文来源：世界卫生理事会（The World Council for Health） 发表于2021 年 11 月 30 日，更新于2022 年 5 月 3 日 https://worldcouncilforhealth.org/resources/spike-protein-detox-guide/ 刺突蛋白抑制剂和中和剂包括： • 松针 • 伊维菌素 • 印楝 • N-乙酰半胱氨酸 (NAC) • 谷胱甘肽 刺突蛋白抑制与剂，避免刺突蛋白进入细胞内： • 夏枯草 • 松针 • 大黄素 • 拿 • 蒲公英叶提取物 • 伊维菌素 刺突蛋白中和剂，使其无法对细胞造成进一步损害，包括： • N-乙酰半胱氨酸 (NAC) • 谷胱甘肽 • 茴香茶 • 八角茶 • 松针茶 • 圣约翰草 • 紫草叶 • 维生素C 细胞的 ACE2 受体保护剂，包括： • 伊维菌素 • 羟氯喹（含锌） • 槲皮素（含锌） • 非瑟酮（一种类黄酮） 促炎细胞因子白细胞介素 6 (IL-6) 抑制剂，可能抑制刺突蛋白引起的炎症，包括： • Boswellia serrata（乳香） • 蒲公英叶提取物 • 黑孜然（Nigella sativa） • 姜黄素 • 磷虾油和其他脂肪酸 • 肉桂 • 非瑟酮 • 芹菜素 • 槲皮素 • 白藜芦醇 • 木犀草素 • 维生素 D3（含维生素 K） • 锌 • 镁 • 茉莉花茶 • 香料 • 月桂叶 • 黑胡椒 • 肉豆蔻 • 智者 弗林蛋白酶抑制剂，可防止刺突蛋白裂解，可帮助您从弗林蛋白酶中解毒，包括： • 柠檬烯 • 黄芩素 • 橙皮苷 丝氨酸蛋白酶抑制剂，可以防止刺突蛋白活化和病毒进入细胞，包括： • 绿茶 • 马铃薯块茎 • 蓝绿藻 • 大豆 • N-乙酰半胱氨酸 (NAC) • 乳香 综上所述，前10 种刺突蛋白排毒必需品包括维生素 D3、维生素 C、黑种草籽、槲皮素、锌、姜黄素、奶蓟草提取物、NAC、谷胱甘肽和伊维菌素。可以从这10种排毒药物中，或者上面所述物质中，选择家人朋友可以接受的药物或保健品用于排解刺突蛋白，尽可能的降低刺突蛋白的人体的损害。让家人和朋友早点接受青蒿素类药物的排毒治疗，恢复健康正常的生活！

3月10日上午7点多在单位值班，突然感觉左手无力不听使唤，没当事。大约中午11点，腿已经无法走路，感觉无力。随后紧急送医，12时医院脑CT结果是内囊脑梗死，造成左侧面瘫，左侧胳膊麻木无力，腿走路拉胯,伴随高血压162/110。超过溶栓4小时的最佳时间和高血压，未溶栓。因核酸问题不能住院，回家后立即给维生素D3-10000iu，下午3点钟吃点东西给伊维菌素24mg和锌50mg，晚饭后给药青蒿琥脂100mg。 3月11日在家，早7点空腹nac1000mg,午饭加羊肉给伊维菌素24mg和锌50mg。下午3点半半碗羊汤给维生素D3-10000iu和维生素C1000。晚饭增加肉进食量给青蒿琥脂100mg。血压150/105，腿走路已无拉胯现象，左侧胳膊明显消肿。临睡前，以青蒿药草煮水擦拭左臂和手。 3月12日在家，早7点半空腹nac1000mg，9点半早餐给羊汤面和羊肉给伊维菌素24mg和锌50mg。血压139/95，腿走路无拉胯现象，左侧胳膊肿胀消失，麻木感降低。人精神明显好转，无肠胃不良反应。至此用药48小时。 接下来将按照11日用药时间和数量，使用5日。每日分享一下治疗康复进程。 目前没有使用降压和溶栓药物。 如果您母亲除了脑梗并没有其他慢性疾病，可以服用青蒿素保健品，跟脑梗药物分开八个小时服用时间。青蒿素应饭后吃，从最小剂量每天100毫克开始，一段时间后无不适感再逐渐递增，成人剂量是200-400毫克/每天，最多不要超过500毫克/每天。服用一周停一周或两周，再照此循环（任何时候出现不适感要马上停用）不能和VC ,NAC，槲皮素等抗氧化剂同时服用的，青蒿素会与它们进行化学反应而失效。服用期间应避免喝酒、吃葡萄柚或喝葡萄柚汁。葡萄柚可以增加血液中这种药物的用量。不要跟羟氯喹，控制血压的钙通道阻滞剂，胃酸抑制剂等药物一起服用。肝肾功能不全，对菊科植物过敏者禁用。铁血性贫血患者慎用。 如果脑梗症状己治愈，在病情稳定的情况下可以服用阿司匹林，然后再参考FLCCC 公布的以使用伊维菌素为主的“I-RECOVER 長期 COVIDl-19 症候群 (LHCS) 管理試驗計畫書”方案。在没有任何症状的情况下可以参照“長期 COVID-19 症候群的初始治療”和“適用於所有患者”这两个部分用药。这是一个比较成熟而且有效的方案。 https://covid19criticalcare.com/wp-content/uploads/2021/07/FLCCC_Alliance-I-RECOVER-Post-COVID19-Protocol-%E7%B9%81%E9%AB%94%E4%B8%AD%E6%96%87-Chinese-TC.pdf

针对COVID 疫苗的成人4周排毒试验计划： （最好有针对性治疗目标，并在医生指导下） •第一周：每天午餐后补充200mg 青蒿素保健品，持续7天 •第二周：伊维菌素（0.5mg/kg）。每天一次油性餐后（可改为晚餐后以增加吸收），持续7天 •第三周：每天午餐后补充200mg 青蒿素保健品，连续5 天，休息2天 •第四周：每天午餐后补充200mg 青蒿素保健品，连续5 天，休息2天 注意事项： 1）在这4 周期间，请每天早餐后添加以下补充剂（不要与青着素或伊维菌素一起服用） 维生素C：1000mg N-乙酰L-半胱氨酸酸： 600mg 锌：25mg 阿司匹林（前一到两周每天300mg，直到症状淌退，其余时间每天100 毫克） 2）如果您患有贫血或可能贫血，您需要在开始计划前至少服用铁剂3 天，并且不要在服用青蒿素或青蒿琥酯的同一天服用铁剂。 3）青蒿素补充剂的剂量可以根据购买的青蒿素的种类和纯度、个人的身体反应和需要改善的目标进行调整（对于那些有症状的，在治疗的第1、第3和第4周可以增加最多到每天500 毫克的青蒿素补充剂或青蒿琥酯100- 200 毫克） 4）对于严重的疫苗不良反应，可能需要2-3 个周期的治疗。如果是这样，请在两个周期之间休息2周。休息期间，请继续补充维生素C、锌、100 毫克阿司匹林和/或铁补充剂（如果需要）。 5）在治疗期间，禁止使用酒类品。 免责声明： 以上信息不能代替任何专业的医疗建议；如有疑间请寻求当地注册医疗专业人员的帮助；请您对您的选择和决定负责；对于那些已经患有疾病和/或COVID 疫苗有严重不良反应者，尤其需要医生指导。 2022年5月5日

青蒿素适用于哪些癌症的治疗？ 华盛顿大学生物工程系研究教授赖亨利和助理研究教授纳伦德拉星，在体外细胞实验中证实，癌细胞和青蒿素在试管内接触16个小时以后，乳腺癌细胞实际上全部被杀灭，而健康细胞仍然存活，可以说是无毒的抗癌药。 近年来中国和美国都做了大量的人体外或动物试验，发现青蒿琥酯能抗白血病、结肠、黑色素瘤、乳腺、卵巢、前列腺、中枢神经系统和肾等器官、组织的恶性细胞。双氢青蒿素对胰腺癌、白血病、骨肉瘤化肺癌有明显的抑制作用。 需要补充说明的是，青蒿素除了能抑制癌细胞扩散，还有稳定肠道内菌类的生态平衡以及维持胆固醇正常水平的作用，这对于支持癌症患者体质有着重要作用。 尤其是，青蒿素还对红斑狼疮的治疗效果也很好，众所周知，红斑狼疮很顽固，治疗难度大，许多患者长年不愈非常痛苦。由此可见，青蒿素对于疾病的治疗具有广泛性，值得人们关注。 青蒿素治疗癌症的原理是什么？ 癌细胞有“亲铁而死于铁”的现象，医学上称之为“铁死亡”，如何诱导癌细胞形成“铁死亡”条件，是当前癌症治疗的重要研究方向之一。 什么是癌细胞的“铁死亡”呢？癌细胞内铁含量高，这是因为癌细胞需要摄取大量的铁来满足它超快的细胞分裂繁殖的需要，而青蒿素恰恰也具有极强的亲铁性，青蒿素能迅速地与血液中的铁分子或癌细胞内已经摄取的铁结合，青蒿素与铁结合后就生成自由基化合物。于是癌细胞内原有的铁变成了自由基化合物不说，血液中的这些自由基化合物也被癌细胞大量吞噬。而癌细胞有个致命的缺点就是缺乏清除自由基的能力，因此这些自由基化合物就滞留在癌细胞内。 众所周知，自由基可不是什么“省油的灯”，这家伙具有强氧化性，能削弱细胞的抵抗力、破坏细胞的活性、阻碍细胞正常生长，是细胞的绝对杀手，于是癌细胞受到自由基化合物的攻击受损甚至凋亡。而人体正常细胞含铁量不高，也没有噬铁性，清除自由基的功能也正常，所以，青蒿素对正常细胞没有什么伤害。怎么样？青蒿素像不像是专和癌细胞过不去的天敌？ 还有一点也很重要，辽宁医学院附属第一医院张秉琪在他的论文《重大发现：青蒿素能抗癌，或彻底改变癌症治疗方法》中说青蒿素会破坏肿瘤细胞膜，通俗地比喻就是青蒿素能把肿瘤细胞膜“捅漏”，于是细胞外的钙离子就会大量进入癌细胞，扰乱癌细胞的机制导致癌细胞死亡，医学上叫“凋亡”，意思是慢慢地耗死。还有，癌细胞膜“漏了”就会“灌进”大量水分，癌细胞会膨胀而死，医学上叫“胀亡”。这种“击穿癌细胞膜”的手段也是现代治疗癌症重要的研究方向之一。 青蒿素治疗癌症前景如何？ 辽宁医学院附属第一医院张秉琪在他的论文《重大发现：青蒿素能抗癌，或彻底改变癌症治疗方法》中如是说“研究还发现，双氢青蒿素的抗癌活性是抗疟疾的3倍，即只要用抗疟疾剂量的1/3就可起到抗癌的作用。”“青蒿素是一类药物，双氢青蒿素是这一类药物中抗癌效果最好的（一种）。可用于口服，更为方便。可以期待不久的将来，青蒿素的抗癌治疗会进入临床，让我们一起盼望这一天的到来。”怎么样？前景光明吧？ 以上内容以摘自辽宁医学院附属第一医院张秉琪的论文《重大发现：青蒿素能抗癌，或彻底改变癌症治疗方法》为主，本文做了通俗的转述而已，请以原文为准。

目前临床已知的青蒿琥酯 药物相互作用研究共有77条： 药物 相互作用 醋噻嗪 (Acetophenazine) 当青蒿琥酯与醋噻嗪联合使用时，QTc间期延长的风险或严重程度可能增加。 阿利美嗪 (Alimemazine) 当青蒿琥酯与阿利美嗪联合使用时，QTc间期延长的风险或严重程度可能增加。 氨溴索 (Ambroxol) 当青蒿琥酯与氨溴索联合使用时，高铁血红蛋白血症的风险或严重程度可能增加。 青蒿素 (Artemether) 当青蒿琥酯与青蒿素联合使用时，QTc间期延长的风险或严重程度可能增加。 阿替卡因 (Articaine) 当青蒿琥酯与阿替卡因联合使用时，高铁血红蛋白血症的风险或严重程度可能增加。 苯佐卡因 (Benzocaine) 当青蒿琥酯与苯佐卡因联合使用时，高铁血红蛋白血症的风险或严重程度可能增加。 苯甲醇 (Benzyl alcohol) 当青蒿琥酯与苯甲醇联合使用时，高铁血红蛋白血症的风险或严重程度可能增加。 布比卡因 (Bupivacaine) 当青蒿琥酯与布比卡因联合使用时，高铁血红蛋白血症的风险或严重程度可能增加。 丁卡因 (Butacaine) 当青蒿琥酯与丁卡因联合使用时，高铁血红蛋白血症的风险或严重程度可能增加。 丁胺卡因 (Butamben) 当青蒿琥酯与丁胺卡因联合使用时，高铁血红蛋白血症的风险或严重程度可能增加。 丁哌嗪 (Butaperazine) 当青蒿琥酯与丁哌嗪联合使用时，QTc间期延长的风险或严重程度可能增加。 大麻二酚 (Cannabidiol) 当青蒿琥酯与大麻二酚联合使用时，青蒿琥酯的代谢可能减慢。 辣椒素 (Capsaicin) 当青蒿琥酯与辣椒素联合使用时，高铁血红蛋白血症的风险或严重程度可能增加。 鹅脱氧胆酸 (Chenodeoxycholic acid) 当青蒿琥酯与鹅脱氧胆酸联合使用时，青蒿琥酯的代谢可能减慢。 氯普鲁卡因 (Chloroprocaine) 当青蒿琥酯与氯普鲁卡因联合使用时，高铁血红蛋白血症的风险或严重程度可能增加。 氯丙嗪 (Chlorpromazine) 当青蒿琥酯与氯丙嗪联合使用时，QTc间期延长的风险或严重程度可能增加。 辛可卡因 (Cinchocaine) 当青蒿琥酯与辛可卡因联合使用时，高铁血红蛋白血症的风险或严重程度可能增加。 可卡因 (Cocaine) 当青蒿琥酯与可卡因联合使用时，高铁血红蛋白血症的风险或严重程度可能增加。 氨苯砜 (Dapsone) 当青蒿琥酯与氨苯砜联合使用时，不良反应的风险或严重程度可能增加。 达尔贝泊汀阿尔法 (Darbepoetin alfa) 当达尔贝泊汀阿尔法与青蒿琥酯联合使用时，血栓的风险或严重程度可能增加。 去铁酮 (Deferasirox) 当青蒿琥酯与去铁酮联合使用时，青蒿琥酯的代谢可能减慢。 双氟尼柳 (Diflunisal) 当青蒿琥酯与双氟尼柳联合使用时，青蒿琥酯的代谢可能减慢。 苯海拉明 (Diphenhydramine) 当青蒿琥酯与苯海拉明联合使用时，高铁血红蛋白血症的风险或严重程度可能增加。 地氯卡因 (Dyclonine) 当青蒿琥酯与地氯卡因联合使用时，高铁血红蛋白血症的风险或严重程度可能增加。 艾曲波帕 (Eltrombopag) 当青蒿琥酯与艾曲波帕联合使用时，青蒿琥酯的代谢可能减慢。 促红细胞生成素 (Erythropoietin) 当促红细胞生成素与青蒿琥酯联合使用时，血栓的风险或严重程度可能增加。 氯乙醇 (Ethyl chloride) 当青蒿琥酯与氯乙醇联合使用时，高铁血红蛋白血症的风险或严重程度可能增加。 依替多卡因 (Etidocaine) 当青蒿琥酯与依替多卡因联合使用时，高铁血红蛋白血症的风险或严重程度可能增加。 艾屈莫德 (Etrasimod) 当青蒿琥酯与艾屈莫德联合使用时，免疫抑制的风险或严重程度可能增加。 氟硝西泮 (Flunitrazepam) 当青蒿琥酯与氟硝西泮联合使用时，青蒿琥酯的代谢可能减慢。 氟哌啶醇 (Fluphenazine) 当青蒿琥酯与氟哌啶醇联合使用时，QTc间期延长的风险或严重程度可能增加。 磷苯妥英 (Fosphenytoin) 当青蒿琥酯与磷苯妥英联合使用时，青蒿琥酯的代谢可能减慢。 吲哚美辛 (Indomethacin) 当青蒿琥酯与吲哚美辛联合使用时，青蒿琥酯的代谢可能减慢。 异伏康唑 (Isavuconazole) 当青蒿琥酯与异伏康唑联合使用时，青蒿琥酯的代谢可能减慢。 酮康唑 (Ketoconazole) 当青蒿琥酯与酮康唑联合使用时，青蒿琥酯的代谢可能减慢。 左布比卡因 (Levobupivacaine) 当青蒿琥酯与左布比卡因联合使用时，高铁血红蛋白血症的风险或严重程度可能增加。 利多卡因 (Lidocaine) 当青蒿琥酯与利多卡因联合使用时，高铁血红蛋白血症的风险或严重程度可能增加。 卢美芬特 (Lumefantrine) 当青蒿琥酯与卢美芬特联合使用时，QTc间期延长的风险或严重程度可能增加。 甲芬那酸 (Mefenamic acid) 当青蒿琥酯与甲芬那酸联合使用时，青蒿琥酯的代谢可能减慢。 甲氟喹 (Mefloquine) 甲氟喹可能增加青蒿琥酯的QTc延长作用。 美洛昔康 (Meloxicam) 当青蒿琥酯与美洛昔康联合使用时，高铁血红蛋白血症的风险或严重程度可能增加。 甲哌卡因 (Mepivacaine) 当青蒿琥酯与甲哌卡因联合使用时，高铁血红蛋白血症的风险或严重程度可能增加。 美索达嗪 (Mesoridazine) 当青蒿琥酯与美索达嗪联合使用时，QTc间期延长的风险或严重程度可能增加。 甲三氯丙嗪 (Methotrimeprazine) 当青蒿琥酯与甲三氯丙嗪联合使用时，QTc间期延长的风险或严重程度可能增加。 甲氧基聚乙二醇促红细胞生成素贝塔 (Methoxy polyethylene glycol-epoetin beta) 当甲氧基聚乙二醇促红细胞生成素贝塔与青蒿琥酯联合使用时，血栓的风险或严重程度可能增加。 亚甲蓝 (Methylene blue) 当青蒿琥酯与亚甲蓝联合使用时，QTc间期延长的风险或严重程度可能增加。 莫利西嗪 (Moricizine) 当青蒿琥酯与莫利西嗪联合使用时，QTc间期延长的风险或严重程度可能增加。 奈韦拉平 (Nevirapine) 当青蒿琥酯与奈韦拉平联合使用时，青蒿琥酯活性代谢物的血清浓度可能降低，导致疗效下降。 奥赛卡因 (Oxetacaine) 当青蒿琥酯与奥赛卡因联合使用时，高铁血红蛋白血症的风险或严重程度可能增加。 羟丁卡因 (Oxybuprocaine) 当青蒿琥酯与羟丁卡因联合使用时，高铁血红蛋白血症的风险或严重程度可能增加。 匹吉奈塞 (Peginesatide) 当匹吉奈塞与青蒿琥酯联合使用时，血栓的风险或严重程度可能增加。 氯丙嗪 (Perazine) 当青蒿琥酯与氯丙嗪联合使用时，QTc间期延长的风险或严重程度可能增加。 匹瑞氯嗪 (Periciazine) 当青蒿琥酯与匹瑞氯嗪联合使用时，QTc间期延长的风险或严重程度可能增加。 奋乃静 (Perphenazine) 当青蒿琥酯与奋乃静联合使用时，QTc间期延长的风险或严重程度可能增加。 苯巴比妥 (Phenobarbital) 当青蒿琥酯与苯巴比妥联合使用时，青蒿琥酯的代谢可能加快。 苯酚 (Phenol) 当青蒿琥酯与苯酚联合使用时，高铁血红蛋白血症的风险或严重程度可能增加。 苯妥英 (Phenytoin) 当青蒿琥酯与苯妥英联合使用时，青蒿琥酯的代谢可能减慢。 匹莫嗪 (Pipotiazine) 当青蒿琥酯与匹莫嗪联合使用时，QTc间期延长的风险或严重程度可能增加。 普鲁卡因 (Pramocaine) 当青蒿琥酯与普鲁卡因联合使用时，高铁血红蛋白血症的风险或严重程度可能增加。 普鲁卡因 (Prilocaine) 当青蒿琥酯与普鲁卡因联合使用时，高铁血红蛋白血症的风险或严重程度可能增加。 普鲁卡因 (Procaine) 当青蒿琥酯与普鲁卡因联合使用时，高铁血红蛋白血症的风险或严重程度可能增加。 丙氯拉嗪 (Prochlorperazine) 当青蒿琥酯与丙氯拉嗪联合使用时，QTc间期延长的风险或严重程度可能增加。 氯丙嗪 (Promazine) 当青蒿琥酯与氯丙嗪联合使用时，QTc间期延长的风险或严重程度可能增加。 异丙嗪 (Promethazine) 当青蒿琥酯与异丙嗪联合使用时，QTc间期延长的风险或严重程度可能增加。 丙氧卡因 (Proparacaine) 当青蒿琥酯与丙氧卡因联合使用时，高铁血红蛋白血症的风险或严重程度可能增加。 丙氧卡因 (Propoxycaine) 当青蒿琥酯与丙氧卡因联合使用时，高铁血红蛋白血症的风险或严重程度可能增加。 瑞格非尼 (Regorafenib) 当青蒿琥酯与瑞格非尼联合使用时，青蒿琥酯的代谢可能减慢。 利福平 (Rifampin) 当青蒿琥酯与利福平联合使用时，青蒿琥酯的代谢可能减慢。 利托那韦 (Ritonavir) 当青蒿琥酯与利托那韦联合使用时，青蒿琥酯的血清浓度可能降低。 罗哌卡因 (Ropivacaine) 当青蒿琥酯与罗哌卡因联合使用时，高铁血红蛋白血症的风险或严重程度可能增加。 索拉非尼 (Sorafenib) 当青蒿琥酯与索拉非尼联合使用时，青蒿琥酯的代谢可能减慢。 丁卡因 (Tetracaine) 当青蒿琥酯与丁卡因联合使用时，高铁血红蛋白血症的风险或严重程度可能增加。 噻乙哌嗪 (Thiethylperazine) 当青蒿琥酯与噻乙哌嗪联合使用时，QTc间期延长的风险或严重程度可能增加。 硫利达嗪 (Thioridazine) 当青蒿琥酯与硫利达嗪联合使用时，QTc间期延长的风险或严重程度可能增加。 三氟拉嗪 (Trifluoperazine) 当青蒿琥酯与三氟拉嗪联合使用时，QTc间期延长的风险或严重程度可能增加。 三氟氯噻嗪 (Triflupromazine) 当青蒿琥酯与三氟氯噻嗪联合使用时，QTc间期延长的风险或严重程度可能增加。 维莫拉芬 (Vemurafenib) 当维莫拉芬与青蒿琥酯联合使用时，QTc间期延长的风险或严重程度可能增加。 目前临床已知的青蒿素 药物相互作用研究共有160条： 阿美他匹 与阿巴他匹合用可增加青蒿素的血药浓度。 阿巴西普 与阿巴西普合用可增加青蒿素的代谢。 乙酰吩嗪 青蒿素与乙酰吩嗪联合使用会增加 QTc 延长的风险或严重程度。 阿达木单抗 与阿达木单抗合用可增加青蒿素的代谢。 芍药 青蒿素与 Alimemazine 联合使用会增加 QTc 延长的风险或严重程度。 阿培力西布 与Alpelisib合用可增加青蒿素的代谢。 阿米替林 与阿米替林合用可降低青蒿素的代谢。 安普那韦 与安普那韦合用可降低青蒿素的代谢。 阿纳金拉 与阿那白滞素合用可增加青蒿素的代谢。 安替比林 与安替比林合用可降低青蒿素的代谢。 阿扑吗啡 与阿扑吗啡合用可降低青蒿素的代谢。 阿普斯特 与阿普司特合用可增加青蒿素的代谢。 阿莫达非尼 与 Armodafinil 合用可增加青蒿素的代谢。 蒿甲醚 青蒿素与蒿甲醚合用可能会增加 QTc 延长的风险或严重程度。 阿舒瑞韦 与阿舒瑞韦合用可降低青蒿素的代谢。 苯佐卡因 与苯佐卡因合用可降低青蒿素的代谢。 苯丙胺 与苯丙胺合用可降低青蒿素的代谢。 倍他米松 与倍他米松合用可增加青蒿素的代谢。 比美珠单抗 与 Bimekizumab 合用可增加青蒿素的代谢。 布立西坦 与布立西坦合用可降低青蒿素的代谢。 溴苯那敏 与溴苯那敏合用可降低青蒿素的代谢。 安非他酮 与安非他酮合用可降低青蒿素的代谢。 丁哌嗪 青蒿素与丁哌拉嗪联合使用会增加 QTc 延长的风险或严重程度。 卡那奴单抗 与 Canakinumab 合用可增加青蒿素的代谢。 大麻二酚 与大麻二酚合用可降低青蒿素的代谢。 赛诺贝特 与Cenobamate合用可降低青蒿素的血药浓度。 西立伐他汀 与西立伐他汀合用可增加青蒿素的代谢。 赛妥珠单抗聚乙二醇 与 Certolizumab pegol 合用可增加青蒿素的代谢。 氯丙嗪 青蒿素与氯丙嗪联合使用会增加 QTc 延长的风险或严重程度。 桂利嗪 与桂利嗪合用可降低青蒿素的代谢。 西沙必利 与西沙必利合用可降低青蒿素的代谢。 顺铂 与顺铂合用可降低青蒿素的代谢。 氯巴占 与氯巴占合用可降低青蒿素的代谢。 氯吡格雷 与氯吡格雷合用可降低青蒿素的代谢。 氯噻泮 与氯硫西泮合用可降低青蒿素的代谢。 姜黄素 与姜黄素合用可降低青蒿素的代谢。 环磷酰胺 与青蒿素合用可降低环磷酰胺的代谢。 达拉非尼 与达拉非尼合用可降低青蒿素的代谢。 氨苯砜 青蒿素与氨苯砜联用可能会增加不良反应的风险或严重程度。 地昔帕明 与地西帕明合用可降低青蒿素的代谢。 地塞米松 与地塞米松合用可促进青蒿素的代谢。 双氯芬酸 与双氯芬酸合用可降低青蒿素的代谢。 多潘立酮 与多潘立酮合用可降低青蒿素的代谢。 多舒平 与青蒿素合用可降低多舒平的代谢。 屈大麻酚 与屈大麻酚合用可降低青蒿素的代谢。 依法韦仑 与依法韦仑合用可降低青蒿素的代谢。 依帕鲁单抗 与 Emapalumab 联合使用可增加青蒿素的代谢。 依那西尼 与青蒿素合用可降低 Enasidenib 的代谢。 恩杂鲁胺 与恩杂鲁胺合用可降低青蒿素的代谢。 依匹斯汀 与依匹斯汀合用可降低青蒿素的代谢。 艾氯胺酮 与艾氯胺酮合用可降低青蒿素的代谢。 依那西普 与依那西普合用可增加青蒿素的代谢。 乙醇 与乙醇合用可降低青蒿素的代谢。 芬氟拉明 与芬氟拉明合用可降低青蒿素的代谢。 非西硝唑 与非昔硝唑合用可降低青蒿素的代谢。 氟硝西泮 与氟硝西泮合用可降低青蒿素的代谢。 氟西汀 与氟西汀合用可降低青蒿素的代谢。 氟奋乃静 青蒿素与氟奋乃静合用会增加 QTc 延长的风险或严重程度。 氟伐他汀 与氟伐他汀合用可促进青蒿素的代谢。 氟伏沙明 与氟伏沙明合用可降低青蒿素的代谢。 磷苯妥英 与磷苯妥英合用可促进青蒿素的代谢。 戈利木单抗 与戈利木单抗合用可增加青蒿素的代谢。 氟烷 与氟烷合用可降低青蒿素的代谢。 氢可酮 与氢可酮合用可降低青蒿素的代谢。 氢化可的松 与氢化可的松合用可促进青蒿素的代谢。 异环磷酰胺 与青蒿素合用可降低异环磷酰胺的代谢。 丙咪嗪 与丙咪嗪合用可降低青蒿素的代谢。 英夫利昔单抗 与英夫利昔单抗合用可增加青蒿素的代谢。 伊立替康 与伊立替康合用可降低青蒿素的代谢。 艾沙康唑 与艾沙康唑合用可增加青蒿素的代谢。 异氟醚 与异氟醚合用可降低青蒿素的代谢。 伊曲茶碱 与伊曲茶碱合用可降低青蒿素的代谢。 伊曲康唑 与伊曲康唑合用可降低青蒿素的代谢。 氯胺酮 与氯胺酮合用可降低青蒿素的代谢。 酮康唑 与酮康唑合用可降低青蒿素的代谢。 伦博瑞生 与Lemborexant合用可降低青蒿素的血清浓度。 左酮康唑 与左酮康唑合用可降低青蒿素的代谢。 洛哌丁胺 与洛哌丁胺合用可降低青蒿素的代谢。 氯卡色林 与氯卡色林合用可降低青蒿素的代谢。 Lumacaftor 与 Lumacaftor 合用可增加青蒿素的代谢。 苯芴醇 当青蒿素与 Lumefantrine 联合使用时，QTc 延长的风险或严重程度可能会增加。 马尼地平 与马尼地平合用可降低青蒿素的代谢。 甲氟喹 甲氟喹可能会增加青蒿素的 QTc 延长活性。 美金刚 与美金刚合用可降低青蒿素的代谢。 哌替啶 与哌替啶合用可降低青蒿素的代谢。 美芬妥英 与美苯妥英合用可降低青蒿素的代谢。 美索达嗪 青蒿素与美索达嗪联合使用会增加 QTc 延长的风险或严重程度。 美沙酮 与美沙酮合用可降低青蒿素的代谢。 甲巯咪唑 与甲巯咪唑合用可降低青蒿素的代谢。 甲氧苄啶 青蒿素与甲氧三美拉嗪联合使用会增加 QTc 延长的风险或严重程度。 甲氧氟醚 与甲氧氟醚合用可降低青蒿素的代谢。 亚甲蓝 青蒿素与亚甲蓝联合使用会增加 QTc 延长的风险或严重程度。 甲基苯巴比妥 与甲基苯巴比妥合用可降低青蒿素的代谢。 甲基睾酮 与甲基睾酮合用可降低青蒿素的代谢。 美西律 与美西律合用可降低青蒿素的代谢。 米安色林 与米安色林合用可降低青蒿素的代谢。 咪康唑 与咪康唑合用可降低青蒿素的代谢。 米塔皮瓦 与米他匹伐合用可增加青蒿素的代谢。 莫里西嗪 当青蒿素与 Moricizine 联合使用时，QTc 延长的风险或严重程度会增加。 奈非那韦 与奈非那韦合用可降低青蒿素的代谢。 奈韦拉平 与奈韦拉平合用可增加青蒿素的代谢。 尼古丁 与尼古丁合用可降低青蒿素的代谢。 诺孕 与诺孕酯合用可降低青蒿素的代谢。 奥芬那君 与奥芬那君合用可降低青蒿素的代谢。 奥西洛司他 与奥西洛他合用可降低青蒿素的代谢。 欧培米芬 与Ospemifene合用可降低青蒿素的代谢。 帕罗西汀 与帕罗西汀合用可降低青蒿素的代谢。 吡仑帕奈 与吡仑帕奈合用可降低青蒿素的代谢。 哌嗪 青蒿素与哌嗪联合使用会增加 QTc 延长的风险或严重程度。 哌克西林 与培可昔林合用可降低青蒿素的代谢。 哌利嗪 青蒿素与哌立西嗪联合使用会增加 QTc 延长的风险或严重程度。 奋乃静 青蒿素与奋乃静联用会增加 QTc 延长的风险或严重程度。 苯巴比妥 与苯巴比妥合用可增加青蒿素的代谢。 苯妥英 与苯妥英合用可促进青蒿素的代谢。 哌泊噻嗪 当青蒿素与哌泊噻嗪联合使用时，QTc 延长的风险或严重程度会增加。 皮托利桑 与青蒿素合用可降低青蒿素的血药浓度。 普拉格雷 与普拉格雷合用可降低青蒿素的代谢。 磷酸泼尼松龙 与磷酸泼尼松龙合用可促进青蒿素的代谢。 丙氯拉嗪 当青蒿素与丙氯拉嗪联合使用时，QTc 延长的风险或严重程度会增加。 丙嗪 青蒿素与丙嗪联合使用会增加 QTc 延长的风险或严重程度。 异丙嗪 青蒿素与异丙嗪联合使用会增加 QTc 延长的风险或严重程度。 异丙酚 与丙泊酚合用可降低青蒿素的代谢。 奎西泮 与奎西泮合用可降低青蒿素的代谢。 雷洛昔芬 与雷洛昔芬合用可降低青蒿素的代谢。 利福布汀 与利福布丁合用可增加青蒿素的代谢。 利福霉素 与利福霉素合用可降低青蒿素的代谢。 利洛西普 与利洛西普合用可增加青蒿素的代谢。 利匹韦林 与利匹韦林合用可降低青蒿素的代谢。 利托那韦 与利托那韦合用可增加青蒿素的代谢。 罗米地辛 与罗米地辛合用可降低青蒿素的代谢。 苏金单抗 与苏金单抗合用可增加青蒿素的代谢。 司来吉兰 与司来吉兰合用可降低青蒿素的代谢。 舍曲林 与舍曲林合用可降低青蒿素的代谢。 七氟醚 与七氟醚合用可降低青蒿素的代谢。 西妥昔单抗 与 Siltuximab 合用可增加青蒿素的代谢。 辛伐他汀 与辛伐他汀合用可增加青蒿素的代谢。 索拉非尼 与索拉非尼合用可降低青蒿素的代谢。 磺胺苯唑 与磺胺苯唑合用可降低青蒿素的代谢。 他莫昔芬 与青蒿素合用可降低他莫昔芬的代谢。 环戊丙酸睾酮 与青蒿素合用可降低环戊丙酸睾酮的代谢。 庚酸睾酮 与青蒿素合用可降低庚酸睾酮的代谢。 硫乙拉嗪 当青蒿素与硫乙拉嗪联合使用时，QTc 延长的风险或严重程度会增加。 硫利达嗪 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